JPWO2016052690A1 - 免疫測定用ブロッキング方法及び免疫測定用器具 - Google Patents
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Abstract
Description
また、本発明はさらなる側面において、血液試料中に含まれる2種以上のタンパク質を測定する免疫測定に用いる器具であって、前記器具の前記血液試料と接触する面の少なくとも一部に、前記2種以上のタンパク質のそれぞれの非特異吸着を防止する2種以上のブロッキング剤のコーティング層を有する器具を提供する。
2種以上のブロッキング剤で測定用器具をコーティングする場合、全てのブロッキング剤のコーティングが終わった時の各測定対象物質(タンパク質)と測定用器具との非特異結合の防止効果は、各ブロッキング剤のコーティングの順序によって異なってくる。本発明の好ましい態様では、2種以上の測定対象物質(タンパク質)のうち、分子量の小さい方の測定対象物質(タンパク質)に対するブロッキング剤から順にコーティングすることにより、最も効果的な非特異吸着防止効果が得られる(後記実施例参照)。
1.本発明のブロッキング方法について
本発明のブロッキング方法の一態様は、
「血液試料中に含まれる2種以上のタンパク質を同じ測定用器具を用いて測定する免疫測定のためのブロッキング方法であって、前記2種以上のタンパク質のそれぞれの非特異吸着を防止する2種以上のブロッキング剤によって、前記血液試料と接触する器具の表面の少なくとも一部をコーティングするブロッキング方法」
である。
本発明のブロッキング方法は、血液試料に含まれる2種以上のタンパク質を免疫測定するためのブロッキング方法である。この場合の血液試料は、ヒトや動物から採取された血液由来の試料であり、例えば、全血、血漿、血清、血球、その他目的に応じた調製を行ったものを試料とすることができる。
本発明でブロッキングとは、測定対象物質が測定用器具(採血管、フィルター、ウエル又は流路を備えたプレート等)の表面に非特異的に吸着することを防止することをいい、本発明でブロッキング剤とは、このような吸着を防止する物質をいう。
本発明で用いるブロッキング剤は、通常、タンパク質のブロッキングに用いられているブロッキング剤の中から、測定対象物質であるタンパク質のブロッキングに適したものを選定すればよい。タンパク質のブロッキングに用いられているブロッキング剤の例としては、スキムミルク、フィッシュゼラチン、ウシ血清アルブミン(BSA)、界面活性剤、カゼイン、プロタミン、ポリエチレングリコール、トレハロース、デキストラン等がある。
本発明のブロッキング方法は、同じ測定用器具(採血管、フィルター、ウエル又は流路を備えたプレート等)を用いて、同一の血液試料に含まれる2種以上の測定対象物質を免疫測定する場合に用いられる。例えば、1本の採血管に採取した血液試料を、1個のフィルターでろ過し、ウエルまたは流路を有する1枚のプレートで、2種以上の測定対象物質を免疫測定する場合である。このような場合であっても、本発明のブロッキング方法により、前述の効果が得られる。この場合、例えば、1枚のプレートを用いて2種以上の測定対象物質を免疫測定する場合、プレート上には2種以上の測定対象物質に対応した2種以上の1次抗体が、それぞれ異なるウエルまたは流路中の所定の領域(測定領域)に固定化されているが、このような2種以上のウエルまたは領域で免疫測定をする実施形態であっても「同じ測定用器具を用いて測定する」ことに含まれる。測定器具の材質は特に制限はなく、個々の測定器具の材質の例は前述の通りである。
前述の通り選定したブロッキング剤によって、測定用器具の血液試料が接触する表面(例えば、採血管内面、フィルター内部、プレートの流路とウエル等)の少なくとも一部、好ましくは全面をコーティングする。この場合のコーティング方法は通常用いられている方法によればよく、例えば、ブロッキング剤を溶液状態として、測定用器具の血液試料が接触する表面に加えて覆い、所定時間保持後、測定用器具からブロッキング剤を除去すればよい。コーティングの処理条件は、例えば、ブロッキング剤溶液で覆った状態で室温で1時間保持し、純水で洗浄後、乾燥させることが挙げられる(後記実施例参照)。
測定対象物質とブロッキング剤の組合せの一例は次の通りである。
上記のようにして、血液試料に含まれる2種以上の測定対象物質に対するブロッキング剤で測定用器具をコーティングした後は、コーティングした同じ測定用器具(採血管、フィルター、ウエル又は流路を備えたプレート等)を用いて、一つの血液試料に含まれる当該2種以上の測定対象物質について目的とする免疫測定を行う。免疫測定の方法は特に制限はなく、通常用いられているELISAその他の方法で検出、定量等を行えばよい。
本発明の免疫測定用器具の一態様は、
「血液試料中に含まれる2種以上のタンパク質を測定する免疫測定に用いる器具であって、前記器具の前記血液試料と接触する面の少なくとも一部に、前記2種以上のタンパク質のそれぞれの非特異吸着を防止する2種以上のブロッキング剤のコーティング層を有する器具」
である。
本発明の免疫測定用器具は、2種以上のブロッキング剤のコーティング層を有する。ここで、2種以上のブロッキング剤や免疫測定用器具へのコーティング方法については、前述の通りである。
本発明の免疫測定用器具についてのその他の説明は、前述の「1.本発明のブロッキング方法について」の説明の通りである。
測定対象物質(多重染色する心筋マーカー)の組み合わせとブロッキング剤の関係は後記の表1に示す。また、各比較例、実施例における回収率を比較した結果は、後記の表3〜4及び図1〜2に示す。
cTnI(トロポニンI、分子量:約23500)に対しブロッキング効果(回収率85%)が確認されたカゼイン(サーモフィッシャー製:Casein in PBS)をガラスフィルターにブロッキングした系において、BNP(分子量:約3500)に対するブロッキング効果を確認したところ、回収率は1%と低値となった(表3、図1参照)。
BNPに対しブロッキング効果(回収率85%)が確認されたプロタミン(和光純薬: プロタミン硫酸塩・サケ由来)をガラスフィルターにブロッキングした系において、cTnIに対するブロッキング効果を確認したところ、回収率は20%と低値となった(表3、図1参照)。
cTnIに対しブロッキング効果(回収率85%)が確認されたカゼイン(サーモフィッシャー製:Casein in PBS)をガラスフィルターにブロッキングした系において、NT−proBNP(分子量:約8500)に対するブロッキング効果を確認したところ、回収率は53%と低値となった(表4、図2参照)。
NT−proBNPに対しブロッキング効果(回収率83%)が確認されたBSA(サーモフィッシャー製:BSA in PBS)をガラスフィルターにブロッキングした系において、cTnIに対するブロッキング効果を確認したところ、回収率は55%と低値となった(表4、図2参照)。
BNPに対しブロッキング効果が確認されたプロタミン(和光純薬: プロタミン硫酸塩・サケ由来)をブロッキング後、cTnIに対しブロッキング効果が確認されたカゼイン(サーモフィッシャー製:Casein in PBS)をブロッキングしたところ、回収率はBNPが80%、cTnIが85%と、いずれも高回収率となった(表3、図1参照)。
cTnIに対しブロッキング効果が確認されたカゼイン(サーモフィッシャー製:Casein in PBS)をブロッキング後、BNPに対しブロッキング効果が確認されたプロタミンをブロッキングしたところ、回収率はBNPが82%、cTnIが56%と、cTnIの回収率は実施例1に比べ低値となった(表3、図1参照)。
カゼイン(サーモフィッシャー製:Casein in PBS)中にプロタミン(和光純薬: プロタミン硫酸塩・サケ由来)を1:1で混ぜ、ブロッキングを行ったところ、回収率はBNPが56%、cTnIが85%となり、BNPの回収率は実施例1に比べて低値となった(表3、図1参照)。
NT−proBNPに対しブロッキング効果が確認されたBSA(サーモフィッシャー製:BSA in PBS)をブロッキング後、cTnIに対しブロッキング効果が確認されたカゼイン(サーモフィッシャー製:Casein in PBS)をブロッキングしたところ、回収率はNT−proBNPが82%、cTnIが84%と、いずれも高回収率となった(表4、図2参照)。
cTnIに対しブロッキング効果が確認されたカゼイン(サーモフィッシャー製:Casein in PBS)をブロッキング後、NT−proBNPに対しブロッキング効果が確認されたBSA(サーモフィッシャー製:BSA in PBS)をブロッキングしたところ、回収率はNT−proBNPが81%、cTnIが52%と、cTnIの回収率は実施例4に比べ低値となった(表4、図2参照)。
Claims (8)
- 血液試料中に含まれる2種以上のタンパク質を同じ測定用器具を用いて測定する免疫測定のためのブロッキング方法であって、前記2種以上のタンパク質のそれぞれの非特異吸着を防止する2種以上のブロッキング剤によって、前記血液試料と接触する前記器具の表面の少なくとも一部をコーティングするブロッキング方法。
- 前記2種以上のタンパク質のうち、分子量の小さいタンパク質の非特異吸着を防止するブロッキング剤から分子量の大きいタンパク質の非特異吸着を防止するブロッキング剤へ順にコーティングを実施する、請求項1に記載の方法。
- 前のブロッキング剤が乾燥した後に次のブロッキング剤のコーティングを実施する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記タンパク質、前記ブロッキング剤、及びコーティングを実施する順序が次のいずれかである、請求項2又は3に記載の方法。
(1)前記タンパク質がBNP及びトロポニンIであり、前記ブロッキング剤がプロタミン及びカゼインであり、プロタミンのコーティングの次にカゼインのコーティングを実施する。
(2)前記タンパク質がNT−proBNP及びトロポニンIであり、前記ブロッキング剤がBSA及びカゼインであり、BSAのコーティングの次にカゼインのコーティングを実施する。 - 血液試料中に含まれる2種以上のタンパク質を測定する免疫測定に用いる器具であって、前記器具の前記血液試料と接触する面の少なくとも一部に、前記2種以上のタンパク質のそれぞれの非特異吸着を防止する2種以上のブロッキング剤のコーティング層を有する器具。
- 前記2種以上のタンパク質のうち、分子量の小さいタンパク質の非特異吸着を防止するブロッキング剤のコーティング層の上に、分子量の大きいタンパク質の非特異吸着を防止するブロッキング剤のコーティング層をそれぞれ順に有する請求項5に記載の器具。
- 採血管、フィルター、又はウエル若しくは流路を備えたプレートである、請求項5又は6に記載の器具。
- 前記タンパク質、前記ブロッキング剤、及びコーティング層を有する順序が次のいずれかである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の器具。
(1)前記タンパク質がBNP及びトロポニンIであり、前記ブロッキング剤がプロタミン及びカゼインであり、プロタミンのコーティング層の上にカゼインのコーティング層を有する。
(2)前記タンパク質がNT−proBNP及びトロポニンIであり、前記ブロッキング剤がBSA及びカゼインであり、BSAのコーティング層の上にカゼインのコーティング層を有する。
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