WO2015186684A1 - 検出チップの製造方法 - Google Patents

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WO2015186684A1
WO2015186684A1 PCT/JP2015/065837 JP2015065837W WO2015186684A1 WO 2015186684 A1 WO2015186684 A1 WO 2015186684A1 JP 2015065837 W JP2015065837 W JP 2015065837W WO 2015186684 A1 WO2015186684 A1 WO 2015186684A1
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WO
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metal film
seal member
film
hole
substrate
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PCT/JP2015/065837
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French (fr)
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浩志 梅津
佳弘 奥村
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a detection chip used for detecting a substance to be detected using surface plasmon resonance.
  • SPR Surface plasmon resonance
  • SPFS Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy
  • a dedicated detection chip having a fine channel is often used (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • a metal film for generating SPR is disposed on the bottom surface of the fine channel, and a part of the surface of the metal film includes a capturing body (for example, an antibody) for capturing a substance to be detected.
  • a chemical film is formed. That is, the capturing body is fixed to a part of the surface of the metal film in the fine channel.
  • the size of the immobilized film is preferably smaller than the width of the fine channel.
  • the concentration of the capture body contained in the immobilized film also differs for each detection chip. It fluctuates according to the concentration. That is, if the sizes of the immobilized films that should be the same among the plurality of detection chips are different from each other, the detection accuracy is lowered. Therefore, from the viewpoint of improving detection accuracy, it is required to form an immobilization film in a predetermined region on the metal film with high accuracy.
  • the shape of the seal member changes depending on the strength of pressing, so the area of the fixed film is ⁇ 10% or more for each detection chip. May change.
  • a change in the size of the immobilization film leads to a decrease in detection accuracy.
  • the metal film may be damaged, and it may not be possible to appropriately detect using SPR.
  • the strength which presses a sealing member is too large, there exists a possibility that the birefringence characteristic of the resin substrate arrange
  • the birefringence characteristic of the substrate changes in this way, the polarization characteristic of the excitation light incident on the metal film changes, and as a result, the detection accuracy decreases.
  • An object of the present invention is a method of manufacturing a detection chip used for detecting a substance to be detected using SPR, and changes the birefringence characteristics of a substrate without forming damage to the metal film.
  • An object of the present invention is to provide a detection chip manufacturing method capable of forming an immobilization film including a capturing body in a predetermined region on a metal film with high accuracy.
  • a detection chip manufacturing method is a detection chip manufacturing method used for detecting a detection target substance using surface plasmon resonance, A step of preparing a dielectric substrate on which a metal film for generating surface plasmon resonance is disposed, a metal film having one or more through holes, and an elastic body A step of pressing the sealing member so as to satisfy the following formulas (1) and (2), and providing a liquid containing the trapping body in the through-hole to immobilize the trapping body on the metal film And a process.
  • A1 is an area (mm 2 ) where the metal film and the seal member come into contact when the seal member is not pressed against the metal film.
  • A2 is an opening area (mm 2 ) of the through hole having the smallest opening area on the metal film side when the seal member is not pressed against the metal film.
  • T is the thickness (mm) in the pressing direction of the seal member when the seal member is not pressed against the metal film.
  • ⁇ T is a change amount (mm) of the thickness T in the pressing direction of the seal member caused by pressing the seal member against the metal film.
  • a detection chip in which an immobilization film is formed with high accuracy without causing damage to a metal film disposed on a dielectric and without changing the birefringence characteristics of a substrate is manufactured.
  • the detection chip according to the present invention since the amount of the liquid containing the capturing body can be reduced compared to the dip method or the like, the manufacturing cost of the detection chip can be reduced.
  • a substance to be detected in a specimen can be detected with high sensitivity and high accuracy.
  • FIG. 1A and 1B are diagrams illustrating examples of detection chips that can be manufactured by the manufacturing method according to the embodiment.
  • 2A and 2B are diagrams showing another example of the detection chip that can be manufactured by the manufacturing method according to the embodiment.
  • 3A to 3D are diagrams illustrating an example of the procedure of the manufacturing method according to the embodiment.
  • FIG. 4A is a diagram illustrating a state in which the sealing member is pressed against the metal film using the first pressing member and the second pressing member
  • FIG. 4B is a diagram illustrating an example in which the sealing member is fixed to the first pressing member.
  • 5A to 5C are views showing the configuration of the sealing member according to No. 1.
  • 6A to 6C are diagrams showing the configuration of the seal member according to No. 2.
  • FIG. 1A and 1B are diagrams illustrating examples of detection chips that can be manufactured by the manufacturing method according to the embodiment.
  • 2A and 2B are diagrams showing another example of the detection chip that can be manufactured by the manufacturing method according to the embodiment.
  • FIG. 7A to 7C are views showing the configuration of the seal member according to No. 3.
  • 8A to 8C are diagrams showing the configuration of the sealing member according to No. 4.
  • 9A to 9C are diagrams showing the configuration of the seal member according to No. 5.
  • 10A to 10C are diagrams showing the configuration of the seal member according to No. 6.
  • 11A to 11C are diagrams showing the configuration of the sealing member according to No. 7.
  • 12A is a plan view of a first pressing member to which a sealing member having one through hole is fixed
  • FIG. 12B is a partially enlarged sectional view taken along line AA shown in FIG. 12A
  • FIG. It is a top view which shows a mode that the board
  • FIG. 12A is a plan view of a first pressing member to which a sealing member having one through hole is fixed
  • FIG. 12B is a partially enlarged sectional view taken along line AA shown in FIG
  • FIG. 13A is a plan view of a first pressing member to which a sealing member having three through holes is fixed
  • FIG. 13B is a partially enlarged sectional view taken along line AA shown in FIG. 13A
  • FIG. It is a top view which shows a mode that the board
  • FIG. 14A is a perspective view showing a state in which a first pressing member and a second pressing member to which a sealing member having one through hole is fixed
  • FIG. 14B is a view of a substrate of the structure shown in FIG. 14A.
  • FIG. 14C is a cross-sectional view taken along the long axis direction of the substrate of the structure shown in FIG. 14A.
  • FIG. 15A is a perspective view showing a state in which the first pressing member and the second pressing member to which a sealing member having three through holes is fixed
  • FIG. 15B is a view of the substrate of the structure shown in FIG. 15A
  • FIG. 15C is a cross-sectional view taken along the long axis direction of the substrate of the structure shown in FIG. 15A.
  • FIGS. 1 and 2 are diagrams showing examples of detection chips that can be manufactured by the manufacturing method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A is a perspective view showing an example of a detection chip having one immobilization film
  • FIG. 1B is a cross-sectional view of the detection chip shown in FIG. 1A.
  • FIG. 2A is a perspective view showing an example of a detection chip having three immobilization films of the same size
  • FIG. 2B is a perspective view showing an example of a detection chip having three immobilization films of different sizes. .
  • the detection chip 100 includes a substrate 110, a metal film 120 formed on the substrate 110, and one or more immobilization films 130 formed on the metal film 120.
  • light for generating SPR hereinafter also referred to as “incident light”
  • the detection chip 100 may further include a flow path lid (not shown) for forming a fine flow path on the metal film 120.
  • the substrate 110 is made of a dielectric that is transparent to incident light.
  • the substrate 110 has an entrance surface 111, a film formation surface 112, and an exit surface 113, and functions as a prism (see FIG. 1B).
  • the incident surface 111 allows light for generating SPR to enter the substrate 110.
  • a metal film 120 is formed on the film formation surface 112. Light incident on the inside of the substrate 110 is reflected on the back surface of the metal film 120 (interface between the substrate 110 and the metal film 120).
  • the emission surface 113 emits reflected light to the outside of the substrate 110.
  • the shape of the substrate 110 is not particularly limited.
  • the shape of the substrate 110 is a hexahedron having a trapezoidal cross-sectional shape.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film formation surface 112
  • the surface corresponding to one leg is the incident surface 111
  • the surface corresponding to the other leg is the emission surface 113.
  • the trapezoid is preferably an isosceles trapezoid.
  • the incident surface 111 and the exit surface 113 are symmetric, and the S wave component of the incident light is less likely to stay in the substrate 110.
  • the angle between the incident surface 111 and the film formation surface 112 and the angle between the film formation surface 112 and the emission surface 113 are both about 80 °.
  • the material of the substrate 110 is not particularly limited as long as it is an optically transparent material at least with respect to incident light.
  • resin or glass is preferable.
  • the resin constituting the substrate 110 include polyesters such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate, polyolefins such as polyethylene (PE) and polypropylene (PP), cyclic olefin copolymer (COC) and cyclic olefin polymer ( COP) and other polycyclic olefins, vinyl resins such as polyvinyl chloride and polyvinylidene chloride, polystyrene, polyether ether ketone (PEEK), polysulfone (PSF), polyether sulfone (PES), polycarbonate (PC), Polyamide, polyimide, acrylic resin such as polymethyl methacrylate resin (PMMA), and triacetyl cellulose (TAC) are included.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PP polyethylene
  • the material of the substrate 110 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • a method for forming the substrate 110 is not particularly limited.
  • the substrate 110 when the substrate 110 is a resin substrate, the substrate 110 can be formed by injection molding.
  • the metal film 120 is disposed on the film formation surface 112 of the substrate 110.
  • an interaction occurs between the photon of light incident on the film formation surface 112 under total reflection conditions and free electrons in the metal film 120, and localized field light (on the surface of the metal film 120 ( Generally referred to as “evanescent light” or “near-field light”).
  • the material of the metal film 120 is not particularly limited as long as it is a metal that can cause SPR, but is one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, or an alloy of two or more metals. It is preferable that it is especially gold.
  • the metal film 120 may be a laminate of a plurality of films made of these metals. In the present embodiment, the metal film 120 is a gold thin film.
  • the formation method of the metal film 120 is not particularly limited, and can be appropriately selected from known methods. Examples of the method for forming the metal film 120 include vacuum film forming methods such as electron beam heating vacuum deposition, resistance heating vacuum deposition, magnetron sputtering, plasma assisted sputtering, ion assisted deposition, and ion plating.
  • the thickness of the metal film 120 is not particularly limited, and can be set as appropriate according to the type of metal constituting the metal film 120.
  • the thickness of the metal film 120 is preferably in the range of 5 to 500 nm.
  • the thickness of the metal film 120 is preferably in the range of 20 to 70 nm
  • the material of the metal film 120 is In the case of aluminum or an alloy of the above metal, the thickness of the metal film 120 is preferably in the range of 10 to 70 nm.
  • surface plasmon is likely to occur.
  • the immobilization film 130 includes a capturing body for capturing a substance to be detected, and is formed in a predetermined region on the surface of the metal film 120 that does not face the substrate 110. That is, the capturing body is fixed to a predetermined region of the metal film 120. By immobilizing the capturing body in this way, it becomes possible to selectively detect the substance to be detected.
  • the immobilization film 130 is a self-assembled monolayer (Self-Assembled Monolayer: hereinafter abbreviated as “SAM”) formed on the metal film 120, and is immobilized on the SAM. Including a capturing body. It is preferable that a hydrophilic polymer layer is further formed on the SAM, and the capturing body is fixed to the hydrophilic polymer layer.
  • SAM Self-Assembled Monolayer
  • SAM self-assembled monolayer
  • SAM The self-assembled monolayer
  • carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms is usually used, and 10-carboxy-1-decanethiol is particularly preferably used.
  • the SAM formed by using it has little optical influence (high transparency, low refractive index and thin film thickness), so that carboxyalkanethiol having 4 to 20 carbon atoms constitutes SAM.
  • These carboxyalkanethiols are available from, for example, Dojindo Laboratories Co., Ltd. and Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.
  • the method for forming the SAM is not particularly limited, and may be appropriately selected from known methods.
  • the substrate 110 on which the metal film 120 is formed may be immersed in an ethanol solution containing 10-carboxy-1-decanethiol.
  • the thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol binds to and is immobilized on the metal constituting the metal film 120, and the 10-carboxy-1-decanethiol self-assembles on the metal film 120.
  • the hydrophilic polymer layer is preferably formed so as to intervene the bond between the SAM and the capturing body.
  • dextran such as carboxymethyldextran (CMD) is preferable as the polysaccharide
  • polyacrylic acid is preferable as the resin.
  • CMD carboxymethyldextran
  • These polymers have a hydroxyl group (—OH) and a carboxyl group (—COOH), and can prevent adsorption of non-specific proteins by inclusion of water molecules by hydrogen bonding.
  • the method for forming the hydrophilic polymer layer is not particularly limited, and may be appropriately selected from known methods.
  • EDC 1- (3-dimethylaminopropyl) -3ethylcarbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the carboxyl group possessed by the hydrophilic polymer may be activated, and the activated carboxyl group of the hydrophilic polymer may be reacted with the amino group possessed by the SAM.
  • the type of the capturing body is not particularly limited as long as the substance to be detected can be specifically captured.
  • the capturing body is a protein that specifically binds to the substance to be detected.
  • proteins include antibodies to antigens, enzymes to substrates or coenzymes, receptors to hormones, proteins A and G to antibodies, avidins to biotin, calmodulin to calcium, lectins to sugars, and the like.
  • a capturing body is an antibody.
  • the substance to be detected is a nucleic acid
  • the capturing body may be a nucleic acid having a sequence that can specifically bind to the nucleic acid that is the substance to be detected.
  • the method for immobilizing the capturing body on the SAM or the hydrophilic polymer layer is not particularly limited as long as it does not lose the capturing ability of the capturing body, and can be appropriately selected from known methods.
  • EDC alone or by using EDC and NHS in combination
  • the carboxyl group of SAM or hydrophilic polymer is activated, and the activated carboxyl group of SAM or hydrophilic polymer is captured. What is necessary is just to make it react with the amino group which has.
  • the planar view shape of the immobilization film 130 is not particularly limited. Examples of the shape of the immobilizing film 130 include a circle and a polygon. Further, the number of the fixing films 130 is not limited. The number of immobilization films 130 may be one (see FIG. 1A) or plural (see FIGS. 2A and 2B). When there are a plurality of immobilization films 130, the shape and size of each immobilization film 130 may be the same (see FIG. 2A) or different from each other (see FIG. 2B).
  • a flow path lid (not shown) is disposed on the metal film 120.
  • the flow path lid may be disposed on the film formation surface 112.
  • a channel groove is formed on the back surface of the channel lid, and the channel lid, together with the metal film 120 (and the substrate 110), forms a fine channel through which liquid flows.
  • the liquid include a specimen containing a substance to be detected (for example, whole blood, plasma, serum, or a diluted solution thereof) and a capturing body labeled with a fluorescent substance (for example, a fluorescently labeled secondary antibody). Labeling solution, washing solution, etc. are included.
  • the entire surface of the immobilizing film 130 is exposed in the fine flow path. Both ends of the fine channel are respectively connected to an inlet and an outlet formed on the upper surface of the channel lid. When the liquid is injected into the fine channel, the liquid comes into contact with the fixed membrane 130.
  • the material of the flow path lid is not particularly limited as long as it is a material that is stable to the liquid flowing in the fine flow path.
  • the material of the channel lid is preferably made of a material that is transparent to the fluorescence to be detected.
  • An example of the material of the channel lid includes a resin.
  • the channel lid is bonded to the metal film 120 or the substrate 110 by, for example, adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, or pressure bonding using a clamp member.
  • the detection chip manufacturing method includes (1) a first step of preparing the substrate 110 on which the metal film 120 is disposed, and (2) a second step of pressing the seal member against the metal film 120. (3) providing a liquid containing the trapping body in the through-hole of the seal member to form the immobilization film 130 on the metal film 120. Thereafter, as an optional step, (4) a fourth step of bonding the flow path lid to the metal film 120 or the substrate 110 may be performed.
  • the above-described substrate 110 on which the metal film 120 is disposed is prepared.
  • the method for forming the metal film 120 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 120 include vacuum film forming methods such as electron beam heating vacuum deposition, resistance heating vacuum deposition, magnetron sputtering, plasma assisted sputtering, ion assisted deposition, and ion plating. It is. Moreover, you may purchase the board
  • FIG. 3A is a diagram illustrating a state in which the seal member 210 is placed on the metal film 120.
  • FIG. 3B is a diagram illustrating a state in which the seal member 210 is pressed against the metal film 120 by pressing the seal member 210.
  • the seal member 210 is made of an elastic body and has one or more through holes 211 for forming the immobilization film 130.
  • the rubber hardness (JIS ⁇ ⁇ K 2533; ISO 18517) of the elastic body constituting the seal member 210 is not particularly limited, but is preferably in the range of A50 to A80 from the viewpoint of ease of use, and is in the range of A55 to A65. More preferably, it is within.
  • the elastic body constituting the seal member 210 is preferably excellent in chemical resistance. Specifically, the volume change when immersed in alcohol or alkali is 10. Those less than% are preferred. Examples of such an elastic body include fluorine rubber and silicone rubber.
  • the through-hole 211 of the sealing member 210 corresponds to the outer peripheral edge of the immobilization film 130 to be formed. Therefore, normally, the number, shape, and size of the opening of the through hole 211 coincide with the number, shape, and size of the immobilizing film 130 to be formed.
  • the seal member 210 shown in FIGS. 3A and 3B is for manufacturing the detection chip 100 shown in FIG. 2B and has three through holes 211. Each through-hole 211 has a cylindrical shape. Further, the areas of the openings on the metal film side of the through holes 211 are different from each other. 3A and 3B, the opening of the through hole 211 shown on the leftmost side is the smallest.
  • the shape of the seal member 210 is set so as to satisfy the following formula (1) in order to form the immobilization film 130 with high accuracy.
  • A1 is an area where the metal film 120 and the seal member 210 come into contact when the seal member 210 is placed on the metal film 120 (when the seal member 210 is not pressed against the metal film 120).
  • Mm 2 is an area where the metal film 120 and the seal member 210 come into contact when the seal member 210 is placed on the metal film 120 (when the seal member 210 is not pressed against the metal film 120).
  • Mm 2 shows the opening area (mm 2 ) of the through hole 211 having the smallest opening area on the metal film 120 side when the sealing member 210 is placed on the metal film 120 (when the sealing member 210 is not pressed against the metal film 120).
  • the radius of curvature of the opening edge on the metal film 120 side of the through-hole 211 when the seal member 210 is not pressed against the metal film 120 is not particularly limited, but is 0 from the viewpoint of forming the fixed film 130 with high accuracy. 0.1 or less is preferable, and 0.03 or less is more preferable. Further, the radius of curvature of the opening edge on the metal film 120 side of the through hole 211 is not particularly limited, but is preferably 0.01 or more from the viewpoint of preventing the opening edge from being lost.
  • the manufacturing method of the seal member 210 is not particularly limited. For example, considering the accuracy of the shape of the seal member 210 and the degree of freedom of processing, the seal member 210 can be manufactured by press working using a mold.
  • T is the thickness (mm) in the pressing direction of the sealing member 210 (the depth direction of the through hole 211) when the sealing member 210 is not pressed against the metal film 120 (FIG. 3A). reference).
  • ⁇ T is a change amount (mm) of the thickness T in the pressing direction of the seal member 210 by pressing the seal member 210 against the metal film 120 (see FIG. 3B).
  • ⁇ T / T When ⁇ T / T is less than 0.05, the pressing force is too small, so that when the liquid is injected into the through-hole 211, liquid leakage occurs and the shape of the immobilization film 130 changes. On the other hand, when ⁇ T / T is more than 0.25, the pressing force is too large, so that damage (for example, cracks) is formed in the metal film 120 or the birefringence characteristics of the substrate 110 are changed. Moreover, since the pressing force is too large, the shape around the opening of the through hole 211 changes, and the shape of the immobilization film 13 also changes.
  • the method for pressing the seal member 210 against the metal film 120 is not particularly limited.
  • the seal member 210 may be pressed against the metal film 120 using the first pressing member 310 and the second pressing member 320.
  • the sealing member 210 can be pressed against the metal film 120 by applying a force to the first pressing member 310 and the second pressing member 320 by tightening with a bolt or the like (see FIGS. 14B and 15B).
  • the material of the first pressing member 310 and the second pressing member 320 is not particularly limited, and is, for example, a metal, a resin, or an elastic body. Among these, from the viewpoint of deformation resistance and chemical resistance, the material of the first pressing member 310 and the second pressing member 320 is preferably stainless steel.
  • a through hole 311 corresponding to each through hole 211 of the seal member 210 is formed in the first pressing member 310 located on the upper side (the seal member 210 side).
  • the first pressing member 310 may further be formed with a liquid storage part for storing reagents and the like. Moreover, the through hole 311 may function as a liquid storage part.
  • a jig for aligning the positions of the substrate 110 and the metal film 120 with the first pressing member 310 may be further used.
  • a pin for positioning the substrate 110 may be fixed to the first pressing member 310 (see FIGS. 12C and 13C).
  • the sealing member 210 is fixed to the 1st press member 310.
  • FIG. 4B and FIG. 12B an annular recess for fitting the seal member 210 around the through hole 311 is formed on the surface of the first pressing member 310 on the substrate 110 side.
  • the seal member 210 can be fixed to the first pressing member 310 by fitting the seal member 210.
  • the difference between the outer shape of the annular recess formed in the pressing member 310 and the inner diameter of the corresponding through hole 211 of the seal member 210 is preferably within a range of ⁇ 20 ⁇ m. That is, it is preferable that the seal member 210 is fitted in the recess while being slightly expanded, or is fitted in the recess with a slight margin.
  • the method for injecting the liquid 220 including the trapping body is not particularly limited as long as the metal film 120 is not damaged.
  • the injection may be performed automatically using a dispenser or the like, or may be performed manually using a pipette.
  • the immobilized film 130 when forming the above-described immobilized film 130 including the SAM, the hydrophilic polymer layer, and the capturing body, the immobilized film 130 may be formed by the following procedure (steps 3 (a) to (d)). .
  • Step 3 (a) First, a SAM is formed on the metal film 120. 1 mL of an ethanol solution containing 1 mM of 10-carboxy-1-decanethiol is injected into the through hole 311 of the first pressing member 310 and the through hole 211 of the seal member 210, and is allowed to stand for 1 hour. Form. Thereafter, the liquid in the through hole 311 and the through hole 211 is removed, the SAM is washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
  • Step 3 (b) a hydrophilic polymer layer made of carboxymethyldextran (CMD) is formed on the SAM.
  • CMD carboxymethyldextran
  • EDC Water-soluble carbodiimide
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • pH 6.0 buffered saline
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a liquid mixture is dripped on SAM exposed in the through-hole 311 and the through-hole 211, and it is made to react at room temperature for 1.5 hours, and a hydrophilic polymer layer is formed.
  • MES buffered saline containing 25 mg / mL N-hydroxysuccinimide (NHS) and 25 mg / mL water-soluble carbodiimide (EDC) on the hydrophilic polymer layer exposed in the through-hole 311 and the through-hole 211 Inject 0.2 mL of (pH 6.0) and react for 20 minutes. After removing the liquid in the through-hole 311 and the through-hole 211, 0.2 mL of an acetate buffer solution (pH 6.0) containing an antibody as a capturing body is injected and allowed to react for 30 minutes. Immobilize the trap.
  • pH 6.0 an acetate buffer solution
  • Step 3 (d) After removing the liquid in the through hole 311 and the through hole 211 so as not to damage the fixed film 130 formed in the steps 3 (a) to (c), the fixed film exposed in the through hole 311 and the through hole 211. 130 is dried with an air gun. Thereafter, the seal member 210, the first pressing member 310, and the second pressing member 320 are removed.
  • the detection chip 100 can be manufactured by the above procedure. Thereafter, as an optional step, a fourth step of bonding the flow path lid to the metal film 120 or the substrate 110 may be performed.
  • the flow path lid made of resin is bonded to the metal film 120 or the substrate 110 by adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, pressure bonding using a clamp member, or the like. .
  • the manufacturing method of detection chip 100 state where seal member 210 that satisfies the above formula (1) is pressed against metal film 120 so as to satisfy formula (2).
  • the liquid containing the trapping body is provided to the through hole 211 of the seal member 210 to form the immobilization film 130 on the metal film 120.
  • the fixing film 130 can be formed with high accuracy in a predetermined region on the metal film 120 without causing damage to the metal film 120 and without changing the birefringence characteristics of the substrate 110.
  • Substrate A substrate (prism) having a substantially trapezoidal cross section was prepared using a cycloolefin polymer resin (ZEONEX; Nippon Zeon Co., Ltd.). A gold thin film having a thickness of 32 to 52 nm was formed on the film formation surface (20 mm ⁇ 10 mm) of the substrate by sputtering.
  • seal members shown in Table 1 were prepared. Each sealing member was produced from fluoro rubber (rubber hardness A60) or silicone rubber (rubber hardness A50) by press molding using a mold.
  • A1 is a contact area (mm 2 ) between the gold thin film and the seal member when the seal member is placed on a flat gold thin film (when the seal member is not pressed against the gold thin film).
  • A2 is the opening area (mm 2 ) of the through hole having the smallest opening area on the gold thin film side when the sealing member is placed on a flat gold thin film (when the sealing member is not pressed against the gold thin film).
  • T is the thickness (mm) of the seal member when no force is applied to the seal member.
  • FIG. 5A to 5C are views showing the configuration of the sealing member according to No. 1.
  • 5A is a perspective view
  • FIG. 5B is a plan view
  • FIG. 5C is a cross-sectional view.
  • the portion in contact with the gold thin film is shown on the upper side (the same applies to FIGS. 6 to 10).
  • FIG. 5B the area corresponding to A1 is hatched.
  • the radius of curvature of the opening edge of the through hole is less than 0.01.
  • FIG. 6A to 6C are diagrams showing the configuration of the seal member according to No. 2.
  • FIG. 6A is a perspective view
  • FIG. 6B is a plan view
  • FIG. 6C is a cross-sectional view.
  • the area corresponding to A1 is hatched.
  • the sealing member according to No. 2 has one cylindrical through hole (opening area: 4.52 mm 2 ) having a diameter of 2.4 mm, and only the outer peripheral part (area: 3.52 mm 2 ) of the through hole is gold. Contact the thin film.
  • the radius of curvature of the opening edge of the through hole (indicated by R in FIG. 6C) is less than 0.01.
  • FIG. 7A to 7C are views showing the configuration of the seal member according to No. 3.
  • 7A is a perspective view
  • FIG. 7B is a plan view
  • FIG. 7C is a cross-sectional view.
  • the seal member according to No. 3 has three cylindrical through holes (diameter of opening: 10.17 mm 2 ) having a diameter of 3.6 mm, and only the outer peripheral portion (total area: 15.07 mm 2 ) of each through hole. Contacts the gold film.
  • the radius of curvature of the opening edge of each through hole is less than 0.01.
  • FIG. 8A to 8C are diagrams showing the configuration of the sealing member according to No. 4.
  • 8A is a perspective view
  • FIG. 8B is a plan view
  • FIG. 8C is a cross-sectional view.
  • the seal member according to No. 4 has three cylindrical through-holes (opening area: 10.17 mm 2 ) with a diameter of 3.6 mm, and the entire surface facing the gold thin film (area: 64.40 mm 2 ). Contacts the gold film.
  • the radius of curvature of the opening edge of each through hole (indicated by R in FIG. 8C) is less than 0.01.
  • FIGS 9A to 9C are diagrams showing the configuration of the seal member according to No. 5.
  • 9A is a perspective view
  • FIG. 9B is a plan view
  • FIG. 9C is a cross-sectional view.
  • the seal member according to No. 5 has three cylindrical through-holes (opening area: 4.52 mm 2 ) having a diameter of 2.4 mm, and the entire surface facing the gold thin film (area: 81.36 mm 2 ). Contacts the gold film.
  • the radius of curvature of the opening edge of each through hole is less than 0.01.
  • FIGS. 10A to 10C are diagrams showing the configuration of the seal member according to No. 6.
  • 10A is a perspective view
  • FIG. 10B is a plan view
  • FIG. 10C is a cross-sectional view.
  • the area corresponding to A1 is hatched.
  • Sealing member according to No.6 the through-holes (aperture area: 10.17mm 2) of cylindrical shape with a diameter of 3.6mm to a one, the outer peripheral portion of the through-hole (area: 0.50 mm 2) Nomigakin Contact the thin film.
  • the radius of curvature of the opening edge of the through hole (indicated by R in FIG. 10C) is less than 0.01.
  • FIG. 11A to 11C are diagrams showing the configuration of the sealing member according to No. 7.
  • 11A is a perspective view
  • FIG. 11B is a plan view
  • FIG. 11C is a cross-sectional view.
  • the area corresponding to A1 is hatched.
  • Sealing member according to No.7 the through-holes (aperture area: 3.14 mm 2) of cylindrical shape with a diameter of 2.0mm has three outer peripheral portion (total area: 24.6 mm 2) of each of the through holes only Contacts the gold film.
  • the radius of curvature of the opening edge of the through hole is less than 0.01.
  • FIG. 12A is a plan view of a first pressing member (a diagram of a substrate side surface) to which a sealing member having one through hole (a sealing member according to No. 1, 2, 6) is fixed.
  • 12B is a partially enlarged cross-sectional view taken along the line AA shown in FIG. 12A
  • FIG. 12C is a plan view showing a state in which the substrate is arranged on the first pressing member shown in FIG. 12A. is there.
  • FIG. 13A is a plan view of the first pressing member to which a sealing member having three through holes (sealing members according to Nos. 3 to 5 and 7) is fixed (a view of the surface on the substrate side)
  • FIG. 13C is a partially enlarged cross-sectional view taken along the line AA shown in FIG. 13A
  • FIG. 13C is a plan view showing a state in which the substrate is arranged on the first pressing member shown in FIG. 13A.
  • the seal member 210 according to Nos. 1 to 7 was fixed to the substrate-side surface (upper surface in the drawing) of the first pressing member 310 made of stainless steel. .
  • the through hole 311 of the first pressing member 310 communicates with the through hole 211 of the seal member 210 and also functions as a liquid reservoir.
  • Six pins 312 for fixing the substrate 110 are arranged around the seal member 210.
  • the six pins 312 were fixed to the first pressing member 310 by being press-fitted into six pin press-fitting holes 313 (see FIGS. 14A and 15A) formed in the first pressing member 310, respectively.
  • FIG. 13C and FIG. 14C the substrate 110 on which the gold thin film was formed was placed on the seal member 210.
  • FIG. 14A is a perspective view showing a state in which a first pressing member and a second pressing member, to which a sealing member having one through hole (a sealing member according to No. 1, 2, 6) is fixed, are combined.
  • 14B is a sectional view taken along the minor axis direction of the substrate of the structure shown in FIG. 14A
  • FIG. 14C is a sectional view taken along the major axis direction of the substrate of the structure shown in FIG. 14A.
  • FIG. 15A is a perspective view showing a state in which a first pressing member and a second pressing member to which a sealing member having three through holes (sealing members according to Nos.
  • FIG. 15B is a sectional view taken along the minor axis direction of the substrate of the structure shown in FIG. 15A
  • FIG. 15C is a sectional view taken along the major axis direction of the substrate of the structure shown in FIG. 15A.
  • the first pressing member 310 and the second pressing member 320 arranged so as to sandwich the substrate 110 are fastened with bolts 314, so that the seal member 210 is pressed against the metal of the substrate 110 with a predetermined pressure. Pressed against the thin film.
  • the change value ⁇ T (mm) of the thickness of the seal member 210 was measured.
  • a detection chip was produced by forming an immobilized film on the gold thin film by the following procedure (steps 3 (a) to (d)). For each example and each comparative example, the same process was repeated 6 times to produce 6 detection chips.
  • Step 3 (a) 1 mL of an ethanol solution containing 1 mM of 10-carboxy-1-decanethiol is injected into the through-hole 311 of the first pressing member 310 and the through-hole 211 of the seal member 210 using a pipetter, and is left to stand for 1 hour. A SAM was formed on top. Thereafter, the liquid in the through holes 211 and 311 was removed, the SAM was washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
  • Step 3 Subsequently, 25 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffered physiology containing 1 mg / mL CMD (CMD-500-06I4; Meitsu Sangyo Co., Ltd .: average molecular weight 500,000, substitution degree 0.51) and 10 mM NaCl.
  • CMD CMD-500-06I4; Meitsu Sangyo Co., Ltd .: average molecular weight 500,000, substitution degree 0.51
  • 10 mM NaCl 10 mM NaCl.
  • EDC water-soluble carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the mixed solution was dropped onto the SAM exposed in the through hole 211 of the seal member 210 using a pipetter and reacted at room temperature for 1.5 hours to form a hydrophilic polymer layer. Thereafter, 0.8 mL of 1N NaOH aqueous solution is added to the mixed solution in the through holes 211 and 311 and reacted for 30 minutes. Then, the liquid in the through holes 211 and 311 is removed, and 0.8 mL of ultrapure water is used for hydrophilicity. The functional polymer layer was washed three times.
  • Step 3 (c) Next, MES buffered physiology containing 25 mg / mL N-hydroxysuccinimide (NHS) and 25 mg / mL water-soluble carbodiimide (EDC) on the hydrophilic polymer layer exposed in the through hole 211 of the seal member 210.
  • Saline solution pH 6.0 was injected with 0.2 mL using a pipetter and allowed to react for 20 minutes.
  • 0.2 mL of an acetate buffer solution (pH 6.0) containing an anti-troponin I (TnI) monoclonal antibody is injected and reacted for 30 minutes, so that the hydrophilic polymer layer An anti-TnI antibody was immobilized on the top.
  • 0.2 mL of 50 mM Tris buffer (pH 7.4) is injected using a pipetter and reacted for 15 minutes to remove unreacted activated ester groups. Activated.
  • Step 3 (d) Finally, after removing the liquid in the through holes 211 and 311 so as not to damage the immobilization film formed in the above steps 3 (a) to (c), the immobilization exposed in the through hole 211 of the seal member 210 is removed.
  • the membrane was dried with an air gun. Thereafter, the seal member 210, the first pressing member 310, and the second pressing member 320 were removed.
  • Evaluation of the change in the area of the immobilized film was performed by calculating the area of the immobilized film of each detection chip by image analysis using an image measuring machine.
  • “ ⁇ ” indicates that the area of the immobilization film is within the range of ⁇ 10% from the opening area of the corresponding seal member through hole in all the six detection chips produced.
  • any detection chip when the area of the immobilization film was not within the range of ⁇ 10% from the opening area of the corresponding through hole of the seal member, it was evaluated as “x”.
  • the immobilization film was pressed in a state where A1 / A2 was 0.15 or more and 6.5 or less and pressed against the gold thin film so that ⁇ T / T was 0.05 or more and 0.25 or less. It can be seen that the immobilization film can be formed with high accuracy without forming damage to the gold thin film and without changing the birefringence of the substrate.
  • the detection chip manufactured by the manufacturing method according to the present invention is useful for clinical examinations, for example.

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Abstract

　金属膜に、１または２以上の貫通孔を有し、かつ弾性体からなるシール部材を、以下の式（１）および式（２）を満たすように押し付ける。次いで、前記貫通孔に捕捉体を含む液体を提供して、前記金属膜上に前記捕捉体を固定化する。　０.１５≦Ａ１／Ａ２≦６.５　…（１）　０.０５≦ΔＴ／Ｔ≦０.２５　…（２）　［Ａ１は、前記金属膜と前記シール部材が接触する面積（ｍｍ２）である。Ａ２は、前記金属膜側の開口面積が最小の前記貫通孔の開口面積（ｍｍ２）である。Ｔは、前記金属膜の押圧方向の厚み（ｍｍ）である。ΔＴは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けることによる、前記金属膜の押圧方向の厚みＴの変化量（ｍｍ）である。］

Description

検出チップの製造方法
　本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップの製造方法に関する。
　臨床検査などにおいて、検体中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、検体中の被検出物質を高感度に検出できる方法が求められている。
　検体中の被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）法および表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。これらの方法では、所定の条件でレーザー光などの光を金属膜に照射すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じることを利用する。
　ＳＰＲ法およびＳＰＦＳでは、被検出物質を高感度かつ高精度に検出するために、微細流路を有する専用の検出チップを使用することが多い（例えば、特許文献１～３参照）。微細流路の底面には、ＳＰＲを生じさせるための金属膜が配置されており、金属膜の表面の一部には、被検出物質を捕捉するための捕捉体（例えば、抗体）を含む固定化膜が形成されている。すなわち、捕捉体は、微細流路内において金属膜表面の一部の領域に固定化されている。微細流路内に検体を導入すると、検体に含まれる被検出物質は捕捉体により捕捉される。
　検出チップの製造安定性の向上の観点からは、固定化膜の大きさは微細流路の幅より小さいことが好ましい。また、複数の検出チップ間において本来同一であるはずの固定化膜の大きさが異なる場合、固定化膜に含まれる捕捉体の濃度も検出チップごとに異なることになり、検出結果も捕捉体の濃度に応じて変動してしまう。すなわち、複数の検出チップ間において本来同一であるはずの固定化膜の大きさが互いに異なることは、検出精度の低下に繋がる。したがって、検出精度の向上の観点からは、金属膜上の所定の領域に、固定化膜を高精度に形成することが要求される。
　検出チップの金属膜上の所定の領域に固定化膜を形成する方法としては、シール部材を使用する方法が知られている。たとえば、特許文献４，５には、貫通孔を有し、シリコーンゴムまたはフッ素ゴムからなるシール部材を金属膜上に載置し、次いでシール部材の貫通孔に捕捉体を含む液体を提供して、金属膜上の所定の領域に固定化膜を形成することが記載されている。
国際公開第２０１３／０９９８７１号 国際公開第２０１２／００８２５８号 国際公開第２０１２／１７２９９２号 特開２００７－２５６１０３号公報 特開２０１０－２１０３７８号公報
　特許文献４，５に記載されている固定化膜の形成方法では、シリコーンゴムやフッ素ゴムなどの弾性体からなるシール部材を金属膜上に載せている。このとき、固定化膜を形成するために、例えば貫通孔を有するシール部材を金属膜上に単に載せるだけでは、貫通孔内に提供した液体が貫通孔外に漏れ出てしまい、固定化膜の形状および大きさを制御できないと考えられる。これを防ぐためには、金属膜にシール部材を押し付けることが考えられる。
　しかしながら、金属膜に弾性体からなるシール部材を押し付けて固定膜を形成する場合、押し付ける強さによりシール部材の形状が変化してしまうため、固定化膜の面積が検出チップごとに±１０％以上変化してしまうおそれがある。前述のとおり、固定化膜の大きさが変化することは、検出精度の低下に繋がる。
　また、シール部材を押し付ける強さが大きすぎる場合、金属膜に損傷が形成されてしまい、ＳＰＲを利用して適切に検出を行うことができなくなるおそれがある。また、シール部材を押し付ける強さが大きすぎる場合、金属膜の下に配置されている樹脂基板の複屈折特性が変化してしまうおそれもある。このように基板の複屈折特性が変化してしまうと、金属膜に入射する励起光の偏光特性が変化してしまい、結果として検出精度が低下してしまう。
　本発明の目的は、ＳＰＲを利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップの製造方法であって、金属膜に損傷を形成することなく、かつ基板の複屈折特性を変化させることなく、金属膜上の所定の領域に捕捉体を含む固定化膜を高精度に形成することができる検出チップの製造方法を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出チップの製造方法は、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップの製造方法であって、その表面に表面プラズモン共鳴を発生させるための金属膜を配置されている、誘電体からなる基板を準備する工程と、前記金属膜に、１または２以上の貫通孔を有し、かつ弾性体からなるシール部材を、以下の式（１）および式（２）を満たすように押し付ける工程と、前記貫通孔に捕捉体を含む液体を提供して、前記金属膜上に前記捕捉体を固定化する工程と、を含む。
　０.１５≦Ａ１／Ａ２≦６.５　…（１）
　０.０５≦ΔＴ／Ｔ≦０.２５　…（２）
　［上記式（１）および（２）において、Ａ１は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜と前記シール部材が接触する面積（ｍｍ２）である。Ａ２は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜側の開口面積が最小の前記貫通孔の開口面積（ｍｍ２）である。Ｔは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記シール部材の押圧方向の厚み（ｍｍ）である。ΔＴは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けることによる、前記シール部材の押圧方向の厚みＴの変化量（ｍｍ）である。］
　本発明によれば、誘電体上に配置された金属膜に損傷を形成することなく、かつ基板の複屈折特性を変化させることなく、固定化膜が高精度に形成されている検出チップを製造することができる。また、本発明によれば、ディップ法などに比べて捕捉体を含む液体の使用量を少なくすることができるため、検出チップの製造コストを低減することもできる。本発明に係る検出チップを使用することで、検体中の被検出物質を高感度かつ高精度に検出することができる。
図１Ａおよび図１Ｂは、実施の形態に係る製造方法により製造されうる検出チップの例を示す図である。 図２Ａおよび図２Ｂは、実施の形態に係る製造方法により製造されうる検出チップの別の例を示す図である。 図３Ａ～Ｄは、実施の形態に係る製造方法の手順の例を示す図である。 図４Ａは、第１押圧部材および第２押圧部材を用いて金属膜にシール部材を押し付ける様子を示す図であり、図４Ｂは、第１押圧部材にシール部材を固定する例を示す図である。 図５Ａ～Ｃは、Ｎｏ.１に係るシール部材の構成を示す図である。 図６Ａ～Ｃは、Ｎｏ.２に係るシール部材の構成を示す図である。 図７Ａ～Ｃは、Ｎｏ.３に係るシール部材の構成を示す図である。 図８Ａ～Ｃは、Ｎｏ.４に係るシール部材の構成を示す図である。 図９Ａ～Ｃは、Ｎｏ.５に係るシール部材の構成を示す図である。 図１０Ａ～Ｃは、Ｎｏ.６に係るシール部材の構成を示す図である。 図１１Ａ～Ｃは、Ｎｏ.７に係るシール部材の構成を示す図である。 図１２Ａは、１つの貫通孔を有するシール部材を固定した第１押圧部材の平面図であり、図１２Ｂは、図１２Ａに示されるＡ－Ａ線における部分拡大断面図であり、図１２Ｃは、図１２Ａに示される第１押圧部材上に基板を配置した様子を示す平面図である。 図１３Ａは、３つの貫通孔を有するシール部材を固定した第１押圧部材の平面図であり、図１３Ｂは、図１３Ａに示されるＡ－Ａ線における部分拡大断面図であり、図１３Ｃは、図１３Ａに示される第１押圧部材上に基板を配置した様子を示す平面図である。 図１４Ａは、１つの貫通孔を有するシール部材を固定した第１押圧部材と第２押圧部材とを組み合わせた様子を示す斜視図であり、図１４Ｂは、図１４Ａに示される構造体の基板の短軸方向に沿う断面図であり、図１４Ｃは、図１４Ａに示される構造体の基板の長軸方向に沿う断面図である。 図１５Ａは、３つの貫通孔を有するシール部材を固定した第１押圧部材と第２押圧部材とを組み合わせた様子を示す斜視図であり、図１５Ｂは、図１５Ａに示される構造体の基板の短軸方向に沿う断面図であり、図１５Ｃは、図１５Ａに示される構造体の基板の長軸方向に沿う断面図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　１．検出チップ
　図１および図２は、本発明の一実施の形態に係る製造方法により製造されうる検出チップの例を示す図である。図１Ａは、固定化膜を１つ有する検出チップの例を示す斜視図であり、図１Ｂは、図１Ａに示される検出チップの断面図である。図２Ａは、同じサイズの固定化膜を３つ有する検出チップの例を示す斜視図であり、図２Ｂは、互いに異なるサイズの固定化膜を３つ有する検出チップの例を示す斜視図である。
　図１および図２に示されるように、検出チップ１００は、基板１１０と、基板１１０上に形成された金属膜１２０と、金属膜１２０上に形成された１または２以上の固定化膜１３０とを有する。本実施の形態の検出チップ１００では、ＳＰＲを発生されるための光（以下「入射光」ともいう）が、基板１１０側から金属膜１２０に照射される。検出チップ１００は、さらに、金属膜１２０上に微細流路を形成するための流路蓋（不図示）を有していてもよい。
　（基板）
　基板１１０は、入射光に対して透明な誘電体からなる。基板１１０は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有し、プリズムとして機能する（図１Ｂ参照）。入射面１１１は、ＳＰＲを発生させるための光を基板１１０の内部に入射させる。成膜面１１２上には、金属膜１２０が形成されている。基板１１０の内部に入射した光は、金属膜１２０の裏面（基板１１０と金属膜１２０との界面）で反射する。出射面１１３は、反射光を基板１１０の外部に出射させる。
　基板１１０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、基板１１０の形状は、断面形状が台形の六面体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面１１１と出射面１１３とが対称になり、入射光のＳ波成分が基板１１０内に滞留しにくくなる。本実施の形態では、入射面１１１と成膜面１１２との角度および成膜面１１２と出射面１１３との角度は、いずれも約８０°である。
　基板１１０の材料は、少なくとも入射光に対して光学的に透明な材料であれば特に限定されないが、取扱い易い基板１１０を提供する観点からは、樹脂またはガラスが好ましい。基板１１０を構成する樹脂の例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）やポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）や環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、ポリ塩化ビニルやポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）などのアクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）が含まれる。基板１１０の材料は、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂であることが好ましい。基板１１０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、基板１１０が樹脂基板の場合、基板１１０は射出成形により形成されうる。
　（金属膜）
　金属膜１２０は、基板１１０の成膜面１１２上に配置されている。これにより、成膜面１１２に全反射条件で入射した光の光子と、金属膜１２０中の自由電子との間で相互作用（ＳＰＲ）が生じ、金属膜１２０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。
　金属膜１２０の材料は、ＳＰＲを生じさせうる金属であれば特に限定されないが、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる１種の金属または２種以上の金属の合金であることが好ましく、特に金であることが好ましい。金属膜１２０は、これらの金属からなる複数の膜の積層体であってもよい。本実施の形態では、金属膜１２０は、金薄膜である。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。金属膜１２０の形成方法の例には、電子ビーム加熱真空蒸着法や抵抗加熱真空蒸着法、マグネトロンスパッタ法、プラズマ支援スパッタ法、イオンアシスト蒸着法、イオンプレーティング法などの真空成膜法が含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されず、金属膜１２０を構成する金属の種類に応じて適宜設定されうる。たとえば、金属膜１２０の材料が金、銀、アルミニウム、銅、白金またはこれらの合金である場合、金属膜１２０の厚みは５～５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。電場増強効果の観点からは、金属膜１２０の材料が金、銀、銅または白金である場合は、金属膜１２０の厚みは２０～７０ｎｍの範囲内であることが好ましく、金属膜１２０の材料がアルミニウムまたは上記金属の合金である場合は、金属膜１２０の厚みは１０～７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。金属膜１２０の厚みが上記範囲内の場合、表面プラズモンが発生しやすい。
　（固定化膜）
　固定化膜１３０は、被検出物質を捕捉するための捕捉体を含み、金属膜１２０の基板１１０と対向しない面上の所定の領域に形成されている。すなわち、捕捉体は、金属膜１２０の所定の領域に固定化されている。このように捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。
　本実施の形態では、固定化膜１３０は、金属膜１２０上に形成された自己組織化単分子膜（Self-Assembled Monolayer：以下「ＳＡＭ」と略記する）と、前記ＳＡＭ上に固定化された捕捉体とを含む。前記ＳＡＭ上には、さらに親水性高分子層が形成されており、前記捕捉体は、この親水性高分子層に固定化されていることが好ましい。
　(ＳＡＭ)
　自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）は、金属膜１２０上に配置されており、金属膜１２０に捕捉体または親水性高分子を固定するための土台としての役割を有する。ＳＡＭを構成する単分子としては、通常、炭素原子数４～２０程度のカルボキシアルカンチオールが使用され、特に好ましくは１０－カルボキシ－１－デカンチオールが使用される。それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない（透明性が高く、屈折率が低くかつ膜厚が薄い）ことから、炭素原子数４～２０のカルボキシアルカンチオールは、ＳＡＭを構成する単分子として好ましい。これらのカルボキシアルカンチオールは、例えば、株式会社同仁化学研究所やシグマアルドリッチジャパン株式会社などから入手可能である。
　ＳＡＭの形成方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、金属膜１２０がその表面に形成された基板１１０を、１０－カルボキシ－１－デカンチオールを含むエタノール溶液に浸漬すればよい。これにより、１０－カルボキシ－１－デカンチオールのチオール基が、金属膜１２０を構成する金属と結合して固定化され、１０－カルボキシ－１－デカンチオールは、金属膜１２０上で自己組織化してＳＡＭを形成する。
　（親水性高分子層）
　親水性高分子層は、ＳＡＭと捕捉体との結合を介在しうるように形成されることが好ましい。親水性高分子層を構成する親水性高分子は、多糖類としてはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが好ましく、樹脂としてはポリアクリル酸が好ましい。これらの高分子は、水酸基（－ＯＨ）およびカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有しており、水素結合による水分子の内包により非特異的タンパク質の吸着を防ぐことができる。
　親水性高分子層の形成方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、水溶性カルボジイミドである１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を単独で使用すること、またはＥＤＣとＮ－ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）とを併用することによって、親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、親水性高分子の活性化したカルボキシル基をＳＡＭが有するアミノ基と反応させればよい。
　（捕捉体）
　捕捉体の種類は、被検出物質を特異的に捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質と特異的に結合するタンパク質である。そのようなタンパク質の例には、抗原に対する抗体、基質または補酵素に対する酵素、ホルモンに対する受容体，抗体に対するプロテインＡおよびプロテインＧ、ビオチンに対するアビジン類、カルシウムに対するカルモジュリン、糖に対するレクチンなどが含まれる。これらの中では、捕捉体は、抗体であることが好ましい。また、被検出物質が核酸である場合は、捕捉体は、被検出物質である核酸と特異的に結合しうる配列を有する核酸であってもよい。
　捕捉体をＳＡＭまたは親水性高分子層に固定化する方法は、捕捉体の捕捉能を失わせない方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、ＥＤＣを単独で使用すること、またはＥＤＣとＮＨＳとを併用することによって、ＳＡＭまたは親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、ＳＡＭまたは親水性高分子の活性化したカルボキシル基を捕捉体が有するアミノ基と反応させればよい。
　固定化膜１３０の平面視形状は、特に限定されない。固定化膜１３０の形状の例には、円、多角形などが含まれる。また、固定化膜１３０の数も限定されない。固定化膜１３０の数は、１つであってもよいし（図１Ａ参照）、複数であってもよい（図２Ａおよび図２Ｂ参照）。また、固定化膜１３０が複数の場合、各固定化膜１３０の形状および大きさは、同一であってもよいし（図２Ａ参照）、互いに異なっていてもよい（図２Ｂ参照）。
　流路蓋（不図示）は、金属膜１２０上に配置されている。金属膜１２０が基板１１０の成膜面１１２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋は、成膜面１１２上に配置されていてもよい。流路蓋の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋は、金属膜１２０（および基板１１０）と共に、液体が流れる微細流路を形成する。液体の例には、被検出物質を含む検体（例えば、全血、血漿、血清またはこれらの希釈液）や、蛍光物質で標識された捕捉体（例えば、蛍光標識された２次抗体）を含む標識液、洗浄液などが含まれる。固定化膜１３０は、全面が微細流路内に露出している。微細流路の両端は、流路蓋の上面に形成された注入口および排出口とそれぞれ接続されている。微細流路内へ液体が注入されると、液体は固定化膜１３０に接触する。
　流路蓋の材料は、微細流路内に流す液体に対して安定な材料であれば特に限定されない。しかしながら、本実施の形態に係る検出チップ１００をＳＰＦＳで使用する場合は、流路蓋の材料は、検出する蛍光に対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋の材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜１２０または基板１１０に接合される。
　２．検出チップの製造方法
　次に、本実施の形態に係る検出チップ１００の製造方法について、図３を参照して説明する。
　本実施の形態に係る検出チップの製造方法は、（１）金属膜１２０を配置されている基板１１０を準備する第１工程と、（２）シール部材を金属膜１２０に押し付ける第２工程と、（３）シール部材の貫通孔に捕捉体を含む液体を提供して、金属膜１２０上に固定化膜１３０を形成する第３工程と、を含む。この後、任意の工程として、（４）流路蓋を金属膜１２０または基板１１０に接合する第４工程を行ってもよい。
　（１）第１工程
　第１工程では、その表面に金属膜１２０を配置されている、前述の基板１１０を準備する。前述のとおり、金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、電子ビーム加熱真空蒸着法や抵抗加熱真空蒸着法、マグネトロンスパッタ法、プラズマ支援スパッタ法、イオンアシスト蒸着法、イオンプレーティング法などの真空成膜法が含まれる。また、その表面に金属膜１２０を配置されている基板１１０を購入してもよい。
　（２）第２工程
　第２工程では、金属膜１２０に、１または２以上の貫通孔２１１を有するシール部材２１０を押し付ける。図３Ａは、金属膜１２０上にシール部材２１０を載せた様子を示す図である。図３Ｂは、シール部材２１０に押圧を加えて、金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けた様子を示す図である。
　シール部材２１０は、弾性体からなり、固定化膜１３０を形成するための１または２以上の貫通孔２１１を有する。シール部材２１０を構成する弾性体のゴム硬度（ＪＩＳ Ｋ ６２５３；ＩＳＯ １８５１７）は、特に限定されないが、使いやすさの観点からはＡ５０～Ａ８０の範囲内であることが好ましく、Ａ５５～Ａ６５の範囲内であることがより好ましい。また、貫通孔２１１に試薬などを注入されるため、シール部材２１０を構成する弾性体は、耐薬品性に優れるものが好ましく、具体的にはアルコールまたはアルカリに浸漬させた時の体積変化が１０％未満であるものが好ましい。このような弾性体の例には、フッ素ゴムおよびシリコーンゴムが含まれる。
　シール部材２１０の貫通孔２１１は、形成される固定化膜１３０の外周縁に対応する。したがって、通常は、貫通孔２１１の開口部の数、形状および大きさは、形成する固定化膜１３０の数、形状および大きさと一致する。たとえば、図３Ａおよび図３Ｂに示されるシール部材２１０は、図２Ｂに示される検出チップ１００を製造するためのものであり、３つの貫通孔２１１を有する。各貫通孔２１１の形状は、円柱形状である。また、各貫通孔２１１の金属膜側の開口部の面積は、互いに異なっている。図３Ａおよび図３Ｂでは、一番左側に図示されている貫通孔２１１の開口部が一番小さい。
　シール部材２１０の形状は、固定化膜１３０を高精度に形成するために、以下の式（１）を満たすように設定される。以下の式（１）において、Ａ１は、金属膜１２０にシール部材２１０を載せた時（金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けていない時）の、金属膜１２０とシール部材２１０とが接触する面積（ｍｍ２）である（図３Ａ参照）。Ａ２は、金属膜１２０にシール部材２１０を載せた時（金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けていない時）の、金属膜１２０側の開口面積が最小の貫通孔２１１の開口面積（ｍｍ２）である（図３Ａ参照）。
　０.１５≦Ａ１／Ａ２≦６.５　…（１）
　Ａ１／Ａ２が０.１５未満の場合、金属膜１２０とシール部材２１０との接触面積が小さすぎるため、貫通孔２１１内に液体を注入したときに、液漏れが生じてしまい、固定化膜１３０の形状が変わってしまう。仮に、液漏れが生じないようにシール部材２１０に大きな押圧を加えたとしても、貫通孔２１１の開口部周辺の形状が変化してしまい、固定化膜１３の形状も変わってしまう。一方、Ａ１／Ａ２が６.５超の場合、この後説明する式（２）においてΔＴ／Ｔが下限値（０.０５）以上となるようにすると、金属膜１２０とシール部材２１０との接触面積が大きいため、シール部材を基板に押し付ける押圧力が大きくなって、金属膜１２０に損傷（例えばクラック）が形成されたり、基板１１０の複屈折特性が変化したりしてしまう。式（２）においてΔＴ／Ｔが上限値を超えると、さらに金属膜１２０に損傷が形成されたり、基板１１０の複屈折特性が変化したりしてしまう。
　金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けていない時の、貫通孔２１１の金属膜１２０側の開口縁の曲率半径は、特に限定されないが、固定化膜１３０を高精度に形成する観点からは、０.１以下であることが好ましく、０.０３以下であることがより好ましい。また、貫通孔２１１の金属膜１２０側の開口縁の曲率半径は、特に限定されないが、開口縁の欠損を防ぐ観点からは、０.０１以上であることが好ましい。
　シール部材２１０の作製方法は、特に限定されない。たとえば、シール部材２１０の形状の精度および加工自由度を考慮して、シール部材２１０は、金型を使用したプレス加工成形により作製されうる。
　金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けるときには、以下の式（２）を満たすように、押圧力が設定される。以下の式（２）において、Ｔは、金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けていない時の、シール部材２１０の押圧方向（貫通孔２１１の深さ方向）の厚み（ｍｍ）である（図３Ａ参照）。ΔＴは、金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けることによる、シール部材２１０の押圧方向の厚みＴの変化量（ｍｍ）である（図３Ｂ参照）。
　０.０５≦ΔＴ／Ｔ≦０.２５　…（２）
　ΔＴ／Ｔが０.０５未満の場合、押圧力が小さすぎるため、貫通孔２１１内に液体を注入したときに、液漏れが生じてしまい、固定化膜１３０の形状が変わってしまう。一方、ΔＴ／Ｔが０.２５超の場合、押圧力が大きすぎるため、金属膜１２０に損傷（例えばクラック）が形成されたり、基板１１０の複屈折特性が変化したりしてしまう。また、押圧力が大きすぎるため、貫通孔２１１の開口部周辺の形状が変化してしまい、固定化膜１３の形状も変わってしまう。
　金属膜１２０にシール部材２１０を押し付ける方法は、特に限定されない。たとえば、図４Ａに示されるように、第１押圧部材３１０および第２押圧部材３２０を使用して、金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けてもよい。この場合、ボルトによる締め付けなどにより第１押圧部材３１０および第２押圧部材３２０に力を加えることで、金属膜１２０にシール部材２１０を押し付けることができる（図１４Ｂおよび図１５Ｂ参照）。
　第１押圧部材３１０および第２押圧部材３２０の材料は、特に限定されず、例えば金属、樹脂または弾性体である。これらの中でも、耐変形および耐薬品の観点からは、第１押圧部材３１０および第２押圧部材３２０の材料は、ステンレス鋼が好ましい。上側（シール部材２１０側）に位置する第１押圧部材３１０には、シール部材２１０の各貫通孔２１１に対応する貫通孔３１１が形成されている。第１押圧部材３１０には、さらに試薬などを貯留するための液貯留部が形成されていてもよい。また、貫通孔３１１が液貯留部として機能してもよい。
　固定化膜１３０の形状の精度だけでなく位置の精度も要求される場合は、基板１１０および金属膜１２０と、第１押圧部材３１０との位置を合わせるための治具をさらに使用してもよい。たとえば、第１押圧部材３１０に、基板１１０を位置決めするためのピンが固定されていてもよい（図１２Ｃおよび図１３Ｃ参照）。このように第１押圧部材３１０に基板１１０を位置決めする場合は、シール部材２１０は、第１押圧部材３１０に固定されることが好ましい。たとえば、図４Ｂおよび図１２Ｂに示されるように、第１押圧部材３１０の基板１１０側の面において貫通孔３１１の周囲にシール部材２１０を嵌め込むための円環状の凹部を形成し、この凹部にシール部材２１０を嵌め込むことで、シール部材２１０は第１押圧部材３１０に固定されうる。この場合、押圧部材３１０に形成された環状の凹部の外形と、対応するシール部材２１０の貫通孔２１１の内径の差は、±２０μｍの範囲内が好ましい。すなわち、シール部材２１０が少し広がりながら凹部に嵌るか、または少し余裕がある状態で凹部に嵌る状態が好ましい。
　（３）第３工程
　第３工程では、上記の式（２）を満たすようにシール部材２１０を押し付けている状態で、シール部材２１０の貫通孔２１１に捕捉体を含む液体２２０を注入して、金属膜１２０上に固定化膜１３０を形成する。すなわち、金属膜１２０上の所定の領域に、捕捉体を固定化する。
　捕捉体を含む液体２２０の注入方法は、金属膜１２０に損傷を形成しなければ、特に限定されない。たとえば、ディスペンサーなどを用いて自動で注入してもよいし、ピペットを用いて手動で注入してもよい。
　たとえば、前述のＳＡＭ、親水性高分子層および捕捉体を含む固定化膜１３０を形成する場合は、以下の手順（工程３（ａ）～（ｄ））により固定化膜１３０を形成すればよい。
　工程３（ａ）
　まず、金属膜１２０上にＳＡＭを形成する。第１押圧部材３１０の貫通孔３１１およびシール部材２１０の貫通孔２１１に、１０－カルボキシ－１－デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液を１ｍＬ注入し、１時間静置して、金属膜１２０上にＳＡＭを形成する。その後、貫通孔３１１および貫通孔２１１内の液体を除去し、エタノールおよびイソプロパノールでＳＡＭを洗浄した後、エアガンで乾燥させる。
　工程３（ｂ）
　次いで、ＳＡＭ上にカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）からなる親水性高分子層を形成する。１ｍｇ／ｍＬのＣＭＤおよび１０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭの２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝生理食塩水（ｐＨ６.０）１ｍＬに、最終濃度がそれぞれ０.５ｍＭになるように水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を混合する。その後、貫通孔３１１および貫通孔２１１内に露出したＳＡＭ上に混合液を滴下し、室温で１.５時間反応させて、親水性高分子層を形成する。その後、貫通孔３１１および貫通孔２１１内の混合液に１ＮのＮａＯＨ水溶液０.８ｍＬを添加し、３０分間反応させた後、貫通孔３１１および貫通孔２１１内の液体を除去し、超純水０.８ｍＬで親水性高分子層を３回洗浄する。
　工程３（ｃ）
　次いで、親水性高分子層上に捕捉体を固定化する。貫通孔３１１および貫通孔２１１内に露出した親水性高分子層上に、２５ｍｇ／ｍＬのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および２５ｍｇ／ｍＬの水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）を含むＭＥＳ緩衝生理食塩水（ｐＨ６.０）を０.２ｍＬ注入し、２０分間反応させる。貫通孔３１１および貫通孔２１１内の液体を除去した後、捕捉体としての抗体を含む酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）０.２ｍＬを注入し、３０分間反応させることで、親水性高分子層上に捕捉体を固定化する。貫通孔３１１および貫通孔２１１内の液体を除去した後、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.４）０.２ｍＬを注入し、１５分間反応させることで、未反応の活性化エステル基を不活性化する。
　工程３（ｄ）
　工程３（ａ）～（ｃ）により形成された固定化膜１３０を傷付けないよう貫通孔３１１および貫通孔２１１内の液体を除去した後、貫通孔３１１および貫通孔２１１内に露出した固定化膜１３０をエアガンで乾燥させる。その後、シール部材２１０、第１押圧部材３１０および第２押圧部材３２０を取り外す。
　以上の手順により、検出チップ１００を製造することができる。この後、任意の工程として、流路蓋を金属膜１２０または基板１１０に接合する第４工程を行ってもよい。たとえば、第４工程では、樹脂からなる流路蓋が、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜１２０または基板１１０に接合される。
　以上のように、本実施の形態に係る検出チップ１００の製造方法によれば、上記の式（１）を満たすシール部材２１０を、式（２）を満たすように金属膜１２０に押し付けている状態で、シール部材２１０の貫通孔２１１に捕捉体を含む液体を提供して、金属膜１２０上に固定化膜１３０を形成する。これにより、金属膜１２０に損傷を形成することなく、かつ基板１１０の複屈折特性を変化させることなく、金属膜１２０上の所定の領域に固定化膜１３０を高精度に形成することができる。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
　（１）基板の準備
　シクロオレフィンポリマー樹脂（ＺＥＯＮＥＸ；日本ゼオン株式会社）を用いて、断面形状が略台形の基板（プリズム）を作製した。基板の成膜面（２０ｍｍ×１０ｍｍ）上に、スパッタリング法により膜厚３２～５２ｎｍの金薄膜を形成した。
　（２）シール部材の準備
　表１に示される７種類（Ｎｏ.１～７）のシール部材を準備した。各シール部材は、フッ素ゴム（ゴム硬度Ａ６０）またはシリコーンゴム（ゴム硬度Ａ５０）から、金型を用いたプレス成形により作製した。表１において、Ａ１は、平坦な金薄膜にシール部材を載せた時（金薄膜にシール部材を押し付けていない時）の、金薄膜とシール部材との接触面積（ｍｍ２）である。Ａ２は、平坦な金薄膜にシール部材を載せた時（金薄膜にシール部材を押し付けていない時）の、金薄膜側の開口面積が最小の貫通孔の開口面積（ｍｍ２）である。Ｔは、シール部材に力を加えていない時の、シール部材の厚み（ｍｍ）である。
　図５Ａ～Ｃは、Ｎｏ.１に係るシール部材の構成を示す図である。図５Ａは斜視図であり、図５Ｂは平面図であり、図５Ｃは断面図である。これらの図では、金薄膜と接触する部分を上側に図示している（図６～１０でも同様である）。図５Ｂでは、Ａ１に対応する領域にハッチングを付している。Ｎｏ.１に係るシール部材は、直径３.６ｍｍの円柱形状の貫通孔（開口面積：１０.１７ｍｍ２）を１つ有し、貫通孔の外周部分（面積：１.７５ｍｍ２）のみが金薄膜に接触する。貫通孔の開口縁（図５ＣにおいてＲで示す）の曲率半径は、０.０１未満である。
　図６Ａ～Ｃは、Ｎｏ.２に係るシール部材の構成を示す図である。図６Ａは斜視図であり、図６Ｂは平面図であり、図６Ｃは断面図である。図６Ｂでは、Ａ１に対応する領域にハッチングを付している。Ｎｏ.２に係るシール部材は、直径２.４ｍｍの円柱形状の貫通孔（開口面積：４.５２ｍｍ２）を１つ有し、貫通孔の外周部分（面積：３.５２ｍｍ２）のみが金薄膜に接触する。貫通孔の開口縁（図６ＣにおいてＲで示す）の曲率半径は、０.０１未満である。
　図７Ａ～Ｃは、Ｎｏ.３に係るシール部材の構成を示す図である。図７Ａは斜視図であり、図７Ｂは平面図であり、図７Ｃは断面図である。図７Ｂでは、Ａ１に対応する領域にハッチングを付している。Ｎｏ.３に係るシール部材は、直径３.６ｍｍの円柱形状の貫通孔（開口面積：１０.１７ｍｍ２）を３つ有し、各貫通孔の外周部分（合計面積：１５.０７ｍｍ２）のみが金薄膜に接触する。各貫通孔の開口縁（図７ＣにおいてＲで示す）の曲率半径は、０.０１未満である。
　図８Ａ～Ｃは、Ｎｏ.４に係るシール部材の構成を示す図である。図８Ａは斜視図であり、図８Ｂは平面図であり、図８Ｃは断面図である。図８Ｂでは、Ａ１に対応する領域にハッチングを付している。Ｎｏ.４に係るシール部材は、直径３.６ｍｍの円柱形状の貫通孔（開口面積：１０.１７ｍｍ２）を３つ有し、金薄膜に対向する面の全体（面積：６４.４０ｍｍ２）が金薄膜に接触する。各貫通孔の開口縁（図８ＣにおいてＲで示す）の曲率半径は、０.０１未満である。
　図９Ａ～Ｃは、Ｎｏ.５に係るシール部材の構成を示す図である。図９Ａは斜視図であり、図９Ｂは平面図であり、図９Ｃは断面図である。図９Ｂでは、Ａ１に対応する領域にハッチングを付している。Ｎｏ.５に係るシール部材は、直径２.４ｍｍの円柱形状の貫通孔（開口面積：４.５２ｍｍ２）を３つ有し、金薄膜に対向する面の全体（面積：８１.３６ｍｍ２）が金薄膜に接触する。各貫通孔の開口縁（図９ＣにおいてＲで示す）の曲率半径は、０.０１未満である。
　図１０Ａ～Ｃは、Ｎｏ.６に係るシール部材の構成を示す図である。図１０Ａは斜視図であり、図１０Ｂは平面図であり、図１０Ｃは断面図である。図１０Ｂでは、Ａ１に対応する領域にハッチングを付している。Ｎｏ.６に係るシール部材は、直径３.６ｍｍの円柱形状の貫通孔（開口面積：１０.１７ｍｍ２）を１つ有し、貫通孔の外周部分（面積：０.５０ｍｍ２）のみが金薄膜に接触する。貫通孔の開口縁（図１０ＣにおいてＲで示す）の曲率半径は、０.０１未満である。
　図１１Ａ～Ｃは、Ｎｏ.７に係るシール部材の構成を示す図である。図１１Ａは斜視図であり、図１１Ｂは平面図であり、図１１Ｃは断面図である。図１１Ｂでは、Ａ１に対応する領域にハッチングを付している。Ｎｏ.７に係るシール部材は、直径２.０ｍｍの円柱形状の貫通孔（開口面積：３.１４ｍｍ２）を３つ有し、各貫通孔の外周部分（合計面積：２４.６ｍｍ２）のみが金薄膜に接触する。貫通孔の開口縁（図１１ＣにおいてＲで示す）の曲率半径は、０.０１未満である。
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　（３）固定化膜の形成
　図１２Ａは、１つの貫通孔を有するシール部材（Ｎｏ.１，２，６に係るシール部材）を固定した第１押圧部材の平面図（基板側の面の図）であり、図１２Ｂは、図１２Ａに示されるＡ－Ａ線における部分拡大断面図であり、図１２Ｃは、図１２Ａに示される第１押圧部材上に基板を配置した様子を示す平面図である。図１３Ａは、３つの貫通孔を有するシール部材（Ｎｏ.３～５，７に係るシール部材）を固定した第１押圧部材の平面図（基板側の面の図）であり、図１３Ｂは、図１３Ａに示されるＡ－Ａ線における部分拡大断面図であり、図１３Ｃは、図１３Ａに示される第１押圧部材上に基板を配置した様子を示す平面図である。
　図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３Ａおよび図１３Ｂに示されるように、Ｎｏ.１～７に係るシール部材２１０をステンレス鋼からなる第１押圧部材３１０の基板側の面（図では上面）に固定した。第１押圧部材３１０の貫通孔３１１はシール部材２１０の貫通孔２１１と連通しており、液貯留部としても機能する。シール部材２１０の周囲には、基板１１０を固定するための６つのピン３１２を配置した。６つのピン３１２は、それぞれ第１押圧部材３１０に形成された６つのピン圧入孔３１３（図１４Ａおよび図１５Ａ参照）内に圧入することで第１押圧部材３１０に固定した。次いで、図１３Ｃおよび図１４Ｃに示されるように、シール部材２１０上に金薄膜を形成された基板１１０を載置した。
　さらに、基板１１０を、第１押圧部材３１０とステンレス鋼からなる第２押圧部材３２０とで挟み込んだ。図１４Ａは、１つの貫通孔を有するシール部材（Ｎｏ.１，２，６に係るシール部材）を固定した第１押圧部材と第２押圧部材とを組み合わせた様子を示す斜視図であり、図１４Ｂは、図１４Ａに示される構造体の基板の短軸方向に沿う断面図であり、図１４Ｃは、図１４Ａに示される構造体の基板の長軸方向に沿う断面図である。図１５Ａは、３つの貫通孔を有するシール部材（Ｎｏ.３～５，７に係るシール部材）を固定した第１押圧部材と第２押圧部材とを組み合わせた様子を示す斜視図であり、図１５Ｂは、図１５Ａに示される構造体の基板の短軸方向に沿う断面図であり、図１５Ｃは、図１５Ａに示される構造体の基板の長軸方向に沿う断面図である。これらの図に示されるように、基板１１０を挟むように配置された第１押圧部材３１０と第２押圧部材３２０とをボルト３１４で締めつけることで、シール部材２１０を所定の圧力で基板１１０の金薄膜に押し付けた。この状態でシール部材２１０の厚みの変化値ΔＴ（ｍｍ）を測定した。また、以下の手順（工程３（ａ）～（ｄ））により、金薄膜上に固定化膜を形成して、検出チップを作製した。各実施例および各比較例について、同じ工程を６回繰り返して、６個の検出チップを作製した。
　工程３（ａ）
　第１押圧部材３１０の貫通孔３１１およびシール部材２１０の貫通孔２１１に、ピペッターを用いて１０－カルボキシ－１－デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液を１ｍＬ注入し、１時間静置して、金薄膜上にＳＡＭを形成した。その後、貫通孔２１１，３１１内の液体を除去し、エタノールおよびイソプロパノールでＳＡＭを洗浄した後、エアガンで乾燥させた。
　工程３（ｂ）
　次いで、１ｍｇ／ｍＬのＣＭＤ（ＣＭＤ－５００－０６Ｉ４；名糖産業株式会社：平均分子量５０万，置換度０.５１）および１０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭの２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝生理食塩水（ｐＨ６.０）１ｍＬに、最終濃度がそれぞれ０.５ｍＭになるように水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）をピペッターで添加し、さらにピペッターを用いて数回撹拌した。その直後に、シール部材２１０の貫通孔２１１内に露出したＳＡＭ上にピペッターを用いて混合液を滴下し、室温で１.５時間反応させて、親水性高分子層を形成した。その後、貫通孔２１１，３１１内の混合液に１ＮのＮａＯＨ水溶液０.８ｍＬを添加し、３０分間反応させた後、貫通孔２１１，３１１内の液体を除去し、超純水０.８ｍＬで親水性高分子層を３回洗浄した。
　工程３（ｃ）
　次いで、シール部材２１０の貫通孔２１１内に露出した親水性高分子層上に、２５ｍｇ／ｍＬのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および２５ｍｇ／ｍＬの水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）を含むＭＥＳ緩衝生理食塩水（ｐＨ６.０）をピペッターを用いて０.２ｍＬ注入し、２０分間反応させた。貫通孔２１１，３１１内の液体を除去した後、抗トロポニンＩ（ＴｎＩ）モノクローナル抗体を含む酢酸緩衝液（ｐＨ６.０）０.２ｍＬを注入し、３０分間反応させることで、親水性高分子層上に抗ＴｎＩ抗体を固定化した。貫通孔２１１，３１１内の液体を除去した後、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.４）０.２ｍＬをピペッターを用いて注入し、１５分間反応させることで、未反応の活性化エステル基を不活性化した。
　工程３（ｄ）
　最後に、上記工程３（ａ）～（ｃ）により形成された固定化膜を傷付けないよう貫通孔２１１，３１１内の液体を除去した後、シール部材２１０の貫通孔２１１内に露出した固定化膜をエアガンで乾燥させた。その後、シール部材２１０、第１押圧部材３１０および第２押圧部材３２０を取り外した。
　（４）評価
　各実施例および各比較例について、シール部材からの液漏れの発生の有無、固定化膜の面積の変化、金薄膜の損傷の有無、および基板の複屈折の変化を評価した。評価結果を表２に示す。
　シール部材からの液漏れの発生の有無は、固定化膜を形成した後に固定化膜およびその周辺を顕微鏡および画像測定機で観察することで確認した。各実施例および各比較例について、液漏れが発生している検出チップが１つもない場合は「○」、液漏れが発生している検出チップが１つでもある場合は「×」と評価した。
　固定化膜の面積の変化の評価は、各検出チップの固定化膜の面積を画像測定機による画像解析により算出することで行った。各実施例および各比較例について、作製した６個すべての検出チップにおいて固定化膜の面積が対応するシール部材の貫通孔の開口面積から±１０％の範囲内に入っている場合は「○」、いずれかの検出チップにおいて固定化膜の面積が対応するシール部材の貫通孔の開口面積から±１０％の範囲内に入っていない場合は「×」と評価した。
　金薄膜の損傷の有無は、固定化膜を形成した後に金薄膜を顕微鏡および画像測定機で観察することで確認した。各実施例および各比較例について、金薄膜に損傷が形成されている検出チップが１つもない場合は「○」、金薄膜に損傷が形成されている検出チップが１つでもある場合は「×」と評価した。
　基板の複屈折の変化の評価は、固定化膜を形成する前後の基板を偏光顕微鏡で観察することで確認した。各実施例および各比較例について、基板の複屈折が変化している検出チップが１つもない場合は「○」、基板の複屈折が変化している検出チップが１つでもある場合は「×」と評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示されるように、Ａ１／Ａ２が０.１５未満の表１に記載のＮｏ.６のシール部材を使用した場合は、シール部材と金薄膜の接触面積が小さすぎ、貫通孔内の液体を適切にシールすることができないため、固定化膜の面積変化が大きかった（比較例３，４）。特に、Ｎｏ.６のシール部材をΔＴ／Ｔが０.０５となるように金薄膜に押し付けた場合は、液漏れが発生してしまった。一方、Ａ１／Ａ２が６.５超の表１に記載のＮｏ.５またはＮｏ.７のシール部材を、ΔＴ／Ｔが０.０５以上で０.２５以下となるように金薄膜に押し付けた場合は、押圧力が大きくなってしまい、金薄膜に損傷が形成されるか、または基板に複屈折の変化が生じてしまった（比較例１，２，８，９）。また、Ｎｏ.５のシール部材をΔＴ／Ｔが０.０５未満となるように金薄膜に押し付けた場合は、金薄膜に損傷が形成されるだけでなく、貫通孔内の液体を適切にシールすることができないため、液漏れが発生してしまった（比較例５）。また、Ｎｏ.５のシール部材を金薄膜に押し付けた場合は、Ａ１／Ａ２が８超のため、複屈折変化が生じてしまった。（比較例１，２，５）。
　また、Ａ１／Ａ２が０.１５以上で６.５以下の表１に記載のＮｏ.１のシール部材を、ΔＴ／Ｔが０.２５超となるように金薄膜に押し付けた場合は、押圧力が大きくなってしまい、金薄膜に損傷が形成され、かつ固定化膜の面積変化が大きかった（比較例６）。また、Ａ１／Ａ２が０.１５以上で６.５以下の表１に記載のＮｏ.４のシール部材を、ΔＴ／Ｔが０.０５未満となるように金薄膜に押し付けた場合は、押圧力が小さすぎ、貫通孔内の液体を適切にシールすることができないため、液漏れが発生してしまった（比較例７）。
　これに対し、Ａ１／Ａ２が０.１５以上で６.５以下のＮｏ.１～４のシール部材を、ΔＴ／Ｔが０.０５以上で０.２５以下となるように金薄膜に押し付けた場合は、金薄膜に損傷を形成することなく、かつ基板の複屈折を変化させることなく、固定化膜を高精度に形成することができた。
　以上の結果から、Ａ１／Ａ２が０.１５以上で６.５以下のシール部材を、ΔＴ／Ｔが０.０５以上で０.２５以下となるように金薄膜に押し付けた状態で固定化膜を形成することで、金薄膜に損傷を形成することなく、かつ基板の複屈折を変化させることなく、固定化膜を高精度に形成できることがわかる。
　本出願は、２０１４年６月２日出願の特願２０１４－１１３８９３に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る製造方法により製造された検出チップは、例えば臨床検査などに有用である。
　１００　検出チップ
　１１０　基板
　１１１　入射面
　１１２　成膜面
　１１３　出射面
　１２０　金属膜
　１３０　固定化膜
　２１０　シール部材
　２１１　貫通孔
　２２０　捕捉体を含む液体
　３１０　第１押圧部材
　３１１　貫通孔
　３１２　ピン
　３１３　ピン圧入孔
　３１４　ボルト
　３２０　第２押圧部材

Claims (5)

  1. 　表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップの製造方法であって、
    　その表面に表面プラズモン共鳴を発生させるための金属膜を配置されている、誘電体からなる基板を準備する工程と、
    　前記金属膜に、１または２以上の貫通孔を有し、かつ弾性体からなるシール部材を、以下の式（１）および式（２）を満たすように押し付ける工程と、
    　前記貫通孔に捕捉体を含む液体を提供して、前記金属膜上に前記捕捉体を固定化する工程と、
    　を含む、検出チップの製造方法。
    　０.１５≦Ａ１／Ａ２≦６.５　…（１）
    　０.０５≦ΔＴ／Ｔ≦０.２５　…（２）
    　［上記式（１）および（２）において、Ａ１は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜と前記シール部材が接触する面積（ｍｍ２）である。Ａ２は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜側の開口面積が最小の前記貫通孔の開口面積（ｍｍ２）である。Ｔは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記シール部材の押圧方向の厚み（ｍｍ）である。ΔＴは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けることによる、前記シール部材の押圧方向の厚みＴの変化量（ｍｍ）である。］
  2. 　前記弾性体のゴム硬度（ＪＩＳ Ｋ ６２５３）は、Ａ５０～Ａ８０の範囲内である、請求項１に記載の検出チップの製造方法。
  3. 　前記弾性体は、フッ素ゴムまたはシリコーンゴムである、請求項１または請求項２に記載の検出チップの製造方法。
  4. 　前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記貫通孔の前記金属膜側の開口縁の曲率半径は、０.１ｍｍ以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
  5. 　前記シール部材は、金属、樹脂または弾性体からなる押圧部材に固定された状態で、前記金属膜に押し付けられる、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
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