JP6813247B2 - クロマトグラフィー用の固定相 - Google Patents
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Description
これに対して、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)は、その特徴が順相クロマトグラフィーに似ているといわれている。しかし、その特徴、メカニズムは未だよく解っていない点が多い。また超臨界、あるいは亜臨界二酸化炭素を主とする移動相から徐々に極性の強い移動相、すなわち逆相系に移行することにより広い極性範囲の分離対象をカバーする考え方もある。
具体的には、架橋によって溶媒に溶けなくしたポリ(1−ビニル−2−ピロリドン)(PVP)の粒子をカラムに充填して固定相として用いた例が存在する(例えば、非特許文献1)。
また、硬質のゲルであるシリカゲルの表面にPVPを結合することも試みられている。例えば、タンパクや微生物の分離においてシリカゲルを固定相とすると、いわゆる変性により目的物の性質が変わったり、回収率が著しく低くなることがあるため、これを防ぐために表面を親水性のポリマーで被覆し、シリカゲルの影響を遮蔽することを意図したものがある(非特許文献2)。
また、PVPを結合する方法についてはいくつかの試みがある。例えばPVPをシリカゲル上にコーティングしたのち、γ−線によって架橋処理することが報告されている(非特許文献1)。また別の報告ではシリカゲルに、ビニル基やメタクリロキシ基を持つシランカップリング剤を結合した上で、これにビニルピロリドンモノマーを共重合させる方法が開示されている(非特許文献3)。しかし、これらは一般にピークがブロードであるためか、HPLCのような液体クロマトグラフィーではあまり利用されていない。
修飾基としては、様々な鎖長の飽和アルキル鎖を含むもの、ひとつあるいは二つのベンゼン環、縮合多環芳香族炭化水素基をアルキル鎖又は、アミド結合、エーテル結合を含むアルキル鎖でつないだもの、ハロゲン置換ベンゼン環を特徴とするもの、ハロゲン化アルキル基をつないだもの、2,3−ジヒドロキシプロピル基、CN基、NH2基などの極性基をつないだもの、高分子修飾基として架橋ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどがある。また、グラファイト構造を持った炭素も特徴ある固定相である。これらの中で、特にSFCにおいてよく用いられるものは、2−エチルピリジンと呼ばれる、(2−ピリジル)エチル基を結合したものであり、普通の固定相ではテーリングして幅広いピークを与える塩基性化合物もシャープなピークとなって溶出するだけでなく、酸性化合物も適度に保持可能であるため、好んで用いられる。
[1] 主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とが含まれるポリマーが担持されている担体から構成される、クロマトグラフィー用の固定相。
[2] 以下の式(III−1)または式(III−2)で示される構造を有する、[1]記載のクロマトグラフィー用の固定相。
1〜3のアルキル基である。pは1〜10であり、qは10〜1500である。Rは水素、炭素数1〜6のアルキル基、炭素数3〜12のシクロアルキル基、フェニル基及びヒドロキシフェニル基から選ばれる基である。)
[3] 球状粒子状であることを特徴とする、[1]または[2]に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
[4] 平均粒径が0.1μm〜1000μmであることを特徴とする、[3]に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
[5] モノリス状であることを特徴とする、[1]または[2]に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
[6] 超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相である、[1]〜[5]のいずれかに記載のクロマトグラフィー用の固定相。
[7] [1]〜[5]のいずれかに記載の固定相と、溶離液または超臨界流体を含む移動相とを用いて目的物質を分離する工程を含む、目的物質の分離方法。
[8] 1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピぺリドンと下記式(I)で示される化合物と、重合性官能基が結合している担体とを共重合させる工程を含む、クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
[9] 前記重合性官能基が、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基またはω位に二重結合を有する炭素数4〜12のアルケニル基である、[8]に記載のクロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
[10] 重合性官能基が結合している担体は、下記式(II)で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることにより得られる表面修飾シリカゲルである、[8]または[9]に記載のクロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
[11] 前記Wがビニル基であり、Xがアミド基または炭素数1〜3のN−アルキルアミド基であり、Yが炭素数1〜5のアルキレン基であり、Rが独立してメチル基、エチル基またはプロピル基であり、Zは炭素数1〜5のアルコキシ基、ハロゲン、炭素数1〜20のアルキルメルカプチル基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基、アリル基または2−メチル−2−プロペニル基である、[10]に記載のクロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
[12] 1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピぺリドンと式(I)で示される化合物とを、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤の存在下でラジカル重合させてポリマーを得る工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む、クロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
[13] 末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤が下記式(IV)で示される化合物である、[12]に記載のクロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
[14] 前記クロマトグラフィー用の固定相が超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相である、[8]〜[13]のいずれかに記載の製造方法。
なお、本発明における固定相とは、クロマトグラフィー法において、分析用具(カラムまたはキャピラリー)の内部に固定され、これと接触しながら移動する流体との間で分離対象物質を分配し、分離に導く材料を意味するが、これが粒子である場合には、該粒子が充填されることによって形成された集合体を指すこともあり、またその個別の粒子を指すこともある。
以下の製造方法のうち、(1)〜(7)の製造方法によれば、コポリマーと担体との間に化学結合(共有結合)が生じるものである。一方、(8)と(9)の製造方法によれば、担体の表面上でポリマー同士が架橋して存在することにより、担体表面からコポリマーが溶出したりすることがない。
超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相において、担体との物理的結合を利用してコポリマーをコーティングすることは可能であるが、そのような場合には溶媒によってコポリマーが溶出することもあるので、好ましい方法とはいえない。
(1)1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物と、重合性官能基が結合している担体とをラジカル共重合させる工程を含む製造方法。
(2)1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物とを、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤の存在下でラジカル重合させてコポリマーを得る工程と、得られたコポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
(3)担体表面にドーマント種となる共有結合を導入し、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物とを用いて担体表面からリビングラジカル重合を行うことにより、担体表面にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格を主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入する工程を含む製造方法。
(4)重合性二重結合を有するシランカップリング剤と、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物とを共重合させる工程と、得られたコポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
(5)担体表面に連鎖移動性官能基を導入し、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物とをラジカル重合する工程を含む製造方法。
(6)開始末端に反応性シリル基を有するアニオン開始剤と1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物とをアニオン重合させて、コポリマーを得る工程と、得られたコポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
(7)アニオン開始剤と1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物をアニオン重合後、反応性シリル基を有する停止剤を作用させてコポリマーを得る工程と、得られたコポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法。
(8)1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物と、架橋剤と、開始剤とを含む組成物と、担体とを混合して、架橋反応を行わせる工程を含む製造方法。
(9)1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物とを共重合して得たコポリマーを担体の表面にコーティングし、γ線あるいは電子線の照射により、架橋反応を行わせる工程を含む製造方法。
いずれの方法でも重合時の重合温度、重合溶媒、添加剤等により、生成コポリマーの立体規則性を制御することも可能である。
本発明の固定相の(1)の製造方法に用いられる重合性官能基が結合している担体は、以下の方法により作製することができる。
担体に結合している重合性官能基として、ラジカル重合性官能基を挙げることができ、例えば、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、またはω位に二重結合を有する炭素数4〜12のアルケニル基を挙げることができる。この中でも、ビニル基、アリル基またはイソプロペニル基が好ましい。
また、担体としては、多孔質有機担体又は多孔質無機担体が挙げられ、好ましくは多孔質無機担体を挙げることができる。多孔質有機担体として適当なものは、ポリスチレン、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリ(メタ)アクリレート等から選択される高分子物質であり、多孔質無機担体として適当なものは、シリカゲル、アルミナ、ジルコニア、チタニア、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、ケイ酸塩、ヒドロキシアパタイトなどである。好ましい担体はシリカゲル、アルミナ、又はガラスである。
また最近のクロマトグラフィー用充填粒子には、コアシェルあるいはペリフェラルと呼ばれる、表層のみを多孔質にした担体を用いたものがあり、高いカラム効率を与えるとされる。本発明でも、これらの担体を用いることができ、上記で列挙した材料を用いたコアシェル型あるいはペリフェラル型の担体を用いてもよい。
担体として多孔質有機担体を用いる場合、公知の架橋剤との共重合法やX線、γ線、電子線による架橋により、上記の重合性官能基を担体と化学結合させることができる。
担体としてシリカゲルを用いる場合には、シリカゲルが有するシラノール基を介して、上記の重合性官能基が担体と化学結合する態様を挙げることができる。
シリカゲル以外の担体を用いる場合には、担体の表面処理を行うことにより、担体自体への分離対象物質の過剰な吸着を抑制できるとともに、表面処理で導入された基を介して重合性官能基と結合させることができる。表面処理剤としては、アミノプロピルシランのようなシランカップリング剤や、チタネート系・アルミネート系カップリング剤を挙げることができる。
上記式(II)中、Xは、Wと末端のZ基とのリンカーの一部であり、アミド基、炭素数1〜3のN−アルキルアミド基、エステル基、フェニレン基であることが好ましい。
上記式(II)のYは、炭素数1〜5のアルキレンであることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基のいずれかであることがより好ましい。
上記式(II)のRは、メチル基、またはエチル基であることが好ましい。
なお、式(II)中、Xが「アミド基」である場合、−N−CO−Yと、−CO−N−Yの態様を含み、Xが「N−アルキルアミド基」である場合、−NR−CO−Yと、−CO−NR−Yの態様を含む。
上記式(II)において、Wがビニル基で、Xがアミド基またはN−アルキルアミド基である態様と、Wがイソプロペニル基で、Xがアミド基またはN−アルキルアミド基である態様が、合成が容易な点と分離対象が塩基性物質である場合に良好なピーク形状を得る点で好ましい。
なお、式(II)のXが「アミド基」の場合、−CO−NH−の構造において、窒素にYが結合し、「N−アルキルアミド基」の場合、−CO−NR−(Rは炭素数1〜3のアルキル基)の構造において、窒素にYが結合している態様が好ましい。
それらの化合物同士の反応により、上記式(II)の「−X−」が生じる。
その共重合の態様としては、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンのビニル基と、式(I)で示される化合物の二重結合と、重合性官能基の全てについて共重合を起こさせることが挙げられ、その際の反応条件は公知の方法を用いることができる。
式(III−1)または(III−2)中のX及びYの好ましい基は、上記式(II)と同様のものを採用できる。
式(III−1)または(III−2)中、pは1以上を例示でき、qは10〜1500程度を例示できる。pは好ましくは1〜10であり、qは好ましくは15〜1100、更に好ましくは20〜1000である。なお、p、q、いずれも2以上の場合、式(III−1)または(III−2)では、ピロリドン骨格またはピペリドン骨格を有する単位、イミド骨格を有する単位と担体との結合を有する単位とは、それぞれが連続するブロック共重合体のように見えるが、式(III−1)または(III−2)は、それぞれの残基の数のみを表現しているのであり、実際には交互性の高いランダムな共重合体であろうと推定される。
式(III−1)または(III−2)のVについて、上記式(II)で示される化合物において、n=1の場合、V=Rであり、n=2の場合、全てのVの数に対し、R基の割合は50%であり、未反応のZ基またはZ基が反応によって担体表面に置き換わった構造がそれぞれ0〜50%および50%〜0%であり、n=3の場合、未反応のZ基またはZ基が反応によって担体表面に置き換わった構造がそれぞれ0〜100%および100%〜0%である。
(2)の製造方法は、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤の存在下でラジカル重合させる工程と、得られたコポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法である。
(2)の製造方法で用いる、末端に反応性シリル基を有する連鎖移動剤として、以下の式(IV)で示される化合物を例示することができる。本発明における反応性シリル基とは、下記の式(IV)のZで示されるような脱離基が結合しているシリル基のことであり、ケイ素を含む金属水酸化物に対して縮合によりSi−O−M(Mは金属原子)の形の結合を形成する性質のことである。以下の他の製法において用いる化合物においても同様である。
取り扱いのしやすさと反応性のバランスが良いために、脱離基として一般的に用いられるものは、炭素数1〜5のアルコキシ基であり、その中でもメトキシ基あるいはエトキシ基を例示でき、ハロゲン(塩素、臭素またはヨウ素)、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基のような窒素含有基、またアリル基やイソプロペニル基も用いることができ、脱離基の種類によって反応条件(触媒添加も含めて)を調整できる。Yは、炭素数1〜10のアルキレン基であることがより好ましい。Tは連鎖移動性官能基である。連鎖移動性官能基とは重合反応において、生長活性種の移動および再開始反応を伴う連鎖移動反応が活発に起こる官能基のことである。連鎖移動性官能基があることで、生成ポリマーの分子量や末端構造の制御がある程度可能となる。連鎖移動性官能基の具体例としては、ハロゲン化された炭素数1〜12のアルキル基、末端にチオールを有する炭素数1〜12のアルキル基またはジスルフィド基を基内に有する炭素数1〜12のアルキル基が好ましい。
前記ハロゲン化された炭素数1〜12のアルキル基のハロゲンは塩素、臭素またはヨウ素を挙げることができ、そのアルキル基としては、炭素数1〜3のアルキル基を挙げることができる。
このような連鎖移動剤の存在下、少量のラジカル発生剤を触媒に用い、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンのラジカル重合を行うことで、下記式(V−1)または(V−2)で示される構造を有すると推定される化合物を得ることができる。このときに、連鎖移動剤とモノマーのモル比からある程度の分子量の制御が可能となる。ラジカル発生剤は、重合反応に用いる公知のものを用いることができ、その具体例としては、アゾ化合物や過酸化物を挙げることができる。
本発明の固定相の(2)の製造方法で用いる担体は、(1)の製造方法で用いる担体と同じものを用いることができる。
式(V−1)または(V−2)で示される化合物と、担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法ついては、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
式(V−1)または(V−2)で示される化合物と、担体とを結合させて得られる固定相は以下の構造を有していると推察される。
担体表面にドーマント種となる安定な共有結合を導入し、表面からリビングラジカル重合を行うことにより、シリカゲルのような担体表面にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とを主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入することが可能である。
この手法では、シリカゲルのような担体表面上に高密度にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とを主鎖の繰り返し単位に含むポリマーを導入でき、高度に配向可能なブラシ状ポリマーを得ることが可能である。
上記「ドーマント種となる安定な共有結合の導入とリビングラジカル重合」に関して、よく用いられている例を以下の(i)〜(iii)に示す。
(i) シリカゲルのような担体表面に、銅・鉄・ルテニウムなどの遷移金属触媒によって活性化可能な炭素−ハロゲン結合を導入し、一電子酸化還元機構によりハロゲンの引き抜きと引き戻しを可逆的に行うことで、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物の重合をリビング的に進行させる。この技術を用いることでシリカゲルのような担体表面上に、高密度にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とを主鎖の繰り返し単位に含むコポリマーを導入することが可能である。
(ii) シリカゲルのような担体表面に、例えばアルコキシアミンを導入し、そのアルコキシアミンの炭素−酸素結合が熱的に解離して炭素ラジカルとニトロキシドを生成すると、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物の重合が進行するとともに生長炭素ラジカルはニトロキシドにより可逆的にすばやくキャッピングされることで再びドーマント種に戻り、重合反応が制御される。この技術を用いることでシリカゲルのような担体表面上に、高密度にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とを主鎖の繰り返し単位に含むコポリマーを導入することが可能である。
(iii)シリカゲルのような担体表面に、チオカルボニル化合物やヨウ素化合物を導入した場合、ポリマー末端間でのラジカル種とドーマント種との交換反応による可逆的な連鎖移動が速く起こることで、すべてのコポリマー鎖が同じように生長する機会が与えられて、分子量の制御が可能となる。この技術を用いることでシリカゲルのような担体表面上に、高密度にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とを主鎖の繰り返し単位に含むコポリマーを導入することが可能である。
この製造方法は、重合性二重結合を有するシランカップリング剤と、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンとを共重合させる工程と、得られたポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む方法である。
上記(4)の製造方法においても、担体については、シリカゲルの他には上記(1)や(2)の製造方法で用いるものと同じものを用いることができ、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンや式(I)で示される化合物についても、(1)や(2)の製造方法と同じものを用いることができる。
この製造方法では、コポリマー合成の際に適当な連鎖移動剤や、上述のリビングラジカル重合法を用いることで、分子量の制御も可能である。得られたコポリマーと担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法ついては、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
この製造方法は、担体表面に連鎖移動性官能基を導入し、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物をラジカル重合する工程を含む製造方法である。
Tについては、(2)と同じものを、RやZについても、(1)や(2)や(4)で用いたものと同じものを好ましく用いることができる。
本発明で用いる連鎖移動性官能基が結合している担体は、上記式(VII)で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることによって得られる表面修飾シリカゲルであることが好ましい。
この製造方法は、開始末端に反応性シリル基を有するアニオン開始剤と1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンとをアニオン重合させてコポリマーを得る工程と、得られたコポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法である。
Yについて、任意の水素が置換されてもよい芳香環を含む基としては、例えば1つまたは2つのフェニル基を有する炭素数4〜20のアルキル基を挙げることができ、より具体的には1,1−ジフェニルヘキシル基などを挙げることができる。
ただし、重合時の副反応により開始末端に直接シランカップリング剤を導入することが難しい場合、保護基により開始末端を保護した誘導体を合成し、重合後に脱保護し、定量的にシランカップリング剤へと変換することによっても得ることができる。このようにして得られたコポリマーと担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法ついては、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
この製造方法は、アニオン開始剤と1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物をアニオン重合させ、反応性シリル基を有する停止剤を作用させてコポリマーを得る工程と、得られたコポリマーを担体表面でシランカップリングする工程を含む製造方法である。停止末端に直接シランカップリング剤を導入することが難しい場合、保護基により保護した誘導体を用いて停止後に脱保護し、定量的にシランカップリング剤へと変換することによっても得ることができる。
Z’の具体例としては、ハロゲン(塩素、臭素、またはヨウ素)、炭素数1〜5のアルコキシ基、その中でも好ましくはメトキシ基あるいはエトキシ基、アルキルメルカプチル基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基のような窒素含有基、アリル基または2−メチル−2−プロペニル基を挙げることができる。脱離基の種類によって反応条件(触媒添加も含めて)を調整できる。
Yについて、任意の水素が置換されてもよい芳香環を含む基としては、例えば1つまたは2つのフェニル基を有する炭素数4〜20のアルキル基を挙げることができ、より具体的には1,1−ジフェニルヘキシル基などを挙げることができる。
このようにして得られたコポリマーと担体とをシランカップリング反応によって結合させる方法については、公知のシランカップリングの方法を用いることができる。
この製造方法は、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物と、架橋剤と、開始剤とを含む組成物と、担体とを混合して、架橋反応を行わせる工程を含む。
この製造方法では、該モノマーと架橋剤とを共重合することによって不溶性の重合物とするものである。具体的には、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物と、架橋剤として例えばジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレートなどを前記モノマーに対し0.01〜1当量、適量のラジカル開始剤、必要に応じて溶媒を混じたものを該担体に吸収させ、開始剤が重合を開始する条件におくことができる。
また、ラジカル開始剤としては、一般的なラジカル重合反応に用いる公知のものを使用でき、その具体例としては、アゾ化合物や過酸化物を挙げることができる。
(9)の製造方法は、非特許文献2に記載されている方法を改良したものである。
まず1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物とを共重合して得たコポリマーを溶解した溶液に担体を分散させ、溶媒を除去する。溶媒除去後、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと式(I)で示される化合物とを共重合して得たコポリマーが表面にコーティングされた担体に熱を加える。その際の温度としては、50℃〜180℃程度を挙げることができる。熱を加えることにより、担体上に1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物とを共重合して得たコポリマーを固定化し、その後、γ線や電子線を照射して、架橋反応を起こさせて、担体と1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドンと、式(I)で示される化合物とを共重合して得たコポリマーを結合させる。
上記重量平均分子量は、コポリマーの溶媒への溶解性、コポリマーを担体に担持させる際の粒子の凝集の防止、移動相溶媒への溶解の抑制、担体に化学結合する際の結合量の維持、等の観点から、上記範囲が好ましい。最適点はコポリマーの種類によって異なる。
ただし、本発明の固定相の製造方法(1)においては、1−ビニル−2−ピロリドンまたは1−ビニル−2−ピペリドン及び式(I)で示される化合物の重合とシリカゲルへの固定化が同時に起こるため、重合溶液の上澄みから重量平均分子量を見積もる。
製造方法(2)、(4)、(6)、(7)においては、主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とを含むコポリマーを担体に結合させる前に、そのコポリマーの重量平均分子量を測定する。
重量平均分子量はポリスチレンを標準物質としたゲルパーミエーションクロマトグラフィー法(GPC)方法により測定できる。GPC溶媒としては、コポリマーの溶解の程度に応じてDMF、NMP、THFを適宜用いることができる。DMFやNMPを用いる場合は、異常なピーク形状を避けるため、10−100mMの塩化リチウムあるいは臭化リチウムを添加してもよい。
また、本発明の固定相のうち、製造方法(8)、(9)を用いて得られるものも、担体上でコポリマー同士が架橋していることにより、本来これらコポリマーを溶かしうる溶媒あるいはそれを含む混合溶媒を展開溶媒に用いても、溶解することがない。
また、担体の比表面積は、通常5〜1000m2/g、好ましくは10〜500m2/gである。一般的に、コポリマーを担体に担持させる場合であれば、担持の前後で比表面積に誤差以上の変化はないため、固定相の平均粒径は、用いる担体の平均粒径と同一とみなすことができる。つまり、本発明の固定相が粒子状である場合には、その平均粒径は、0.1μm〜1000μmである態様を挙げることができ、好ましくは1〜50μmである。
なお、固定相100質量部中に含まれるコポリマーの質量部の割合(%)は、元素分析により測定することが可能であり、コポリマーが担持する前の担体の炭素含有量と、得られた固定相の炭素含有量を測定結果に基づき、コポリマーが担持する前の担体に含まれる炭素以外の炭素は、全てコポリマーに由来するものとし、さらにポリマー中のモノマー組成を便宜上1:1(モル比)と仮定して固定相中のコポリマーの質量部の割合を算出する。
アスペクト比は以下のとおりに測定する。試料を観察台上に無作為に散布した状態で真上から電子顕微鏡あるいは光学顕微鏡によって観察し、独立した(他のどの粒子とも接触あるいは重複していない)一次粒子が10個以上観察される任意の画面において、画面内の個々の独立した一次粒子に対し、長軸および短軸(長軸に垂直で最も長い部分の長さ)を求め、両者の比を個別粒子のアスペクト比とする。画面内のすべての独立した一次粒子に対するアスペクト比を相加平均したものを、本発明におけるアスペクト比とする。一次粒子とは、粒子間の界面が明瞭に観察することができる粒子のことである。通常、観察は試料台上での一次粒子の重なりを避けるように適度に分散させて行うが、偶発的重なりは避けがたく、また、複数の一次粒子が凝集したバルク状粒子もあるが、これらは観察対象から除かれる。
本発明の固定相をSFC用に用いると、酸性化合物や塩基性化合物について優れた分離特性を有し、さらに、例えば縮合環芳香族化合物や、芳香族化合物の異性体の分離特性にも優れる。
HPLCの溶離液としては、分離対象とする目的物質に応じて、公知のものを限定なく使用することができる。
超臨界流体クロマトグラフィーでは、超臨界流体と溶剤とを含有する流体を移動相として用いる。ここで言う超臨界流体クロマトグラフィーとは、超臨界流体を主たる移動相とするクロマトグラフィーに対する一般的名称である。前記超臨界流体は、臨界圧力以上及び臨界温度以上の状態(すなわち超臨界状態)にある物質である。超臨界流体として用いられる物質としては、例えば二酸化炭素、アンモニア、二酸化硫黄、ハロゲン化水素、亜酸化窒素、硫化水素、メタン、エタン、プロパン、ブタン、エチレン、プロピレン、ハロゲン化炭化水素、水等をあげることができるが、適当な臨界条件、安全性、コストなどから、実質的には二酸化炭素を利用する態様を挙げることができる。また厳密に超臨界であることは必要ではなく、亜臨界状態での使用も含めて“超臨界流体クロマトグラフィー”と呼ばれる。また、亜臨界も含む「超臨界」条件から、徐々に移動相中の通常液体の含量を増やし、実質的に液体クロマトグラフィー条件に移行させることも行われるようになっている(このような手法をインテグレーテッドクロマトグラフィーと呼ぶこともある)。
前記超臨界流体クロマトグラフィーは、前記超臨界流体と前記溶剤とを含有する流体を移動相に用いるクロマトグラフィーであれば特に限定されない。
分取用の高速液体クロマトグラフィー及び超臨界流体クロマトグラフィーは、カラムで分離した目的の物質に応じて、カラムを通過した後の移動相をフラクションコレクタで分け取る工程を含む高速液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーであれば特に限定されない。
また、流速もそれぞれ適宜調整して用いることができ、例えば内径0.46mmのカラムの場合、0.3〜10ml/minの態様を挙げることでき、好ましくは1〜6ml/minの態様を挙げることができる。
また、それぞれのカラム温度も0〜50℃程度の態様を挙げることができ、20〜40℃程度を挙げることができる。
SFC用の場合、背圧は120〜180bar程度の態様を挙げることができ、130〜160bar程度を挙げることができる。
(シリカゲルのN−メチル−N−[3−(トリメトキシシリル)プロピル]2−プロペンアミド処理)
(調製例1)
300mL三首フラスコの中にトルエン200mL、トリメトキシ[3−(メチルアミノ)プロピル]シラン 3.91g、トリエチルアミン2.74g、4−ピロリジルピリジン約50mgを入れ、撹拌しながら、この中に塩化アクリロイル2.10g、トルエン4mLの混合液を滴下した。滴下終了後、約3時間80℃に加温し、結晶性生成物(トリエチルアミン塩酸塩)が浮遊した淡褐色液体を得た。
一方、300mL三首フラスコの中に160℃で真空乾燥した公称孔径300Å、粒子径5μmのシリカゲル20.60gを入れ、撹拌羽をセットした。ここに前記反応で得た淡褐色液体をグラスフィルターを通して流し込み、グラスフィルターに残った固体は50mLのトルエンで伴洗いした。このフラスコを撹拌しながらオイルバス中、90℃で1時間、125℃で5時間、加温した。この間、側管より約100gのトルエンを留出した。得られたシリカゲルを0.5μmメンブレンフィルター上でろ別し、50mLのN−メチル−2−ピロリドン(NMP)、100mLのメタノール、50mLのアセトンで洗浄した後、60℃で真空乾燥した。
収量21.74g 重量増加率は6.5%であった。
元素分析値はC:2.65、H:0.55、N:0.44(各%)であった。
調製例1で得たシリカゲル2.15gに窒素雰囲気下、1−ビニル−2−ピロリドン510mg、アゾビスイソブチロニトリル20.4 mg、N−フェニルマレイミド784mg、NMP4.00mLの混合液に窒素バブリングした液を注ぎ、65℃2時間、80℃1時間、90℃1時間加熱した。得られたスラリーをグラスフィルター上でNMP、THF、メタノール各40mLで洗浄し、アセトン20mLでリンスして、60℃の真空乾燥機で乾燥した。実施例1で得られた粉体は2.475gであり、15%の重量増加であった。
得られたコポリマー結合シリカゲルは、以下の構造を有していることが推定できた。
カラムは東ソー(株)製TSKgel α−M+TSKgel guardcolumn−α、移動相は塩化リチウム100mMol/Lを含むDMF、送液は1.0mL/min、温度は40℃、検出には示差屈折計検出器を用い、分子量はポリスチレン標準(東ソー(株)製)で換算した。
1−ビニル−2−ピロリドン201mg、N−シクロヘキシルマレイミド321mg、アゾビスイソブチロニトリル8.1mgを3.00mLのアセトンに溶解し、これを調製例1で作製したシリカゲル2.08gに吸収させた後、アセトンを減圧留去した。残った粉体を窒素雰囲気下、実施例1と同じ温度/と時間で熱処理し、同様に洗浄、乾燥した。得られた粉体は2.48gであり、約19%の重量増加であった。
調製例1で作製したシリカゲル2.15gに窒素雰囲気下、1−ビニル−2−ピロリドン542mg、アゾビスイソブチロニトリル19.7mg、マレイミド484mg、シクロヘキサノン4.00mLの混合液に窒素バブリングした液を注ぎ、72℃4時間20分加熱した。得られたスラリー(重合物のためゲル状になっている)にNMP10mLを加え、溶液とした後、グラスフィルターでシリカゲルをろ別し、NMP30mL、メタノール20mL、アセトン20mLでリンスして、60℃の真空乾燥機で乾燥した。得られた粉体は2.62gであり、約23%の重量増加であった。
得られたコポリマー結合シリカゲルは、以下の構造を有していることが推定できた。
VP 984mg、NMP4.2mL、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)23mgを混合し、窒素バブリングの後、調製例1で得たシリカゲル2.084gを入れたフラスコに移液した。液を均一に混和、フラスコを窒素置換した後、ロータリエバポレータに接続し、回転しながら、65℃、80℃、90℃にそれぞれ2時間保温した。得られた液は、5.5μmグラスフィルタに移し、NMP50mL、メタノール50mL、アセトン50mLをそれぞれ何回かに分けて洗浄し、真空乾燥(60℃)した。収量2.262g、調製例1で得たシリカゲルに対する重量増加は8.5%、シリカゲル元素分析値はC:7.91、H:1.37、N:1.48(各%)であった。
得られたポリ(1−ビニル−2−ピロリドン)結合シリカゲルは、以下の構造を有していることが推定できた。
これらのカラムを用いてカフェインと3種のジメチルキサンチン異性体(テオフィリン、テオブロミン、パラキサンチン)をSFCで分析した結果(図1:実施例1、図3:実施例3、図5:比較例1)と、2’−,3’−,4’−ヒドロキシフラバノン異性体をSFCで分析した結果(図2:実施例1、図4:比較例1)を示す。
いずれも移動相はCO2/メタノール 9:1(v/v)、流速は4.0 mL/min、カラム温度は40℃、カラム背圧(BPR)は150 bar、検出にはUV検出器(254nm)を用いた。
図2と図4を比べると、比較例1の固定相では、2’−,3’−,4’−ヒドロキシフラバノン異性体の分離が不十分であることが分かる。図5(比較例1の固定相)を参照すると、2番目のピークにおいて、テオフィリンとテオブロミンが重なっていることが分かる。
Claims (14)
- 主鎖の繰り返し単位にピロリドン骨格またはピペリドン骨格と、イミド骨格とが含まれるポリマーが担持されている担体から構成される、クロマトグラフィー用の固定相。
- 以下の式(III−1)または(III−2)で示される構造を有する、請求項1に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
- 球状粒子状であることを特徴とする、請求項1または2に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
- 平均粒径が0.1μm〜1000μmであることを特徴とする、請求項3に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
- モノリス状であることを特徴とする、請求項1または2に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
- 超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用の固定相。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の固定相と、溶離液または超臨界流体を含む移動相とを用いて目的物質を分離する工程を含む、目的物質の分離方法。
- 前記重合性官能基が、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基またはω位に二重結合を有する炭素数4〜12のアルケニル基である、請求項8に記載のクロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
- 重合性官能基が結合している担体は、下記式(II)で表される化合物と、シリカゲルとをシランカップリングすることにより得られる表面修飾シリカゲルである、請求項8または9に記載のクロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
- 前記Wがビニル基であり、Xがアミド基または炭素数1〜3のN−アルキルアミド基であり、Yが炭素数1〜5のアルキレン基であり、Rが独立してメチル基、エチル基またはプロピル基であり、Zは炭素数1〜5のアルコキシ基、ハロゲン、炭素数1〜20のアルキルメルカプチル基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ピロリジノ基、イミダゾリル基、アリル基または2−メチル−2−プロペニル基である、請求項10に記載のクロマトグラフィー用の固定相の製造方法。
- 前記クロマトグラフィー用の固定相が超臨界流体クロマトグラフィー用の固定相である、請求項8〜13のいずれか一項に記載の製造方法。
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