JPWO2017022695A1 - 超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相 - Google Patents

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Abstract

主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格が含まれるポリマーが担持している担体を含む、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相を提供する。

Description

本発明は、クロマトグラフィー技術に関する。より詳しくは超臨界流体クロマトグラフィーに用いられる固定相に関する。
混合物の成分およびその含量を分析し、また分離精製するための方法として、クロマトグラフィーはもっとも有効な手段である。これは、カラムあるいはキャピラリーと呼ばれる管の中で空間的に固定された多孔質固体（固定相）と、その隙間を移動する流体（移動相）に対する物質固有の分配比（吸着平衡とも理解される）を利用して、異なる物質を分離するものである。その代表的なものとしてガスクロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーがある。前者は移動相として気体を用いるものである。
しかし、分離対象が気相に混じって移動するためには、一定以上の蒸気圧がなければならず、そのため分子量が低く、また電荷を持たない比較的限られた分析対象にしか応用できない。一方、液体クロマトグラフィーは移動相として液体を用いるものであり、適切な移動相を選べば、大抵の物質に適用できる。その半面、液体の粘度は一般に高いために、長いカラムやキャピラリーによって良好な分離を確保しようとしても、粘性抵抗の増加による限界がある。
この両者の欠点を克服できる技術として発明されたものが超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）である。これは、超臨界、あるいは亜臨界状態にある流体が、気体に比べてはるかに他の化合物をよく溶解し、液体に比べて低い粘度、高い拡散速度を有するという特徴を利用したものである。超臨界流体として二酸化炭素を用いるＳＦＣが安全性や装置上の理由から一般的に採用されており、徐々に利用が拡がりつつある。この他にも電気的な引力を利用するクロマトグラフィー、紙や、粉体を薄い層に固結した、いわゆる薄層クロマトグラフィー（液体クロマトグラフィーの変法）などがあるが、応用範囲はあまり広くない。
液体クロマトグラフィーにおいては、極性の高い固定相と低い移動相の組み合わせを用いる順相クロマトグラフィー、この逆の極性である逆相クロマトグラフィーが代表的なモードである。最近はさらに両相とも極性であるＨＩＬＩＣといったものも注目されている。その他、金属イオンと配位子の相互作用を利用する配位子交換クロマトグラフィー、生化学的相互作用を利用するアフィニティークロマトグラフィーなど、特異的な相互作用に基づくものも知られている。概してその分離のメカニズムおよび特徴が明らかになっており、技術の進歩は分離の効率をよくするための粒子形状の改良が主になっている。
これに対して、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）は、その特徴が順相クロマトグラフィーに似ているといわれている。しかし、その特徴、メカニズムは未だよく解っていない点が多く、徐々に逆相系に移行することにより広い極性範囲の分離対象をカバーする考え方もある。
ＳＦＣに用いられる固定相としては、例えば非特許文献１に紹介されるように、シリカゲルあるいはその表面を様々な原子団で修飾したものである。
修飾基としては、様々な鎖長の飽和アルキル鎖を含むもの、ひとつあるいは二つのベンゼン環、縮合多環芳香族炭化水素基をアルキル鎖又は、アミド結合、エーテル結合を含むアルキル鎖でつないだもの、ハロゲン置換ベンゼン環を特徴とするもの、ハロゲン化アルキル基をつないだもの、２，３−ジヒドロキシプロピル基、ＣＮ基、ＮＨ２基などの極性基をつないだもの、高分子修飾基として架橋ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどがある。また、グラファイト構造を持った炭素も特徴ある固定相である。これらの中で、特にＳＦＣにおいてよく用いられるものは、２−エチルピリジンと呼ばれる、（２−ピリジル）エチル基を結合したものであり、普通の固定相ではテーリングして幅広いピークを与える塩基性化合物もシャープなピークとなって溶出するだけでなく、酸性化合物も適度に保持可能であるため、好んで用いられる。
しかしながら、やはり非特許文献２に指摘されるように、様々な化合物に対する保持の傾向が相似的であり、特徴の差がない固定相も少なくない。こうした中にあって、本発明者らは、構造のよく似た分子を識別できることが、求められている要件のひとつであるとの認識に立ち、鋭意、ＳＦＣに用いることができる固定相の開発を進めてきた。
これまでにＳＦＣ用の固定相として用いられてきたものの多くは、シリカゲルあるいはその表面を様々な低分子化合物で修飾したものが大多数であった。一方で、シリカゲル表面を高分子で修飾した固定相の報告例もある。たとえば、特許文献１は、主鎖の繰り返し単位に芳香環と双極性原子団を有するポリマーを固定相としており、様々な化合物の分離に有効であるだけでなく、良好な分子形状認識性を有することが知られている。しかし、前述の２−エチルピリジンカラムと異なり、塩基性物質の分析時にテーリングし、幅広いピークを与えるといった問題点があった。
また、これらの固定相は上記ポリマーを粒子状あるいはモノリス状の担体に担持させて調製したものである。そのため、本来これを溶かしうる溶媒あるいはそれを含む混合溶媒を展開溶媒とすると、一部あるいは全部が溶解し、カラムとしての機能を損ねる場合がある。
一方、これまでに、ポリビニルピロリドンをクロマトグラフィー用途に利用する例が知られている。
具体的には、架橋によって溶媒に溶けなくしたポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）（ＰＶＰ）の粒子をカラムに充填してクロマトグラフィー固定相として用いた例が存在する（例えば、非特許文献２）。
また、硬質のゲルであるシリカゲルの表面にＰＶＰを結合することも試みられている。
例えば、タンパクや微生物の分離においてシリカゲルを固定相とすると、いわゆる変性により目的物の性質が変わったり、回収率が著しく低くなることがあるため、これを防ぐために表面を親水性のポリマーで被覆し、シリカゲルの影響を遮蔽することを意図したものがある（非特許文献３）。
また、ＰＶＰを結合する方法についてはいくつかの試みがある。例えばＰＶＰをシリカゲル上にコーティングしたのち、γ−線によって架橋処理することが報告されている（非特許文献２）。また別の報告ではシリカゲルに、ビニル基やメタクリロキシ基を持つシランカップリング剤を結合した上で、これにビニルピロリドンモノマーを共重合させる方法が開示されている（非特許文献４）。しかし、これらは一般にピークがブロードであるためか、ＨＰＬＣであまり利用されていない。
特願２０１２−１６２５１８号公報
C. West 他、J. Chromatogr. A, 1203 (2008) 105 Kohler, Chromatographia, 21 (1986) 573 I. Krasilnikov 他、J. Chromatogr., 446 (1988) 211 C. R. Kou 他、, Fresenius J. Anal. Chem., 336 (1990) 409
本発明は、上記のような問題を解決するものであり、良好な分子識別能を有する超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格を有するポリマーが担持されている担体から構成される固定相が、超臨界流体クロマトグラフィーにおいて良好な分子識別能が発現されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格が含まれるポリマーが担持されている担体から構成される、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
［２］ 以下の式（ＩＩ）で示される構造を有する、［１］記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
（式ＩＩ中、Ｗ’は、単結合または分岐鎖を有してもよい炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｘは、アミド基、エステル基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エーテル基、スルホキシド基、スルホン基、スルフィド基、またはリン酸エステル基であり、Ｙは、炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｖは担体表面と結合したエーテル基、炭素数１〜５のアルコキシ基または炭素数１〜３のアルキル基である。ｐは１〜１０であり、ｑは１０〜３００）
［３］ 球状粒子状であることを特徴とする、［１］または［２］に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
［４］ 平均粒径が０．１μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
［５］ モノリス状であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
［６］ ［１］〜［５］のいずれかに記載の固定相と、超臨界流体を含む移動相とを用いて目的物質を分離する工程を含む、目的物質の分離方法。
［７］ １−ビニル−２−ピロリドンと、重合性官能基が結合している担体とを共重合させる工程を含む、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
［８］ 前記重合性官能基が、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基またはω位に二重結合を有する炭素数４〜１２のアルケニル基である、［７］に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
［９］ 重合性官能基が結合している担体は、下記式（Ｉ）で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることにより得られる表面修飾シリカゲルである、［７］または［８］に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
（式（Ｉ）中、Ｗは、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基またはω位に二重結合を有する炭素数４〜１２のアルケニル基であり、Ｘは、アミド基、エステル基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エーテル基、スルホキシド基、スルホン基、スルフィド基、またはリン酸エステル基であり、Ｙは、炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｚは炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（Ｉ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基である。ｎは１〜３の整数である。）
［１０］ 前記Ｗがビニル基であり、Ｘがアミド基または炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基であり、Ｙが炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｒが独立してメチル基、エチル基またはプロピル基であり、Ｚが炭素数１〜５のアルコキシ基、ハロゲン、炭素数１〜２０のアルキルメルカプチル基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基、アリル基または２−メチル−２−プロペニル基である、［９］に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
［１１］ １−ビニル−２−ピロリドンを、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤の存在下でラジカル重合させてポリマーを得る工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
［１２］ 末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤が下記式（ＩＩＩ）で示される化合物である、［１１］に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
（式（ＩＩＩ）中、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（ＩＩＩ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基である。Ｙは炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｔは連鎖移動性官能基である。ｎは１〜３の整数である。）
本発明によれば、良好な分子識別能を有する、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相を提供することができる。
フェニルフェノール（オルト、メタ、パラの混合物）の分離を、実施例１の固定相を用いて、ＨＰＬＣにより行った結果（ａ）と、ＳＦＣにより行った結果（ｂ）を示す図である。 ヒドロコルチゾンとプレドニゾロンの分離を、実施例１の固定相を用いて、ＨＰＬＣにより行った結果（ａ）と、ＳＦＣにより行った結果（ｂ）を示す図である。 アセチルフェナントレン３種とアセチルアントラセン２種の異性体の分離を、実施例１の固定相を用いて、ＨＰＬＣにより行った結果（ａ）と、ＳＦＣにより行った結果（ｂ）を示す図である。 アセチルフェナントレンと、アセチルアントラセンの分離を市販品の固定相を用いて行った結果（ａ）と、実施例１の固定相を用いて行った結果（ｂ）を示す図である。 ヒドロコルチゾンとプレドニゾロンの分離を、市販品の固定相を用いて行った結果（ａ）と、実施例１の固定相を用いて行った結果（ｂ）を示す図である。 ベータ−ブロッカーと総称される医薬品４種、アルプレノロール、プロプラノロール、アテノロール、ピンドロールの分離を、実施例４の固定相（イニファータ法）を用いて行った結果（ａ）、実施例５の固定相（メタクリルエステル共重合法）を用いて行った結果（ｂ）、実施例１の固定相を用いて行った結果（ｃ）を示す図である。
本発明の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相は、主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格が含まれるポリマーが担持している担体を含むものである。
なお、本発明における固定相とは、クロマトグラフィー法において、分析用具（カラムまたはキャピラリー）の内部に固定され、これと接触しながら移動する流体との間で分離対象物質を分配し、分離に導く材料を意味するが、これが粒子である場合には、該粒子が充填されることによって形成された集合体を指すこともあり、またその個別の粒子を指すこともある。
ピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に有するとは、以下の式で示される２−ピロリドン骨格がポリマー分子の主鎖に結合していることをいう。なお、本発明において、ポリマー分子中の１−ビニル−２−ピロリドンに由来する単位の割合は、８０モル％以上であることが、固定相として性能を確保する観点から好ましい。
（式中、アスタリスクはポリマーの主鎖と結合する位置を示す。）
本発明の固定相では、その安定性、分離性能の見地から担体にポリマーが担持されており、ポリマーとの間に化学結合を形成させることがより好ましい態様である。具体的には、例えば以下の製造方法を例示することができる。
以下の製造方法のうち、（１）〜（７）の製造方法によれば、ポリマーと担体との間に化学結合（共有結合）が生じるものである。一方、（８）と（９）の製造方法によれば、担体の表面上でポリマー同士が架橋して存在することにより、担体表面からポリマーが溶出したりすることがない。
超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相において、担体との物理的結合を利用してポリマーをコーティングすることは可能であるが、そのような場合には溶媒によってポリマーが溶出することもあるので、好ましい方法とはいえない。
（１）１−ビニル−２−ピロリドンと、重合性官能基が結合している担体とをラジカル共重合させる工程を含む製造方法。
（２）１−ビニル−２−ピロリドンを、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤の存在下でラジカル重合させてポリマーを得る工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
（３）担体表面にドーマント種となる共有結合を導入し、１−ビニル−２−ピロリドンを用いて担体表面からリビングラジカル重合を行うことにより、担体表面に２−ピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入する工程を含む製造方法。
（４）重合性二重結合を有するシランカップリング剤と、１−ビニル−２−ピロリドンとを共重合させる工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
（５）担体表面に連鎖移動性官能基を導入し、１−ビニル−２−ピロリドンをラジカル重合する工程を含む製造方法。
（６）開始末端に反応性シリル基を有するアニオン開始剤と１−ビニル−２−ピロリドンをアニオン重合させて、ポリマーを得る工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
（７）アニオン開始剤と１−ビニル−２−ピロリドンをアニオン重合後、シランカップリング剤を含む停止剤を作用させて得られる工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
（８）１−ビニル−２−ピロリドンと、架橋剤と、開始剤とを含む組成物と、担体とを混合して、架橋反応を行わせる工程を含む製造方法。
（９）１−ビニル−２−ピロリドンを重合して得たポリ（ビニルピロリドン）を担体の表面にコーティングし、γ線あるいは電子線の照射により、架橋反応を行わせる工程を含む製造方法。
いずれの方法でも重合時の重合温度、重合溶媒、添加剤等の調整により、生成ポリマーの立体規則性を制御することも可能である。
（１）の製造方法について説明する。
本発明の固定相の（１）の製造方法に用いられる重合性官能基が結合している担体は、以下の方法により作製することができる。
担体に結合している重合性官能基として、ラジカル重合性官能基を挙げることができ、例えば、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、またはω位に二重結合を有する炭素数４〜１２のアルケニル基を挙げることができる。この中でも、ビニル基、アリル基またはイソプロペニル基が好ましい。
また、担体としては、多孔質有機担体又は多孔質無機担体が挙げられ、好ましくは多孔質無機担体を挙げることができる。多孔質有機担体として適当なものは、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリレート等から選択される高分子物質であり、多孔質無機担体として適当なものは、シリカゲル、アルミナ、ジルコニア、チタニア、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、ケイ酸塩、ヒドロキシアパタイトなどである。好ましい担体はシリカゲル、アルミナ、またはガラスである。
担体としてシリカゲルを用いる場合には、シリカゲルが有するシラノール基を介して、上記の重合性官能基が担体と化学結合している。
シリカゲル以外の担体を用いる場合には、担体の表面処理を行うことにより、担体自体への分離対象物質の過剰な吸着を抑制できるとともに、表面処理で導入された基を介して重合性官能基と結合させることができる。表面処理剤としては、アミノプロピルシランのようなシランカップリング剤や、チタネート系・アルミネート系カップリング剤を挙げることができる。
上記のような、重合性官能基が結合している担体は、例えば下記式（Ｉ）で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることにより得られる。
（式（Ｉ）中、Ｗは、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、またはω位に二重結合を有する炭素数４〜１２のアルケニル基であり、Ｘは、アミド基、エステル基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エーテル基、スルホキシド基、スルホン基、スルフィド基、またはリン酸エステル基であり、Ｙは、炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｚは式（Ｉ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基である。ｎは１〜３の整数である。）
上記式（Ｉ）中、Ｗは、ビニル基、アリル基、またはイソプロペニル基であることが好ましい。
上記式（Ｉ）中、Ｘは、Ｗと末端のＺ基とのリンカーの一部であり、アミド基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エステル基、フェニレン基であることが好ましい。
上記式（Ｉ）のＹは、炭素数１〜５のアルキレンであることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基のいずれかであることがより好ましい。
上記式（Ｉ）のＲは、メチル基、またはエチル基であることが好ましい。
なお、式（Ｉ）中、Ｘが「アミド基」である場合、−Ｎ−ＣＯ−Ｙと、−ＣＯ−Ｎ−Ｙの態様を含み、Ｘが「Ｎ−アルキルアミド基」である場合、−ＮＲ−ＣＯ−Ｙと、−ＣＯ−ＮＲ−Ｙの態様を含む。
上記式（Ｉ）において、Ｗがビニル基で、Ｘがアミド基またはＮ−アルキルアミド基である態様と、Ｗがイソプロペニル基で、Ｘがアミド基またはＮ−アルキルアミド基である態様が、合成が容易な点で好ましい。
なお、式（Ｉ）のＸが「アミド基」の場合、−ＣＯ−ＮＨ−の構造において、窒素にＹが結合し、「Ｎ−アルキルアミド基」の場合、−ＣＯ−ＮＲ−（Ｒは炭素数１〜３のアルキル基）の構造において、窒素にＹが結合している態様が好ましい。
上記式（Ｉ）中のＺは、脱離基であり、式（Ｉ）中のケイ素原子と、担体を構成する酸素のような原子との間に結合を作らせ得るものであれば、いかなる原子団であってもよい。取り扱いのしやすさと反応性のバランスが良いために、一般的に用いられるものは、炭素数１〜５のアルコキシ基、特に好ましくはメトキシ基あるいはエトキシ基を挙げることができ、ハロゲン（塩素、臭素またはヨウ素）、炭素数１〜２０のアルキルメルカプチル基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基のような窒素含有基、アリル基または２−メチル−２−プロペニル基を挙げることができる。脱離基の種類によって反応条件（触媒添加も含めて）を調整できる。
上記式（Ｉ）で表される化合物は、上記式（Ｉ）のＷで表される構造を有する化合物と、上記式（Ｉ）の−Ｙ−ＳｉＲ３−ｎＺｎの構造を有する化合物とを反応させることにより得ることができる。
それらの化合物同士の反応により、上記式（Ｉ）の「−Ｘ−」が生じる。
Ｗで表される構造を有する化合物としては、ビニル基の１−位に結合する水素が、炭素数が１〜１２のアルキル基で置換されていてもよいα−アルキルアクリル酸や、ビニル基の１−位に結合する水素が、炭素数が１〜１２のアルキル基で置換されていてもよいα−アルキルアクリル酸のハロゲン化物を挙げることができる。
上記式（Ｉ）の−Ｙ−ＳｉＲ３−ｎＺｎの構造を有する化合物としては、上記で説明したＸの前駆体である基を有し、脱離基として炭素数が１〜５のアルコキシ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。具体的には、アミノアルキルアルコキシシランやヒドロキシアルキルアルコキシシランを挙げることができる。
本発明で用いる重合性官能基が結合している担体は、上記式（Ｉ）で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることによって得られる表面修飾シリカゲルであることが好ましい。
上記式（Ｉ）で表される化合物を用いることとは別に、まず最初に上記式（Ｉ）の−Ｙ−ＳｉＲ３−ｎＺｎの構造を有する化合物（例えばアミノアルキルアルコキシシランやヒドロキシアルキルアルコキシシラン）と、担体としてのシリカゲルとをカップリングした後、Ｗで表される構造を有する化合物（例えばビニル基に結合する炭素の水素がアルキルで置換されてもよいα−（アルキル）アクリル酸）を用いて反応を起こさせることもできる。
本発明の固定相は、上記で説明した（１）の製造方法で製造する場合、１−ビニル−２−ピロリドンと、重合性官能基が結合している担体とを共重合させて得られるものである。
その共重合の態様としては、１−ビニル−２−ピロリドンのビニル基と、重合性官能基の両方について共重合を起こさせることが挙げられ、その際の反応条件は公知の方法を用いることができる。
上記で説明した原料や製造方法を用いて得られる本発明の固定相は、以下の構造を有する。
（式ＩＩ中、Ｗ’は、式（Ｉ）のＷに由来し、付加重合により生成する基であり、Ｘは、アミド基、エステル基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エーテル基、スルホキシド基、スルホン基、スルフィド基、フェニレン基、またはリン酸エステル基であり、Ｙは、炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｖは担体表面と結合したエーテル基、もしくは未反応の上記式（Ｉ）で示されるＺ基、またはＲ基である。）
上記式（ＩＩ）において、Ｗ’の具体例としては、単結合または分岐鎖を有してもよい炭素数１〜１０のアルキレン基を挙げることができる。好ましくは、単結合、メチレン基、エチレン基またはトリメチレン基を挙げることができる。
式（ＩＩ）中のＸ及びＹの好ましい基は、上記式（Ｉ）と同様のものを採用できる。
式（ＩＩ）中、ｐは１〜１０であり、ｑは１０〜３００程度を挙げることができ、ｑは好ましくは１５〜２５０、更に好ましくは２０〜２００である。なお、ｐ、ｑ、いずれも２以上の場合、式（ＩＩ）では、ピロリドン残基を有する単位と担体との結合を有する単位とは、それぞれが連続するブロック共重合体のように見えるが、式（ＩＩ）は、それぞれの残基の数のみを表現しているのであり、実際にはランダムな共重合体であろうと推定される。
式（ＩＩ）のＶについて、上記式（Ｉ）で示される化合物において、ｎ＝１の場合、Ｖ＝Ｒであり、ｎ＝２の場合、全てのＶの数に対し、Ｒ基の割合は５０％であり、未反応のＺ基またはＺ基が反応によって担体表面に置き換わった構造がそれぞれ０〜５０％および５０％〜０％であり、ｎ＝３の場合、未反応のＺ基またはＺ基が反応によって担体表面に置き換わった構造がそれぞれ０〜１００％および１００％〜０％である。
次に、本発明の固定相を得るための（２）の製造方法について説明する。
（２）の製造方法は、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤の存在下でラジカル重合させる工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法である。
（２）の製造方法で用いる、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤として、以下の式（ＩＩＩ）で示される化合物を例示することができる。本発明における反応性シリル基とは、下記の式（ＩＩＩ）のＺで示されるような脱離基が結合しているシリル基のことであり、ケイ素を含む金属水酸化物に対して縮合によりＳｉ−Ｏ−Ｍの形の結合を形成する性質のことである。以下の他の製法において用いる化合物においても同様である。
（式（ＩＩＩ）中、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（ＩＩＩ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基である。Ｙは炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｔは連鎖移動性官能基である。ｎは１〜３の整数である。）
式（ＩＩＩ）中、Ｒは、メチル基、エチル基、またはプロピル基であることが好ましい。Ｚは、脱離基であり、式（ＩＩＩ）中のケイ素原子とシリカゲルを構成する酸素との間に結合を作らせ得るものであれば、いかなる原子団であってもよい。
取り扱いのしやすさと反応性のバランスが良いために、脱離基として一般的に用いられるものは、炭素数１〜５のアルコキシ基であり、その中でもメトキシ基あるいはエトキシ基を例示でき、ハロゲン（塩素、臭素またはヨウ素）、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基のような窒素含有基、またアリル基やイソプロペニル基も用いることができ、脱離基の種類によって反応条件（触媒添加も含めて）を調整できる。Ｙは、炭素数１〜１０のアルキレン基であることがより好ましい。Ｔは連鎖移動性官能基である。連鎖移動性官能基とは重合反応において、生長活性種の移動および再開始反応を伴う連鎖移動反応が活発に起こる官能基のことである。連鎖移動性官能基があることで、生成ポリマーの分子量や末端構造の制御がある程度可能となる。連鎖移動性官能基の具体例としては、ハロゲン化された炭素数１〜１２のアルキル基、末端にチオールを有する炭素数１〜１２のアルキル基またはジスルフィド基を基内に有する炭素数１〜１２のアルキル基が好ましい。
前記ハロゲン化された炭素数１〜１２のアルキル基のハロゲンは、塩素、臭素またはヨウ素を挙げることができ、そのアルキル基としては、炭素数１〜３のアルキル基を挙げることができる。
このような連鎖移動剤の存在下、少量のラジカル発生剤を触媒に用い、１−ビニル−２−ピロリドンのラジカル重合を行うことで、下記式（ＩＶ）で示される構造を有する化合物を得ることができる。このときに、連鎖移動剤とモノマーのモル比からある程度の分子量の制御が可能となる。ラジカル発生剤は、重合反応に用いる公知のものを用いることができ、その具体例としては、アゾ化合物や過酸化物を挙げることができる。
（式ＩＶ中、Ｔ’は式（ＩＩＩ）のＴに由来し、連鎖移動反応により生成する基である。Ｙ、Ｒ、Ｚは式（ＩＩＩ）のものと同じものを示し、ｑは２〜３００の整数である。）
式（ＩＶ）において、Ｔ’は、Ｔが末端にハロゲンが結合している炭素数１〜１２のアルキル基の場合、そのハロゲンが置換された炭素数１〜１２のアルキレン残基であり、Ｔが末端にチオールを有する炭素数１〜１２のアルキル基またはジスルフィド基を基内に有する炭素数１〜１２のアルキル基である場合はチオエーテルである。
本発明の固定相の（２）の製造方法で用いる担体は、（１）の製造方法で用いる担体と同じものを用いることができる。
式（ＩＶ）で示される化合物と、担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法ついては、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
式（ＩＶ）で示される化合物と、担体とを結合させて得られる固定相は以下の構造を有していると推察される。
（式Ｖ中、Ｔ’は式ＩＩＩのＴに由来し、連鎖移動反応により生成する基である。ｑは２〜３００の整数である。Ｖは担体表面と結合したエーテル基、もしくは未反応の上記式（ＩＩＩ）で示されるＺ基、またはＲ基である。）
式（Ｖ）のＶについて、上記式（ＩＩＩ）で示される化合物において、ｎ＝１の場合、Ｖ＝Ｒであり、ｎ＝２の場合、全てのＶの数に対し、Ｒ基の割合は５０％であり、未反応のＺ基またはＺ基が反応によって担体表面に置き換わった構造がそれぞれ０〜５０％および５０％〜０％であり、ｎ＝３の場合、未反応のＺ基またはＺ基が反応によって担体表面に置き換わった構造がそれぞれ０〜１００％および１００％〜０％である。
次に（３）の製造方法について説明する。
担体表面にドーマント種となる安定な共有結合を導入し、表面からリビングラジカル重合を行うことにより、シリカゲルのような担体表面にピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入することが可能である。
この手法では、シリカゲルのような担体表面上に高密度にピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入でき、高度に配向可能なブラシ状ポリマーを得ることが可能である。
上記「ドーマント種となる安定な共有結合の導入とリビングラジカル重合」に関して、よく用いられている例を以下の（i）〜（iii）に示す。
(i) シリカゲルのような担体表面に、銅・鉄・ルテニウムなどの遷移金属触媒によって活性化可能な炭素−ハロゲン結合を導入し、一電子酸化還元機構によりハロゲンの引き抜きと引き戻しを可逆的に行うことで、１−ビニル−２−ピロリドンの重合をリビング的に進行させる。この技術を用いることでシリカゲルのような担体表面上に、高密度にピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入することが可能である。
(ii) シリカゲルのような担体表面に、例えばアルコキシアミンを導入し、そのアルコキシアミンの炭素−酸素結合が熱的に解離して炭素ラジカルとニトロキシドを生成すると、Ｎ−メチル−２−ピロリドンの重合が進行するとともに生長炭素ラジカルはニトロキシドにより可逆的にすばやくキャッピングされることで再びドーマント種に戻り、重合反応が制御される。この技術を用いることでシリカゲルのような担体表面上に、高密度にピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入することが可能である。
（iii） シリカゲルのような担体表面に、チオカルボニル化合物やヨウ素化合物を導入した場合、ポリマー末端間でのラジカル種とドーマント種との交換反応による可逆的な連鎖移動が速く起こることで、すべてのポリマー鎖が同じように生長する機会が与えられて、分子量の制御が可能となる。この技術を用いることでシリカゲルのような担体表面上に、高密度にピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入することが可能である。
上記（i）〜（iii）のいずれにおいても、担体については、シリカゲルの他には上記（１）や（２）の製造方法で用いられるものと同じものを用いることができる。
次に（４）の製造方法について説明する。
この製造方法は、重合性二重結合を有するシランカップリング剤と、Ｎ−メチル−２−ピロリドンとを共重合させる工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む方法である。
重合性二重結合を有するシランカップリング剤としては、例えば以下の式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を挙げることができる。
（式（Ｉ）中、Ｗは、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、またはω位に二重結合を有する炭素数４〜１２のアルケニル基であり、Ｘは、アミド基、エステル基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エーテル基、スルホキシド基、スルホン基またはリン酸エステル基であり、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（Ｉ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基であり、Ｙは、炭素数１〜３０のアルキレン基である。ｎは１〜３の整数である。）
上記式（Ｉ）中のＹは、炭素数１〜５のアルキレンであることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基のいずれかであることがより好ましい。
Ｒはメチル基、あるいはエチル基であることが好ましい。
Ｚは脱離基であり、式（Ｉ）中のケイ素原子と、担体が例えばシリカゲルである場合、そのシリカゲルを構成する酸素との間に結合を作らせ得るものであれば、いかなる原子団であってもよい。担体がシリカゲルでない場合でも、担体を構成する原子との間に結合を作らせ得るものである。
取り扱いのしやすさと反応性のバランスが良いために、脱離基として一般的に用いられるものは、炭素数１〜５のアルコキシ基であり、その中でもメトキシ基あるいはエトキシ基を例示でき、ハロゲン（塩素、臭素またはヨウ素）、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基のような窒素含有基、またアリル基やイソプロペニル基）も用いることができ、脱離基の種類によって反応条件（触媒添加も含めて）を調整できる。
上記（４）の製造方法においても、担体については、シリカゲルの他には上記（１）や（２）の製造方法で用いるものと同じものを用いることができ、１−ビニル−２−ピロリドンについても、（１）や（２）の製造方法と同じものを用いることができる。
この製造方法では、ポリマー合成の際に適当な連鎖移動剤や、上述のリビングラジカル重合法を用いることで、分子量の制御も可能である。得られたポリマーと担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法については、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
次に（５）の方法について説明する。
この製造方法は、担体表面に連鎖移動性官能基を導入し、１−ビニル−２−ピロリドンをラジカル重合する工程を含む製造方法である。
上記のような連鎖移動性官能基が結合している担体は、例えば下記式（ＶＩ）で表される化合物と、担体としてシリカゲルを用いる場合はシリカゲルとをシランカップリングすることにより得られる。
（式（ＶＩ）中、Ｔは連鎖移動性官能基であり、Ｙは炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（ＶＩ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基である。ｎは１〜３の整数である。）
式（ＶＩ）中、Ｒは、メチル基、エチル基、あるいはプロピル基であることが好ましい。Ｚは、脱離基であり、式（ＶＩ）中のケイ素原子と、担体がシリカゲルである場合、シリカゲルを構成する酸素との間に結合を作らせ得るものであれば、いかなる原子団であってもよい。担体がシリカゲルでない場合でも、担体を構成する原子との間に結合を作らせ得るものである。
Ｔについては、（２）と同じものを、ＲやＺについても、（１）や（２）や（４）で用いたものと同じものを好ましく用いることができる。
本発明で用いる連鎖移動性官能基が結合している担体は、上記式（ＶＩ）で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることによって得られる表面修飾シリカゲルであることが好ましい。
表面に連鎖移動性官能基が導入された（化学結合した）担体の存在下、少量のラジカル発生剤を触媒として用い、Ｎ−メチル−２−ピロリドンのラジカル重合を行うことで、担体表面にポリマーを固定化することが可能となる。上記（５）の製造方法においても、担体については、シリカゲルの他には上記（１）や（２）の製造方法で用いるものと同じものを用いることができる。また、ラジカル発生剤についても、（２）の製造方法で用いるものと同じものを用いることができる。
次に（６）の方法について説明する。
この製造方法は、開始末端に反応性シリル基を有するアニオン開始剤と１−ビニル−２−ピロリドンをアニオン重合させてポリマーを得る工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法である。
上記のような開始末端に反応性シリル基を有するアニオン開始剤は、例えば下記式（ＶＩＩ）で表される化合物と、担体としてシリカゲルを用いる場合、そのシリカゲルとをシランカップリングすることにより得られる。
（式（ＶＩＩ）中、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（ＶＩＩ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基であり、Ｙは、任意の水素が芳香環を有する基で置換されもよい炭素数１〜３０の分岐または直鎖状のアルキレン基である。Ｍはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属である。ｎは１〜３の整数である。）
式（ＶＩＩ）中、Ｒはメチル基、エチル基またはプロピル基であることが好ましく、Ｙ、Ｚは前記式（Ｉ）と同じものを好ましく挙げることができ、Ｍはリチウム、ナトリウム、カリウム、またはマグネシウムを好ましく挙げることができる。
Ｙについて、任意の水素が置換されてもよい芳香環を含む基としては、例えば１つまたは２つのフェニル基を有する炭素数４〜２０のアルキル基を挙げることができ、より具体的には１，１−ジフェニルヘキシル基などを挙げることができる。
このようなアニオン開始剤の存在下、公知の方法により末端に反応性シリル基を有するピロリドン骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを合成できる。
ただし、重合時の副反応により開始末端に直接シランカップリング剤を導入することが難しい場合、保護基により開始末端を保護した誘導体を合成し、重合後に脱保護し、定量的にシランカップリング剤へと変換することによっても得ることができる。このようにして得られたポリマーと担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法については、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
次に（７）の方法について説明する。
この製造方法は、アニオン開始剤と１−ビニル−２−ピロリドンをアニオン重合させ、反応性シリル基を有する停止剤を作用させてポリマーを得る工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法である。停止末端に直接シランカップリング剤を導入することが難しい場合、保護基により保護した誘導体を用いて停止後に脱保護し、定量的にシランカップリング剤へと変換することによっても得ることができる。
アニオン開始剤を用いた重合は、公知の方法を用いることができる。また、反応性シリル基を有する停止剤は、例えば下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
（式（ＶＩＩＩ）中、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（ＶＩＩＩ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基であり、Ｙは、任意の水素が芳香環を含む基で置換されていてもよい炭素数１〜３０の分岐または直鎖状のアルキレン基である。Ｚ’は、生長アニオン末端と停止剤との反応で脱離する基であり、ｎは１〜３の整数である。）
Ｚの具体例としては、前記式（Ｉ）で具体例として挙げられているものを好ましく挙げることができる。
Ｚ’の具体例としては、ハロゲン（塩素、臭素、またはヨウ素）、炭素数１〜５のアルコキシ基、その中でも好ましくはメトキシ基あるいはエトキシ基、アルキルメルカプチル基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基のような窒素含有基、アリル基または２−メチル−２−プロペニル基を挙げることができる。脱離基の種類によって反応条件（触媒添加も含めて）を調整できる。
Ｙについて、任意の水素が置換されてもよい芳香環を含む基としては、例えば１つまたは２つのフェニル基を有する炭素数４〜２０のアルキル基を挙げることができ、より具体的には１，１−ジフェニルヘキシル基などを挙げることができる。
このようにして得られたポリマーと担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法については、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
次に（８）の製造方法について説明する。
この製造方法は、１−ビニル−２−ピロリドンと、架橋剤と、開始剤とを含む組成物と、担体とを混合して、架橋反応を行わせる工程を含む。
この製造方法では、該モノマーと架橋剤とを共重合することによって不溶性の重合物とするものである。具体的には、１−ビニル−２−ピロリドンと、架橋剤として例えばジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレートなどを前記モノマーに対し０．０１−１当量、適量のラジカル開始剤、必要に応じて溶媒を混じたものを該担体に吸収させ、開始剤が重合を開始する条件におくことができる。
また、ラジカル開始剤としては、一般的なラジカル重合反応に用いる公知のものを使用でき、その具体例としては、アゾ化合物や過酸化物を挙げることができる。
次に（９）の製造方法について説明する。
（９）の製造方法の詳細については、非特許文献２に記載されている。
まずポリ（ビニルピロリドン）を溶解した溶液に担体を分散させ、溶媒を除去する。溶媒除去後、ポリ（ビニルピロリドン）が表面にコーティングされた担体に熱を加える。その際の温度としては、５０℃〜１８０℃程度を挙げることができる。熱を加えることにより、担体上にポリ（ビニルピロリドン）を固定化し、その後、γ線や電子線を照射して、架橋反応を起こさせて、担体とポリ（ビニルピロリドン）を結合させる。
上記（１）〜（９）のいずれの方法により得られた固定相も超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相として優れた性能を有する。
上記の操作を経て得られる、本発明の固定相の担体に担持された、主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格が含まれるポリマーの重量平均分子量は、１，０００〜５，０００，０００であることが好ましい。なお、本発明でいうポリマーの重量平均分子量は、例えば上記式（ＩＩ）や（ＩＶ）で示される構造の場合、主鎖の繰り返し単位である−（ＣＨ２−ＣＡＢ）ｎ−の部位のものである。
上記重量平均分子量は、ポリマーの溶媒への溶解性、ポリマーを担体に担持させる際の粒子の凝集の防止、移動相溶媒への溶解の抑制、担体に化学結合する際の結合量の維持、等の観点から、上記範囲が好ましい。最適点はポリマーの種類によって異なる。
ただし、本発明の固定相の製造方法（１）においては、１−ビニル−２−ピロリドンの重合とシリカゲルへの固定化が同時に起こるため、重合溶液の上澄みから重量平均分子量を見積もる。
製造方法（２）、（４）、（６）、（７）においては、主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格を含むポリマーを担体に結合させる前に、そのポリマーの重量平均分子量を測定する。
重量平均分子量はポリスチレンを標準物質としたゲルパーミエーションクロマトグラフィー法（ＧＰＣ）方法により測定できる。
本発明の固定相のうち、製造方法（１）〜（７）を用いて得られるものでは、主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格が含まれるポリマーが担体表面に共有結合しているので、本来これらポリマーを溶かしうる溶媒あるいはそれを含む混合溶媒を展開溶媒に用いても、溶解することなく、固定相としての機能を損ねることはない。
また、本発明の固定相のうち、製造方法（８）、（９）を用いて得られるものも、担体上でポリマー同士が架橋していることにより、本来これらポリマーを溶かしうる溶媒あるいはそれを含む混合溶媒を展開溶媒に用いても、溶解することがない。
本発明の固定相の比表面積は用いる担体の比表面積に相当するため、所望の比表面積の担体を選択すればよい。担体が、例えばシリカゲルである場合、適当な製品を選ぶことで調整することができる。一般的に、ポリマーを担体に担持させる態様では、担持の前後で比表面積に誤差以上の変化はないため、固定相の比表面積は、用いる担体の比表面積と同一とみなすことができる。
本発明で用いることができる、このような担体の平均粒径は、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５０μｍであり、平均孔径は、通常１０〜１００００Å、好ましくは５０〜１０００Åである。
また、担体の比表面積は、通常５〜１０００ｍ２／ｇ、好ましくは１０〜５００ｍ２／ｇである。一般的に、ポリマーを担体に担持させる場合であれば、担持の前後で比表面積に誤差以上の変化はないため、固定相の平均粒径は、用いる担体の平均粒径と同一とみなすことができる。つまり、本発明の固定相が粒子状である場合には、その平均粒径は、０．１μｍ〜１０００μｍである態様を挙げることができ、好ましくは１〜５０μｍである。
担体に担持された該ポリマーの平均厚み（担体ｇ当たり担持量／担体比表面積）は通常２／１０５〜２／１０７（μｍ）であり、４／１０５〜５／１０７（μｍ）が好ましい。上記範囲であれば、ピークがシャープになる傾向があり好ましい。
このように、ポリマーが担体上に担持された固定相において、固定相１００質量部中に含まれるポリマーの質量部の割合（％）は、好ましくは１〜５０質量％であり、より好ましくは３〜３０質量％であり、さらに好ましくは５〜２０質量％である。このような割合とすることで、ポリマーの吸着能力を適切に発現させながら、徒に保持を強くすることやピークを幅広にすることを避けることができ、好ましい。
なお、固定相１００質量部中に含まれるポリマーの質量部の割合（％）は、元素分析により測定することが可能であり、ポリマーが担持する前の担体の炭素含有量と、得られた固定相の炭素含有量を測定結果に基づき、ポリマーが担持する前の担体に含まれる炭素以外の炭素は、全てポリマーに由来するものとして、固定相中のポリマーの質量部の割合を算出する。
本発明の固定相が粒子状である場合の平均粒径は、球形であればその直径を指し、不定形粒子の場合には、該粒子体積と等しくなる球の直径で表される。平均粒径は顕微鏡画像用いて測定する装置、例えばＭａｌｖｅｒｎ社製Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００Ｅにより測定することができる。
本発明の固定相を粒子として用いる場合には、アスペクト比が２以下、好ましくは１．５以下である球状粒子状であることが好ましい。真球に近ければ近いほど好ましいので、下限は、１まで特に制限されない。
アスペクト比は以下のとおりに測定する。試料を観察台上に無作為に散布した状態で真上から電子顕微鏡あるいは光学顕微鏡によって観察し、独立した（他のどの粒子とも接触あるいは重複していない）一次粒子が１０個以上観察される任意の画面において、画面内の個々の独立した一次粒子に対し、長軸および短軸（長軸に垂直で最も長い部分の長さ）を求め、両者の比を個別粒子のアスペクト比とする。画面内のすべての独立した一次粒子に対するアスペクト比を相加平均したものを、本発明におけるアスペクト比とする。一次粒子とは、粒子間の界面が明瞭に観察することができる粒子のことである。通常、観察は試料台上での一次粒子の重なりを避けるように適度に分散させて行うが、偶発的重なりは避けがたく、また、複数の一次粒子が凝集したバルク状粒子もあるが、これらは観察対象から除かれる。
本発明の固定相は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）の固定相として用いることができる。
本発明の固定相をＳＦＣ用に用いると、酸性化合物や塩基性化合物について優れた分離特性を有し、さらに、ＨＰＬＣでは分離することが難しかった物質、例えば縮合環芳香族化合物や、芳香族化合物の異性体の分離特性にも優れる。
本発明の固定相は、例えば特開２００６−０５８１４７号に記載のような、超臨界流体クロマトグラフィー用のカラムに充填して用いることができる。
超臨界流体クロマトグラフィーでは、超臨界流体と溶剤とを含有する流体を移動相として用いる。ここで言う超臨界流体クロマトグラフィーとは、超臨界流体を主たる移動相とするクロマトグラフィーに対する一般的名称である。前記超臨界流体は、臨界圧力以上及び臨界温度以上の状態（すなわち超臨界状態）にある物質である。超臨界流体として用いられる物質としては、例えば二酸化炭素、アンモニア、二酸化硫黄、ハロゲン化水素、亜酸化窒素、硫化水素、メタン、エタン、プロパン、ブタン、エチレン、プロピレン、ハロゲン化炭化水素、水等をあげることができるが、適当な臨界条件、安全性、コストなどから、実質的には二酸化炭素を意味する。また厳密に超臨界であることは必要ではなく、亜臨界状態での使用も含めて“超臨界流体クロマトグラフィー”と呼ばれる。
前記溶剤としては、前記目的の物質の種類や超臨界流体の種類等に応じて、公知の種々の溶剤の中から一種又は二種以上が選ばれる。前記溶剤としては、例えばメタノール、エタノールや２−プロパノール等の低級アルコール、アセトン等のケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ＴＨＦ等が挙げられる。また、塩基性、酸性、両性化合物、極性化合物を分離する際にはピークの形状をよくするために、水、酸、アミン塩基、アンモニウム塩などをさらに少量添加することもある。
前記超臨界流体クロマトグラフィーは、前記超臨界流体と前記溶剤とを含有する流体を移動相に用いるクロマトグラフィーであれば特に限定されない。本発明の固定相を用いた前記超臨界流体クロマトグラフィーは、分析用であってもよいし分取用であってもよい。
分取用の超臨界流体クロマトグラフィーは、カラムで分離した目的の物質に応じて、カラムを通過した後の移動相をフラクションコレクタで分け取る工程を含む超臨界流体クロマトグラフィーであれば特に限定されない。
充填するカラムは公知のサイズのものを用いることができる。
また、流速も適宜調整して用いることができ、例えば内径０．４６ｍｍのカラムの場合、０．３〜１０ｍｌ／ｍｉｎの態様を挙げることでき、好ましくは１〜６ｍｌ／ｍｉｎの態様を挙げることができる。
また、カラム温度も０〜５０℃程度の態様を挙げることができ、２０〜４０℃程度を挙げることができる。
背圧は１２０〜１８０ｂａｒ程度の態様を挙げることができ、１３０〜１６０ｂａｒ程度を挙げることができる。
また、本発明の固定相は、モノリスとして用いることもできる。本発明の固定相をモノリスにする場合には、予めモノリス状に成形されているとともに、重合性官能基が結合している担体、あるいはモノリス状に成形される担体となる原料で重合性官能基が結合しているものと、Ｎ−メチル−２−ピロリドンとを反応させることで得ることができる。
本発明の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相は、フェニルプロピオン酸系ＮＳＡＩＤＳのような酸性化合物、カフェイン類縁体のような塩基性化合物、トリフェニレンやターフェニルのような、芳香族、多環芳香族炭化水素、その他広い範囲の極性を持った化合物の分離性能に優れている。
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に制限されない。
＜実施例１＞
（シリカゲルのＮ−メチル−Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］２−プロペンアミド処理）
（調製例１）
３００ｍＬ三首フラスコの中にトルエン２００ｍＬ、トリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シラン ３．９１ｇ、トリエチルアミン２．７４ｇ、４−ピロリジルピリジン約５０ｍｇを入れ、撹拌しながら、この中に塩化アクリロイル２．１０ｇ、トルエン４ｍＬの混合液を滴下した。滴下終了後、約３時間８０℃に加温し、結晶性生成物（トリエチルアミン塩酸塩）を浮遊した淡褐色液体を得た。
一方、３００ｍＬ三首フラスコの中に１６０℃で真空乾燥した公称孔径３００Å、粒子径５μｍのシリカゲル２０.６０ｇを入れ、撹拌羽をセットした。ここに前記反応で得た淡褐色液体をグラスフィルターを通して流し込み、グラスフィルターに残った固体は５０ｍＬのトルエンで伴洗いした。このフラスコを撹拌しながらオイルバス中、９０℃で１時間、１２５℃で５時間、加温した。この間、側管より約１００ｇのトルエンを留出した。得られたシリカゲルを０．５μｍメンブレンフィルター上でろ別し、５０ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、１００ｍＬのメタノール、５０ｍＬのアセトンで洗浄した後、６０℃で真空乾燥した。
収量２１．７４ｇ 重量増加率は６．５％であった。
元素分析値はＣ：２．６５、Ｈ：０．５５、Ｎ：０．４４（各％）であった。
調製例１で得たシリカゲルへの１−ビニル−２−ピロリドン（VP）の共重合
ＶＰ ９８４ｍｇ、ＮＭＰ４．２ｍＬ、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２３ｍｇを混合し、窒素バブリングの後、調製例１で得たシリカゲル ２．０８４ｇを入れたフラスコに移液した。液を均一に混和、フラスコを窒素置換した後、ロータリエバポレータに接続し、回転しながら、６５℃、８０℃、９０℃にそれぞれ２時間保温した。得られた液は、５．５μｍグラスフィルタに移し、ＮＭＰ５０ｍＬ、メタノール５０ｍＬ、アセトン５０ｍＬをそれぞれ何回かに分けて洗浄し、真空乾燥（６０℃）した。収量２．２６２ｇ、調製例１で得たシリカゲルに対する重量増加は８．５％、シリカゲル元素分析値はＣ：７．９１、Ｈ：１．３７、Ｎ：１．４８（各％）であった。
得られたポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）結合シリカゲルは、以下の構造を有していることが推定できる。
＜実施例２＞
１２０Åシリカゲルからの充填剤
５０ｍｌのナスフラスコＡに、１６０℃で真空乾燥した公称孔径１２０Å、径５μｍのシリカゲル２０９８ｍｇ、トリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シラン １２３ｍｇ、乾燥トルエン ２０ｍＬを入れ、ロータリエバポレータに結合し、回転しながら９０℃に２時間、以下徐々に昇温し３時間で１１８℃にした。この間に約４．５ｇのトルエンがトラップに移行した。得られたシリカゲル分散液に、トリエチルアミン ２１２ｍｇ、塩化アクリロイル１１４ｍｇを加え、回転しながら１時間９７℃に保った。冷却後、メタノール１０ｍＬと共に５．５μｍのグラスフィルターに移し、メタノール１０ｍＬで３回洗浄し、真空乾燥（６０℃）した。得られたシリカゲルの重量は２．２６７ｇ、元素分析値は Ｃ：２．９１、Ｈ：０．８４、Ｎ：０．４９％であった。
得られたシリカゲルの中の２２１６ｍｇに、ＶＰ ６１８ｍｇ、ＡＩＢＮ８．９ｍｇ、アセトン２．５ｍＬを混和した液を滴下し、スパチュラで混ぜて均一に混和させた。これを真空ポンプで減圧することでアセトンを除き、窒素で満たした。この容器を７０℃、８０℃、９０℃にそれぞれ２時間保温した。得られたシリカゲルはメタノール４０ｍＬ，ＮＭＰ３０ｍＬ、メタノール３０ｍＬ、アセトン３２ｍＬで洗浄した後、真空乾燥した。収量２．６３７ｇ。上記、表面処理シリカゲルに対する重量増加は１９．０％、元素分析値はＣ：１０．２、Ｈ：１．７、Ｎ：１．８２ であった。
得られたポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）結合シリカゲルは実施例１と同様の構造を有していると推察された。
＜実施例３＞
二官能カップリング剤によるアクリルアミド結合シリカゲルの調製
実施例１と同様に、ただしトリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シランに代えてジメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］メチルシラン６９０ｍｇ、トリエチルアミン７８６ｍｇ、トルエン３０ｍＬ、塩化アクリロイル５３７ｍｇとトルエン５．５ｍＬを反応させ、この反応液を実施例１と同じシリカゲル４４２７ｍｇに注ぎ、加温、得られたシリカゲルをろ別洗浄した。収量４７２１ｍｇ（６．６５％重量増）、元素分析値はＣ：３．５２、Ｈ：０．７、Ｎ：０．５ であった。
得られたシリカゲル２０８１ｍｇを、ＶＰ ９６５ｍｇ、ＮＭＰ ４．０ｍＬ、ＡＩＢＮ １８．９ｍｇからなる溶液に分散し、実施例１と同様に反応させ、２３５０ｍｇのシリカゲルを得た（１２．９％重量増）。元素分析値はＣ：１０．２、Ｈ：１．７，Ｎ：１．８２であった。
得られたポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）結合シリカゲルは実施例１と同様の構造を有していると推察された。
＜実施例４＞メルカプト基結合シリカゲルの調製
（調製例２）
５０ｍＬのナスフラスコ中で真空乾燥したシリカゲル（細孔径３００Å、径５μｍ）２２３３ｍｇにトルエン２５ｍｌ、トリメトキシ（メルカプトプロピル）シラン５２３ｍｇを注ぎ、フラスコをロータリエバポレータに接続、回転させながら３時間２５分の間にバス温度を１０５℃から１２５℃に上げた。この間に、約１０ｍＬの液体（主にトルエン）がトラップに移行した。フラスコを冷却後、５．５μｍのグラスフィルターでシリカゲルをろ別、メタノール１５ｍＬで４回、アセトン１５ｍＬで２回洗浄し、６０℃の真空乾燥器で乾燥した。２３１０ｍｇのメルカプト基結合シリカゲルを得た。重量増加は３．４％、元素分析値はＣ：１．７２、Ｈ：０．５６，Ｎ：０％であった。
−ＳＨを用いたイニファータ法による結合
調製例２で得たメルカプト基結合シリカゲル２．２２１ｇに、ＶＰ６９６ｍｇ、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）１５ｍｇをアセトン３ｍＬに溶かした液を吸収させ、スパチュラで均一に混合した後、真空ポンプ（１Ｔｏｒｒ）で減圧しアセトンを除いた。このフラスコに窒素を充たし、バス中で６５℃、８０℃、９０℃にそれぞれ２時間保温した。冷却後の粉体をメタノール適量と共に５．５μｍのグラスフィルターに移し、メタノール１５ｍＬで３回、ＮＭＰ１５ｍＬで３回、メタノール１５ｍＬで３回、アセトン１０ｍＬで３回洗浄し、６０℃の真空乾燥器で乾燥させた。乾燥後の粉体は２．４９９ｇであった。重量増は１１．９％、元素分析値はＣ：８．１８，Ｈ：１．４８，Ｎ：１．３１％であった。
得られたポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）結合シリカゲルは、以下の構造を有していることが推定できる。
＜実施例５＞
メタクリロキシ基結合シリカゲルの調製
（調製例３）
１６０℃で真空乾燥した実施例１で用いたものと同じシリカゲル２．１８７ｇを、トルエン２５ｍＬ、トリフルオロ酢酸１０μＬ、トリメトキシ（３−メタクリロイルオキシプロピル）シラン５００μＬと共にロータリエバポレータに接続したフラスコの中で３時間３０分、１０５℃から徐々に１２０℃まで昇温した。この間、約１０ｍＬの液体がトラップに移行した。処理したシリカゲルは、冷却後５．５μｍのグラスフィルターに移し、ろ別、ＮＭＰ８ｍＬで２回、メタノール１０ｍＬで３回、アセトン８ｍＬで２回洗浄し、６０℃で真空乾燥し、２．３０７ｇの粉体を得た。重量増５．５％、元素分析値はＣ：２．６４、Ｈ：０．５５，Ｎ：０．００％であった。
調製例３で得たメタクリロイルオキシ基結合シリカゲル２．１９４ｇを、実施例１と同様にＶＰ １．０ｍＬ、ＮＭＰ４．０ｍＬ、ＡＩＢＮ２２．８ｍｇの溶液中に分散し、ロータリエバポレータに結合して回転しながら窒素雰囲気下、７０℃、８０℃、９０℃にそれぞれ２時間保った。本液を冷却後、ＮＭＰ５ｍＬを加えて希釈し、５．５μｍのグラスフィルターに移し、ＮＭＰ約７ｍＬで３回、メタノール約７ｍＬで３回、アセトン約７ｍＬで３回洗浄し、６０℃で真空乾燥した。収量２．３６４ｇ（重量増７．８％）、元素分析値はＣ：６．９１，Ｈ：１．１６、Ｎ：０．９０％であった。
得られたポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）結合シリカゲルは、以下の構造を有していることが推定できる。
＜実施例６＞
３μｍシリカゲルへの結合
平均粒径３μｍ、平均細孔径３００Åのシリカゲル ４．４２７ｇに対し、調製例１と同様の処理をし、４．７２１ｇの表面処理シリカゲルを得た（重量増６．６％）。
上記で得たシリカゲル２．０９０ｇに、ＶＰ １３４３ｍｇ、ＮＭＰ ４．００ｍＬ、Ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ ２５．６ｍｇよりなる溶液を窒素バブルしてからしたのちに注いだ。得られたスラリーを窒素下撹拌しながら１２時間、７３℃に保った。得られたシリカゲルは調製例２と同様に、グラスフィルター上でＮＭＰ，メタノール、アセトン各２０ｍＬで洗浄、６０℃で真空乾燥した。収量２．４４０ｇ（重量増１６．７％）であった。
上記で得た各シリカゲルについて、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍカラムにスラリー充填して、ＨＰＬＣ用のカラムを作製し、高圧ガス保安法に適合するように耐圧製を保証された４．６ｍｍφ×１５０ｍｍカラムにスラリー充填してＳＦＣ用のカラムを作製した。以下の分離例ではこれらのカラムを用いて行った。
＜分離例１＞
図１は、フェニルフェノール（オルト、メタ、パラの混合物）の分離を、固定相として同じものを用いて高速液体クロマトグラフィーを用いて行って得たクロマトグラム（ａ）と、ＳＦＣを用いて分離を行って得たクロマトグラム（ｂ）を示すものである。
高速液体クロマトグラフィーの条件：溶離液（Ｈｅｘ／ＥｔＯＨ＝９７／３）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２５４ｎｍ。
超臨界流体クロマトグラフィーの条件：溶離液：ＣＯ２／メタノール（９７：３ｖ／ｖ）、流速：４ｍｌ／ｍｉｎ、温度：４０℃、背圧：１５０ｂａｒの条件で行った。検出はＵＶ２５４ｎｍで行った。
＜分離例２＞
図２は、分離例１と同じ固定相を用いて、ヒドロコルチゾンとプレドニゾロンの分離を行って得られたクロマトグラムであり、ＨＰＬＣを用いて得られたものが（ａ）、ＳＦＣを用いて得られたものが（ｂ）である。
ＨＰＬＣにおいて溶離液：ＣＯ２／エタノール（９０：１０ｖ／ｖ）とＳＦＣにおいて溶離液：ＣＯ２／メタノール（９０：１０ｖ／ｖ）を用いた点以外の条件は分離例１と同じである。
＜分離例３＞
図３は、分離例１と同じ固定相を用いて、アセチルフェナントレンとアセチルアントラセンの分離を行って得られたクロマトグラムであり、ＨＰＬＣを用いて得られたものが（ａ）、ＳＦＣを用いて得られたものが（ｂ）である。
ＨＰＬＣとＳＦＣの条件は分離例１と同じである。
＜分離例４＞
図４は、アセチルフェナントレンとアセチルアントラセンの分離を、固定相として市販品の２−エチルピリジン結合シリカゲルを用いて行って得られたクロマトグラム（ａ）と、分離例１のＳＦＣで用いた固定相を用いて得られたもの（ｂ）を示す。
それぞれのＳＦＣの条件は分離例１と同じである。
市販品の２−ピリジルエチル固定相（下記式で示す）の構造を以下に示す。
＜分離例５＞
図５は、ＳＦＣによるヒドロコルチゾンとプレドニゾロンの分離において、それぞれ分離例４で用いた２−エチルピリジン結合シリカゲル（比較例）を用いて得られたクロマトグラム（ａ）と、分離例１のＳＦＣで用いたポリ（１−ビニル−２−ピロリドン）結合シリカゲルを用いて得られたもの（ｂ）を示す。
それぞれのＳＦＣの条件は溶離液：ＣＯ２／メタノール（９０：１０ｖ／ｖ）を用いた点以外は分離例１と同じである。
＜分離例６＞
図６は、４種のベータブロッカーと呼ばれる医薬成分（アルプレノロール、プロプラノロール、アテノロール、ピンドロール）の分離を、実施例４の固定相（イニファータ法）を用いて行った結果（ａ）、実施例５の固定相（メタクリルエステル共重合法）を用いて行った結果（ｂ）、実施例１の固定相を用いて行った結果（ｃ）を示すものである。（ｂ）、（ｃ）では各成分が溶出しているが、（ａ）ではアルプレノロールが溶出したことのみ確認して終了している。なお、各クロマトグラフィーにおけるＳＦＣ条件は、溶離液：ＣＯ２／メタノール（９０：１０ ｖ／ｖ）を用いた点以外は分離例１と同じである。
図１、図２及び図５の各ピークについて、分離度（Ｒｓ）を算出し、以下の表にまとめた。
なお、分離度は以下の式より求めた。
分離度（Ｒｓ）：２×（より強く吸着される分離対象とより弱く吸着される分離対象の両ピーク間の距離）／両ピークのバンド巾の合計
表１の記載からも明らかなように、本発明の固定相は、ＨＰＬＣよりもＳＦＣで用いると、目的物質の分離度がより高いことが分かる。また同じくＳＦＣにおいても、従来から最もよく用いられてきた２−エチルピリジン固定相とは異なる特性を示し、しばしばより良い分離を与えることが分かる。
本発明の固定相は、従来のＨＰＬＣでは分離が難しかった化合物についても良好な分離特性を有する。具体的には、カラム段数の向上が見込まれる。このことから本発明の固定相は、これまで分離が難しかった様々な物質の新たな分離条件の発見や改良だけでなく、分離された物質の同定、解析の利便性の向上に寄与することが期待される。

Claims (12)

  1. 主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格が含まれるポリマーが担持されている担体から構成される、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
  2. 以下の式（ＩＩ）で示される構造を有する、請求項１に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
    （式ＩＩ中、Ｗ’は、単結合または分岐鎖を有してもよい炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｘは、アミド基、エステル基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エーテル基、スルホキシド基、スルホン基、スルフィド基、またはリン酸エステル基であり、Ｙは、炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｖは担体表面と結合したエーテル基、炭素数１〜５のアルコキシ基または炭素数１〜３のアルキル基である。ｐは１〜１０であり、ｑは１０〜３００）
  3. 球状粒子状であることを特徴とする、請求項１または２に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
  4. 平均粒径が０．１μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
  5. モノリス状であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の固定相と、超臨界流体を含む移動相とを用いて目的物質を分離する工程を含む、目的物質の分離方法。
  7. １−ビニル−２−ピロリドンと、重合性官能基が結合している担体とを共重合させる工程を含む、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
  8. 前記重合性官能基が、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基またはω位に二重結合を有する炭素数４〜１２のアルケニル基である、請求項７に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
  9. 重合性官能基が結合している担体は、下記式（Ｉ）で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることにより得られる表面修飾シリカゲルである、請求項７または８に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
    （式（Ｉ）中、Ｗは、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基またはω位に二重結合を有する炭素数４〜１２のアルケニル基であり、Ｘは、アミド基、エステル基、炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基、エーテル基、スルホキシド基、スルホン基、スルフィド基、またはリン酸エステル基であり、Ｙは、炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｚは炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（Ｉ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基である。ｎは１〜３の整数である。）
  10. 前記Ｗがビニル基であり、Ｘがアミド基または炭素数１〜３のＮ−アルキルアミド基であり、Ｙが炭素数１〜５のアルキレン基であり、Ｒが独立してメチル基、エチル基またはプロピル基であり、Ｚは炭素数１〜５のアルコキシ基、ハロゲン、炭素数１〜２０のアルキルメルカプチル基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基、アリル基または２−メチル−２−プロペニル基である、請求項９に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
  11. １−ビニル−２−ピロリドンを、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤の存在下でラジカル重合させてポリマーを得る工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む、超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
  12. 末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤が下記式（ＩＩＩ）で示される化合物である、請求項１１に記載の超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
    （式（ＩＩＩ）中、Ｒはそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｚは式（ＩＩＩ）中のケイ素原子と担体との間に結合を作らせ得る脱離基である。Ｙは炭素数１〜３０のアルキレン基であり、Ｔは連鎖移動性官能基である。ｎは１〜３の整数である。）
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