JPWO2015129361A1 - 表面プラズモン励起増強蛍光分光測定用センサーチップ - Google Patents
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Abstract
本発明は、測定試料（生体試料）由来の夾雑物がセンサー部に非特異的に吸着することが効果的に防止され、かつ時間経過によっても誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果が低下しないセンサーチップを提供することを課題とするものである。本発明のセンサーチップは誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップである。
Description
本発明は、測定試料（生体試料）由来の夾雑物がセンサー部に非特異的に吸着することが防止された表面プラズモン励起増強蛍光分光測定用センサーチップに関する。更に詳しくは、測定試料（生体試料）由来の夾雑物がセンサー部に非特異的に吸着することが防止され、更に誘電体部材からの自家蛍光によるノイズの発生が低減された表面プラズモン励起増強蛍光分光測定用センサーチップに関する。
ヒトや動物の血液、尿、その他の生体試料中に含まれる腫瘍マーカー、特定のタンパク質や核酸、その他の生体関連物質を検出、定量することは、今日の医療分野における診断や生物、生化学の分野における研究において広く行われている。そして、生体試料中に含まれる微量の生体関連物質を高感度に測定する方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ、Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）（以下、「ＳＰＦＳ」ともいう）を用いた測定方法が知られている。
ＳＰＦＳでは、光源より照射したレーザー光等の励起光が、金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン（粗密波）を発生させる。その結果、光源より照射した励起光が有するフォトン量が数十倍〜数百倍に増加され、表面プラズモン光の電場増強効果が得られる。そして、ＳＰＦＳを用いた測定法では、金属薄膜の表面近傍に捕捉した測定対象化合物と結合した蛍光物質を、この電場増強効果により効率良く励起させ、発生する蛍光発光を観察することによって、極めて微量の測定対象化合物も測定可能となる。
表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」ともいう）の概略構成の一例を図１に示す。ＳＰＦＳ装置１００は、センサーチップ装填部１１１を備えており、このセンサーチップ装填部１１１に、センサーチップ１１０が装填されるように構成されている。
図１の例では、センサーチップ１１０は、誘電体部材１１２と、誘電体部材１１２の主面１１２ａ上に形成された金属薄膜１１３と、金属薄膜１１３上の微細流路１１７の所定位置に形成されたセンサー部１１６を有している。センサー部１１６は、測定対象物質を捕捉する物質（以下、捕捉物質ともいう）が固定化された領域である。微細流路１１７は、薄層部材１１４とプレート（蓋）１１５によって、誘電体部材１１２の主面１１２ａに金属薄膜１１３を介して形成されている。
ＳＰＦＳ装置１００のセンサーチップ装填部１１１に装填されたセンサーチップ１１０の誘電体部材１１２側には、誘電体部材１１２の入射面１１２ｉから入射され、金属薄膜１１３において全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる所定の入射角θでセンサー部１１６に向かう励起光１２１を照射する光源１２０を備えるとともに、さらに光源１２０から照射された励起光１２１が金属薄膜１１３で反射した反射光１２２を受光する受光手段１２３が備えられている。また、センサーチップ１１０の上方には、センサー部１１６に捕捉された測定対象物質を標識する蛍光物質が発する蛍光１３１を受光する光検出手段１３０が設けられている。
センサーチップ１１０と光検出手段１３０との間には、蛍光１３１を効率良く集光するための集光部材１２６と、蛍光１３１以外の光を除去して蛍光１３１のみを選択的に透過する波長選択機能部材１３３が設けられている。
このようなＳＰＦＳ装置１００は、使用例は次の通りである。
先ず、センサー部１１６に微細流路１１７を通して測定対象物質を含有する検体液（測定試料）を流入させ、測定対象物質をセンサー部１１６に固定された捕捉物質に捕捉する。次いで、測定対象物質を蛍光標識する物質（例えば、蛍光標識化２次抗体）（以下、蛍光標識物質ともいう）を、同様に微細流路１１７を通して流入させることで、センサー部１１６に蛍光物質で標識された測定対象物質が捕捉された状態とする。
先ず、センサー部１１６に微細流路１１７を通して測定対象物質を含有する検体液（測定試料）を流入させ、測定対象物質をセンサー部１１６に固定された捕捉物質に捕捉する。次いで、測定対象物質を蛍光標識する物質（例えば、蛍光標識化２次抗体）（以下、蛍光標識物質ともいう）を、同様に微細流路１１７を通して流入させることで、センサー部１１６に蛍光物質で標識された測定対象物質が捕捉された状態とする。
そして、この状態で光源１２０より誘電体部材１１２を介して、金属薄膜１１３において全反射減衰が生じる所定の入射角θで励起光１２１を照射することで、エバネッセント波と金属薄膜１１３からの表面プラズモンとの共鳴によって増強された電場が発生し、それによりセンサー部１１６に捕捉された測定対象物質を標識する蛍光物質による蛍光１３１を効率良く励起させる。この励起された蛍光１３１を光検出手段１３０で検出することで、極めて微量の測定対象物質でも検出・定量が可能である。
このようなＳＰＦＳ装置を用いて、生体試料中の測定対象物質を測定する場合、センサー部１１６に捕捉された測定対象物質を標識する蛍光物質による蛍光１３１以外にもノイズが発生する。このノイズは、主として、蛍光標識物質がセンサー部１１６に非特異的に結合することによるノイズ（ブランクシグナル）並びに誘電体部材１１２等の基材からの自家蛍光及び環境由来の迷光によるノイズ（ベースラインシグナル）である。
このうち、ブランクシグナルの主な原因は、生体試料中に含まれる測定対象物質以外のタンパク質、脂質、糖、その他の夾雑物がセンサー部（センサー部の捕捉物質（１次抗体等）や捕捉物質を固定化するための支持体等）に非特異的に吸着し、この夾雑物に蛍光標識物質が結合することや、蛍光標識物質が直接センサー部に非特異的に吸着すること等にある。なお、夾雑物や蛍光標識物質の非特異的な吸着を防止する方法としては、ブロッキング剤による処理（以下、ブロッキング処理という）が知られている（特許文献１）。
また、ベースラインシグナルの原因の一つに、プリズム等の誘電体部材の材料から生じる自家蛍光があるが、自家蛍光の多くの部分は、金属薄膜により遮蔽されることにより、光検出手段には届かず、ベースラインシグナルが抑制されている。
微細流路を有するセンサーチップにおいて、従来は、ブロッキング剤を含む溶液を微細流路に導入し、微細流路中の金属薄膜全体をブロッキング剤を含む溶液で覆うことにより、ブロッキング処理を行っていた。このブロッキング処理により、夾雑物がセンサー部に非特異的に吸着することは防止される。しかしながら、時間の経過により、金属薄膜が部分的に誘電体部材から剥離する場合があった。すなわち、通常、プラズマ支援型スパッタ法、電子ビーム加熱式真空蒸着法等の真空成膜法等によって誘電体部材の主面上に金属薄膜が形成されるが、上記のように金属薄膜をブロッキング処理した後に時間が経過すると、金属薄膜が部分的に円形隆起し誘電体部材から剥離する現象が生じる場合があった。その結果、誘電体部材の材料から生じる自家蛍光が金属薄膜によって十分に遮蔽されなくなり、ベースラインシグナルが増大し、ノイズの原因となることが分かってきた。
本発明は、測定試料（生体試料）由来の夾雑物がセンサー部に非特異的に吸着することが効果的に防止され、かつ時間経過によっても誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果が低下しないセンサーチップを提供することを課題とする。
本発明者らは、誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果が時間経過によって低下する原因は、金属薄膜が誘電体部材から部分的に剥離することにあることに着目した。そして検討した結果、金属薄膜が誘電体部材から剥離するのは金属薄膜上のブロッキング剤が影響していること、またその原因として、特許文献１に記載されているように微細流路を形成してブロッキング剤を送液し、底面に相当する金属薄膜表面を含む微細流路の内壁を全面的にブロッキング処理をした場合、ブロッキング剤溶液が微細流路内（金属薄膜表面）に残存し、その水分が金属薄膜の隆起や剥離を生み出している可能性があることを見い出した。そして、ブロッキング処理を、センサー部を含む必要な範囲のみに限定することが、金属薄膜の誘電体部材からの剥離防止に有効であることを見い出し、本発明を完成させた。
更に、異なる領域にそれぞれ異なる種類の捕捉物質を固定したセンサーチップの場合は、それぞれのセンサー部に固定した捕捉物質に捕捉される物質、すなわち、それぞれのセンサー部に捕捉される測定対象物質、に適したブロッキング剤で、それぞれのセンサー部を含む必要な範囲のみをブロッキング処理をすることが、夾雑物の非特異吸着防止と誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果の低減防止の両者を実現するために有効であることを見い出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップは、次の通りである。
すなわち、本発明の表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップは、次の通りである。
[項１]
誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ。
[項２]
前記ブロッキング処理が前記捕捉物質が固定された領域のみに行われている、項１に記載のセンサーチップ。
[項３]
前記捕捉物質が固定された領域を複数有し、前記複数の領域のそれぞれに行うブロッキング処理のブロッキング剤のうち少なくとも１種が他のブロッキング剤と異なっている項１又は２に記載のセンサーチップ。
[項４]
前記ブロッキング剤がブロッキング効果を有する物質と糖類とを含む、項１〜３いずれか一項に記載のセンサーチップ。
[項５]
前記ブロッキング剤がウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン及びスキムミルクのうちの少なくとも１種を含む項１〜４いずれか一項に記載のセンサーチップ。
誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ。
[項２]
前記ブロッキング処理が前記捕捉物質が固定された領域のみに行われている、項１に記載のセンサーチップ。
[項３]
前記捕捉物質が固定された領域を複数有し、前記複数の領域のそれぞれに行うブロッキング処理のブロッキング剤のうち少なくとも１種が他のブロッキング剤と異なっている項１又は２に記載のセンサーチップ。
[項４]
前記ブロッキング剤がブロッキング効果を有する物質と糖類とを含む、項１〜３いずれか一項に記載のセンサーチップ。
[項５]
前記ブロッキング剤がウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン及びスキムミルクのうちの少なくとも１種を含む項１〜４いずれか一項に記載のセンサーチップ。
本発明によれば、測定試料（生体試料）由来の夾雑物がセンサー部に非特異的に吸着することが効果的に防止され、かつ時間経過によっても誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果が低下しないセンサーチップが提供される。
以下に、図面を用いて本発明のセンサーチップについて詳細に説明するが、本発明のセンサーチップは図面の具体例に限定されるものではない。
１．センサーチップの構成
本発明のセンサーチップは、
「誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ」
である。
１．センサーチップの構成
本発明のセンサーチップは、
「誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ」
である。
図２に示した本発明のセンサーチップの一具体例に基づいて、本発明のセンサーチップの主要な構成を説明する。図２ａは、１つのセンサー部を有するセンサーチップの一具体例である。なお、図２ａでは蓋などの部材は省略して示している。図２ｂは、１つのセンサー部を有するセンサーチップの一具体例を用いて、流路を形成したものである。図２ｃは、３つのセンサー部を有するセンサーチップの一具体例である。なお、図２ｃにおいても簡略化のため流路を形成する部材（蓋など）は省略して示している。
図２ａ及び図２ｃに示すように、センサーチップの一具体例２００は、誘電体部材２０１と、誘電体部材２０１の主面２０１ａ上に形成された金属薄膜２０２と、金属薄膜２０２の一部に設けられたセンサー部２０３とを有する。センサー部とは、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域のことをいい、金属薄膜２０２上の一部の領域に形成される。センサー部２０３を含む領域は、ブロッキング剤によるブロッキング処理が行われているが、このブロッキング処理は測定試料と金属薄膜２０２との接液面の全体、すなわち流路２０６内の金属薄膜２０２全体には行われていない。これらセンサーチップは、具体的には図２ｂに例示するような流路等が形成されたセンサーチップに構成されて使用される。
図２ｂに示すセンサーチップは、図２ａ及び図２ｃに示したセンサーチップと同様な構成を備え、さらに流路等が形成された状態の一具体例を示している。なお、図２ｂは図２ａに示したように１つのセンサー部を有するセンサーチップの具体例であるが、図２ｃに示したように複数のセンサー部を有するセンサーチップの場合にも同様な構成にすることができる。図２ｂに示すように、センサーチップの一具体例２００は、金属薄膜２０２上に薄層部材２０４を設置し、薄層部材２０４上にプレート（蓋）２０５を設置することにより、測定試料が流れる流路２０６がセンサー部２０３を含む金属薄膜２０２上に形成される。測定試料は、ピペット等を用いて、流入・排出口２０７から流路２０６に導入し、導入された測定試料は液溜部２０８に溜るようになっている。
センサーチップ２００は、ＳＰＦＳ装置に装填して使用する。測定に際しては、測定試料を流入・排出口２０７から注入する。流入・排出口２０７でピペット等により測定試料を注入し、所定時間反応させることで、測定対象物質はセンサー部２０３に固定された捕捉物質に捕捉される。その後、測定試料を流入・排出口２０７からピペット等により排出する。続いて、洗浄液（例えば界面活性剤が溶解したＰＢＳ）を流入・排出口２０７から注入し、流路２０６に残存する測定試料や非特異的に吸着した測定対象物質を洗い流した後、それらが溶け込んだ洗浄液を流入・排出口２０７から吸引する。次に、センサー部２０３に捕捉された測定対象物質を蛍光物質で標識するため、蛍光物質の溶液を流入・排出口２０７から注入し、測定試料のときと同様、所定時間反応させた後、流入・排出口２０７から吸引する。再び、洗浄液を流入・排出口２０７から注入し、流路２０６に残存する蛍光物質の溶液や非特異的に吸着した蛍光物質を洗い流した後、それらが溶け込んだ洗浄液を流入・排出口２０７から吸引する。最後に、測定液（例えばＰＢＳ）を流入・排出口２０７から注入し、流路２０６を測定液で満たした状態にしてから、センサー部に励起光を照射し、表面プラズモン励起増強蛍光分光法による蛍光物質の励起された蛍光を測定する。
なお、本発明で測定試料とは、本発明のセンサーチップを装填したＳＰＦＳ装置に供する試料をいい、例えば、測定試料は生体試料、すなわち、ヒトや動物から採取された検体、および生体試料に由来する物質を含んだ試料である。また、本発明で測定対象物質とは、本発明のセンサーチップを装填したＳＰＦＳ装置を用いて検出又は定量する物質をいい、例えば、測定対象物質は、測定試料から検出又は定量するタンパク質、脂質、糖、核酸、その他の物質である。
２．誘電体部材
上記の本発明のセンサーチップの一具体例（図２）では、誘電体部材２０１は、断面が台形状をなした六面体形状に形成されている。その上側の面が主面２０１ａであり、この六面体の側面の一面が、励起光の入射面である入射面２０１ｉである。
上記の本発明のセンサーチップの一具体例（図２）では、誘電体部材２０１は、断面が台形状をなした六面体形状に形成されている。その上側の面が主面２０１ａであり、この六面体の側面の一面が、励起光の入射面である入射面２０１ｉである。
誘電体部材２０１の形状は、上記のような六面体形状に限定されない。少なくともセンサー部２０３が形成される主面２０１ａと、励起光が入射する面である入射面２０１ｉを有し、入射面２０１ｉから入射した励起光が、誘電体部材２０１の内部を通過し、全反射条件となる所定の入射角θでセンサー部２０３を照射するように構成されていればよく、その形状は、例えば円錐形状や、三角錐や四角錐などの角錐形状、或いはかまぼこ状であってもよい。また、誘電体部材２０１に二面以上の入射面２０１ｉを形成することも可能である。
誘電体部材の材質は、少なくとも励起光に関して光学的に透明な材料から形成されていればその材質は特に限定されないが、安価で取り扱い性に優れるセンサーチップを提供する上では、例えば樹脂材料から形成されていることが好ましい。誘電体部材を樹脂材料から形成する場合は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）等のアクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。
誘電体部材の形成方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のような樹脂材料を用いる場合には、射出成形によって形成することができる。
誘電体部材の形成方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のような樹脂材料を用いる場合には、射出成形によって形成することができる。
３．金属薄膜
金属薄膜２０２（図２参照）は、一般的なＳＰＦＳ装置に用いられるセンサーチップを構成する金属薄膜と同様の金属を用いることができる。すなわち、金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、その中でも金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。
金属薄膜２０２（図２参照）は、一般的なＳＰＦＳ装置に用いられるセンサーチップを構成する金属薄膜と同様の金属を用いることができる。すなわち、金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、その中でも金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。
金属薄膜を誘電体部材の主面上に形成する方法としては、通常行われている方法を用いればよく、例えば、電子ビーム加熱真空蒸着法、抵抗加熱真空蒸着法、マグネトロンスパッタ法、プラズマ支援スパッタ法、イオンアシスト蒸着法、イオンプレーティング法等の真空成膜法によって、誘電体部材の主面上に金属薄膜を成膜することができる。
金属薄膜の厚さとしては、金は５〜５００ｎｍ、銀は５〜５００ｎｍ、アルミニウムは５〜５００ｎｍ、銅は５〜５００ｎｍ、白金は５〜５００ｎｍ、これらの合金は５〜５００ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金は２０〜７０ｎｍ、銀は２０〜７０ｎｍ、アルミニウムは１０〜５０ｎｍ、銅は２０〜７０ｎｍ、白金は２０〜７０ｎｍ、これらの合金は１０〜７０ｎｍがより好ましい。金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。
４．センサー部
センサー部２０３（図２参照）は、金属薄膜２０２上の一部の領域に設けられており、この領域に捕捉物質が固定されている。この場合、センサー部は複数個設けられていてもよく、それぞれのセンサー部には異なる捕捉物質が固定されていてもよい（図２ｃ参照）。
センサー部２０３（図２参照）は、金属薄膜２０２上の一部の領域に設けられており、この領域に捕捉物質が固定されている。この場合、センサー部は複数個設けられていてもよく、それぞれのセンサー部には異なる捕捉物質が固定されていてもよい（図２ｃ参照）。
捕捉物質は、測定対象物質（タンパク質、脂質、糖、核酸、その他の物質）を特異的に捕捉する物質である。捕捉物質としては、例えば、抗原に対する抗体、基質・補酵素に対する酵素、ホルモンに対するレセプタ、抗体に対するプロテインＡ・プロテインＧ、ビオチンに対するアビジン類、カルシウムに対するカルモジュリン、糖に対するレクチン、等が挙げられる。また、測定対象物質が核酸である場合、それと特異的に結合する配列を有する核酸も捕捉物質として使用可能である。
捕捉物質を金属薄膜上に固定する方法としては、通常行われている方法を用いればよく、例えば、金属薄膜の表面に特定の結合を生じる修飾基を導入し、捕捉物質にこの修飾基に対応した反応基を導入し、これらの修飾基と反応基を結合させることにより、捕捉物質を金属薄膜上に固定することができる。
具体的には、例えば、必要に応じて金属薄膜上に誘電体層を形成させた後、金属薄膜の表面を、末端にアミノ基を有するシランカップリング剤で処理してアミノ基で修飾し、続いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）−ＰＥＧ４−ビオチンで処理して上記アミノ基にビオチンを結合させ、このビオチンにアビジンを反応させた後に、ビオチン化した捕捉物質（例えば抗体）を反応させることにより、金属薄膜上に捕捉物質を固定することができる。あるいは、金属薄膜の表面を、末端にカルボキシル基を有するシランカップリング剤で処理してカルボキシル基で修飾し、続いてＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride）およびＮＨＳで処理してそのカルボキシル基を活性エステル化した後に、アミノ基を有する捕捉物質（例えば抗体）を反応させることによっても、金属薄膜上に捕捉物質を固定することができる。
また、必要に応じて、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を、金属薄膜の表面に形成させ、捕捉物質を金属薄膜上に固定してもよい。ＳＡＭは、捕捉物質を金属薄膜上に固定する際の土台としての役割を有する。
このＳＡＭが含む単分子としては、例えば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
ＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。形成したＳＡＭ上へ捕捉物質を固定する方法も、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、上記のＥＤＣ及びＮＨＳで処理する方法を用いることができる。
金属薄膜上に捕捉物質が固定された領域、すなわちセンサー部、の形状及び面積は、特に限定されるものではないが、入射した励起光が照射される照射領域の面積以上であることが好ましい。特に、センサー部で励起された蛍光測定時のＳ／Ｎを向上させるためには、センサー部の形状は、励起光が照射される領域と同じ形状であることが好ましい。この場合、金属薄膜上の一部の領域のみに捕捉物質を固定するためには、捕捉物質を固定する領域の形状に応じて、例えば後述する溶液貯留部材３０４のような部材を金属薄膜上の所定の位置に設置して、この部材の中へ上記の捕捉物質を金属薄膜上に固定する方法で用いる試薬等を添加すればよい。
なお、センサー部は、上記のような流路の金属薄膜上に形成する場合に限定されるものではなく、例えば、ウエルを有するプレートのウエル内の金属薄膜上に形成してもよい。
なお、センサー部は、上記のような流路の金属薄膜上に形成する場合に限定されるものではなく、例えば、ウエルを有するプレートのウエル内の金属薄膜上に形成してもよい。
５．ブロッキング処理
本発明でブロッキング処理とは、測定試料中の夾雑物（測定対象物質以外のタンパク質、脂質、糖、その他）や蛍光標識物質がセンサー部に非特異的に吸着又は結合することを防止する処理をいい、本発明でブロッキング剤とは、このような吸着又は結合を防止する物質をいう。
本発明でブロッキング処理とは、測定試料中の夾雑物（測定対象物質以外のタンパク質、脂質、糖、その他）や蛍光標識物質がセンサー部に非特異的に吸着又は結合することを防止する処理をいい、本発明でブロッキング剤とは、このような吸着又は結合を防止する物質をいう。
本発明のセンサーチップ２０３（図２参照）は、金属薄膜２０２上の捕捉物質が固定された領域（センサー部２０３）を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われている。ただし、このブロッキング処理は、測定試料と金属薄膜２０２との接液面の全体には行われていない。
前述のように、本発明者らが検討したところ、誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果が時間経過によって低下する原因は金属薄膜が誘電体部材から部分的に剥離することにあり、このように金属薄膜が誘電体部材から剥離するのは金属薄膜上のブロッキング剤が影響している。従って、金属薄膜の誘電体部材からの剥離を防止するためには、ブロッキング処理を、捕捉物質が固定された領域（センサー部）を含む必要な範囲、好ましくは捕捉物質が固定された領域（センサー部）のみに限定して行うことが効果的である。
また、捕捉物質が固定された領域を複数有するセンサーチップの場合、捕捉物質が固定されたそれぞれの領域に行うブロッキング処理のブロッキング剤のうち少なくとも１種が他のブロッキング剤と異なっていることが好ましい。異なる領域にそれぞれ異なる種類の捕捉物質を固定したセンサーチップの場合（例えば、図２ｃの場合）は、それぞれのセンサー部に固定した捕捉物質に捕捉される物質、すなわち、それぞれのセンサー部に捕捉される測定対象物質、に適したブロッキング剤で、それぞれのセンサー部のみをブロッキング処理をすることが、夾雑物の非特異吸着防止と誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果の低減防止の両者を実現するために有効である。全てのセンサー部の領域を同じブロッキング剤でブロッキング処理すると、それぞれのセンサー部に捕捉される測定対象物質に対してブロッキング効果が異なり、ブロッキング効果を最適化することができない場合がある。従って、例えば、図２ｃのセンサー部２０３の場合は、それぞれの領域に捕捉される測定対象物質に適したブロッキング剤でそれぞれのセンサー部のみをブロッキングすることが好ましく、これによって、いわゆるマルチアッセイにおいても、ノイズが低減された高感度の測定を達成できる。
なお、捕捉物質が固定された金属薄膜上の領域（センサー部）を複数有するセンサーチップの場合、測定試料と金属薄膜との接液面の全体を、上記センサー部をそれぞれ１個ずつ含む領域に分けて、それぞれの領域の全体を、その領域に適したブロッキング剤、すなわち、その領域のセンサー部で捕捉される測定対象物質に適したブロッキング剤によりブロッキング処理を行ってもよい（例えば、図４を参照）。このように、測定対象物質が異なる複数のセンサー部を有するセンサーチップにおいては、少なくともセンサー部のそれぞれの領域には各センサー部に適したブロッキング処理を行うべく、センサー部毎に異なるブロッキング剤によるブロッキング処理を行うことが好ましく、このようにブロッキング処理を行うことにより、前述のように、マルチアッセイにおいてもノイズが低減された高感度の測定を達成することができる。
ブロッキング剤及びブロッキング処理方法は、特に制限はなく、通常行われているものを使用すればよい。ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク、フィッシュゼラチン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤、カゼイン、プロタミン、ポリエチレングリコール、トレハロース、デキストラン等が知られており、測定試料、測定対象物質に応じて適切なものを選べばよい。このうち、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルクがより一般的によく使用される。
ブロッキング剤の選定方法の例は、次の通りである。すなわち、候補とするブロッキング剤で本発明のセンサーチップのセンサー部を含む領域をブロッキング処理し、センサーチップをＳＰＦＳ装置に装填した後、測定試料をセンサーチップの流路に導入し、センサー部に測定対象物質を捕捉し、捕捉された測定対象物質を蛍光物質で標識して、センサー部に励起光を照射し蛍光を測定する。ブロッキング処理しないセンサーチップについても、同様に蛍光を測定し、両者の蛍光を比較して、観察されるノイズ（ブランクシグナル及びベースラインシグナルの合計）が目的に応じた程度に低減されるブロッキング剤を選定すればよい。
測定対象物質に対するブロッキング剤の好ましい例としては、トロポニンＩに対するブロッキング剤としてはカゼイン、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰに対するブロッキング剤としてはゼラチン、Ｄ−Ｄｉｍｅｒに対するブロッキング剤としてはＢＳＡが挙げられる。
このようなブロッキング剤は、更に糖類を含むことによって、捕捉物質、特に抗体のようなタンパク質の捕捉物質、の構造を安定に保護し、時間経過による測定対象物質が有する捕捉効果の減少を防ぐ効果がある。このような糖類は、単糖（例えば、グルコース、フルクトース等）、二糖（スクロース、マルトース等）、及び３〜１０個の単糖から構成されるオリゴ糖（ラフィノース、パノース等）からなる群から選択される少なくとも１種の糖であることが好ましい。また、糖類がブロッキング剤溶液に含まれる量は、ブロッキング剤溶液に対して、１〜２０重量％であることが好ましく、５〜１２重量％であることがより好ましい。
ブロッキング処理の方法としては、例えば、ブロッキング剤を溶液状態として、金属薄膜のセンサー部の表面に加えて覆い、所定時間保持後、金属薄膜のセンサー部から余剰のブロッキング剤溶液を除去すればよい。具体的には、例えば、ブロッキング剤溶液で覆った状態で室温で１時間保持し、ブロッキング剤溶液を除去して、ブロッキング剤溶液で覆ったセンサー部等の表面を乾燥させるように、例えばセンサーチップ全体を乾燥させることが挙げられる。
ブロッキング処理は、捕捉物質が固定された領域、すなわちセンサー部２０３のみに行われていることが好ましい。これは、ブロッキング剤によるブロッキング処理を必要最小限とすることにより、前述のブロッキング剤（水分の残存等）の金属薄膜の剥離に与える影響を最小限とするためである。
金属薄膜上の捕捉物質が固定された領域（センサー部）のみをブロッキングする方法の例として、図３に示す工程を説明する。センサー部３０３が円形の場合、センサー部と同じ寸法の内径を有する円筒形の溶液貯留部材３０４を、金属薄膜３０２のセンサー部３０３上に、センサー部３０３がブロッキング溶液貯留部材の内径に入るように設置する。溶液貯留部材３０４の材質は、ブロッキング剤溶液を貯留できるものであれば特に制限はなく、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）などの樹脂等である。次に、溶液貯留部材３０４内へ、ピペット等により、センサー部３０３全体が覆われるようにブロッキング溶液を加え、所定の時間、例えば１時間保持する。この場合、溶液貯留部材３０４内に入れたブロッキング剤溶液３０５が溶液貯留部材３０４と金属薄膜３０２との隙間から漏れ出さないように、溶液貯留部材３０４と金属薄膜３０２との間をシールしておく。このシールは、例えば、溶液貯留部材３０４の下部に巻いたシール部材３０６より行われる。シール部材３０６の材質は、例えばゴムであり、シール部材３０６の効果をより十分にするために、例えばブロッキング剤溶液貯留部材３０４と誘電体部材３００を適当な板部材（図示せず）で挟んで力を加える等の方法によって、溶液貯留部材３０４の上から力を加えてシール部材３０６を金属薄膜３０３の表面に密着させることが好ましい。室温で所定時間(例えば１時間)保持後、ピペット等により、溶液貯留部材３０４からブロッキング剤溶液３０５を取り出した後、恒温槽にセンサーチップを入れて乾燥させる。
センサー部３０３に対して行うブロッキング処理は、複数のブロッキング剤を用いた処理であってもよい。例えば、測定試料と測定対象物質に応じて、複数のブロッキング剤を用いることがブロッキング効果が高い場合は、ある種類のブロッキング剤溶液を用いて処理した後に、別の種類のブロッキング剤溶液を用いて処理すれば、それらの２種類のブロッキング剤からなる層でセンサー部３０３を被覆することができる。
センサー部の形状は円形に限るものではないことは前述の通りであり、円形以外の形状のセンサー部の場合は、その形状に応じたブロッキング剤溶液貯留部材を設置すればよい。また、例えば図２ｃのような複数のセンサー部を有するセンサーチップの場合は、上記の方法を複数のセンサー部に対して行えばよい。
なお、前述のように、捕捉物質が固定された金属薄膜上の領域（センサー部）を複数有するセンサーチップの場合、測定試料と金属薄膜との接液面の全体を、上記センサー部をそれぞれ１個ずつ含む領域に分けて、それぞれの領域の全体を、その領域に適したブロッキング剤によりブロッキング処理を行ってもよい（例えば、図４を参照）。この場合、１つの領域を適当な部材で区切り、他の領域にブロッキング剤が接触しないようにして、それぞれの領域を、その領域に適したブロッキング剤によりブロッキング処理を行うことができる。
６．測定試料中の測定対象物質の検出、定量
本発明のセンサーチップは、ＳＰＦＳ装置に装填して、測定試料中の測定対象物質の検出、定量に使用することができる。ＳＰＦＳ装置は、従来公知のものを使用することができ、測定対象物質のセンサー部への捕捉、捕捉された測定対象物質の蛍光標識（例えば、標識化２次抗体の使用等）、励起光の照射、エバネッセント波と金属薄膜からの表面プラズモンとの共鳴、蛍光発光の測定等についても、従来公知の種々の方法でよく、特に制限はない。
本発明のセンサーチップは、ＳＰＦＳ装置に装填して、測定試料中の測定対象物質の検出、定量に使用することができる。ＳＰＦＳ装置は、従来公知のものを使用することができ、測定対象物質のセンサー部への捕捉、捕捉された測定対象物質の蛍光標識（例えば、標識化２次抗体の使用等）、励起光の照射、エバネッセント波と金属薄膜からの表面プラズモンとの共鳴、蛍光発光の測定等についても、従来公知の種々の方法でよく、特に制限はない。
本発明のセンサーチップの一具体例として、図２ｂに示すように、金属薄膜２０２上に薄層部材２０４を設置し、薄層部材２０４上にプレート（蓋）２０５を設置することにより、測定試料が流れる流路２０６をセンサー部２０３を含む金属薄膜２０２上に形成したセンサーチップが挙げられることは前述の通りである。この場合の薄層部材２０４の材質は、例えばアクリル性粘着シートであり、その厚さは目的の流路の高さに応じて決めればよく、例えば、２０〜１０００μｍである。プレート（蓋）２０５の材質は、例えば前述した誘電体部材と同様の樹脂材料である。流入・排出口２０７及び液溜部２０８の形状は、前述のように、流入・排出口２０７からピペット等を用いて測定試料を導入し、流入・排出口２０７でピペット等により測定試料を数回繰り返し吸引、注入することにより、液溜部２０８に溜った測定試料が撹拌されやすいように、適宜設定することができる。
また、本発明のセンサーチップは、上記のような流路を構成して使用する場合だけでなく、他の形態、例えば、ウエルを有するプレートのウエル内にセンサー部を形成したセンサーチップをＳＰＦＳ装置に装填して使用してもよいことも前述の通りである。
測定試料は、前述の通り、例えば生体試料（ヒトや動物から採取された検体）であるが、実際の測定のために、液状の検体が好ましい。このような測定試料の例として代表的なものは、血液（血清、血漿を含む）及び尿である。細胞を対象とする場合も、所定の方法に従って細胞懸濁液を作製して、液状の測定試料とすることもできる。また、採取された検体は、必要に応じて、抗凝固処理、遠心分離、抽出、その他の必要な処理を行った上で、測定試料としてもよい。
測定対象物質は、前述の通り、測定試料から検出又は定量するタンパク質、脂質、糖、核酸、その他の物質である。測定試料が血液の場合の測定対象物質の例として、心筋マーカーであるトロポニンＩ、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ、Ｄ−Ｄｉｍｅｒ等が挙げられる。
以下に、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）：誘電体部材の材料としてシクロオレフィンポリマー樹脂（日本ゼオン株式会社）、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）用いて作成した略台形の断面形状を持つプリズム部材の主面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。
［実施例１］
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）：誘電体部材の材料としてシクロオレフィンポリマー樹脂（日本ゼオン株式会社）、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）用いて作成した略台形の断面形状を持つプリズム部材の主面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。
工程（ｂ）：得られた成膜済みプリズムを、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（自己組織化単分子膜）を形成した。プリズムを該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。
工程（ｃ）：ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）製の外径７ｍｍ、内径５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円筒部材の一方の端に、深さ０．５ｍｍ、幅１ｍｍの溝を形成し、フッ素ゴム製の太さ１ｍｍ、内径６ｍｍのＯリング（株式会社ミスミ）を設置した容液貯留部材を、該工程（ｂ）で得られたプリズムの金属薄膜上に設置した。溶液貯留部材からの漏出を防ぐため、ステンレス製の板材２枚を用いて溶液貯留部材及びプリズムを上下から挟み込み、ビスで固定した（上側のステンレス製の板材には、溶液貯留部材へ試薬等を出し入れするための開口部が設けられている）。
工程（ｄ）：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド〔ＥＤＣ〕を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ〔2-morpholinoethanesulfonic acid〕緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）を０．２ｍＬ導入し、２０分間反応させた後、反応液を抜き取り、抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（ｐＨ６．０）０．２ｍＬを導入し、３０分間反応させることで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。
工程（ｅ）：次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬを導入し、１５分間反応させることで、未反応の活性化エステル基を不活性化した。
工程（ｆ）：ブロッキング剤溶液として１重量％カゼインと１０重量％スクロースを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を導入し、３０分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取り、１次抗体が固定化された領域に非特異的吸着防止処理を行った。
工程（ｆ）：ブロッキング剤溶液として１重量％カゼインと１０重量％スクロースを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を導入し、３０分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取り、１次抗体が固定化された領域に非特異的吸着防止処理を行った。
工程（ｇ）：溶液貯留部材を除去し、流路を形成するための貫通孔（７ｍｍ×３０ｍｍ）を形成したＰＥＴ基材両面テープＮｏ．５６１０（日東電工株式会社）（薄層部材２０４）を用いて、流入・排出口２０７および液溜部２０８を有する、厚さ１０ｍｍのポリメチルメタクリレート製プレートを接着し、流路２０６を形成し、センサーチップとした。
（２）センサーチップ作製直後と保存後の比較
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
抗原添加工程：（１）によって作製したセンサーチップに、抗原となるトロポニンＩを０．１ｎｇ／ｍＬと１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を注入し、固相化された１次抗体と抗原を３０分間反応させた。抗原を含む溶液を吸引除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを注入・吸引除去する操作を数回繰り返し、洗浄操作を行った。
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
抗原添加工程：（１）によって作製したセンサーチップに、抗原となるトロポニンＩを０．１ｎｇ／ｍＬと１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を注入し、固相化された１次抗体と抗原を３０分間反応させた。抗原を含む溶液を吸引除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを注入・吸引除去する操作を数回繰り返し、洗浄操作を行った。
ベースラインシグナル測定：ここでブランクの蛍光（ベースラインシグナル）を、光源としてレーザー光源を用いて、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルター（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、センサーチップの金属薄膜に照射し、カットフィルターとして蛍光成分以外の波長をカットするカットフィルター、対物レンズ（２０倍）を用いてＣＣＤイメージセンサー（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。
標識抗体添加工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを吸引除去し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体（一次抗体とは異なるクローン）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を流路に注入し、１５分間反応させ、免疫複合体を形成させた。蛍光標識抗体を含む溶液であるＰＢＳ緩衝生理食塩水を吸引除去した後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを注入・吸引除去する操作を数回繰り返し、洗浄操作を行った。
アッセイシグナル測定：ベースラインシグナル測定と同様に蛍光を測定し、免疫複合体に由来する蛍光シグナルを測定した。
ブランクシグナル測定：標識化抗体の非特異的な吸着に由来するブランクシグナルの測定は、別のセンサーチップを用いて上記抗原添加工程において、抗原となるトロポニンＩを含まない１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を注入することを除いて同様の工程で行った。
ブランクシグナル測定：標識化抗体の非特異的な吸着に由来するブランクシグナルの測定は、別のセンサーチップを用いて上記抗原添加工程において、抗原となるトロポニンＩを含まない１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を注入することを除いて同様の工程で行った。
Ｓ／Ｎの算出：上記測定で得られた、ノイズ成分（ベースラインシグナル、ブランクシグナル）と抗原を含む溶液を用いて得られたシグナルから、下記式によりＳ／Ｎを算出した。
Ｓ／Ｎ
＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ベースラインシグナル＋ブランクシグナル）｜
金属薄膜欠陥の評価：金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表１に示す。
Ｓ／Ｎ
＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ベースラインシグナル＋ブランクシグナル）｜
金属薄膜欠陥の評価：金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表１に示す。
（２−２）保存後のセンサーチップを用いた測定
（１）の手法で作製したセンサーチップを、４℃で６０日間保存した後、（２−１）と同様にベースラインシグナルおよびアッセイシグナルを測定し、Ｓ／Ｎを算出した。また、（２−１）と同様に、金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表１に示す。
（１）の手法で作製したセンサーチップを、４℃で６０日間保存した後、（２−１）と同様にベースラインシグナルおよびアッセイシグナルを測定し、Ｓ／Ｎを算出した。また、（２−１）と同様に、金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表１に示す。
［比較例１］
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）〜工程（ｅ）：上記実施例１と同様の手順で、プリズム上に成膜された金薄膜上に１次抗体を固相化した。
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）〜工程（ｅ）：上記実施例１と同様の手順で、プリズム上に成膜された金薄膜上に１次抗体を固相化した。
工程（ｆ）：溶液貯留部材を除去し、流路を形成するための貫通孔（７ｍｍ×３０ｍｍ）を形成したＰＥＴ基材両面テープＮｏ．５６１０（日東電工株式会社）（薄層部材２０４）を用いて、流入・排出口２０７および液溜部２０８を有する、厚さ１０ｍｍのポリメチルメタクリレート製プレートを接着し、流路２０６を形成した。
工程（ｇ）：最後にブロッキング剤溶液として１重量％カゼインと１０重量％スクロースを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を流路２０６に導入し、３０分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取って非特異的吸着防止処理（ブロッキング処理）を行い、センサーチップとした。
（２）センサーチップ作製直後と保存後の比較
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例１の（２−１）と同様にして、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表１に示す。
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例１の（２−１）と同様にして、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表１に示す。
（２−２）保存後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例１の（２−２）と同様にして、（１）の手法で作製したセンサーチップを保存した後、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表１に示す。
上記実施例１の（２−２）と同様にして、（１）の手法で作製したセンサーチップを保存した後、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表１に示す。
※２ 比較例１の保存日数０の場合のＳ／Ｎを１として、他の場合のＳ／Ｎを換算して表記した。
［実施例２］
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）：実施例１の工程（ａ）と同様に金成膜済みプリズムを作製した。
工程（ｂ）：実施例１と同様に、金薄膜の片面にＳＡＭ（自己組織化単分子膜）を形成した。
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）：実施例１の工程（ａ）と同様に金成膜済みプリズムを作製した。
工程（ｂ）：実施例１と同様に、金薄膜の片面にＳＡＭ（自己組織化単分子膜）を形成した。
工程（ｃ）：実施例１と同様のポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）製の溶液貯留部材を、金成膜済みプリズム上の３カ所（領域１〜３のセンサー部）に設置し、溶液貯留部からの漏出を防ぐため、ステンレス製の板材２枚を用いて溶液貯留部材及びプリズムを上下から挟み込み、ビスで固定した（上側のステンレス製の板材には、溶液貯留部材へ試薬等を出し入れするための開口部が設けられている）。
工程（ｄ）：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド〔ＥＤＣ〕を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ〔2-morpholinoethanesulfonic acid〕緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）を０．２ｍＬを各溶液貯留部材に導入し、２０分間反応させた後、反応液を抜き取り、それぞれの溶液貯留部材に、抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（ｐＨ６．０）を０．２ｍＬ、抗ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（ｐＨ６．０）を０．２ｍＬ、抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒモノクローナル抗体を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（ｐＨ６．０）を０．２ｍＬ導入し、３０分間反応させることで、ＳＡＭ上に異なる種類の１次抗体を固相化した。
工程（ｅ）：次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬを各溶液貯留部材に導入し、１５分間反応させることで、未反応の活性化エステル基を不活性化した。
工程（ｆ）：、抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体を固相化した領域に、ブロッキング剤溶液として１重量％カゼインと１０重量％スクロースを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を導入し、３０分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取り、抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体が固定化された領域に非特異的吸着防止処理を行った。
工程（ｇ）：同様に抗ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を固相化した領域に、１重量％ゼラチンと１０重量％スクロースを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を導入し、３０分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取り、抗ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰモノクローナル抗体が固定化された領域に非特異的吸着防止処理を行った。
工程（ｈ）：同様に抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒモノクローナル抗体を固相化した領域に、ブロッキング剤溶液として１重量％ゼラチンと１０重量％スクロースを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を導入し、３０分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取り、抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒモノクローナル抗体が固定化された領域に非特異的吸着防止処理を行った。
工程（ｉ）：溶液貯留部材を除去し、流路を形成するための貫通孔（７ｍｍ×３０ｍｍ）を形成したＰＥＴ基材両面テープＮｏ．５６１０（日東電工株式会社）（薄層部材２０４）を用いて、流入・排出口２０７および液溜部２０８を有する、厚さ１０ｍｍのポリメチルメタクリレート製プレートを接着し、流路２０６を形成し、３カ所（領域１〜３のセンサー部）の抗体固相化領域を有するセンサーチップとした。
（２）センサーチップ作製直後と保存後の比較
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
抗原添加工程：抗原溶液として、トロポニンＩを０．１ｎｇ／ｍＬと、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰを０．１ｎｇ／ｍＬと、Ｄ−Ｄｉｍｅｒを０．１ｎｇ／ｍＬと１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕とを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を使用することを除いては実施例１と同様に行った。
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
抗原添加工程：抗原溶液として、トロポニンＩを０．１ｎｇ／ｍＬと、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰを０．１ｎｇ／ｍＬと、Ｄ−Ｄｉｍｅｒを０．１ｎｇ／ｍＬと１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕とを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を使用することを除いては実施例１と同様に行った。
ベースラインシグナル測定：レーザー光源からの励起光を、センサーチップ上の３カ所の抗体固定化領域にそれぞれ照射することを除いて、実施例１と同様にベースラインシグナルの測定を行った。
標識抗体添加工程：標識抗体溶液として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体（一次抗体とは異なるクローン）、抗ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰモノクローナル抗体（一次抗体とは異なるクローン）、抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒモノクローナル抗体（一次抗体とは異なるクローン）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を使用することを除いて、実施例１と同様に行った。
アッセイシグナル測定：ベースラインシグナル測定と同様に、センサーチップ上の３カ所の抗体固定化領域にそれぞれ励起光を照射し、それぞれの抗体固定化領域における、免疫複合体に由来する蛍光シグナルを測定した。
ブランクシグナル測定：標識化抗体の非特異的な吸着に由来するブランクシグナルの測定は、別のセンサーチップを用いて上記抗原添加工程において、抗原を含まない１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を注入することを除いて同様の工程で行った。
Ｓ／Ｎの算出：上記測定で得られた、ノイズ成分（ベースラインシグナル、ブランクシグナル）と抗原を含む溶液を用いて得られたシグナルから、下記式によりＳ／Ｎを算出した。
Ｓ／Ｎ
＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ベースラインシグナル＋ブランクシグナル）｜
金属薄膜欠陥の評価：金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって行った。得られた結果を表２に示す。
Ｓ／Ｎ
＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ベースラインシグナル＋ブランクシグナル）｜
金属薄膜欠陥の評価：金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって行った。得られた結果を表２に示す。
（２−２）保存後のセンサーチップを用いた測定
（１）の手法で作製したセンサーチップを、４℃で６０日間保存した後、（２−１）と同様にベースラインシグナルおよびアッセイシグナルを測定し、Ｓ／Ｎを算出した。また、（２−１）と同様に、金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表２に示す。
（１）の手法で作製したセンサーチップを、４℃で６０日間保存した後、（２−１）と同様にベースラインシグナルおよびアッセイシグナルを測定し、Ｓ／Ｎを算出した。また、（２−１）と同様に、金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表２に示す。
［比較例２］
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）〜工程（ｅ）：上記実施例２と同様の手順で、プリズム上に成膜された金薄膜上に各１次抗体を固相化した。
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）〜工程（ｅ）：上記実施例２と同様の手順で、プリズム上に成膜された金薄膜上に各１次抗体を固相化した。
工程（ｆ）：溶液貯留部材を除去し、流路を形成するための貫通孔（７ｍｍ×３０ｍｍ）を形成したＰＥＴ基材両面テープＮｏ．５６１０（日東電工株式会社）（薄層部材２０４）を用いて、流入・排出口２０７および液溜部２０８を有する、厚さ１０ｍｍのポリメチルメタクリレート製プレートを接着し、流路２０６を形成した。
工程（ｇ）：最後にブロッキング剤溶液として１重量％カゼインと１０重量％スクロースを含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を流路２０６に導入し、３０分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取り、非特異的吸着防止処理を行い、３カ所（領域１〜３のセンサー部）の抗体固相化領域を有するセンサーチップとした。
（２）センサーチップ作製直後と保存後の比較
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例２の（２−１）と同様にして、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎ比の算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表２に示す。
（２−１）作製直後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例２の（２−１）と同様にして、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎ比の算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表２に示す。
（２−２）保存後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例２の（２−２）と同様にして、（１）の手法で作製したセンサーチップを保存した後、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表２に示す。
上記実施例２の（２−２）と同様にして、（１）の手法で作製したセンサーチップを保存した後、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにＳ／Ｎの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表２に示す。
表２から分かるように、実施例２によれば、異なる領域にそれぞれ異なる種類の捕捉物質を固定したセンサーチップであって、測定試料（生体試料）由来の夾雑物が、それぞれの捕捉物質が固定された領域（それぞれのセンサー部）に非特異的に吸着することが防止され、かつ時間経過によっても誘電体部材から生じる自家蛍光の遮蔽効果が低下しないセンサーチップが得られる。
※２ 各領域における実施例２、比較例２のブランクシグナルの％は、同じ項目（測定対象物質）で同じ保存日数の場合のブロッキング剤の差の影響を表したものである。それぞれの領域の各保存日数で、比較例２（ブロッキング剤は、カゼインを使用）の場合を１００％とし、それと同じ保存日数に対応する実施例２（ブロッキング剤は、各領域の測定対象物質に適したものを使用）の場合を換算して％で表記した。
※３ 各領域において、比較例２の保存日数０（ブロッキング剤はカゼインを使用）の場合のＳ／Ｎを１として、他の場合のＳ／Ｎを換算して表記した。
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ センサーチップ
１１１ センサーチップ装填部
１１２ 誘電体部材
１１２ａ 誘電体部材の主面
１１２ｉ 誘電体部材の入射面
１１３ 金属薄膜
１１４ 薄層部材
１１５ プレート（蓋）
１１６ センサー部
１１７ 微細流路
１２０ 光源
１２１ 励起光
１２２ 反射光
１２３ 受光手段
１３０ 光検出手段
１３１ 蛍光
１３２ 集光部材
１３３ 波長選択機能部材
θ 入射角
２００ センサーチップ
２０１ 誘電体部材
２０１ａ 誘電体部材の主面
２０１ｉ 誘電体部材の入射面
２０２ 金属薄膜
２０３ センサー部
２０４ 薄層部材
２０５ プレート（蓋）
２０６ 流路
２０７ 流入・排出口
２０８ 液溜部
３００ センサーチップ
３０１ 誘電体部材
３０１ａ 誘電体部材の主面
３０１ｉ 誘電体部材の入射面
３０２ 金属薄膜
３０３ センサー部
３０４ 溶液貯留部材
３０５ ブロッキング剤溶液
３０６ シール部材
１１０ センサーチップ
１１１ センサーチップ装填部
１１２ 誘電体部材
１１２ａ 誘電体部材の主面
１１２ｉ 誘電体部材の入射面
１１３ 金属薄膜
１１４ 薄層部材
１１５ プレート（蓋）
１１６ センサー部
１１７ 微細流路
１２０ 光源
１２１ 励起光
１２２ 反射光
１２３ 受光手段
１３０ 光検出手段
１３１ 蛍光
１３２ 集光部材
１３３ 波長選択機能部材
θ 入射角
２００ センサーチップ
２０１ 誘電体部材
２０１ａ 誘電体部材の主面
２０１ｉ 誘電体部材の入射面
２０２ 金属薄膜
２０３ センサー部
２０４ 薄層部材
２０５ プレート（蓋）
２０６ 流路
２０７ 流入・排出口
２０８ 液溜部
３００ センサーチップ
３０１ 誘電体部材
３０１ａ 誘電体部材の主面
３０１ｉ 誘電体部材の入射面
３０２ 金属薄膜
３０３ センサー部
３０４ 溶液貯留部材
３０５ ブロッキング剤溶液
３０６ シール部材
Claims (5)
- 誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ。 - 前記ブロッキング処理が前記捕捉物質が固定された領域のみに行われている、請求項１に記載のセンサーチップ。
- 前記捕捉物質が固定された領域を複数有し、前記複数の領域のそれぞれに行うブロッキング処理のブロッキング剤のうち少なくとも１種が他のブロッキング剤と異なっている請求項１又は２に記載のセンサーチップ。
- 前記ブロッキング剤がブロッキング効果を有する物質と糖類とを含む、請求項１〜３いずれか一項に記載のセンサーチップ。
- 前記ブロッキング剤がウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン及びスキムミルクのうちの少なくとも１種を含む請求項１〜４いずれか一項に記載のセンサーチップ。
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