JPWO2016174766A1 - 発光計測装置 - Google Patents

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Abstract

遮光室1006内に、保持容器101を収納する容器ラック1003と、液体を分注する分注機構2001と、試料と発光試薬との混合液を収容する反応容器104を同心円上に複数保持し、かつ反応容器104のうちの隣り合う少なくとも一組の間に、容器ラック1003が通過可能な間隔を設けて回転する回転板1005と、発光計測を行う光検出部2013と、を備えており、遮光室1006は、容器ラック1003を挿入可能な幅を有しかつ開閉可能に設けられた挿入口1008を有しており、回転板1005は、反応容器104が回転中に通過する領域の内側に容器ラック1003を設置可能な領域を備え、かつ遮光室1006が閉鎖された状態で回転可能に設けられている発光計測装置である。

Description

本発明は、発光計測により、試料中に含まれる細胞の存在の検知又は細胞数の計測を行う発光計測装置に関する。
医薬品製造事業者は、厚生労働省により定められた日本薬局方(局方)の規格に従い、医薬品原料や中間体、最終製品の微生物学的品質を管理するため、これらに含まれる微生物(細菌・真菌)の細胞数を計測することが義務付けられている。
細胞数の計測方法としては、一般に、所定期間の培養を経て形成されたコロニー数(CFU : Colony Forming Unit)を、目視で計測する培養法が採用されているが、培養時間に約1週間程度を要するため、原料受け入れ、中間体製造、最終製品出荷の各段階で、品質管理部門の細胞数の計測結果を待つ必要があり、事業者の経済的負荷が過大となっていた。
培養法より迅速な計測方法として、ATP(Adenosine TriPhosphate,アデノシン三リン酸)発光法が知られている。
ATP発光法は、試料中の生存微生物内から抽出されたATPを発光試薬と反応されて得られた発光を、光電子増倍管などの光検出部で計測し、得られた発光量から生存細胞数を見積もる方法であり(非特許文献1参照。)、光検出部近傍に試料容器を設置して計測が行われている。このため、一般的な発光計測装置の構造や感度では検出されなかった、単体の容器由来の発光が検出されることがある。
従来、発光検出による分析方法では、試料容器を遮光環境下で保存した後、試料容器由来の発光であるバックグラウンドノイズの計測を行い、バックグラウンドノイズの低い試料容器を選定する工程を繰り返すことが行われてきた(例えば特許文献1参照。)。
また、細菌1個相当のATP量は、真菌や人間などの大きい細胞に含まれるATP量と比較して微小である。このため、作業者や外部環境由来の物質が発光計測装置内に侵入して微生物汚染やATP汚染が生じると、細菌由来のATP量が過大に見積もられる。
微生物汚染やATP汚染を防止するためには、微生物の前処理や発光計測を含めた工程を、安全キャビネット等の清浄な空間に収めて行うことがよいことが知られており、細菌由来のATP量の測定精度を高めるには、測定装置の使用空間を、このような清浄空間内に限定することが求められる。実際の作業操作性を考慮すると、作業者が工程に介することなく、自動で各工程を実施できる計測装置を、安全キャビネット内に設置できるように小型化することが求められている。
例えば特許文献2には、複数の反応管が設置された反応ディスクの内側に、試薬庫を設置した自動化学分析装置が記載されている。また、特許文献3には、試薬ディスクと、サンプル分注チップ及び反応容器保持部材と、サンプル分注チップ及び反応容器搬送機構とを備えた分析装置が開示されている。
特開2008−96324号公報 特開平6−174730号公報 特開2011−153946号公報
Analytical Biochemistry 第319巻第287−295頁, 2003年
特許文献1に記載されているように、バックグラウンドノイズの低い容器を事前に選定し、試料容器として用いて発光計測を行った場合でも、発光検出時には再び試料容器由来のバックグラウンドノイズが検出されることが確認された。バックグラウンドノイズが検出されると、その都度、容器内の試料や試薬の入替えや、破棄を行う必要があり、計測時間の長期化や計測作業の煩雑化を招き、また環境汚染の原因となるおそれがある。
また特許文献2に記載された分析装置では、例えば試薬庫へ試薬ビンを収める際に、作業者の手の動線が反応ディスク上に重なり、作業者からの汚染が生じるおそれがある。さらにこの装置構成では、試薬庫に試薬ビンを収容するための作業者の動線が生じるため、試薬ビン収容のための開放面を確保する必要があり、遮光環境が十分に保たれないおそれがある。一方、特許文献3に記載されている装置では、作業者による動線が試薬ディスク等と重なり難い構成とされているものの、装置の横幅が広がり、全体的なサイズが肥大化し易くなる。
なお、発光計測装置に空調用モータを直接取り付けた場合には、モータの振動の影響で、測定結果にノイズが生じ易くなる。一方、空調用モータ等の清浄空間維持部を発光計測装置と分離して設置し、室内全体の清浄状態を維持しようとすると、電力消費量が著しく増大する。このため、高感度な発光計測を行うには、遮光環境の維持と清浄空間の維持の両立が重要な課題となる。
本発明は、遮光性に優れ、かつ外部環境や作業者からの汚染物質の侵入が少なく、測定対象の細胞を、高感度に計測することが可能な発光計測装置を提供することを目的とする。
本発明の好ましい実施形態としては、外部からの光を遮蔽する遮光室内に、試料又は前記試料と混合されて発光反応を生じさせる発光試薬から選択される少なくとも一つを各別に収容する保持容器を収納する容器ラックと、液体を分注する分注機構と、前記試料と前記発光試薬との混合液を収容する反応容器を同心円上に複数保持し、かつ前記反応容器のうちの隣り合う少なくとも一組の間に、前記容器ラックが通過可能な間隔を設けて回転する回転板と、前記回転板の開口部を介して、該開口部上に設けられる反応容器の底面と対向可能に設けられ、前記遮光室が閉鎖された状態で発光計測を行う光検出部と、を備えており、前記遮光室は、前記容器ラックを挿入可能な幅を有しかつ開閉可能に設けられた挿入口を有しており、前記回転板は、前記反応容器が回転中に通過する領域の内側に前記容器ラックを設置可能な領域を備え、かつ前記遮光室が閉鎖された状態で回転可能に設けられていることを特徴とする発光計測装置である。
本発明によれば、遮光性に優れ、かつ外部環境や作業者からの汚染物質の侵入が少なく、測定対象の細胞を、高感度に計測することが可能な発光計測装置を実現することができる。
実施形態に係る発光計測装置の一部を上方から見た状態を示す図である。 発光計測装置の内部構成を説明するための概略図である。 遮光室に容器ラックを導入するときの状態を示す図である。 遮光室に反応容器を設置するときの状態を示す図である。 遮光室内の反応容器をシャッターから廃棄する状態を示す図である。 容器ラックの近傍に恒温部を設けた発光計測装置の構成を示す図である。 回転板に恒温部を設けた発光計測装置の構成を示す図である。 発光計測装置の第1の実施形態に係る使用形態を説明するステップ図である。 光検出部により得られたフォトンカウンティングの計測値の変化を計測時間に対して示す図である。 発光計測装置の第2の実施形態に係る使用形態を説明するステップ図である。 発光計測装置の第3の実施形態に係る使用形態を説明するステップ図である。 ノズル洗浄時のノズル及び吸引部の動作について説明する図である。
以下に、図面を用いて本発明の実施の形態を説明する。
以下の説明では、実施形態の発光計測装置を、ATP発光法に適用した場合を例に説明する。
ATP発光法の検出対象となるATPは、生命活動のエネルギー源となる有機化合物であり、全生物の細胞内に存在する。
ATP発光法では、一般に、試料中で死んでいる微生物由来のATPを酵素で分解し、生存している微生物内のATPを界面活性剤等で抽出し、抽出されたATPを、例えばルシフェラーゼ・ルシフェリン等の発光試薬と発光反応させている。
このようにして得られた発光を、光電子増倍管などの光検出器で計測し、発光量から、試料中に含まれる生存細胞数が見積られる(非特許文献1参照。)。
微生物中のATP量は細胞の大きさに依存しており、細胞サイズが小さい細菌のATP量は約1.5×10−18mol ATP/CFU(0.001 fmol/CFU=1 amol/CFU)である(非特許文献1参照。)。
現在の一般的なATP法の検出感度は1×10−15〜1×10−16mol ATP(1〜0.1 fmol)であり、細菌1個相当のATPの検出感度に達しておらず、細菌約100〜1000個相当する。
このため、一般には、ATP法では微生物1〜100個相当の数や存在を確認できないのが現状である。しかしながら、本発明者らは、現在のATP発光法による検出感度の限界を超える、細菌1個相当の1×10−18molATPを検出可能な高感度の発光計測装置を開発しており、その開発過程において、これまでは誤差として扱われ、発光計測結果に反映されなかった発光現象を確認した。
この点について、本発明者らがさらに検討した結果、試料容器由来のバックグラウンドノイズ発生の有無は、測定環境下での発光計測装置の扉の開閉回数や開閉時間、及び試料容器への試料や試薬の導入時間に依存することを見出した。
すなわち、仮にバックグラウンドノイズが検出されない試料容器を選定して発光計測装置に設置しても、装置への設置後、扉の開放により、測定環境から装置内に光が侵入すると、この光を試料容器が吸収し、再び発光することで、バックグラウンドノイズが生じることが確認された。
特に多種類かつ多数の試料を計測する際には、従来は、扉の開閉を、測定試料の数に応じた回数行う必要があり、また装置内に設置される試料数が多くなると、その分、これらを設置するための扉の開口面積が増大する傾向にある。バックグラウンドノイズを低減するためには、試料容器の設置や破棄に要する扉の開閉回数を最小限に低減し、また扉の開口面積をできる限り小さくすることが求められる。
図1は、実施形態に係る発光計測装置の一部を上方から見た状態を示す図であり、図2は、発光計測装置の内部構成を説明するための概略図である。
なお、以下の説明においては、「試料」とは、検査対象となる細菌や真菌等の微生物を含む液状体であり、「試薬」とは、これらの微生物に含まれるATPと反応して発光する発光試薬、細胞を分解してATPを抽出するATP抽出試薬、生存細胞外に存在するATPを分解するATP消去試薬、細胞内に含まれるATPを増加させる試薬を包含するものである。
図1に示すように、発光計測装置は、遮光室1006内に、回転板1005と、回転板1005の中心領域に設置された容器ラック1003とが設けられている。
容器ラック1003には、試料又は発光試薬から選択される少なくとも一つを保持する保持容器101を設置するための保持容器設置部1001が設けられている。
また、回転板1005には、容器ラック1003の設置領域を囲むように、反応容器104(No.1〜No.16)を設置するための反応容器設置部1004(No.1〜No.16)が、回転板1005の外周に沿って全部で16個設けられている。各反応容器設置部1004(No.1〜No.16)の底面には、それぞれ開口部2002が設けられており(図2参照。)、各反応容器設置部1004(No.1〜No.16)には、その外周を囲むように、集光鏡1013が設けられている(図2参照。)。
反応容器104(No.1〜No.16)は、保持容器101から分注される、試料又は発光試薬のうちの少なくとも一方と、他方との混合液を収容するものであり、隣接する反応容器設置部1004 No.1と反応容器設置部1004 No.16との間には、容器ラック1003の幅よりやや幅広の間隔1007が設けられている。
容器ラック1003は、図2に示すように、支持台4003上に設けられたレール4002の上を移動するスライド4001と一体となるように設けられている。容器ラック1003は、スライド4001をレール4002上で移動させることで、反応容器104 No.1と反応容器104No.16との間の間隔1007を通って挿入口1008から遮光室1006の外に引き出され、また、スライド4001を回転板1005側に移動させることで、再度、反応容器設置部1004(No.1〜No.16)の内側の領域に設置されるように設けられている。
遮光室1006に設けられた挿入口1008には、挿入口1008を閉鎖するための扉1009が、開閉可能に設けられている。扉1009は、挿入口1008全体を閉鎖できるように設けられており、扉1009の中央領域には、さらに、扉1009より幅狭の小扉1010が開閉可能に設けられている。
図2に示すように、遮光室1006内には、回転板1005の上方に、液体の分注機能を有する分注機構2001が設けられている。
分注機構2001は、液体の吸引及び吐出を行うノズル2004と、ノズル2004を図2中矢印x方向(図2中左右方向)又は矢印z方向(図2中上下方向)に移動させるアーム2005を有している。
分注機構2001は、制御部2020によりアーム2005の動きが制御されるように構成されている。保持容器101内の試料又は試薬を反応容器104に分注する際は、まず、制御部2020によりアーム2005を矢印x方向に駆動して、ノズル2004の先端を保持容器101の上方に移動させた後、アーム2005を矢印z方向に駆動して、ノズル2004の先端を保持容器101内に導入し、保持容器101内の試料又は試薬を吸引する。次いで、制御部2020によりアーム2005を矢印x方向に駆動し、ノズル2004を反応容器104の上方に移動させた後、アーム2005を矢印z方向に駆動し、ノズル2004の先端を反応容器104内に導入して、ノズル2004内に吸引された試料又は試薬を反応容器104内に吐出する。なお、制御部2020は、遮光室1006外に設けられた不図示のコントローラにより適宜操作可能に構成されている。
回転板1005の下側には、回転板支持板1100が設置されている。回転板支持板1100は、回転板1005を支柱回避孔4005において貫通するように設けられた支柱4004により、支持台4003に吊設されており、回転板1005の中心領域の下側(支持台4003の下側)には、回転板支持板1100を貫通するように、回転板回転部2014が設けられている。
回転板回転部2014は、制御部2020により回転動作が制御可能に構成されており、回転板回転部2014の回転に伴い回転板1005が回転する。
図1に示すように、遮光室1006の外側には、回転ダイヤル1012が設けられている。回転板回転部2014及び回転板1005は、回転ダイヤル1012による操作によっても回転駆動可能に構成されている。
回転板支持板1100の下側には、発光計測を行う光検出部2003が設けられている。光検出部2003は、回転板1005の各反応容器設置部1004(No.1〜No.16)の底面に設けられた開口部2002を介して、この開口部2002上に設置される反応容器104の底面と対向可能に設けられており、制御部2020により、発光計測動作を制御可能に構成されている。
回転板支持板1100の形成材料は特に限定されないが、回転板支持板1100の光検出部2003と対向する領域は、光透過性を有する光検出部保護材2013で形成されている。
回転板支持板1100には、制御部2020により開閉動作を制御可能に構成されたシャッター1011が設けられており、シャッター1011の下側には、シャッター1011の開放時に、回転板1005の開口部2002から落下する反応容器104を収容する反応廃棄ボックス2012が設けられている。
スライド4001上には、例えば図6に示すように、容器ラック1003と隣接するように、保持容器101を加熱して恒温状態を維持する恒温部9001を設けることができる。図6では、恒温部9001を、容器ラック1003に隣接するように設けたが、恒温部9001は、例えばスライド4001の側面に設置することも可能である。
また、回転板1005の外周側、すなわち反応容器設置部1004にも、例えば図7に示すように、適宜反応容器104を加熱して恒温状態を維持する恒温部11001を設けることができる。
なお、恒温部9001及び恒温部11001は、図2には示していないが、恒温部9001及び恒温部11001も、上記した光検出部2003等と同様、制御部2020により加熱動作を制御可能に構成することができる。
遮光室1006内には、筒状体2006が設けられており、筒状体2006の内側には、筒状体2006の内壁に嵌合するように、有底のフィルター2007が設けられている。
筒状体2006は、遮光室1006の外部に設けられ、制御部2020により吸引動作を制御可能に構成された吸引部2008とチューブ2021で接続されている。
フィルター2007の種類は特に限定されないが、筒状体2006内に供給される液体の種類に応じて、適宜目粗さを選択して用いることで、吸引部2008による非吸引時には、筒状体2006内に供給された液体がフィルター2007上に貯留され、吸引部2008による吸引時には、筒状体2006内に供給された液体がフィルター2007を通過し、遮光室1006の外部に排出されるようにすることができる。
遮光室1006内には、隔壁2022を隔てて回転板1005と隣接する空間に、洗浄液を貯留した洗浄液タンク2011が設置されている。洗浄液タンク2011内に設置された吸引管2023は、三方弁2009を介して、ノズル2004と接続されており、三方弁2009には、さらにシリンジ2010が接続されている。三方弁2009は、制御部2020により切替動作を制御可能に構成されており、シリンジ2010は、制御部2020により、押出し動作及び引込み動作を制御可能に構成されている。
本実施形態の発光計測装置によれば、回転板1005の回転、ノズル2004の移動、及び光検出部2003の発光計測動作を、遮光室1006の挿入口1008を閉鎖したまま行うことができるため、挿入口1008の開閉回数を低減することができる。このため、測定環境からの迷光の侵入回数及び侵入量が低減され、試料容器由来の発光(バックグラウンドノイズ)を防止することができる。また、遮光室1006内に作業者の手を入れて行うことが必要な工程が低減されるため、作業者からの汚染が防止され、試料中の測定対象の細胞由来物質を、高感度で発光計測することが可能となる。また、装置全体を小型化し易いため、遮光管理や清浄度管理を行い易く、光の侵入や汚染物質の侵入が抑制された高感度での発光計測が可能となる。
また、本実施形態の発光計測装置は、扉1009に、扉1009より幅狭の小扉1010が設けられているため、挿入口1008から遮光室1006内に容器ラック1003を挿入して扉1009を閉じた後、反応容器104を、小扉1010から遮光室1006内に設置することができる。このため、扉1009や小扉1010の開閉回数や挿入口1008の開放面積を、必要最小限に止めることができ、測定環境からの光の侵入を大幅に低減することができる。
また、本実施形態の発光計測装置は、回転板1005の下側に、開閉可能に構成されたシャッター1011が備えられているため、挿入口1008を閉鎖したまま、発光計測終了後の反応容器104を回転板1005の下に廃棄することができる。このため、反応容器104の廃棄に伴う挿入口1008の開閉回数や開放時間を低減することができ、測定環境からの光の侵入が低減され、また作業者からの汚染が防止される。
また、実施形態の発光計測装置は、保持容器101に、ATP抽出試薬、ATP消去試薬、又は細胞内に含まれるATPを増加させる試薬からなる群から選択される少なくとも一つを収容して容器ラック1003に収納することで、容器ラック1003を遮光室1006内に設置して挿入口1008を閉鎖した後は、遮光室1006内で、作業者の手を介することなく、遮光環境と清浄空間を保持したまま、複数の前処理を行うことが可能である。このため、前処理を行うときの、測定環境からの光の侵入が低減され、また作業者からの汚染が防止される。
また、実施形態の発光計測装置によれば、恒温部9001又は恒温部11001を有しているため、遮光室1003内で、作業者の手を介することなく遮光環境と清浄空間を保持したまま、複数の前処理を行うことが可能である。このため、前処理を行うときの、測定環境からの光の侵入が低減され、また作業者からの汚染が防止される。
(第1の実施形態)
以下に、図1〜5に示す発光計測装置を用いた第1の実施形態に係る発光計測方法について、図8に沿って説明する。
第1の実施形態は、まず容器ラック1003に設置される保持容器101に試薬又は試料のうちの一方を収容し、回転板1005上に保持される反応容器104に他方を収容した後、保持容器101内の試薬又は試料を、反応容器104内に分注する形態である。
すなわち、第1の実施形態は、容器ラック1003上に、試薬が収容された保管容器101を設置し、回転板1005上に、試料が収容された反応容器104を設置し、挿入口1008を閉鎖後、保持容器101内の試薬を、反応容器104内に分注する形態、又は容器ラック103上に、試料が収容された保管容器101を設置し、回転板1005上に、試薬が収容された反応容器104を設置しておき、挿入口1008を閉鎖後、保管容器101内の試料を、反応容器104内に分注する形態である。
作業者は、まず以下の手順で試薬と試料を遮光室1006にセットする。
まず、保持容器101内に試薬又は試料を収容し、この保持容器101を、容器ラック1003へ収める(ステップ3001)。
次いで、図4に示すように、この容器ラック1003を遮光室1006内に設置する。まず、遮光室1006の扉1009を開く(ステップ3002)。スライド4001をレール4002上で移動させて挿入口1008から引き出し、スライド4001上へ容器ラック1003を載せる。容器ラック1003を載せた状態で、スライド4001を挿入口1008側に押し込み、レール4002上を移動させて、容器ラック1003を挿入口1008から間隔1007を有する反応容器104の間を通過させ、反応容器104が回転中に通過する領域の内側に設置する(ステップ3003)。扉1009を閉じる(ステップ3004)。
次いで、遮光室1006内に、反応容器104を設置する。
まず、反応容器104内に、試薬又は試料を収容する。本実施形態では、保持容器101に試薬を収容した場合には、反応容器104内には試料を収容し、保持容器101内に試料を収容した場合には、反応容器104内に試薬を収容する。以下の説明では、保持容器101内に、試薬として発光試薬を収容し、反応容器104内に試料を収容した場合について説明する。
次に、図4に示すように、遮光室1006の小型扉1010を開く(ステップ3005)。回転ダイヤル1012で回転板1005を回転させる(ステップ3006)。試料が収容された反応容器104 No.1を反応容器設置部1004 No.1に設置する(ステップ3007)。再び回転ダイヤル1012で回転板1005を回転させ、反応容器104 No.2を反応容器設置部1004 No.2に設置する。これを反応容器104の個数分繰り返す。その後、小型扉1010を閉じる(ステップ3008)。
次いで、作業者が発光計測を開始することで、以下のステップ(3010)〜(3022)は、制御部2020により自動で実行される(ステップ3009)。
回転板1005は、反応容器104 No.1が光検出部2003上へ位置するように回転する(ステップ3010)。光検出部2003は、反応容器104 No.1のバックグラウンドノイズを計測する(ステップ3011)。
[バックグラウンドノイズが検出されない場合]
図9に、光検出部2003により得られたフォトンカウンティングの計測値の計測時間に対する変化を示す。
実線で示される例のように、光検出部2003による計測開始から、発光試薬と試料の混合まで、バックグラウンドノイズが検出されなかった場合は、検出部の暗電流とバックグラウンドの合計値は低い水準で一定値を示している。バックグラウンドノイズが検出されない場合、反応容器104 No.1は、そのままの位置に留まる(ステップ3012)。
分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の保持容器101内の発光試薬を分取し、反応容器104 No.1へ分注する(ステップ3013)。
発光試薬と反応容器104内の試料との混合により生じた発光は、光検出部2003で計測される(ステップ3014)。発光計測完了後、回転板1005は、反応容器104 No.2が光検出部2003上へ位置するように回転する(ステップ3015)。再び、バックグラウンドノイズを計測する。これをNo.16まで繰り返す。
[バックグラウンドノイズが検出された場合]
一方、光検出部2003による計測開始から、発光試薬と試料との混合までの間にノイズが検出された場合は、図9に複数の破線で示される例のように、検出部の暗電流とバックグラウンドの合計は、高い水準で一定となったり、又は減少したりして変動する。
ノイズが検出された場合は(ステップ3016)、回転板1005は、反応容器104 No.2が光検出部2003上へ位置するように回転し(ステップ3015)、反応容器104 No.2を退避させる。光検出部2003は、反応容器104 No.2のバックグラウンドノイズを計測する(ステップ3011)。ノイズが検出されなかった場合(ステップ3012)、分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の保持容器101内の発光試薬を分取し、反応容器104 No.2へ分注する (ステップ3013)。発光試薬と反応容器104内の試料との混合により生じた発光は、光検出部2003で計測される(ステップ3014)。計測完了後、未計測の退避させた反応容器104 No.1があるため(ステップ3017)、回転板1005は、退避させた反応容器104 No.1が光検出部2003上に位置するように回転して戻す(ステップ3018)。再びバックグラウンドノイズを計測する (ステップ3011)。これを反応容器104 No.16まで繰り返す。
次いで、計測が完了した反応容器を廃棄する(図5参照。)。
発光計測が完了した反応容器104 No.1以降がシャッター1011上へ達した時点で(ステップ3019)、シャッター1011が開き(ステップ3020)、反応容器104 No.1は、廃棄ボックス2012内へ廃棄される(ステップ3021)。
反応容器104No.1〜No.16の全ての発光計測と廃棄が終了して、全工程が終了する(ステップ3022)。
(第2の実施形態)
以下に、図1〜6に示す発光計測装置を用いた第2の実施形態に係る発光計測方法について、図10に沿って説明する。
第2の実施形態は、試薬及び試料をそれぞれ各別に、保管容器101に収容して容器ラック1003に設置し、反応容器104を空の状態のまま回転板1005に設置する形態である。
第2の実施形態では、容器ラック1003中で、発光試薬以外の試薬と試料とを混合して前処理し、これと同時に反応容器104のバックグラウンドのチェックを行う。
すなわち、第2の実施形態は、容器ラック1003上に、発光試薬が収容された第1の保持容器101aと、ATP消去試薬が収容された第2の保持容器101bと、ATP抽出試薬が収容された第3の保管容器101cと、微生物試料が収容された第4の保持容器101dと、を設置しておき(図6参照。)、回転板1005上に、空の反応容器104を設置しておき、挿入口1008を閉鎖後、第2の保持容器101bのATP消去試薬及び第3の保持容器101c内のATP抽出試薬と、第4の保持容器101d内の微生物試料とを容器ラック1003上で混合して前処理すると同時に、反応容器104のバックグラウンドチェックを行った後、前処理後の混合液を、空の反応容器104に分注する形態である。
本実施形態では、容器ラック1003上での試料の前処理と並行して、反応容器104のバックグラウンドノイズの検出を行うことができるため、発光計測を効率的に行うことができる。
また、本実施形態では、少数の微生物と共存する各種薬剤感受性の時間変化を評価するため、高頻度で微生物試料を入れ替える必要がある際に利用しやすい。また多種類の微生物試料を取り扱う際に利用しやすい。
作業者は、まず以下の手順で試薬と試料を遮光室1006にセットする。
まず、第1の保持容器101aに発光試薬を収容し、第2の保持容器101bにATP消去試薬を収容し、第3の保持容器101cにATP抽出試薬を収容し、第4の保持容器101dに各種の微生物試料を収容し、これら第1の保持容器101a〜第4の保持容器101dを、容器ラック1003へ収める(ステップ8001)。
次いで、この容器ラック1003を、遮光室1006内に設置する。まず、図3に示すように、遮光室1006の扉1009を開く(ステップ8002)。
第1の実施形態と同様にして容器ラック1003を挿入口1008から引き出し、スライド4001上へ容器ラック1003を載せる。容器ラック1003を載せた状態で、スライド4001を挿入口1008側に押し込み、レール4002上を移動させて、容器ラック1003を挿入口1008から間隔1007を有する反応容器104の間(反応容器104 No.1と反応容器104 No.16との間)を通過させ、反応容器104が回転中に通過する領域の内側に設置する (ステップ8003)。扉1009を閉じる (ステップ8004)。
次いで、遮光室1006内に、反応容器104を設置する。まず、図4に示すように、遮光室1006の小型扉1010を開く(ステップ8005)。回転ダイヤル1012で回転板1005を回転させる(ステップ8006)。空の反応容器104 No.1を反応容器設置部1004 No.1に設置する(ステップ8007)。再び回転ダイヤル1012で回転板1005を回転させ、空の反応容器104 No.2を反応容器設置部1004 No.2に設置する。これを反応容器104の個数分繰り返す。
その後、小型扉1010を閉じる(ステップ8008)。
次いで、作業者が発光計測を開始することで、以下のステップ(8010)〜(8025)は、制御部2020により自動で実行される(ステップ8009)。
分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第2の保持容器101b内のATP消去試薬を分取し、第4の保持容器101d内の微生物試料へ分注する(ステップ8010)。
このとき、図6に示すように、一定時間(例えば30分間)、恒温部9001により容器ラック1003の全部または一部を恒温状態(例えば37℃)として、微生物試料中の非微生物由来のATPを消去する(ステップ8011)。
(ステップ8010)〜(ステップ8011)の分注・恒温と並行して、回転板1005は、反応容器104 No.1が光検出部2003上へ位置するように回転し、光検出部2003は、反応容器104 No.1のバックグラウンドノイズを計測する(ステップ8012)。
バックグラウンド検出の有無は、第1の実施形態で説明したのと同様にして、図9に例示されるような、フォトカウンティングの計測結果に基づいて判定する。反応容器104 No.1のバックグラウンドノイズの計測終了後、回転板1005は反応容器104 No.2が光検出部2003上へ位置するように回転する(ステップ8013)。再び、バックグラウンドノイズを計測する。これを反応容器104No.16まで繰り返す。
バックグラウンドノイズが検出された反応容器104がある場合には(ステップ8014)、回転板1005はバックグラウンドノイズが検出された反応容器104を再度光検出部2003上へ位置するように回転して戻し、再びバックグラウンドノイズを計測する (ステップ8015)。
一方、恒温部9001による保持容器101(ATP消去試薬と微生物試料の混合液)の恒温終了後、分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第3の保持容器101c内のATP抽出試薬を分取し、第4の保持容器101d内の微生物試料へ分注してATPを抽出する(ステップ8016)。
ATP抽出が終了した時点で、バックグラウンドノイズが消えない反応容器のNo.を記憶領域に格納し、当該反応容器への分注をスキップするように設定する(ステップ8017)。
一方、バックグラウンドノイズが検出された反応容器104がない場合には、上記(ステップ8015)、(ステップ8017)は省略し、ATP抽出(ステップ8016)が終了した時点で、次のステップに移行する。
分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第1の保持容器101a内の発光試薬を分取し、反応容器104 No.1へ分注する(ステップ8018)。
分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第4の保持容器101d内の微生物試料を分取し、発光試薬が収容されている反応容器104 No.1へ分注する(ステップ8019)。
発光試薬と試料との混合により生じた発光は光検出部2003で計測される (ステップ8020)。発光計測完了後、回転板1005は反応容器104 No.2が光検出部2003上へ位置するように回転する(ステップ8021)。
以降、記憶領域に格納された反応容器のNo.以外の反応容器104への、発光試薬の分注(ステップ8018)及び微生物試料の分注(ステップ8019)、さらに発光計測(ステップ8020)を、No. 16まで繰り返す。
次いで、計測が完了した反応容器104を廃棄する。図5に示すように、回転板1005の回転の繰返しにより、発光計測が完了した反応容器104 No.1以降がシャッター1011へ達した時点で(ステップ8022)、シャッター1011が開き(ステップ8023)、反応容器104は、廃棄ボックス2012内へ廃棄される (ステップ8024)。
反応容器104 No.1〜No.16の全ての発光計測と廃棄が終了して、全工程が終了する (ステップ8025)。
(第3実施形態)
以下に、図1〜5及び図7に示す発光計測装置を用いた第3の実施形態に係る発光計測方法について、図11に沿って説明する。
第3の実施形態は、各種試薬をそれぞれ各別に保持容器101に収容して容器ラック1003に設置し、反応容器104に微生物試料を収容して回転板1005上に設置する形態である。
第3の実施形態は、分注機構2001は試薬のみを分注し、微生物試料の分注を必要としない形態である。そして、回転板1005上で、微生物試料を恒温処理可能な形態である。
すなわち、第3の実施形態は、容器ラック1003上に、発光試薬が収容された第1の保持容器101aと、ATP消去試薬が収容された第2の保持容器101bと、ATP抽出試薬が収容された第3の保管容器101cと、を設置し、回転板1005上に、微生物試料が収容された反応容器104を設置しておき、挿入口1008を閉鎖後、第1の保持容器101a〜第3の保持容器101c内の試薬を、微生物試料を収容する反応容器104内に分注する形態である。
第3の実施形態によれば、反応容器104内に試料が収容された状態でバックグラウンド計測を行えるため、反応容器104だけでなく、発光試薬との混合前の試料単独の発光現象も確認することができる。また、第3の実施形態では、容器ラック1003には試薬だけをセットすればよいため、容器ラック1003の準備を簡易に行うことができる。
作業者は、まず以下の手順で試薬と試料を遮光室1006にセットする。
まず、第1の保持容器101a内に発光試薬を収容し、第2の保持容器101b内にATP消去試薬を収容し、第3の保持容器101c内にATP抽出試薬を収容し、第1の保持容器101a〜第3の保持容器101cを、容器ラック1003へ収める(ステップ10001)。
次いで、この容器ラック1003を遮光室1006内に設置する。まず、図3に示すように、遮光室1006の扉1009を開く(ステップ10002)。
第1の実施形態と同様にして容器ラック1003を挿入口1008から引き出し、スライド4001上へ容器ラック1003を載せる。容器ラック1003を載せた状態で、スライド4001を挿入口1008側に押し込み、レール4002上を移動させて、容器ラック1003を挿入口1008から、間隔1007を有する反応容器104の間(反応容器104 No.1と反応容器104 No.16との間)を通過させ、反応容器104が回転中に通過する領域の内側に設置する(ステップ10003)。扉1009を閉じる (ステップ10004)。
次いで、遮光室1006内に、反応容器104を設置する。まず、反応容器104内に、試料を収容する。 次いで、図4に示すように、遮光室1006の小型扉1010を開く(ステップ10005)。回転ダイヤル1012で回転板1005を回転させる(ステップ10006)。
微生物試料を収めた反応容器104 No.1を反応容器設置部1004 No.1に設置する(ステップ10007)。再び回転ダイヤル1012で回転板1005を回転させ、微生物試料を収めた反応容器104 No.2を反応容器設置部1004 No.2に設置する。これを反応容器104の個数分繰り返す。その後、小型扉1010を閉じる(ステップ10008)。
次いで、作業者が発光計測を開始することで、以下のステップ(10010)〜(10025)は、制御部2020により自動で実行される(ステップ10009)。
分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第2の保持容器101b内のATP消去試薬を分取し、反応容器104内の微生物試料へ分注する (ステップ10010)。
図7に示すように、恒温部11001により、反応容器104を一定時間(例えば30分間)恒温状態(例えば37℃)として、微生物試料中の非微生物由来のATPを消去する(ステップ10011)。
恒温処理終了後、分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第3の保持容器101c内のATP抽出試薬を分取し、反応容器104内の微生物試料へ分注してATPを抽出する(ステップ10012)。
図1に示すように、回転板1005は、反応容器104 No.1が光検出部2003上へ位置するように回転する(ステップ10013)。光検出部2003は、反応容器104 No.1のバックグラウンドノイズを計測する (ステップ10014)。
[バックグラウンドノイズが検出されない場合]
バックグラウンド検出の有無は、第1の実施形態で説明したのと同様にして、図9に例示されるような、フォトカウンティングの計測結果に基づいて判定する。
図9に示すように、バックグラウンドノイズが検出されない場合、反応容器104 No.1は、そのままの位置に留まる(ステップ10015)。
分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第1の保持容器101a内の発光試薬を分取し、反応容器104 No.1へ分注する(ステップ10016)。
発光試薬と反応容器104内の試料との混合により生じた発光は光検出部2003で計測される(ステップ10017)。発光計測完了後、回転板1005は、反応容器104 No.2が光検出部2003上へ位置するように、回転する(ステップ10018)。再び、バックグラウンドノイズを計測する。これをNo.16まで繰り返す。
[バックグラウンドノイズが検出された場合]
図9に示すように、ノイズが検出された場合は(ステップ10019)、回転板1005は反応容器104 No.2が光検出部2003上へ位置するように回転し(ステップ10018)、反応容器104 No.1を退避させる。光検出部2003は、反応容器104 No.2のバックグラウンドノイズを計測する (ステップ10014)。
反応容器104 No.2のノイズが検出されなかった場合(ステップ10015)、分注機構2001は、制御部2020により制御されて、容器ラック1003の第1の保持容器101a内の発光試薬を分取し、反応容器104 No.2へ分注する (ステップ10016)。
発光試薬と反応容器104内の試料との混合により生じた発光は光検出部2003で計測される(ステップ10017)。発光計測完了後、未計測の退避させた反応容器104 No.1があるため(ステップ10020)、回転板1005は、退避させた反応容器104 No.1を光検出部2003上へ位置するように回転して戻す(ステップ10021)。再びバックグラウンドノイズを計測する(ステップ10014)。これを反応容器104No.16まで繰り返す。
次いで、計測が完了した反応容器104を廃棄する。図5に示すように、発光計測が完了した反応容器104 No.1以降がシャッター1011へ達した時点で(ステップ10022)、シャッター1011が開き(ステップ10023)、反応容器104 No.1は、廃棄ボックス2012内へ廃棄される(ステップ10024)。
反応容器104No.1〜No.16の全ての発光計測と廃棄が終了して、全工程が終了する (ステップ10025)。
以上の第1の実施形態〜第3の実施形態では、図1〜図7に示す発光計測装置にATP発光法を適用した場合を例に説明したが、図1〜図7に示す発光計測装置は、必ずしもATP発光法による発光計測への適用に限定されるものではない。
(第1の実施形態〜第3の実施形態)
次に、ノズルの洗浄工程について説明する。図12は、ノズル洗浄時のノズル及び吸引部の動作について説明する図である。
保持容器101内の試薬又は試料の少なくとも何れか1つを分取する前に、制御部2020によりアーム2005を駆動し、ノズル2004を筒状体2006内のフィルター2007上に導入する。
次いで、制御部2020により吸引部2008の吸引動作を開始する。吸引部2008による吸引と並行して、ノズル2004内に吸引された洗浄液を、三方弁2009を経由してシリンジ2010により押し出し、筒状体2006内のフィルター2007上へ吐出する。これにより、ノズル2004の内部を洗浄する。フィルター2007上の洗浄液は、吸引部2008の吸引により、筒状体2006外に速やかに排出される(図12A)。
続いて、制御部2020により吸引部2008を停止する。再びシリンジ2010の押し出しを行うことで、ノズル2004内に吸引された洗浄液を筒状体2006内のフィルター2007上へ吐出する。吸引部2008を停止しているため、フィルター2007上に吐出された洗浄液12001はフィルター2007上に留まる。この洗浄液12001にノズル2004の先端を導入することで、ノズル2004の外壁を洗浄する(図12B)。
その後、ノズル2004により保持容器101内の試薬又は試料の少なくとも何れか1つを分取しているときも、吸引部2008の吸引は引き続き停止しているため、洗浄液12001は、フィルター2007の抵抗によりフィルター2007上に留まり続ける(図12C)。
続いて、制御部2020によりアーム2005を駆動して、ノズル2004により保持容器101内の試薬又は試料の少なくとも何れか1つを分取し、分取した試薬又は試料を反応容器104に分注した後、ノズル2004を再度筒状体2006上に移動させ、その先端を洗浄液12001内へ導入する。これにより、試薬又は試料の少なくとも何れかが付着したノズル2004の外壁を洗浄する(図12D)。
ノズル2004外壁の洗浄後、制御部2020により吸引部2008の吸引動作を開始することで、フィルター2007上の洗浄水を排出する(図12E)。ノズル2004は、分取した試薬と試料の少なくとも何れか1つを分注し、再び、ノズル2004内の洗浄(図12A)を開始する。
これにより、作業者による実作業を介することなく、遮光環境と清浄空間を維持したまま、分注機構2001の内外の洗浄が可能となる。また、洗浄液の使用量を最少限に止めて行うことができ、洗浄に伴う消耗部材も不要である。
以上説明した実施形態に係る発光計測装置によれば、挿入口1008を開けることなく、遮光室1006を密閉したまま、保持容器101内の試薬又は試料の反応容器104への分注や、回転板1005の回転、反応容器104の廃棄を行うことができる。このため、試料容器由来の発光(バックグラウンドノイズ)を防止することができ、また作業者からの汚染を防止することができる。このため、生細胞や死細胞、細菌や真菌(酵母・カビ等)、芽胞や胞子、非芽胞、好気性や嫌気性、グラム陰性やグラム陽性などの菌を、直接、または試料に含まれた状態で、多品種を短時間で高感度に発光計測することができる。
また、実施形態に係る発光計測装置によれば、試料又は試薬が収められた容器ラック1003は、回転板1005の内側の領域に収められるとともに、発光計測の対象外となった反応容器104や、発光計測済みの反応容器104は、自動的に一箇所(廃棄ボックス2012)に破棄される。このため、装置全体を小型化し易く、遮光管理や清浄度管理を行い易い。従って、試料容器由来のバックグラウンドノイズを防止することができ、測定環境や作業者からの汚染の無い、高感度な発光計測を行うことが可能となるとともに、清浄度管理に必要な電力や空間を削減することができる。このため、汚染リスクを最小化することができる。
また、以上説明した実施形態に係る発光計測装置によれば、光検出部2003による発光検出時に、試料容器由来の発光が検出されても、試料を収めたまま、反応容器104を遮光環境で一時的に退避させることが可能である。この際、反応容器104は遮光環境で保持されるため、反応容器104を発光させる光のさらなる侵入は防止されており、また、反応容器104由来の光の消光を再度確認することが可能である。このため、消光した反応容器104に関しては、反応容器104や試料の廃棄(喪失)、及び試料の入れ替えが不要となり、多品種を短時間で、高感度にかつ効率的に発光計測することができる。
101…保持容器、1001…保持容器設置部、1003…容器ラック、104(No.1〜No.16)…反応容器、104(No.1〜No.16)…反応容器設置部、1005…回転板、1006…遮光室、1007…間隔、1008…挿入口、1009…扉、1010…小扉、1011…シャッター、1012…回転ダイヤル、1013…集光鏡、1100…回転板支持板、2001…分注機構、2002…開口部、2003…光検出部、2004…ノズル、2005…アーム、2006…筒状体、2007…フィルター、2008…吸引部、2009…三方弁、2010…シリンジ、2011…洗浄液タンク、2012…反応廃棄ボックス、2013…光検出部保護材、2014…回転板回転部、2020…分注機構制御部、2021…チューブ、2022…隔壁、2023…吸引管、4001…スライド、4002…レール、4003…支持台、4004…支柱、4005…支柱回避孔、9001…恒温部、11001…恒温部、12001…洗浄液

Claims (13)

  1. 外部からの光を遮蔽する遮光室内に、
    試料又は前記試料と混合されて発光反応を生じさせる発光試薬から選択される少なくとも一つを各別に収容する保持容器を収納する容器ラックと、
    液体を分注する分注機構と、
    前記試料と前記発光試薬との混合液を収容する反応容器を同心円上に複数保持し、かつ前記反応容器のうちの隣り合う少なくとも一組の間に、前記容器ラックが通過可能な間隔を設けて回転する回転板と、
    前記回転板の開口部を介して、該開口部上に設けられる反応容器の底面と対向可能に設けられ、前記遮光室が閉鎖された状態で発光計測を行う光検出部と、を備えており、
    前記遮光室は、前記容器ラックを挿入可能な幅を有しかつ開閉可能に設けられた挿入口を有しており、
    前記回転板は、前記反応容器が回転中に通過する領域の内側に前記容器ラックを設置可能な領域を備え、かつ前記遮光室が閉鎖された状態で回転可能に設けられていることを特徴とする発光計測装置。
  2. 前記分注機構は、前記遮光室が閉鎖された状態での分注動作が可能に設けられていることを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  3. 前記遮光室には、前記挿入口を閉鎖する扉が設けられており、前記扉には、該扉より幅狭の小扉が設けられていることを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  4. 遮光室の外部には、前記回転板を回転させる回転ダイヤルが設けられていることを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  5. 前記回転板の下側には前記遮光室が閉鎖された状態で開閉動作が可能なシャッターが備えられていることを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  6. 前記発光計測装置は、前記回転板、前記分注機構、前記光検出部及び前記シャッターをそれぞれ制御する制御部を備えていることを特徴とする請求項5記載の発光計測装置。
  7. 前記保持容器には、前記試料に含まれる細胞外の物質を分解する試薬、前記試料に含まれる細胞内の物質を増加させる試薬、及び前記試料に含まれる細胞を分解する試薬からなる群から選択される少なくとも一つが収容されることを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  8. 前記保持容器又は前記反応容器のうちの少なくとも一方を加熱して恒温状態を保持できる恒温部を有することを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  9. 前記回転板の中央領域には、レールを備えた支持台が設けられており、
    前記容器ラックは、前記レール上を移動可能に設けられたスライドに保持されることを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  10. 前記発光計測装置には、先端に筒状体を有し、該筒状体内部の空間に供給された液体を吸引する吸引部が設けられており、
    前記筒状体の内部には、該筒状体の内壁に嵌合するように、有底のフィルターが設けられていることを特徴とする請求項1記載の発光計測装置。
  11. 前記分注機構には、洗浄液を貯留した洗浄液タンクが接続されていることを特徴とする請求項10記載の発光計測装置。
  12. 前記制御部は、前記分注機構の先端を前記筒状体の上方に移動させ、前記吸引部による吸引時には、前記洗浄液タンクから吸引した洗浄液を前記フィルター内の空間に吐出させるように制御し、前記吸引部による非吸引時には、前記洗浄液タンクから吸引した洗浄液を前記フィルター内の空間に吐出させるとともに、該フィルター上に貯留された前記洗浄液に前記分注機構の先端を導入させるように制御することを特徴とする請求項11記載の発光計測装置。
  13. 前記制御部は、
    前記保持容器内に収容された前記試薬又は前記試料の前記反応容器内への分注前に、前記分注機構の先端を前記筒状体の上方に移動させ、前記吸引部による非吸引時に、前記洗浄液タンクから吸引した洗浄液を前記フィルター内の空間に吐出させ、
    前記保持容器内に収容された前記試薬又は前記試料の前記反応容器内への分注後に、前記分注機構の先端を再度前記筒状体の上方に移動させ、該フィルター上に貯留された前記洗浄液内に前記分注機構の先端を導入するように制御することを特徴とする請求項12記載の発光計測装置。
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