WO2014189143A1

WO2014189143A1 - 対象物質の濃度測定方法、イムノクロマトグラフィーキットおよびイムノクロマトグラフィー装置

Info

Publication number: WO2014189143A1
Application number: PCT/JP2014/063751
Authority: WO
Inventors: 秀和新井; 勝雄中村; 俵田　啓
Original assignee: 株式会社住化分析センター; 関西電力株式会社
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2014-11-27
Also published as: JPWO2014189143A1

Abstract

　本発明は、クロマトグラフィー法を用いた目視での濃度判定を可能とする方法であり、液体試料と対象物質に特異的に結合する抗体とを接触させる接触工程と、上記接触工程において上記対象物質と複合体を形成しなかった上記抗体を第１捕捉物質によって捕捉する第１捕捉工程と、上記第１捕捉工程において捕捉されなかった上記抗体を第２捕捉物質によって捕捉する第２捕捉工程と、上記対象物質の濃度を測定する測定工程と、を含む。

Description

対象物質の濃度測定方法、イムノクロマトグラフィーキットおよびイムノクロマトグラフィー装置

　本発明は、イムノクロマトグラフィー法を用いた試料液中の対象物質の濃度測定方法、イムノクロマトグラフィーキットおよびイムノクロマトグラフィー装置に関する。

　重金属類、特にカドミウムは、人体および環境に対する有害性から、公的機関によって飲料水や地下水における水質基準、土壌における環境基準、環境への排出基準が設けられている。また、農作物、水産物、畜産物等に含まれている重金属の量を検査することは重要である。

　重金属類を検出する方法として、化学的測定法を利用した目視判定キットが利用されている。例えば、共立理化学研究所社製の「パックテスト（登録商標）　金属総量（５種）
　型式　ＷＡＫ－Ｍｅ」は、ＰＡＮ比色法（PAN Color Comparison Method）を利用しており、試料液中に銅、亜鉛、マンガン、ニッケルおよびカドミウムのいずれかが含まれている場合に発色するため、これらの金属の有無を目視にて確認することができる。しかし、このような化学的測定法を利用した目視判定キットは、一般的に、検出感度が低く、検出対象物質に対する選択性も低い。このため、より高感度且つ選択性の高い重金属類の検出方法が求められている。

　そこで、イムノクロマトグラフィー法によって、重金属類を検出することが試みられている。イムノクロマトグラフィー法は、試料液中に含まれている検出対象物質を、抗原抗体反応を利用することによって簡易的に且つ短時間で検出する方法であり、特に、医療分野において、妊娠判定や感染症の診断等に広く利用されている。

　例えば、非特許文献１には、金コロイド標識した抗カドミウム－エチレンジアミン四酢酸錯体（Ｃｄ－ＥＤＴＡ）モノクローナル抗体を用いて、米に含まれているカドミウムをイムノクロマトグラフィー法によって検出することが開示されている。さらには、イムノクロマトグラフィー装置のテストラインに出現するバンドの濃さを、クロマトリーダーを用いて数値化することによって、得られた数値に基づきカドミウムの濃度を定量できることも開示されている。

佐々木　和裕ら，BUNSEKI KAGAKU, Vol 56, No. 1, pp. 29-36 (2007)

　イムノクロマトグラフィー法は、抗原抗体反応を利用するため、従来の化学的測定法を利用した検出方法と比較して高感度且つ選択性が高いという利点を有する。しかし、イムノクロマトグラフィー法は、主として定性的な判定に使用され、定量的な使用には適していない。非特許文献１には、テストラインに出現するバンドの濃さを、クロマトリーダーを用いて数値化することによって、カドミウムの濃度を定量できることが開示されているが、目視で濃度を判定することは極めて困難であるという課題を有する。

　また、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置では、テストラインの濃さは、試料液中にカドミウムが存在しない場合に最も濃くなり、試料液中のカドミウムの濃度の増大に伴い薄くなる。実際、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置では、カドミウムの濃度が０．０１ｍｇｋｇ^－１～０．１ｍｇｋｇ^－１の範囲で、テストラインの濃さとカドミウム濃度との間に直線関係が認められている。しかし、例えば、試料液中のカドミウムが０．０１ｍｇｋｇ^－１より低濃度の場合にはテストラインの濃さに基づく濃度判定は極めて困難である。

　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、クロマトグラフィー法を用いた目視での濃度判定を可能とする方法を提供することにある。

　本発明者らは、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置におけるテストラインの下流に、抗Ｃｄ－ＥＤＴＡモノクローナル抗体を捕捉可能な抗体を固定化した領域（コントロールライン）を設けた新たなイムノクロマトグラフィー装置を作製した。そして、かかる新規イムノクロマトグラフィー装置において、コントロールラインに出現するバンドの濃さと試料液中に含まれているカドミウムの濃度とに相関があること、およびコントロールラインの濃さ（発色強度）と色見本とを比較することによって、目視での濃度の判定が可能となることを初めて見出し、かかる新規知見に基づいて本発明を完成させるに至った。通常、イムノクロマトグラフィー装置におけるコントロールラインは、テストラインにおける発色の有効性を確認するために設けられているものである。このため、コントロールラインの発色を指標として対象物質の有無を判定するという発想自体がこれまでにない。また、コントロールラインの発色強度に基づいて対象物質の濃度を目視で判定できるという報告もこれまでに全くない。そもそも、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置には、コントロールライン自体が設けられていない。

　すなわち、上記の課題を解決するために、本発明に係る測定方法は、イムノクロマトグラフィー法を用いて試料液中の対象物質の濃度を測定する方法であって、
　上記試料液と、当該対象物質に特異的に結合する抗体とを接触させる接触工程と、
　上記接触工程において上記対象物質と複合体を形成しなかった上記抗体を、第１捕捉物質によって捕捉する第１捕捉工程と、
　上記第１捕捉工程において捕捉されなかった上記抗体を、第２捕捉物質によって捕捉する第２捕捉工程と、
　上記対象物質の濃度を測定する測定工程と、を含み、
　上記測定工程では、上記対象物質の濃度を、上記第２捕捉工程において捕捉した上記抗体に結合された標識物質の発色強度に基づいて測定することを特徴としている。

　本発明に係る測定方法では、上記測定工程では、上記対象物質の濃度を、上記第２捕捉工程において捕捉した上記抗体に結合された上記標識物質の発色と色見本とを目視で比較することによって測定してもよい。

　本発明に係る測定方法では、上記測定工程では、さらに、上記第１捕捉工程において捕捉した上記抗体に結合された標識物質の発色強度に基づいて、上記対象物質の濃度を測定してもよい。

　本発明に係る測定方法では、上記第１捕捉工程では、上記測定工程において、上記複合体を形成しなかった上記抗体に由来する発色が検出されないように、上記複合体を形成しなかった上記抗体を捕捉することが好ましい。

　本発明に係る測定方法では、上記対象物質は、重金属であり得る。

　本発明に係る測定方法では、上記重金属は、カドミウムであり得る。

　本発明に係るキットは、本発明に係る測定方法に用いるためのイムノクロマトグラフィーキットであって、
　イムノクロマトグラフィー装置と、色見本とを少なくとも備え、
　上記イムノクロマトグラフィー装置は、上記対象物質に特異的に結合する抗体の内、上記対象物質と複合体を形成していない上記抗体を第１捕捉物質によって捕捉するための第１捕捉領域と、
　上記第１捕捉領域において捕捉されなかった上記抗体を、第２捕捉物質によって捕捉するための第２捕捉領域と、を少なくとも有し、
　上記色見本は、上記第２捕捉領域において捕捉された上記抗体に結合された標識物質の発色強度と、上記対象物質の濃度との関係を示すものであることを特徴としている。

　本発明に係るキットでは、上記第１捕捉領域において捕捉された上記抗体に結合された標識物質の発色強度と、上記対象物質の濃度との関係を示す第２色見本をさらに備えていてもよい。

　本発明に係るキットでは、上記第１捕捉領域には、上記第２捕捉領域において上記複合体を形成していない上記抗体に由来する発色が検出されないように、上記複合体を形成していない上記抗体を捕捉可能な量の上記第１捕捉物質が固定されていることが好ましい。

　本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置は、本発明に係る測定方法に用いるためのイムノクロマトグラフィー装置であって、
　対象物質に特異的に結合する抗体の内、当該対象物質と複合体を形成していない上記抗体を第１捕捉物質によって捕捉するための第１捕捉領域と、
　当該第１捕捉領域において捕捉されなかった上記抗体を、第２捕捉物質によって捕捉するための第２捕捉領域と、を少なくとも有していることを特徴としている。

　本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置では、上記第１捕捉領域には、上記第２捕捉領域において上記複合体を形成していない上記抗体に由来する発色が検出されないように、上記複合体を形成していない上記抗体を捕捉可能な量の上記第１捕捉物質が固定されていることが好ましい。

　本発明に係る測定方法によれば、イムノクロマトグラフィー法を用いるので、高感度且つ高い選択性をもって対象物質の濃度を測定することが可能となる。また、本発明に係る測定方法によれば、対象物質の濃度を、第２捕捉工程において捕捉した抗体に結合された標識物質の発色強度に基づいて測定するので、対象物質の濃度を目視で判定することが可能となる。従って、より簡便且つ迅速に多数の試料の濃度を測定することが可能となる。

　また、本発明に係るイムノクロマトグラフィーキット（「本発明に係るキット」ともいう。）は、本発明に係る測定方法に用いることができる。本発明に係るキットによれば、イムノクロマトグラフィー法を用いるので、高感度且つ高い選択性をもって対象物質の濃度を測定することが可能となる。また、本発明に係るキットによれば、本キットが有するイムノクロマトグラフィー装置の第２捕捉領域において捕捉された抗体に結合された標識物質の発色強度と、対象物質の濃度との関係を示す色見本を備えているので、第２捕捉領域において捕捉した抗体に結合された標識物質の発色強度と、色見本とを比較することによって、対象物質の濃度を目視で判定することが可能となる。従って、より簡便且つ迅速に多数の試料の濃度を測定することが可能となる。

　また、本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置は、本発明に係る測定方法に用いることができる。このため、本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置によれば、対象物質の濃度を目視で判定することが可能となる。従って、より簡便且つ迅速に多数の試料の濃度を測定することが可能となる。

本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー装置の構成を模式的に示す図である。非特許文献１に記載のイムノクロマトグラフィー装置の構成を模式的に示す図である。（ａ）は、実施例で用いたイムノクロマトグラフィー装置の構成を模式的に示す図であり、（ｂ）は、試料液中に含まれているカドミウムの濃度と第２捕捉領域における発色強度との関係を示す図である。浸漬時間と発色強度との関係を示す図であり、（ａ）は、浸漬時間を５分間とした場合の結果を示し、（ｂ）は、浸漬時間を１０分間とした場合の結果を示す。浸漬後の経時的な発色変化を示す図である。抗Ｃｄ－ＥＤＴＡモノクローナル抗体と亜鉛およびマンガンとの交差反応性を確認した結果を示す図である。試料中に含まれているカドミウムの濃度と第２捕捉領域における発色強度との関係、および第２捕捉領域における発色を目視にて判定できるかを確認した結果を示す図である。試料中に含まれているカドミウムの濃度と第２捕捉領域における発色強度との関係を示す曲線である。

　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。

　〔１．対象物質の濃度測定方法およびイムノクロマトグラフィー装置〕
　本発明に係る対象物質の濃度測定方法（以下、「本発明の濃度測定方法」という。）は、イムノクロマトグラフィー法を用いて試料液中の対象物質の濃度を測定する方法であって、上記試料液と、当該対象物質に特異的に結合する抗体とを接触させる接触工程と、上記接触工程において上記対象物質と複合体を形成しなかった上記抗体を、第１捕捉物質によって捕捉する第１捕捉工程と、上記第１捕捉工程において捕捉されなかった上記抗体を、第２捕捉物質によって捕捉する第２捕捉工程と、上記対象物質の濃度を測定する測定工程と、を含み、上記測定工程では、上記対象物質の濃度を、上記第２捕捉工程において捕捉した上記抗体に結合された標識物質の発色強度に基づいて測定するものである。

　本発明の濃度測定方法は、本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置（以下、「本発明のイムノクロマトグラフィー装置」という。）を用いて実施することができる。そこで、まず、本発明のイムノクロマトグラフィー装置について以下に説明する。

　（１－１．イムノクロマトグラフィー装置）
　図１は、本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本発明のイムノクロマトグラフィー装置１は、対象物質２に特異的に結合する抗体３の内、対象物質２と複合体５を形成していない抗体３を第１捕捉物質６によって捕捉するための第１捕捉領域と、当該第１捕捉領域において捕捉されなかった抗体３を、第２捕捉物質７によって捕捉するための第２捕捉領域と、を少なくとも有している構成である。

　図１に示すように、本発明のイムノクロマトグラフィー装置１においては、担体１０としてのニトロセルロース膜上に、第１捕捉領域と、第２捕捉領域とが、試料液の移動方向に沿ってこの順に設けられている。すなわち、第１捕捉領域は、第２捕捉領域の上流に設けられている。本発明のイムノクロマトグラフィー装置１においては、第１捕捉領域を「コントロールライン」と称し、第２捕捉領域を「テストライン」と称する。

　担体１０としては、液体が内部を毛細管現象によって移動可能な媒体であれば、ニトロセルロース膜以外のものを使用することが可能である。具体的には、例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等を挙げることができる。

　本発明のイムノクロマトグラフィー装置１には、さらに、第１捕捉領域の上流に、試料滴下領域および接触領域がこの順に設けられていてもよい。また、第２捕捉領域の下流には、試料吸収領域が設けられていてもよい。

　なお、本明細書において、用語「上流」および「下流」は、イムノクロマトグラフィー装置内における試料液の移動方向を基準とした概念である。試料液は、イムノクロマトグラフィー装置の担体１０内を毛細管現象によって移動する。図１に示した矢印は、試料液の移動方向を示している。本明細書においては、担体１０内を試料液が移動する方向（流れていく方向）を「下流」、液体の移動方向と逆方向を「上流」と呼ぶ。また、上記「試料液」は、イムノクロマトグラフィー装置に導入される検体（被検物）をいい、検出の対象としている物質（対象物質）を含んでいても、いなくてもよい。

　上記「試料滴下領域」は、試料液が滴下される領域であり、サンプルパッド１１が設けられている。

　サンプルパッド１１は、サンプルパッド１１としては、親水性およびフィルター機能を有するものであれば特に限定されず、例えば、グラスファイバー、セルロースファイバー等を使用することができる。

　上記「接触領域」は、対象物質２と、検出抗体３とを接触させて抗原－抗体複合体５を形成させる領域である。接触領域にはコンジュゲートパッド８が設けられており、コンジュゲートパッド８内には、試料液の流れに応じて検出抗体３が移動可能なように保持されている。検出抗体３には、標識物質４が結合されている。

　コンジュゲートパッド８としては、検出抗体３を試料液の流れに応じて移動可能なように保持することができるものであれば特に限定されず、例えば、グラスファイバー等を使用することができる。

　検出抗体３としては、対象物質２に特異的に結合する抗体であれば特に限定されない。例えば、対象物質２がカドミウムである場合は、カドミウムに特異的に結合する抗体を使用することができる。このような抗体としては、例えば、非特許文献１に記載の受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７０３として寄託されたハイブリドーマにより産生されるマウスモノクローナル抗体を好適に利用することができる。

　本発明のイムノクロマトグラフィー装置１によって検出される対象物質２は、カドミウムに限定されるものではなく、カドミウム以外の重金属を対象物質としてもよい。なお、上記「重金属」とは、比重が４以上の金属の総称であり、カドミウム以外には、例えば、水銀、鉛、六価クロム等を挙げることができる。また、重金属以外にも、タンパク質、ペプチド、核酸、軽金属等を対象物質２としてもよい。なお、上記「軽金属」とは、比重が４よりも小さい金属の総称であり、例えば、アルミニウム、マグネシウム、ベリリウム、チタン、アルカリ土類金属、アルカリ金属等を挙げることができる。この場合は、対象物質２の種類に応じて、検出抗体３を適宜選択すればよい。

　検出抗体３には、標識物質４が結合されている。標識物質４としては、コロイド金属（例えば、金コロイド等）、ラテックス粒子等の標識化剤として使用できる物質であれば特に限定されない。標識物質４の粒径は、２～５００ｎｍ、好ましくは２０～４０ｎｍである。検出抗体３に標識物質４が結合されていることにより、色の濃淡に基づいて微粒子の量を検出することができる。その結果、色の濃淡に基づいて、検出抗体３と抗原－抗体複合体５を形成した対象物質２の濃度を測定することができる。

　上記「第１捕捉領域」には、第１捕捉物質として、検出抗体３が特異的に結合する抗原６が、担体１０上に固定されている。「第１捕捉領域」では、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成しなかった検出抗体３が、抗原６によって捕捉される。

　抗原６としては、検出抗体３が特異的に結合するエピトープを分子内に少なくとも有するものであればよい。例えば、抗原６として、対象物質２と同じ物質をそのまま使用することができる。また、対象物質２がタンパク質等である場合は、抗原６は、対象物質２の部分ペプチドであり、且つ検出抗体３が特異的に結合するエピトープを分子内に少なくとも有するペプチドであってもよい。

　第１捕捉領域においては、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成しなかった検出抗体３が抗原６によって捕捉される以外に、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成した検出抗体３が抗原６によって捕捉される場合がある。すなわち、抗原－抗体反応は、可逆的な反応であるため、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成した検出抗体３が、対象物質２から解離して抗原６と複合体を再形成する場合がある。担体１０内を移動する試料液の移動速度、試料液の浸漬時間、検出抗体３の量、抗原６の量、検出抗体３および抗原６の濃度バランス等を最適化することによって、このような現象を起こりにくくすることができる。

　例えば、担体１０内を移動する試料液の移動速度は、担体１０の材質、空隙率等によって決定される。対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成した検出抗体３が、対象物質２から解離して抗原６と複合体を再形成しないような最適な試料液の移動速度は、対象物質２、検出抗体３および抗原６の種類によって変わる。このため、対象物質２、検出抗体３および抗原６の種類に応じて、試料液の移動速度が最適な速度となるように担体１０の材質、空隙率等を適宜設定すればよい。

　上記「第２捕捉領域」には、第２捕捉物質として、検出抗体３に特異的に結合する抗体７（捕捉抗体７）が、担体１０上に固定されている。「第２捕捉領域」では、上記「第１捕捉領域」において抗原６によって捕捉されなかった検出抗体３が、捕捉抗体７によって捕捉される。

　捕捉抗体７としては、検出抗体３に特異的に結合する抗体であれば特に限定されない。例えば、検出抗体３としてマウス由来のモノクローナル抗体を用いる場合は、捕捉抗体７として、マウス以外の動物種から取得された抗マウスＩｇＧ抗体等を用いることができる。

　ここで、上記「第１捕捉領域において抗原６によって捕捉されなかった検出抗体３」とは、(i)対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成している検出抗体３、および(ii)対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していないが第１捕捉領域において抗原６によって捕捉されなかった検出抗体３、をいう。

　第２捕捉領域おいて捕捉される検出抗体３の内、上記(ii)に該当する検出抗体３の割合が多くなると、バックグラウンドの値が高くなる。すなわち、試料液中に対象物質２が全く含まれていない場合にもテストラインにおける発色が検出されることになる。このため、バックグラウンドの値を低くする観点から、第１捕捉領域には、第２捕捉領域において上記(ii)に該当する検出抗体３（対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していない検出抗体３）に由来する発色が検出されないように、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していない検出抗体３を捕捉可能な量の抗原６（第１捕捉物質）が固定されていることが好ましい。これにより、バックグラウンドの値を低くすることができる。

　なお、上記「第２捕捉領域において上記(ii)に該当する検出抗体３（対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していない検出抗体３）に由来する発色が検出されないように、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していない検出抗体３を捕捉可能な量」とは、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していない検出抗体３を全て捕捉可能な量でなくとも、第２捕捉領域において上記(ii)に該当する検出抗体３に由来する発色が検出されない程度に、対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していない検出抗体３を捕捉し得る量であればよい。

　第１捕捉領域に固定される抗原６の必要量は、抗原６の種類、検出抗体３の種類、使用される検出抗体３の量等によって変わる。このため、試料液中に対象物質２が全く含まれていない場合に、第２捕捉領域において上記(ii)に該当する検出抗体３に由来する発色が検出されないように対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成していない検出抗体３を捕捉可能な量を、抗原６の種類、検出抗体３の種類、使用される検出抗体３の量等に応じて適宜設定すればよい。

　また、第２捕捉領域に固定される捕捉抗体７の量は、使用する検出抗体３を全て捕捉し得る量であることが好ましい。これにより、検出抗体３の全てが対象物質２と抗原－抗体複合体５を形成した場合に、第２捕捉領域において複合体５を全て捕捉することができる。

　第２捕捉領域に固定される捕捉抗体７の必要量は、検出抗体３の種類、使用される検出抗体３の量等によって変わる。このため、使用する検出抗体３を全て捕捉可能な量を、検出抗体３の種類、使用される検出抗体３の量等に応じて適宜設定すればよい。

　「第１捕捉領域」における担体１０への抗原６の固定は、抗原６を含有している水溶液を担体１０に塗布し、例えば、５０℃にて３０分間乾燥させることによって行うことができる。「第２捕捉領域」における、担体１０への捕捉抗体７の固定も同様の方法によって行うことができる。

　上記「試料吸収領域」には、試料液を吸収可能な吸収パッド９が設けられている。吸収パッド９には、担体１０内の試料液の展開を一定に保つ役割がある。吸収パッド９としては、液体を吸収可能なものであれば特に限定されず、例えば、セルロース等を使用することができる。

　本発明のイムノクロマトグラフィー装置１においては、試料滴下領域に滴下された試料液は、毛細管現象によって担体１０内を移動する。まず、コンジュゲートパッド８内に流入した試料液中の対象物質２は、検出抗体３と抗原－抗体複合体５を形成する（接触工程）。その後、抗原－抗体複合体５および抗原－抗体複合体５を形成しなかった検出抗体３は、担体１０内を移動し、抗原－抗体複合体５を形成しなかった検出抗体３が第１捕捉領域において抗原６によって捕捉される（第１捕捉工程）。抗原６によって検出抗体３が捕捉されたことは、第１捕捉領域（コントロールライン）における標識物質４の発色を指標として確認できる。第１捕捉領域において捕捉されなかった検出抗体３は、担体１０内をさらに下流へと移動し、第２捕捉領域において捕捉抗体７によって捕捉される（第２捕捉工程）。捕捉抗体７によって検出抗体３が捕捉されたことは、第２捕捉領域（テストライン）における標識物質４の発色を指標として確認できる。本発明のイムノクロマトグラフィー装置１においては、試料液中の対象物質２の濃度を、第２捕捉領域における標識物質４の発色強度を指標として測定することができる（測定工程）。

　なお、本発明のイムノクロマトグラフィー装置に接触領域が設けられている場合は、接触工程は、コンジュゲートパッド８（図１）内で行われてもよい。

　また、本発明のイムノクロマトグラフィー装置に接触領域が設けられていない場合は、接触工程は、対象物質を含んでいる試料溶液中に検出抗体を添加し、抗原－抗体複合体の形成が平衡状態になるまで、例えば、２０～３７℃にて、１～６０分間インキュベートすることによって行うことができる。その後、検出抗体を含む試料溶液をイムノクロマトグラフィー装置に供すればよい。接触工程は、上記のように、対象物質と検出抗体とが抗原－抗体複合体を形成できる条件であれば、その条件は特に限定されない。

　測定工程は、対象物質の濃度を測定する工程である。測定工程において、対象物質の濃度は、第２捕捉工程において捕捉した検出抗体３に結合された標識物質の発色強度に基づいて測定される。すなわち、対象物質の濃度は、第２捕捉領域における発色強度を指標として測定される。

　後述する実施例に示すように、対象物質の濃度と第２捕捉領域における発色強度との間には相関関係がある（例えば、図４の（ａ）のグラフを参照）。このため、対象物質の濃度と第２捕捉領域における発色強度との関係を示す検量線を予め作成しておけば、かかる検量線に基づいて、第２捕捉領域における発色強度から試料液中に含まれている対象物質の濃度を算出することができる。

　第２捕捉領域における発色強度は、目視で確認してもよく、クロマトリーダー等を用いて吸光度を測定することによって確認してもよい。第２捕捉領域における発色強度を目視で確認する場合は、第２捕捉領域の色と色見本とを比較することにより、対象物質の濃度を測定することが好ましい。なお、後述する実施例に示すように、第２補足領域のバンドの濃さ（吸光度）が２０ｍＡｂｓを以上となる場合に、第２補足領域における発色を目視で確認できるといえる。ここで、上記「色見本」とは、第２捕捉領域において捕捉された検出抗体に結合された標識物質の発色強度と、対象物質の濃度との関係を示すものである。色見本は、種々の濃度の対象物質の標準液を用意し、各標準液をそれぞれクロマトグラフィー装置に供した場合の第２捕捉領域における発色に基づいて作成することができる。第２捕捉領域の色と色見本とを目視で比較することにより、試料液中に含まれている対象物質の濃度を簡便に測定することができる。なお、使用するイムノクロマトグラフィー装置のロットや、測定条件等によって、対象物質の濃度と第２捕捉領域における発色強度との相関が異なる可能性があるため、ロット毎および測定条件毎に検量線または色見本を作製することが好ましい。これにより、より正確に濃度を測定することができる。

　本発明の濃度測定方法は、試料液中の対象物質の濃度がより低濃度である場合の濃度測定に適している。例えば、対象物質がカドミウムであり、検出抗体として受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７０３として寄託されたハイブリドーマにより産生されるマウスモノクローナル抗体を用いる場合は、試料液中に含まれている対象物質の濃度が０～６０ｎｇ／ｍＬ（ｐｐｂ）、好ましくは０～３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０～１０ｎｇ／ｍＬである場合の濃度測定に適している。例えば、最も厳しいカドミウムの国際基準値が設けられているものは水質であり、その基準値は、３ｎｇ／ｍＬである。本発明の濃度測定方法によれば、この基準値の濃度を目視で測定することが可能となる。

　ここで、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置の構成を説明する。図２に示すように、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置２１においては、担体３０としてのニトロセルロース膜上に、試料滴下領域（サンプルパッド３１）と、第１捕捉領域と、試料吸収領域（吸収パッド２９）と、がこの順に設けられている。第１捕捉領域は、本発明のイムノクロマトグラフィー装置１（図１）の第１捕捉領域（コントロールライン）に相当し、抗原２６としてカドミウム－エチレンジアミン四酢酸錯体（Ｃｄ－ＥＤＴＡ）と卵白アルブミン（ＯＶＡ）との複合体であるＣｄ－ＥＤＴＡ－ＯＶＡがニトロセルロース膜上に固定されている。非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置では、第１捕捉領域をテストラインとしている。

　非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置２１においては、試料液と検出抗体２３とを予め混合したものを試料滴下領域に滴下する。試料滴下領域に滴下された試料液は、毛細管現象によって担体３０内を移動する。試料液中のＣｄ－ＥＤＴＡ２２と抗原－抗体複合体２５を形成しなかった検出抗体２３は、第１捕捉領域においてＣｄ－ＥＤＴＡ－ＯＶＡ２６によって捕捉される。検出抗体２３には標識物質として金コロイド２４が結合されているので、抗原－抗体複合体２５を形成しなかった検出抗体２３は、第１捕捉領域における金コロイド２４の発色を指標として検出される。

　上述したように、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置２１では、テストラインの濃さは、試料液中にカドミウムが存在しない場合に最も濃くなり、試料液中のカドミウムの濃度の増大に伴い薄くなる。このため、試料液中に含まれているカドミウムの濃度が低い場合に、テストラインの濃さの変化を目視で確認することは非常に困難である。

　これに対して、本発明のイムノクロマトグラフィー装置においては、非特許文献１に開示されたイムノクロマトグラフィー装置における第１捕捉領域の下流に、第２捕捉領域をさらに設け、第１捕捉領域をコントロールラインとし、第２捕捉領域をテストラインとすることによって、対象物質の濃度が低濃度である場合であっても、目視での濃度測定を可能とした。

　なお、本発明のイムノクロマトグラフィー装置においては、第１捕捉領域（コントロールライン）の発色は、試料液中にカドミウムが存在しない場合に最も濃くなり、試料液中のカドミウムの濃度の増大に伴い薄くなる。このため、本発明の濃度測定方法では、さらに、第１捕捉工程において捕捉した検出抗体に結合された標識物質の発色強度に基づいて、対象物質の濃度を測定してもよい。すなわち、本発明の濃度測定方法では、第２捕捉領域の発色強度と併せて、第１捕捉領域の発色強度を同時に確認してもよい。これによって、より正確な濃度測定が可能となる。また、より広い濃度範囲を目視で確認することが可能となる。

　第１捕捉領域における発色強度は、目視で確認してもよく、クロマトリーダー等を用いて吸光度を測定することによって確認してもよい。第１捕捉領域における発色強度を目視で確認する場合は、第１捕捉領域の色と第２色見本とを比較することにより、対象物質の濃度を測定することが好ましい。かかる第２色見本は、第２捕捉領域の色の比較対象として作製された色見本とは別のものであり、種々の濃度の対象物質の標準液を用意し、各標準液をそれぞれクロマトグラフィー装置に供した場合の第１捕捉領域における発色に基づいて作製することができる。

　本発明の濃度測定方法では、第１捕捉工程では、測定工程において抗原－抗体複合体を形成しなかった検出抗体に由来する発色が検出されないように抗原－抗体複合体を形成しなかった検出抗体を捕捉することが好ましい。測定工程において抗原－抗体複合体を形成しなかった検出抗体に由来する発色が検出されないように抗原－抗体複合体を形成しなかった検出抗体を捕捉するためには、検出抗体の量と第１捕捉物質の量とを最適化する必要がある。上述したように、第１捕捉物質の必要量は、第１捕捉物質の種類、検出抗体の種類、使用される検出抗体の量等によって変わる。このため、試料液中に対象物質が全く含まれていない場合に、測定工程において抗原－抗体複合体を形成しなかった検出抗体に由来する発色が検出されないように抗原－抗体複合体を形成していない検出抗体を捕捉可能な量を、第１捕捉物質の種類、検出抗体の種類、使用される検出抗体の量等に応じて適宜設定すればよい。

　また、本発明の濃度測定方法では、第１捕捉工程は、対象物質と複合体を形成した検出抗体が、第１捕捉物質と複合体を再形成しない条件で行うことが好ましい。

　本発明の濃度測定方法では、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッドを試料液に浸漬させることによって接触工程を行う場合は、浸漬時間を５～１０分間とすることが好ましい。これにより、測定工程において、標識物質の発色を安定して検出することができる。

　本発明の濃度測定法によれば、イムノクロマトグラフィー装置を用いて試料液中に含まれている対象物質の濃度を目視で測定することができる。このため、より簡便に対象物質の濃度を測定することができる。

　〔２．イムノクロマトグラフィーキット〕
　本発明に係るキット（以下、「本発明のキット」と称する。）は、本発明の測定方法に用いるためのイムノクロマトグラフィーキットであって、イムノクロマトグラフィー装置と、色見本とを少なくとも備えている。本発明のキットは、第１捕捉領域において捕捉された検出抗体に結合された標識物質の発色強度と、対象物質の濃度との関係を示す第２色見本をさらに備えていてもよい。

　本発明の測定方法については、上記「１．対象物質の濃度測定方法およびイムノクロマトグラフィー装置」の項で説明したとおりであるので、説明を省略する。イムノクロマトグラフィー装置、色見本、第２色見本については、上記「１－１．イムノクロマトグラフィー装置」の項で説明したとおりであるので、説明を省略する。

　本発明に係るキットは、検体をクロマトグラフィー装置に供するために必要な試薬を備えていてもよい。例えば、対象物質がカドミウムであり、検出抗体として受託番号ＦＥＲＭＰ－１９７０３として寄託されたハイブリドーマにより産生されるマウスモノクローナル抗体を用いるイムノクロマトグラフィー装置を備えたキットの場合は、カドミウムを上記抗体によって捕捉するためのエチレンジアミン四酢酸錯体（ＥＤＴＡ）溶液を備えていてもよい。また、本発明のキットを使用するための指示書を備えていてもよい。

　本発明のキットを用いれば、試料液中に含まれている対象物質の濃度を目視で測定することができる。このため、より簡便に対象物質の濃度を測定することができる。

　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

　〔実施例１〕
　図３の（ａ）に示す構造のイムノクロマトグラフィー装置６１を作製した。

　第１捕捉物質６６として、カドミウム－エチレンジアミン四酢酸錯体（Ｃｄ－ＥＤＴＡ）と卵白アルブミン（ＯＶＡ）との複合体であるＣｄ－ＥＤＴＡ－ＯＶＡ（０．６６ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．０）を用いた。第２捕捉物質６７として、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（１ｍｇ/ｍL、型番：A90-116A、BETYL Laboratories 社製）を用いた。Ｃｄ－ＥＤＴＡを特異的に認識する抗体（抗Ｃｄ－ＥＤＴＡ抗体）６３として、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７０３として寄託されたハイブリドーマにより産生されるマウスモノクローナル抗体を用いた。標識物質６４として、直径４０ｎｍの金コロイド（型番：CRL EMGC40、BB International社製）を用いた。

　ニトロセルロース膜７０（HF120、ミリポア社製）の上流から３０ｍｍの位置に、約１ｍｍ幅になるように第１捕捉物質６６であるＣｄ－ＥＤＴＡ－ＯＶＡを塗布した。その後、ニトロセルロース膜７０を４０℃で９０分間加熱乾燥後、乾燥剤入り容器で一昼夜除湿乾燥することにより固定化し、第１捕捉領域（コントロールライン）とした。

　また、ニトロセルロース膜７０の上流から３５ｍｍの位置に、約１ｍｍ幅になるように、第２捕捉物質６７である抗マウスＩｇＧ抗体を塗布した。抗マウスＩｇＧ抗体はＢＳＡ溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）で適宜希釈し調節した。その後、ニトロセルロース膜７０を４０℃で９０分間加熱乾燥後、乾燥剤入り容器で一昼夜除湿乾燥することにより固定化し、第２捕捉領域（テストライン）とした。

　コンジュゲートパッド６８（Ｇ０１４タイプ、ミリポア社製）は８ｍｍ×３～５ｍｍ幅に切り取り、金コロイド標識した抗Ｃｄ－ＥＤＴＡ抗体を含浸させ、４０℃で９０分間加熱乾燥し、その後乾燥剤入り容器で一昼夜除湿乾燥した。このときの金コロイド標識した抗Ｃｄ－ＥＤＴＡ抗体の濃度は、金コロイドの吸光度ＯＤ５２０で０．１８になるように調製した。

　ニトロセルロース膜７０を３～５ｍｍ幅で切り取り、同様の幅で長さ２０ｍｍのサンプルパッド７１（Ｇ０１４タイプ、ミリポア社製）および長さ２０ｍｍの吸収パッド６９（Ｇ０８３タイプ、ミリポア社製）を切り取った。ニトロセルロース膜７０に、サンプルパッド７１、コンジュゲートパッド６８、吸収パッド６９を図３の（ａ）に示すように配置して貼り合わせた。

　このようにして得られたイムノクロマトグラフィー装置を、以下の実験に使用した。

　まず、表１に示した試料を調製した。

　試料１～６に、それぞれ、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド部分を５分間浸漬させた。その結果を図３の（ｂ）に示す。図３の（ｂ）は、試料液中に含まれているカドミウム（対象物質）の濃度と第２捕捉領域における発色強度との関係を示す図である。図３の（ｂ）に示したように、試料液中に含まれているカドミウムの濃度が高くなると、イムノクロマトグラフィー装置の第２捕捉領域における発色強度が強くなることが確認された。

　〔実施例２〕
　イムノクロマトグラフィー装置の試料液への浸漬時間と、第２捕捉領域における発色強度との関係を確認した。

　まず、表２に示した試料を調製した。

　試料１～４に、それぞれ、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド部分を５分間浸漬させ、その後、イムノクロマトリーダ（型番：C10066、HAMAMATSU製）を用いて第２捕捉領域のバンドの濃さ（吸光度）を測定した（ｎ＝２）。

　同様に、試料１～４に、それぞれ、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド部分を１０分間浸漬させ、その後、イムノクロマトリーダ（型番：C10066、HAMAMATSU製）を用いて第２捕捉領域のバンドの濃さ（吸光度）を測定した（ｎ＝２）。上記イムノクロマトリーダ（型番：C10066、HAMAMATSU製）を用いて測定される吸光度は、５～５００ｍＡｂｓの吸光度である。

　浸漬時間を５分間とした場合の結果を表３に示し、浸漬時間を１０分間とした場合の結果を表４に示す。

　表３および４の結果をグラフ化したものを図４に示す。図４の（ａ）は、浸漬時間を５分間とした場合の結果を示し、（ｂ）は、浸漬時間を１０分間とした場合の結果を示す。図４の（ａ）および（ｂ）に示したように、浸漬時間を１０分間に延長した場合であっても、第２捕捉領域における発色強度は、浸漬時間が５分間の場合の発色強度とほぼ同じであることが確認された。

　〔実施例３〕
　イムノクロマトグラフィー装置の試料液への浸漬後の、第２捕捉領域の経時的な発色変化を確認した。

　まず、表５に示した試料を調製した。

　試料１～４に、それぞれ、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド部分を５分間浸漬させ、直後にイムノクロマトリーダを用いて第２捕捉領域のバンドの濃さ（吸光度）を測定した（ｎ＝２）。さらに、イムノクロマトグラフィー装置を、室温（２５℃）にて一定時間（５分間、１０分間および１５分間）放置した後で、第２捕捉領域のバンドの濃さ（吸光度）を測定した（ｎ＝１）。

　結果を表６に示す。

　表６の結果をグラフ化したものを図５に示す。図５に示したように、試料液中に含まれているカドミウムの濃度が低濃度（０～１０ｎｇ／ｍＬ）の場合は、室温にて放置後の経時的な発色変化はほとんど認められなかった。一方、試料液中に含まれているカドミウムの濃度が高濃度（３０～６０ｎｇ／ｍＬ）の場合は、室温にて放置後１０分間くらいまでは、時間の経過とともに発色が強くなる傾向があった。

　〔実施例４〕
　抗Ｃｄ－ＥＤＴＡモノクローナル抗体と亜鉛およびマンガンとの交差反応性を確認した。

　亜鉛標準液（５００ｎｇ／ｍＬ、１０ｍＭ　ＨＣｌ）およびマンガン標準液（５００ｎｇ／ｍＬ、１０ｍＭ　ＨＣｌ）を、それぞれマイクロチューブに１５０μＬずつ分取した。さらに、それぞれのマイクロチューブに、ＥＤＴＡ溶液を１０μＬ加えて十分に混合した。各混合試料に、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド部分を５分間浸漬させた（ｎ＝２）。

　結果を表７に示す。

　表７の結果をグラフ化したものを図６に示す。図６に示したように、亜鉛およびマンガンのそれぞれについて、交差反応性の影響は認められなかった。

　〔実施例５〕
　イムノクロマトグラフィー装置をそれぞれ異なる濃度にてＣｄを含んでいる試料に浸漬した後の、上記イムノクロマトグラフィー装置における第２補足領域における発色を目視にて判定することが可能かどうかを確認した。

　実施例１～３の場合と同様にして試料１～５を調製した。具体的には、１０ｍＭＨＣｌおよびＥＤＴＡ溶液を用いて、Ｃｄ濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬとなるようにＣｄを溶解し、試料１～５を調製した。

　温度２５℃、湿度４２％の条件下にて、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド部分を、試料１、２、３、４、または５に対して５分間浸漬した。その後、任意に選出された複数のモニターが上記イムノクロマトグラフィー装置における第２補足領域における発色を目視にて確認した。

　その結果を図７に示す。図７では横軸にＣｄ濃度（ｎｇ／ｍＬ）とし、縦軸に吸光度（ｍＡｂｓ）とした。図７中、上記のモニターの内、第２補足領域における発色を目視で認識できた者の割合（「認識率（％）」という。）が、０％の場合を×で示し、５０％の場合を△で示し、１００％の場合を○で示した。

　本発明では、認識率が５０％を超える場合を、第２補足領域における発色を目視で認識できる閾値であると判断することとした。そして、図７の結果から、吸光度が２０ｍＡｂｓの時（すなわちＣｄ濃度が３ｎｇ／ｍＬの時）が、第２補足領域における発色を目視で認識できる閾値であると判断した。

　ここで、実施例３の表６における５分後（展開直後）の上記第２捕捉領域のバンドの吸光度と試料中のＣｄ濃度との関係を図８に示した。図８において、Ｃｄ濃度の対数を横軸とし、吸光度（ｍＡｂｓ）を縦軸とした。

　通常のイムノクロマトグラフィー装置を用いた対象物質、例えばＣｄ濃度の定量では、テストラインの濃さとＣｄ濃度との間に直線関係が認められるＣｄ濃度の範囲、すなわち図８中、破線で囲まれた、Ｓ字曲線の直線性の高い部分を利用する。上記破線で囲まれた部分以外の範囲は、図８の横軸が対数であるため、わずかに吸光度がずれただけで極端に濃度が変わってしまうので、通常、Ｃｄ濃度の定量には用いられていない。

　これに対して、本発明では、通常Ｃｄの定量に用いる範囲を使用せず、あえて、図８の実線で囲まれた範囲を利用する。すなわち、本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置によれば、第１捕捉領域をコントロールラインとし、第２捕捉領域をテストラインとすることにより、Ｃｄの濃度が３ｎｇ／ｍＬと低濃度であっても、上記第２補足領域におけるバンドの濃さを目視可能な閾値である２０ｍＡｂｓに設定することができる。

　従って、本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置によれば、通常使用される上記破線で囲まれた範囲よりも低い濃度範囲である、実線で囲まれた範囲を利用し、Ｃｄ濃度が３ｎｇ／ｍＬ以上の場合には上記バンドを目視確認することを可能とし、かつ、Ｃｄ濃度が３ｎｇ／ｍＬ未満の場合には、上記バンドを目視確認できないようにすることができる。なお、この３ｎｇ／ｍＬとは世界保健機関（ＷＨＯ）が定めるＣｄ濃度の水質環境基準値である。このため、本発明に係るイムノクロマトグラフィー装置を用いることによって、試料が、ＷＨＯが定めるＣｄの水質環境基準を満たしているか否かを目視にて確認できる。

　上述したように、本発明によれば、イムノクロマトグラフィー法によって対象物質の濃度を目視で測定することができるという効果を奏する。また、従来のイムノクロマトグラフィー法では、測定できなかった低濃度の対象物質を含んでいる試料においても、その濃度を目視にて測定できる。

　さらに、ＷＨＯが定めるＣｄについての水質環境基準（３ｎｇ／ｍＬ）を満たしているか否かを目視にて確認できる。

　よって、本発明によれば、対象物質の濃度測定を、より簡便且つ迅速に行うことができる。このため、本発明は、イムノクロマトグラフィー法を利用する種々広範な産業において利用可能である。

　１　イムノクロマトグラフィー装置
　２　対象物質
　３　抗体
　４　標識物質
　５　抗原－抗体複合体
　６　第１捕捉物質
　７　第２捕捉物質
　８　コンジュゲートパッド
　９　吸収パッド
１０　担体
１１　サンプルパッド
　

Claims

　イムノクロマトグラフィー法を用いて試料液中の対象物質の濃度を測定する方法であって、
　上記試料液と、当該対象物質に特異的に結合する抗体とを接触させる接触工程と、
　上記接触工程において上記対象物質と複合体を形成しなかった上記抗体を、第１捕捉物質によって捕捉する第１捕捉工程と、
　上記第１捕捉工程において捕捉されなかった上記抗体を、第２捕捉物質によって捕捉する第２捕捉工程と、
　上記対象物質の濃度を測定する測定工程と、を含み、
　上記測定工程では、上記対象物質の濃度を、上記第２捕捉工程において捕捉した上記抗体に結合された標識物質の発色強度に基づいて測定することを特徴とする測定方法。
　上記測定工程では、上記対象物質の濃度を、上記第２捕捉工程において捕捉した上記抗体に結合された上記標識物質の発色と色見本とを目視で比較することによって測定することを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
　上記測定工程では、さらに、上記第１捕捉工程において捕捉した上記抗体に結合された標識物質の発色強度に基づいて、上記対象物質の濃度を測定することを特徴とする、請求項１または２に記載の測定方法。
　上記第１捕捉工程では、上記測定工程において、上記複合体を形成しなかった上記抗体に由来する発色が検出されないように、上記複合体を形成しなかった上記抗体を捕捉することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の測定方法。
　上記対象物質は、重金属であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の測定方法。
　上記重金属は、カドミウムであることを特徴とする請求項５に記載の測定方法。
　請求項１から６のいずれか１項に記載の測定方法に用いるためのイムノクロマトグラフィーキットであって、
　イムノクロマトグラフィー装置と、色見本とを少なくとも備え、
　上記イムノクロマトグラフィー装置は、上記対象物質に特異的に結合する抗体の内、上記対象物質と複合体を形成していない上記抗体を第１捕捉物質によって捕捉するための第１捕捉領域と、
　上記第１捕捉領域において捕捉されなかった上記抗体を、第２捕捉物質によって捕捉するための第２捕捉領域と、を少なくとも有し、
　上記色見本は、上記第２捕捉領域において捕捉された上記抗体に結合された標識物質の発色強度と、上記対象物質の濃度との関係を示すものであることを特徴とするキット。
　上記第１捕捉領域において捕捉された上記抗体に結合された標識物質の発色強度と、上記対象物質の濃度との関係を示す第２色見本をさらに備えていることを特徴とする、請求項７に記載のキット。
　上記第１捕捉領域には、上記第２捕捉領域において上記複合体を形成していない上記抗体に由来する発色が検出されないように、上記複合体を形成していない上記抗体を捕捉可能な量の上記第１捕捉物質が固定されていることを特徴とする、請求項７または８に記載のキット。
　請求項１から６のいずれか１項に記載の測定方法に用いるためのイムノクロマトグラフィー装置であって、
　対象物質に特異的に結合する抗体の内、当該対象物質と複合体を形成していない上記抗体を第１捕捉物質によって捕捉するための第１捕捉領域と、
　当該第１捕捉領域において捕捉されなかった上記抗体を、第２捕捉物質によって捕捉するための第２捕捉領域と、を少なくとも有していることを特徴とするイムノクロマトグラフィー装置。
　上記第１捕捉領域には、上記第２捕捉領域において上記複合体を形成していない上記抗体に由来する発色が検出されないように、上記複合体を形成していない上記抗体を捕捉可能な量の上記第１捕捉物質が固定されていることを特徴とする、請求項１０に記載のイムノクロマトグラフィー装置。