JPWO2015129361A1 - 表面プラズモン励起増強蛍光分光測定用センサーチップ - Google Patents
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Abstract
Description
先ず、センサー部116に微細流路117を通して測定対象物質を含有する検体液(測定試料)を流入させ、測定対象物質をセンサー部116に固定された捕捉物質に捕捉する。次いで、測定対象物質を蛍光標識する物質(例えば、蛍光標識化2次抗体)(以下、蛍光標識物質ともいう)を、同様に微細流路117を通して流入させることで、センサー部116に蛍光物質で標識された測定対象物質が捕捉された状態とする。
すなわち、本発明の表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップは、次の通りである。
誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ。
[項2]
前記ブロッキング処理が前記捕捉物質が固定された領域のみに行われている、項1に記載のセンサーチップ。
[項3]
前記捕捉物質が固定された領域を複数有し、前記複数の領域のそれぞれに行うブロッキング処理のブロッキング剤のうち少なくとも1種が他のブロッキング剤と異なっている項1又は2に記載のセンサーチップ。
[項4]
前記ブロッキング剤がブロッキング効果を有する物質と糖類とを含む、項1〜3いずれか一項に記載のセンサーチップ。
[項5]
前記ブロッキング剤がウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン及びスキムミルクのうちの少なくとも1種を含む項1〜4いずれか一項に記載のセンサーチップ。
1.センサーチップの構成
本発明のセンサーチップは、
「誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ」
である。
上記の本発明のセンサーチップの一具体例(図2)では、誘電体部材201は、断面が台形状をなした六面体形状に形成されている。その上側の面が主面201aであり、この六面体の側面の一面が、励起光の入射面である入射面201iである。
誘電体部材の形成方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のような樹脂材料を用いる場合には、射出成形によって形成することができる。
金属薄膜202(図2参照)は、一般的なSPFS装置に用いられるセンサーチップを構成する金属薄膜と同様の金属を用いることができる。すなわち、金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属からなることが好ましく、その中でも金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。
センサー部203(図2参照)は、金属薄膜202上の一部の領域に設けられており、この領域に捕捉物質が固定されている。この場合、センサー部は複数個設けられていてもよく、それぞれのセンサー部には異なる捕捉物質が固定されていてもよい(図2c参照)。
なお、センサー部は、上記のような流路の金属薄膜上に形成する場合に限定されるものではなく、例えば、ウエルを有するプレートのウエル内の金属薄膜上に形成してもよい。
本発明でブロッキング処理とは、測定試料中の夾雑物(測定対象物質以外のタンパク質、脂質、糖、その他)や蛍光標識物質がセンサー部に非特異的に吸着又は結合することを防止する処理をいい、本発明でブロッキング剤とは、このような吸着又は結合を防止する物質をいう。
本発明のセンサーチップは、SPFS装置に装填して、測定試料中の測定対象物質の検出、定量に使用することができる。SPFS装置は、従来公知のものを使用することができ、測定対象物質のセンサー部への捕捉、捕捉された測定対象物質の蛍光標識(例えば、標識化2次抗体の使用等)、励起光の照射、エバネッセント波と金属薄膜からの表面プラズモンとの共鳴、蛍光発光の測定等についても、従来公知の種々の方法でよく、特に制限はない。
[実施例1]
(1)センサーチップの作製
工程(a):誘電体部材の材料としてシクロオレフィンポリマー樹脂(日本ゼオン株式会社)、ZEONEX(登録商標)用いて作成した略台形の断面形状を持つプリズム部材の主面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは1〜3nm、金薄膜の厚さは44〜52nmであった。
工程(f):ブロッキング剤溶液として1重量%カゼインと10重量%スクロースを含むPBS緩衝生理食塩水を導入し、30分間放置後に該ブロッキング剤溶液を抜き取り、1次抗体が固定化された領域に非特異的吸着防止処理を行った。
(2−1)作製直後のセンサーチップを用いた測定
抗原添加工程:(1)によって作製したセンサーチップに、抗原となるトロポニンIを0.1ng/mLと1重量%牛血清アルブミン〔BSA〕を含むPBS緩衝生理食塩水を注入し、固相化された1次抗体と抗原を30分間反応させた。抗原を含む溶液を吸引除去し、Tween20を0.05重量%含むTBSを注入・吸引除去する操作を数回繰り返し、洗浄操作を行った。
ブランクシグナル測定:標識化抗体の非特異的な吸着に由来するブランクシグナルの測定は、別のセンサーチップを用いて上記抗原添加工程において、抗原となるトロポニンIを含まない1重量%牛血清アルブミン〔BSA〕を含むPBS緩衝生理食塩水を注入することを除いて同様の工程で行った。
S/N
=|(アッセイシグナル)|/|(ベースラインシグナル+ブランクシグナル)|
金属薄膜欠陥の評価:金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表1に示す。
(1)の手法で作製したセンサーチップを、4℃で60日間保存した後、(2−1)と同様にベースラインシグナルおよびアッセイシグナルを測定し、S/Nを算出した。また、(2−1)と同様に、金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表1に示す。
(1)センサーチップの作製
工程(a)〜工程(e):上記実施例1と同様の手順で、プリズム上に成膜された金薄膜上に1次抗体を固相化した。
(2−1)作製直後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例1の(2−1)と同様にして、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにS/Nの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表1に示す。
上記実施例1の(2−2)と同様にして、(1)の手法で作製したセンサーチップを保存した後、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにS/Nの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表1に示す。
※2 比較例1の保存日数0の場合のS/Nを1として、他の場合のS/Nを換算して表記した。
(1)センサーチップの作製
工程(a):実施例1の工程(a)と同様に金成膜済みプリズムを作製した。
工程(b):実施例1と同様に、金薄膜の片面にSAM(自己組織化単分子膜)を形成した。
(2−1)作製直後のセンサーチップを用いた測定
抗原添加工程:抗原溶液として、トロポニンIを0.1ng/mLと、NT−ProBNPを0.1ng/mLと、D−Dimerを0.1ng/mLと1重量%牛血清アルブミン〔BSA〕とを含むPBS緩衝生理食塩水を使用することを除いては実施例1と同様に行った。
S/N
=|(アッセイシグナル)|/|(ベースラインシグナル+ブランクシグナル)|
金属薄膜欠陥の評価:金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって行った。得られた結果を表2に示す。
(1)の手法で作製したセンサーチップを、4℃で60日間保存した後、(2−1)と同様にベースラインシグナルおよびアッセイシグナルを測定し、S/Nを算出した。また、(2−1)と同様に、金属薄膜欠陥の有無は、光学顕微鏡を用いて金属薄膜の表面状態を観察することによって確認した。得られた結果を表2に示す。
(1)センサーチップの作製
工程(a)〜工程(e):上記実施例2と同様の手順で、プリズム上に成膜された金薄膜上に各1次抗体を固相化した。
(2−1)作製直後のセンサーチップを用いた測定
上記実施例2の(2−1)と同様にして、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにS/N比の算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表2に示す。
上記実施例2の(2−2)と同様にして、(1)の手法で作製したセンサーチップを保存した後、ベースラインシグナルおよびアッセイシグナルの測定ならびにS/Nの算出を行い、金属薄膜欠陥の有無を確認した。得られた結果を表2に示す。
※2 各領域における実施例2、比較例2のブランクシグナルの%は、同じ項目(測定対象物質)で同じ保存日数の場合のブロッキング剤の差の影響を表したものである。それぞれの領域の各保存日数で、比較例2(ブロッキング剤は、カゼインを使用)の場合を100%とし、それと同じ保存日数に対応する実施例2(ブロッキング剤は、各領域の測定対象物質に適したものを使用)の場合を換算して%で表記した。
※3 各領域において、比較例2の保存日数0(ブロッキング剤はカゼインを使用)の場合のS/Nを1として、他の場合のS/Nを換算して表記した。
110 センサーチップ
111 センサーチップ装填部
112 誘電体部材
112a 誘電体部材の主面
112i 誘電体部材の入射面
113 金属薄膜
114 薄層部材
115 プレート(蓋)
116 センサー部
117 微細流路
120 光源
121 励起光
122 反射光
123 受光手段
130 光検出手段
131 蛍光
132 集光部材
133 波長選択機能部材
θ 入射角
200 センサーチップ
201 誘電体部材
201a 誘電体部材の主面
201i 誘電体部材の入射面
202 金属薄膜
203 センサー部
204 薄層部材
205 プレート(蓋)
206 流路
207 流入・排出口
208 液溜部
300 センサーチップ
301 誘電体部材
301a 誘電体部材の主面
301i 誘電体部材の入射面
302 金属薄膜
303 センサー部
304 溶液貯留部材
305 ブロッキング剤溶液
306 シール部材
Claims (5)
- 誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する表面プラズモン励起増強分光測定のためのセンサーチップであって、
前記捕捉物質が固定された領域を含む領域にブロッキング剤によるブロッキング処理が行われ、前記ブロッキング処理は測定試料と前記金属薄膜との接液面の全体には行われていない、センサーチップ。 - 前記ブロッキング処理が前記捕捉物質が固定された領域のみに行われている、請求項1に記載のセンサーチップ。
- 前記捕捉物質が固定された領域を複数有し、前記複数の領域のそれぞれに行うブロッキング処理のブロッキング剤のうち少なくとも1種が他のブロッキング剤と異なっている請求項1又は2に記載のセンサーチップ。
- 前記ブロッキング剤がブロッキング効果を有する物質と糖類とを含む、請求項1〜3いずれか一項に記載のセンサーチップ。
- 前記ブロッキング剤がウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン及びスキムミルクのうちの少なくとも1種を含む請求項1〜4いずれか一項に記載のセンサーチップ。
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