JP6414209B2 - 表面プラズモン増強蛍光測定方法および表面プラズモン増強蛍光測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン増強蛍光測定方法および表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。

タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に測定できる方法には、表面プラズモン増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳには、蛍光磁性粒子を用いてＢ／Ｆ分離を行う方法が知られている（例えば、特許文献１および２参照）。

特許文献１に記載のＳＰＦＳでは、磁性粒子、蛍光物質および被検出物質を、ＳＰＦＳ測定装置における金属膜の、被検出物質が固定されるべき測定位置で反応させ、磁界の印加によって、磁性粒子、蛍光物質および被検出物質を含む複合体を上記測定位置に固定して、ＳＰＦＳにより被検出物質を測定する。磁性粒子は、例えば１００ｎｍ〜１μｍのサイズを有し、未反応の磁性粒子は、上記複合体に比べて磁気誘導されにくく、測定用に調製された試料液中を浮遊しやすいので、他の未反応成分と共に洗浄によって除去される。

特許文献２に記載のＳＰＦＳでは、蛍光磁性粒子と被検出物質との複合体を上記測定位置に捕捉した後、磁気誘導によって蛍光磁性粒子を金属膜の表面から一定の距離に揃えて、ＳＰＦＳにより被検出物質を測定する。

特開２０１１−０３３４５４号公報 特開２０１０−００８２４７号公報

一般に、ＳＰＦＳは、被検出物質を高感度で検出することが可能である一方で、試料液中の夾雑物によるノイズシグナルの測定結果への影響がより大きくなる傾向にある。上記特許文献１および２に記載のいずれのＳＰＦＳでも、試料液が上記測定位置に直接触れるため、試料液中の夾雑物が非特異的に上記測定位置に吸着し、ノイズシグナルとして検出されることがある。このように、従来のＳＰＦＳでは、ＳＰＦＳにおける被検出物質の検出の感度が相対的に低下し、不十分となることがある。

本発明は、ＳＰＦＳにおいて、夾雑物によるノイズシグナルがもたらす被検出物質の感度の相対的な低下を抑制することを目的とする。

本発明者らは、上記測定位置とは独立した容器内で試料原液中の夾雑物を除去する前処理を、蛍光磁性粒子を利用して行い、かつその後、アフィニティ反応を利用して蛍光磁性粒子を被検出物質とともに上記測定位置へ固定し、その蛍光シグナルを検出することで、高感度かつ低ノイズの検出が可能であることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、前述した目的を実現するための一手段として、蛍光物質で標識された被検出物質が固定された金属膜に向けて励起光を照射し、前記励起光の前記金属膜への照射によって発生した表面プラズモンにより発生した増強電場によって励起された、前記蛍光物質の蛍光を検出することで前記被検出物質を測定する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、前記金属膜に対して独立して配置されている容器内で、蛍光物質を含有する磁性粒子に試料原液中の前記被検出物質を担持させる第１の工程と、前記容器内に磁界を発生させて前記磁性粒子を固定しながら前記容器内の前記試料原液中の夾雑物を除去して測定用の試料液を調製する第２の工程と、前記試料液中の前記被検出物質を前記金属膜に固定する第３の工程と、を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法、を提供する。

また、本発明は、前述した目的を実現するための一手段として、蛍光物質で標識された被検出物質が固定されるべき金属膜に向けて励起光を照射するための光源と、蛍光物質で標識された被検出物質が固定されたときに前記励起光の前記金属膜への照射によって発生する蛍光を検出するための光検出器と、前記金属膜に固定されるべき被検出物質を含有する測定用の試料液を、前記金属膜とは独立して配置される容器中で調製するための試料液調製部と、前記試料液の調製の作業に応じて前記容器内に磁界を発生させるための磁界発生装置と、を有する、表面プラズモン増強蛍光測定装置、を提供する。

本発明によれば、血清などの夾雑物が多く含まれる試料原液であっても、被検出物質を担持した磁性粒子が磁界によって固定されながら試料原液から夾雑物が除去される。このように、上記測定位置とは独立した場所で試料原液から夾雑物が除去され、かつ測定用の試料液が調製されるので、上記測定位置への夾雑物の吸着が防止される。よって、ＳＰＦＳにおいて、夾雑物によるノイズシグナルがもたらす被検出物質の感度の相対的な低下が抑制される。

本発明の実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の一例の構成を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法の一例の途中の状態を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態における蛍光磁性粒子の断面を模式的に示す図である。 上記表面プラズモン増強蛍光測定装置の主な動作手順の一例を示すフローチャートである。 本発明の実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法の他の例における主な工程の状態を模式的に示す図である。 本発明の実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の他の例の構成を模式的に示す図である。

本発明の実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法（以下、「ＳＰＦＳ」とも言う）は、蛍光物質で標識された被検出物質が固定された金属膜に向けて励起光を照射し、上記励起光の上記金属膜への照射によって発生した表面プラズモンにより発生した増強電場によって励起された、上記被検出物質を標識する上記蛍光物質の蛍光を検出することで、上記被検出物質の存在や量などを測定する。

上記励起光は、被検出物質を標識する蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。当該励起光は、蛍光物質を直接励起させる光であれば、被検出物質に直接照射され、蛍光物質を間接的に励起させる光であれば、蛍光物質の励起を発生させる場所（例えば、金属膜における回折格子または金属膜の裏面）に照射される。

本実施の形態に係るＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとの結合にプリズムを利用するプリズムカップリングＳＰＦＳ（ＰＣ−ＳＰＦＳ）にも、励起光と表面プラズモンとの結合に回折格子を利用する格子カップリングＳＰＦＳ（ＧＣ−ＳＰＦＳ）にも適用可能である。

本実施の形態にかかるＳＰＦＳは、少なくとも第１〜第３の工程を含む。
上記第１の工程では、上記金属膜に対して独立して配置されている容器内で、蛍光物質を含有する磁性粒子（以下、「蛍光磁性粒子」とも言う）に試料原液中の上記被検出物質を担持させる。

「独立して配置されている」とは、上記容器から上記金属膜に直接に至る液体の流路が形成されないように上記容器が配置されていることを意味する。たとえば、上記容器は、当該金属膜の平面方向において上記金属膜から離れて配置される。

上記容器は、試料原液からの夾雑物の除去（後述する複合体の洗浄）や試料液の調製などに使用することが可能であり、かつ、容器外の後述する磁界発生装置による磁界が容器内に作用する範囲から、適宜に決めることが可能である。当該容器の例には、ガラスや樹脂などの非磁性材料による容器が含まれる。なお、本発明において、「試料液」は、後述する金属膜に固定される直前の（ＳＰＦＳに供されるべき）被検出物質を含有する液を言い、「試料原液」は、被検出物質を含有する、本発明における処理前または処理中の液を言う。

上記磁性粒子は、試料液の調製または夾雑物の除去の際に磁界発生装置の磁界によって容器内に固定される粒子である。磁性粒子の例には、磁性体の粒子、樹脂成分で被覆された磁性体の粒子、および、磁性体の粒子が分散した樹脂製の粒子が含まれる。上記磁性粒子の粒径は、上記の磁界によって固定される範囲において適宜に決めることが可能であり、個数平均粒径で１０〜３００ｎｍであることが好ましく、１０〜１５０ｎｍであることがより好ましい。

上記蛍光物質は、表面プラズモンによって増強される電場によって励起されて蛍光を発生する物質である。蛍光物質は、単分子であってもよいし、蛍光を発する分子構造（置換基など）を含むポリマーであってもよい。また、蛍光物質は、上記磁性粒子の表面に担持されていてもよいし、上記磁性粒子内に含有されていてもよいし、上記磁性粒子の表面を被覆していてもよい。

上記蛍光物質の例には、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（例えばライフテクノロジーズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（例えばライフテクノロジーズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（例えばライフテクノロジーズジャパン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（例えばＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ・ファミリーの蛍光色素（例えばライフテクノロジーズジャパン（株）製。「ＢＯＤＩＰＹ」は同社の登録商標）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素シリーズ（例えばライフテクノロジーズジャパン（株）製。「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ」はモレキュラー・プローブス社の登録商標）、ＣＦ色素シリーズ（例えばＢｉｏｔｉｕｍ社製）、などの有機蛍光色素が含まれる。

また、上記蛍光物質の例には、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素（例えばＡＴＢＴＡ−Ｅｕ^３＋）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）またはＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）などの蛍光タンパク質、および、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子、が含まれる。

上記蛍光物質は、ＳＰＦＳにおける他の要件に応じて適宜に決めることが可能である。たとえば、血液検体に由来する試料を分析に供する場合は、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えるため、Ｃｙ５やＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７など、近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。

また、上記蛍光磁性粒子の例には、国際公開０９／０７２４５７号に記載されている「蛍光物質を保持したポリマー被覆磁性微粒子」が含まれる。

上記試料原液の例には、血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、脳脊髄液、尿などの生体試料、細胞培養液などの生合成による成分、およびその希釈液が含まれる。

上記被検出物質は、上記試料原液中の一以上の成分である。被検出物質の例には、タンパク質、ホルモン、核酸、エキソソーム、細胞などの生体物質が含まれる。

上記被検出物質は、水素結合や分子間力による結合などの化学的な手法によって上記蛍光磁性粒子へ担持されてもよいが、抗原抗体反応などの、生化学的な特異的な結合によって上記蛍光磁性粒子へ好適に担持させることが可能である。

上記蛍光磁性粒子は、その表面に、上記被検出物質と特異的に結合する第１の捕捉体を有することが、試料の洗浄の観点から好ましい。この場合では、上記第１の工程では、上記被検出物質を上記第１の捕捉体に特異的に結合させて上記被検出物質を上記蛍光磁性粒子に担持させることが可能である。

上記第１の捕捉体は、被検出物質に応じて適宜に決めることが可能であり、上記第１の捕捉体の例には、抗体、核酸、酵素、ストレプトアビジン、ビオチンおよびレクチンが含まれる。上記第１の捕捉体と上記被検出物質との特異的な結合は、例えば、常温での混合などの常法によって行うことが可能である。

上記第２の工程では、上記容器内に磁界を発生させて上記蛍光磁性粒子を固定しながら上記容器内の上記試料原液中の夾雑物を除去して上記試料液を調製する。

上記磁界は、磁性粒子を容器内の一部分に留めるように発生させられる。当該上記磁界を発生させる装置は、任意のタイミングで上記磁界を発生させることが好ましく、当該装置の例には、電磁石、および、永久磁石および搬送装置、が含まれる。当該搬送装置は、永久磁石を上記容器に対して適時に接近、離間させてもよいし、上記容器を永久磁石に接近、離間させてもよい。

上記夾雑物は、試料原液中の被検出物質以外の、上記金属膜または第３の捕捉体に対して吸着され得る成分であり、被検出物質や金属膜または第３の捕捉体に応じて適宜に決められる。夾雑物の例には、異好性抗体、イムノグロブリン、乳び、ビリルビン、アルブミン、リウマチ因子およびヘモグロビンが含まれる。

上記夾雑物の試料原液からの除去は、例えば、蛍光磁性粒子の磁界による固定時における容器内からの液の排出、洗浄液の供給、および、蛍光磁性粒子の磁界による固定時における容器内からの洗浄液の排出、によって行うことが可能である。容器内に供給された洗浄液は、洗浄効果を高める観点から、攪拌されることが好ましい。

上記洗浄液は、上記夾雑物を排出させることが可能な範囲から適宜に決められる。上記洗浄液は、上記試料原液または試料液の液成分と同じかそれに似た性状を有することが、被検出物質の蛍光磁性粒子との結合に悪影響を及ぼさずに夾雑物を除去する観点から好ましい。当該洗浄液の例には、ＰＢＳやＴＢＳなどの緩衝液、および、当該緩衝液に界面活性剤が添加された液、が含まれる。

また、上記第３の工程では、上記夾雑物が除去された上記試料原液（上記試料液）中の上記被検出物質を上記金属膜に固定する。

上記金属膜は、例えば、３０〜７０ｎｍの厚みを有する。当該金属膜の材料の例には、金、銀、アルミニウム、銅および白金が含まれる。上記金属膜は、例えばスパッタリング法、めっきや蒸着法などの公知の方法によって作製することが可能である。

上記金属膜は、その表面に回折格子を有していてもよい。金属膜が回折格子を有していると、本実施の形態に係るＳＰＦＳをＧＣ−ＳＰＦＳに適用することが可能である。当該回折格子は、励起光で照射された時にエバネッセント波を生じさせる。当該回折格子は、例えば１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。

上記被検出物質は、水素結合や分子間力による結合によって上記金属膜の測定位置へ固定されてもよいが、抗原抗体反応などの特異的な結合によって上記金属膜へ好適に固定させることが可能である。

上記第３の工程は、上記金属膜は、その表面に、上記被検出物質と特異的に結合する第２の捕捉体を捕捉する第３の捕捉体を有するとともに、上記第２の捕捉体を上記第３の捕捉体で捕捉することによって上記被検出物質を上記金属膜に固定することが、未反応磁性粒子の除去の観点から好ましい。この場合、本実施の形態に係るＳＰＦＳは、第４の工程をさらに含む。当該上記第４の工程では、上記蛍光磁性粒子に担持された上記被検出物質に上記第２の捕捉体を結合させる。

上記第２の捕捉体は、上記被検出物質および上記第３の捕捉体に応じて、適宜に決めることが可能である。たとえば、第２の捕捉体は、上記被検出物質に対して特異的に結合する部位と、上記第３の捕捉体に対して特異的に結合する部位とを含む。上記第２の捕捉体の例には、ビオチン標識抗体およびビオチン標識核酸が含まれる。

上記第３の捕捉体は、上記第２の捕捉体に応じて適宜に決めることが可能である。上記第３の捕捉体の例には、第２の捕捉体に特異的な抗体、アビジン、改変アビジンおよび核酸が含まれる。上記改変アビジンは、アビジンの一部のアミノ酸配列を改変したものであり、改変アビジンの例には、ストレプトアビジンおよび中性アビジンが含まれる。

上記第３の捕捉体は、上記金属膜に直接固定されていてもよいし、他の物質を介して上記金属膜に固定されていてもよい。当該他の物質の例には、一種以上の単量体の重合による高分子化合物が含まれる。当該単量体の例には、グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびにビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、および、ビニルケトン類、が含まれる。

上記高分子化合物は、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子化合物と、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類からなる疎水性単量体の群から選ばれる一以上が重合してなる疎水性高分子化合物と、を含むことがより好ましく、上記親水性高分子化合物は、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが、生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。

本実施の形態に係るＳＰＦＳにおいて、第２の工程および第４の工程は、第３の工程の前の任意の時期に行うことが可能である。たとえば、上記第１の工程および第２の工程は、同時に行われてもよいし、あるいは、上記第１の工程、第２の工程および第４の工程は、同時に行われてもよいし、あるいは、上記第２の工程は、上記第１の工程および第４の工程の後に行われてもよい。

また、本実施の形態に係るＳＰＦＳは、本発明の効果が得られる範囲において、前述した第１から第４の工程以外の他の工程をさらに含んでいてもよい。

本実施の形態に係るＳＰＦＳは、前述の試料液の調製（試料原液からの夾雑物の除去）のための磁界発生装置を有する以外は、通常のＳＰＦＳ装置を用いて行うことが可能である。たとえば、本実施の形態に係るＳＰＦＳは、図１に示されるようなＳＰＦＳ装置を用いて行うことが可能である。図１は、本実施の形態に係るＳＰＦＳを実施可能なＳＰＦＳ装置の一例の構成を模式的に示す図である。

ＳＰＦＳ装置１００は、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の装置である。ＳＰＦＳ装置１００は、図１に示されるように、励起光学系ユニット１１０、受光光学系ユニット１２０、試料液調製部１３０および制御部（ＣＵ）１６０から構成される。

励起光学系ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構（ＡＲＳ）１１２および光源制御部（ＩＣＵ）１１３によって構成される。

光源ユニット１１１は、例えば、レーザーダイオード（以下「ＬＤ」とも言う）、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）から構成される。上記ビーム整形光学系は、例えば、コリメーター、バンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリットおよびズーム手段によって構成される。上記ＡＰＣ機構は、コリメートされた後の励起光αの光量を検出する手段（例えば励起光αを分岐させる装置および分岐させた光の光量を検出するフォトダイオードなど）で構成されている。上記温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。

角度調整機構１１２は、励起光αの照射角度を変更するための装置であり、例えば、光源ユニット１１１を回動させる回転支持部材やロボットアームなどで構成される。

光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。光源制御部１１３は、光源ユニット１１１を構成する前述した各種機器を作動させ、制御し、光源ユニット１１１の出射光の出射を制御する。

受光光学系ユニット１２０は、例えば、受光ユニット１２１、位置切り替え機構（ＰＳＳ）１２２およびセンサー制御部（ＳＣＵ）１２３によって構成される。

受光ユニット１２１は、例えば、分析チップ１０の金属膜（成膜面２２）の法線方向に順次配置されている、第１レンズ１２４、光学フィルター１２５、第２レンズ１２６および受光センサー１２７によって構成される。

第１レンズ１２４は、例えば、金属膜３０上から出射される光を集光するための集光レンズであり、第２レンズ１２６は、例えば、第１レンズ１２４で集光された上記光を受光センサー１２７の受光面に再結像させるための結像レンズである。両レンズの間には、光学フィルター１２５が配置されている。光学フィルター１２５は、例えば、所定の光成分を反射することで除去する多層膜からなるフィルターである。

受光センサー１２７は、上記蛍光の光量を検出するための受光センサーであり、微少量の被検出物質からの微弱な蛍光を検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２７は、例えば、ヘッドオンタイプの光電子増倍管（ＰＭＴ）である。

位置切り替え機構１２２は、例えば、回転駆動部と、光学フィルター１２５を有するターンテーブルやラックアンドピニオンなどの、回転運動によって光学フィルター１２５を上記光路に対して進出させ、当該光路から後退させる公知の機構とによって構成される。

センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。センサー制御部１２３は、受光センサー１２７による光量の検出や、受光センサー１２７の検出レンジの管理、変更、などを制御する。

試料液調製部１３０は、容器１３１に試料原液、薬液または洗浄液を供給し、分析チップ１０に試料液または洗浄液を供給する。試料液調製部１３０は、例えば、容器１３１、シリンジポンプ１３２、磁石１３７および試料液調製機構（ＳＰＳ）１３３によって構成される。

容器１３１は、複数用意されている。容器１３１は、例えば、試料液を調製するための容器、および、試料原液、各種の薬液、洗浄液をそれぞれ収容する容器、を含む。

シリンジポンプ１３２は、シリンジ１３４と、シリンジ１３４内を往復動作可能なプランジャー１３５とによって構成される。プランジャー１３５の往復運動によって、試料原液、薬液または洗浄液の吸引および排出が定量的に行われる。

磁石１３７は、例えば永久磁石である。磁石１３７は、容器１３１に対して接近、離間可能に配置されている。

試料液調製機構１３３は、例えば、プランジャー１３５の駆動装置と、シリンジポンプ１３２の移動装置と、磁石１３７の移動装置と、によって構成される。

プランジャー１３５の駆動装置は、プランジャー１３５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む当該駆動装置は、シリンジポンプ１３２の送液量や送液速度を一定に管理し、分析チップ１０の残液量を一定に管理する観点から好ましい。

シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１３２を、シリンジ１３４の軸方向（例えば垂直方向）と、当該軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす装置である。シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。磁石１３７の移動装置も、シリンジポンプ１３２の移動装置と同様に構成される。

制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切り替え機構１２２、センサー制御部１２３および試料液調製機構１３３を制御し、上記の機構などに種々の操作を実行させる。また、制御部１６０は、受光センサー１２７の検出レンジなどの、上記の操作に必要な数値を適宜に設定する。

ＳＰＦＳ装置１００には、被検出物質の測定において、不図示のチップホルダーに分析チップ１０が装着される。上記チップホルダーは、分析チップ１０を、試料液調製部１３０とＳＰＦＳ装置１００の測定可能位置とのいずれかに搬送するように構成されている。

分析チップ１０は、プリズム２０と、プリズム２０の成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。

プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有し、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

プリズム２０の形状は、例えば、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

なお、分析チップ１０の設計により共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が凡そ決まる。設計要素は、プリズム屈折率、金属の屈折率、金属の膜厚、金属の消衰係数、励起波長などである。金属膜に固定された被検出物質の量に応じて共鳴角および増強角がシフトするが、そのシフト量は数度未満である。

入射面２１は、励起光αの波長または出力の変動を防止する観点から、励起光αが励起光学系ユニット１１０に戻らないように形成されている。たとえば、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

金属膜３０は、例えば金の蒸着膜であり、金属膜３０の厚さは、例えば５０ｎｍである。金属膜３０の表面には、後述する第３の捕捉体が固定されており、当該第３の捕捉体は、たとえば保湿剤で覆われている。

流路蓋４０は、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面上に、流路を挟んで配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、流路を挟んで成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路を形成する。

流路蓋４０は、金属膜３０上から放出された光（プラズモン散乱光および蛍光）に対して透明な材料からなる。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋４０は、これらの光を受光光学系ユニット１２０に導くことができればよい。たとえば、少なくとも、被検出物質を標識した蛍光物質からの蛍光を外部に取り出す面が光学的に透明であれば、流路蓋４０の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

次に、ＳＰＦＳ装置１００による、本実施の形態に係るＳＰＦＳの一例を説明する。図２は、本実施の形態に係るＳＰＦＳの一例の途中の状態を模式的に示す図である。図３は、本実施の形態における蛍光磁性粒子の断面を模式的に示す図である。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の主な動作手順の一例を示すフローチャートである。

まず、制御部１６０は、蛍光磁性粒子４００を収容する容器１３１から調製用の容器１３１に、蛍光磁性粒子４００を供給させ（図２の（Ａ））、次いで、試料原液を収容する容器１３１から調製用の容器１３１に、試料原液を供給させ、一定時間、反応させる（図２の（Ｂ）、図４のステップ４０１）。試料原液は、被検出物質５００と夾雑物６００とを含む。

蛍光磁性粒子４００は、図３に示されるように、磁性粒子４１０と、磁性粒子４１０の表面を覆う蛍光層４２０と、蛍光層４２０の表面に配置された第１の捕捉体４３０とを有する。蛍光磁性粒子４００の体積平均粒径は、例えば０．２μｍである。磁性粒子４１０は、例えば、磁性体微粒子が分散した樹脂製の粒子であり、蛍光層４２０は、例えば、Ｃｙ５などの蛍光色素を含有する樹脂層であり、第１の捕捉体４３０は、試料原液中の被検出物質５００と特異的に結合する抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体）である。

蛍光磁性粒子４００と試料原液との混合（反応）によって、被検出物質５００は、蛍光磁性粒子４００の第１の捕捉体４３０と特異的に結合する。こうして、金属膜３０に独立した容器１３１内で、蛍光物質を有する磁性粒子に、試料原液中の被検出物質が担持され、被検出物質５００と蛍光磁性粒子４００との第１の複合体４５０が生成する。

次いで、制御部１６０は、磁石１３７を調製用の容器１３１の周壁の近傍に配置させ（図２の（Ｃ）、図４のステップ４０２）、調製用の容器１３１内の第１の複合体４５０を容器１３１の壁面に引き寄せ、容器１３１内の液体を吸引させて除去させる（図２の（Ｄ）、図４のステップ４０３）。この液体の除去に伴い、容器１３１内の夾雑物６００も容器１３１から除去される。

次いで、制御部１６０は、容器１３１に洗浄液を注入させ、磁石１３７を容器１３１の周面から離して配置させて第１の複合体４５０を容器１３１内の洗浄液中に一定時間、分散させ、再び磁石１３７を容器１３１の周面近傍に配置させて第１の複合体４５０を容器１３１の壁面に引き寄せ、容器１３１内の洗浄液を吸引させて除去させる。制御部１６０は、例えば、上記の洗浄液の注入から洗浄液の吸引の操作（洗浄操作）を３回繰り返させる（図４のステップ４０４）。この操作により、試料原液中の夾雑物６００は、容器１３１から実質的に除去される。

次いで、制御部１６０は、第２の捕捉体であるビオチン化抗体７００の溶液を、薬液を収容する容器１３１から調製用の容器１３１に供給させる（図２の（Ｅ）、図４のステップ４０５）。こうして、第１の複合体４５０の被検出物質とビオチン化抗体７００とが特異的に結合し、ビオチン化抗体７００と、被検出物質５００と、蛍光磁性粒子４００との第２の複合体６５０が構成される。

次いで、制御部１６０は、磁石１３７を調製用の容器１３１の周壁の近傍に配置させ（図４のステップ４０６）、調製用の容器１３１内の第２の複合体６５０を容器１３１の壁面に引き寄せ、容器１３１内の液体を吸引させて除去させる（図４のステップ４０７）。この液体の除去に伴い、容器１３１内の余剰のビオチン化抗体７００が容器１３１から除去される（図２の（Ｆ））。

次いで、制御部１６０は、容器１３１に洗浄液を注入させ、磁石１３７を容器１３１の周面から離して配置させて第２の複合体６５０を容器１３１内の洗浄液中に一定時間、分散させ、再び磁石１３７を容器１３１の周面近傍に配置させて第２の複合体６５０を容器１３１の壁面に引き寄せ、容器１３１内の洗浄液を吸引させて除去させる。制御部１６０は、例えば、上記の洗浄操作を３回繰り返させる（図４のステップ４０８）。この操作により、試料原液中の余剰のビオチン化抗体７００は、容器１３１から実質的に除去される。そして、制御部１６０は、調製用の容器１３１に洗浄液を適量供給する。こうして、測定用の試料液が調製される。

次いで、制御部１６０は、分析チップ１０を試料液調製部１３０の操作位置に搬送させ、分析チップ１０の金属膜３０の表面に塗布されている保湿剤を除去させる（図２の（Ｇ）、図４のステップ４０９）。分析チップの金属膜３０に第３の捕捉体８００が配置されている場合では、金属膜３０にさらに保湿剤が塗布されていることがある。保湿剤の除去によって、第３の捕捉体８００が、高い活性を有した状態で、金属膜３０の表面に現れる。第３の捕捉体８００は、例えば、ストレプトアビジン８１０を含有するカルボキシメチルデキストラン８２０である。

次いで、制御部１６０は、分析チップ１０に上記試料液を供給させ、一定時間、反応させる（図４のステップ４１０）。上記試料液中の第２の複合体６５０のビオチン化抗体７００は、第３の捕捉体８００のストレプトアビジン８１０に特異的に結合し、分析チップ１０における第３の捕捉体８００に上記試料液中の第２の複合体６５０が捕捉される。次いで、制御部１６０は、分析チップ１０に対して、例えば、上記の洗浄操作を５回繰り返させる（図４のステップ４１１）。この操作により、余剰の蛍光磁性粒子４００が分析チップ１０から実質的に除去される。

次いで、制御部１６０は、緩衝液（洗浄液）を分析チップ１０に注入して金属膜３０と流路蓋４０との間の流路を緩衝液で満たし、分析チップ１０におけるプリズム２０と金属膜３０との界面に励起光αを、全反射角以上の入射角度で入射させて金属膜３０上に表面プラズモンによる増強電場を生じさせ、当該増強電場によって励起した、第２の複合体中の蛍光物質の蛍光を受光センサー１２７によって検出させる（図２の（Ｈ）、図４のステップ４１２）。

ＳＰＦＳ装置１００では、蛍光磁性粒子４００の蛍光物質のＳＰＦＳによる蛍光が高感度で検出されるが、金属膜３０の表面には、第３の捕捉体８００に非特異的に結合する物質が実質的には存在しないので、ノイズシグナルとなる他の蛍光は実質的には検出されない。

上記反応の時間や上記洗浄操作における分散の時間は、同じでも異なっていてもよい。例えば当該時間は、一律に１０分間であってもよいし、例えば、５分間、３分間、１分間、３０秒間、１０秒間、とそれぞれ異なっていてもよい。

上記のように、第１の捕捉体と第２の捕捉体とを順次反応させて試料液を調製し、第３の捕捉体によって分析チップ１０の金属膜３０上に固定することは、例えば、強力なアフィニティ反応であるアビジン−ビオチン反応を利用することができ、反応時間の短縮と蛍光強度の高感度化とを達成する観点から、より効果的である。

本実施の形態に係るＳＰＦＳでは、より短縮された工程で試料液を調製することが可能である。図５は、本実施の形態に係るＳＰＦＳの他の例における途中の状態を模式的に示す図である。

まず、制御部１６０は、蛍光磁性粒子４００を収容する容器１３１から調製用の容器１３１に、蛍光磁性粒子４００を供給させ（図５の（Ａ））、次いで、試料原液を収容する容器１３１から調製用の容器１３１に、試料原液を供給させ、さらに、ビオチン化抗体７００を収容する容器１３１から調製用の容器１３１に、ビオチン化抗体７００を供給させ、これらを一定時間、反応させる。当該反応によって、第２の複合体６５０が生成する（図５の（Ｂ））。

次いで、制御部１６０は、磁石１３７を調製用の容器１３１の周壁の近傍に配置させ、調製用の容器１３１内の第２の複合体６５０を容器１３１の壁面に引き寄せ（図５の（Ｃ））、容器１３１内の液体を吸引させて除去する。この液体の除去に伴い、容器１３１内の夾雑物６００および余剰のビオチン化抗体７００が容器１３１から除去される。

そして、制御部１６０は、例えば、上記の洗浄操作を３回繰り返させる（図５の（Ｅ））。この操作により、試料原液中の夾雑物６００は、容器１３１から実質的に除去される。そして、制御部１６０は、調製用の容器１３１に洗浄液を適量供給させる。こうして、測定用の試料液が調製される。

次いで、制御部１６０は、分析チップ１０を試料液調製部１３０の操作位置に搬送させ、分析チップ１０の金属膜３０の表面に塗布されている保湿剤を除去させ（図５の（Ｆ））、分析チップ１０に上記試料液を供給させ、一定時間、反応させ、分析チップ１０に対して、例えば、上記の洗浄操作を５回繰り返させる。この操作により、余剰の蛍光磁性粒子４００が分析チップ１０から実質的に除去される。

そして、制御部１６０は、緩衝液を分析チップ１０に注入させて金属膜３０と流路蓋４０との間の流路を緩衝液で満たし、分析チップ１０におけるプリズム２０と金属膜３０との界面に励起光αを、全反射角以上の入射角度で入射させて金属膜３０上に表面プラズモンによる増強電場を生じさせ、当該増強電場によって励起した、第２の複合体中の蛍光物質の蛍光を受光センサー１２７によって検出させる（図５の（Ｇ））。

上記のように、第１の捕捉体と第２の捕捉体とを同時に反応させて試料液を調製することは、洗浄操作の回数をより削減することが可能となり、低コスト化の観点、および、試料の調製から高感度の蛍光検出までに要する時間をより短縮する観点、からより効果的である。

前述したＳＰＦＳは、図６に示されるようなＳＰＦＳ装置を用いても、実施することが可能である。図６は、本実施の形態に係るＳＰＦＳを実施可能なＳＰＦＳ装置の他の例の構成を模式的に示す図である。

ＳＰＦＳ装置９００は、ＧＣ−ＳＰＦＳ用の装置である。ＳＰＦＳ装置９００は、分析チップ１５の金属膜３５の表面の、第２の複合体が固定されるべき部分に回折格子３７が形成されていること、励起光学系ユニット１１０の光源ユニット１１１が、回折格子３７に励起光αを照射するように金属膜３５の表面側に配置されていること、受光光学系ユニット１２０の受光センサー１２７が、回折格子３７に固定された第２の複合体から生じる蛍光βを受光する位置に配置されていること、および、受光光学系ユニット１２０が、受光センサー１２７と、蛍光βから励起光αを除去するための蛍光フィルター１２８と、から主に構成されていること、以外は、ＳＰＦＳ装置１００と同様に構成されている。

分析チップ１５は、基板２５と、基板２５の上に形成された金属膜３５とを有する。金属膜３５には、回折格子３７が形成されている。回折格子３７には、例えば、第３の捕捉体が固定されている。

基板２５は、金属膜３５の支持部材である。基板２５の材料は、金属膜３５を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板２５の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。

金属膜３５は、回折格子３７を有する以外は、前述の金属膜３０と同様に構成される。

回折格子３７は、金属膜３５に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせるように形成されている。たとえば、回折格子３７は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。回折格子３７は、例えば、平板状の基板２５の上に配置した金属膜３５に凹凸形状を付与することによって形成することが可能であり、あるいは、予め凹凸形状を付与された基板２５の上に金属膜３５を作製することによって形成することが可能である。

本実施の形態に係るＳＰＦＳは、回折格子３７上に第２の複合体を固定し、蛍光βを検出する以外は、前述したＳＰＦＳ装置１００を用いる方法と同様に行うことが可能である。ＳＰＦＳ装置９００を用いる方法は、ＳＰＦＳ装置１００を用いる方法と同様に高感度の蛍光の検出が可能である。

なお、本実施の形態において、試料液調製部１３０が複数のシリンジ１３４を有し、シリンジ１３４を交換可能であると、シリンジ１３４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などの影響を抑える観点から好ましい。シリンジ１３４が交換可能に構成されていない場合では、シリンジ１３４内を洗浄する構成または操作をさらに含むことにより、シリンジ１３４の交換が不要となる。このため、シリンジ１３４の消費を抑制する観点から好ましい。

また、試料液調製部１３０は、シリンジ１３４の先端の位置を検出する装置をさらに有することが、シリンジ１３４と分析チップ１０との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ１０内での残液量を一定に管理する観点から好ましい。

さらに、分析チップ１０における、分析チップ１０に供給されるべき液体が収容される液収容部が多層フィルムで保護されており、シリンジ１３４が当該液体の供給のために当該多層フィルムを貫通した時に上記液収容部を密閉するように分析チップ１０およびシリンジ１３４が構成されていることが、好ましい。

上記の説明から明らかなように、本実施の形態に係るＳＰＦＳは、蛍光物質で標識された被検出物質が固定された金属膜に向けて励起光を照射し、上記励起光の上記金属膜への照射によって発生した表面プラズモンにより発生した増強電場によって励起された、上記蛍光物質の蛍光を検出することで上記被検出物質を測定する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、上記金属膜に対して独立して配置されている容器内で、蛍光物質を含有する蛍光磁性粒子に試料原液中の上記被検出物質を担持させる第１の工程と、上記容器内に磁界を発生させて上記蛍光磁性粒子を固定しながら上記容器内の上記試料原液中の夾雑物を除去して測定用の試料液を調製する第２の工程と、上記試料液中の上記被検出物質を上記金属膜に固定する第３の工程と、を含む。このため、上記ＳＰＦＳでは、夾雑物によるノイズシグナルがもたらす被検出物質の感度の相対的な低下を抑制することができる。よって、高感度ならではのＳＰＦＳによる被検出物質の測定結果がノイズシグナルに埋没しないので、上記ＳＰＦＳでは、被検出物質の高感度な測定結果が、従来のＳＰＦＳに比べてより明確に得られる。

上記ＳＰＦＳでは、上記蛍光磁性粒子がその表面に、上記被検出物質と特異的に結合する第１の捕捉体を有するとともに、上記第１の工程において上記被検出物質を上記第１の捕捉体に特異的に結合させて上記被検出物質を上記蛍光磁性粒子に担持し、さらに、上記第３の工程の前に、上記蛍光磁性粒子に担持された上記被検出物質に、上記被検出物質と特異的に結合する第２の捕捉体を結合させる第４の工程を含み、かつ、上記金属膜がその表面に、上記第２の捕捉体を捕捉する第３の捕捉体を有するとともに、上記第３の工程では、上記第２の捕捉体を上記第３の捕捉体で捕捉することによって上記被検出物質を上記金属膜に固定することが、夾雑物によるノイズシグナルの低減とそれによる被検出物質の高感度な測定結果の明示をより穏和な条件で簡易に行う観点からより一層効果的である。

また、上記ＳＰＦＳに用いられるＳＰＦＳ装置１００、９００は、いずれも、蛍光物質で標識された被検出物質が固定されるべき金属膜に向けて励起光を照射するための光源と、蛍光物質で標識された被検出物質が固定されたときに上記励起光の上記金属膜への照射によって発生する蛍光を検出するための光検出器と、上記金属膜に固定されるべき被検出物質を含有する試料液を、上記金属膜とは独立して配置される容器中で調製するための試料液調製部と、上記試料液の調製の作業に応じて上記容器内に磁界を発生させるための磁界発生装置と、を有する。このため、ＳＰＦＳ装置１００、９００のいずれにおいても、前述の蛍光磁性粒子に被検出物質を担持させることにより、上記磁界発生装置によって容器内に被検出物質を固定することが可能となる。よって、ＳＰＦＳ装置１００、９００は、いずれも、夾雑物によるノイズシグナルがもたらす被検出物質の感度の相対的な低下が抑制されるＳＰＦＳを実施することが可能となる。

また、ＳＰＦＳ装置１００では、上記金属膜が誘電体で構成されたプリズムの表面の一部に配置され、上記光源が、上記プリズムを通して上記金属膜に向けて上記励起光を照射するように配置されていることから、上記の効果を奏するＰＣ−ＳＰＦＳを実施することが可能である。

また、ＳＰＦＳ装置９００では、上記金属膜がその表面に回折格子を有し、上記光源が、上記回折格子に向けて上記励起光を照射するように配置されていることから、上記の効果を奏するＧＣ−ＳＰＦＳを実施することが可能である。

本出願は、２０１４年５月２３日出願の特願２０１４−１０７０１３号に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、夾雑物によるノイズシグナルが非常に低減されることから、被検出物質を高感度で測定することが可能である。よって、上記測定方法には、例えば生体分子の研究、開発などの、より高感度の測定を求められる技術分野での利用、および、当該技術分野の発展への寄与、が期待される。

１０、１５ 分析チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
２５ 基板
３０、３５ 金属膜
３７ 回折格子
４０ 流路蓋
１００、９００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光学系ユニット
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０ 受光光学系ユニット
１２１ 受光ユニット
１２２ 位置切り替え機構
１２３ センサー制御部
１２４ 第１レンズ
１２５ 光学フィルター
１２６ 第２レンズ
１２７ 受光センサー
１２８ 蛍光フィルター
１３０ 試料液調製部
１３１ 容器
１３２ シリンジポンプ
１３３ 試料液調製機構
１３４ シリンジ
１３５ プランジャー
１３７ 磁石
１６０ 制御部
４００ 蛍光磁性粒子
４１０ 磁性粒子
４２０ 蛍光層
４３０ 第１の捕捉体
４５０ 第１の複合体
５００ 被検出物質
６００ 夾雑物
６５０ 第２の複合体
７００ ビオチン化抗体
８００ 第３の捕捉体
８１０ ストレプトアビジン
８２０ カルボキシメチルデキストラン
α 励起光
β 蛍光

Claims (5)

1. 蛍光物質で標識された被検出物質が固定された金属膜に向けて励起光を照射し、前記励起光の前記金属膜への照射によって発生した表面プラズモンにより発生した増強電場によって励起された、前記蛍光物質の蛍光を検出することで前記被検出物質を測定する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
   前記金属膜に対して独立して配置されている容器内で、蛍光物質を含有する磁性粒子に試料原液中の前記被検出物質を担持させる第１の工程と、
   前記容器内に磁界を発生させて前記磁性粒子を固定しながら前記容器内の前記試料原液中の夾雑物を除去して測定用の試料液を調製する第２の工程と、
   前記金属膜上に磁界を発生させずに、前記試料液中の前記被検出物質を前記金属膜に固定する第３の工程と、
   を含む、
   表面プラズモン増強蛍光測定方法。
2. 前記磁性粒子は、その表面に、前記被検出物質と特異的に結合する第１の捕捉体を有するとともに、前記第１の工程では、前記被検出物質を前記第１の捕捉体に特異的に結合させて前記被検出物質を前記磁性粒子に担持し、
   前記表面プラズモン増強蛍光測定方法は、前記第３の工程の前に、前記磁性粒子に担持された前記被検出物質に、前記被検出物質と特異的に結合する第２の捕捉体を結合させる第４の工程をさらに含み、
   前記金属膜は、その表面に、前記第２の捕捉体を捕捉する第３の捕捉体を有するとともに、前記第３の工程では、前記第２の捕捉体を前記第３の捕捉体で捕捉することによって前記被検出物質を前記金属膜に固定する、
   請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
3. 蛍光物質で標識された被検出物質が固定されるべき金属膜に向けて励起光を照射するための光源と、
   蛍光物質で標識された被検出物質が固定されたときに前記励起光の前記金属膜への照射によって発生する蛍光を検出するための光検出器と、
   前記金属膜に固定されるべき被検出物質を含有する測定用の試料液を、前記金属膜とは独立して配置される容器中で調製するための試料液調製部と、
   前記試料液の調製の作業に応じて前記容器内に磁界を発生させるための磁界発生装置と、
   を有し、
   前記金属膜上に磁界を発生させるための磁界発生装置を有しない、
   表面プラズモン増強蛍光測定装置。
4. 前記金属膜は、誘電体で構成されたプリズムの表面の一部に配置され、
   前記光源は、前記プリズムを通して前記金属膜に向けて前記励起光を照射するように配置されている、
   請求項３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
5. 前記金属膜は、その表面に回折格子を有し、
   前記光源は、前記回折格子に向けて前記励起光を照射するように配置されている、
   請求項３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。

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