JPWO2015186684A1 - 検出チップの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
0.15≦A1/A2≦6.5 …(1)
0.05≦ΔT/T≦0.25 …(2)
[上記式(1)および(2)において、A1は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜と前記シール部材が接触する面積(mm2)である。A2は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜側の開口面積が最小の前記貫通孔の開口面積(mm2)である。Tは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記シール部材の押圧方向の厚み(mm)である。ΔTは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けることによる、前記シール部材の押圧方向の厚みTの変化量(mm)である。]
図1および図2は、本発明の一実施の形態に係る製造方法により製造されうる検出チップの例を示す図である。図1Aは、固定化膜を1つ有する検出チップの例を示す斜視図であり、図1Bは、図1Aに示される検出チップの断面図である。図2Aは、同じサイズの固定化膜を3つ有する検出チップの例を示す斜視図であり、図2Bは、互いに異なるサイズの固定化膜を3つ有する検出チップの例を示す斜視図である。
基板110は、入射光に対して透明な誘電体からなる。基板110は、入射面111、成膜面112および出射面113を有し、プリズムとして機能する(図1B参照)。入射面111は、SPRを発生させるための光を基板110の内部に入射させる。成膜面112上には、金属膜120が形成されている。基板110の内部に入射した光は、金属膜120の裏面(基板110と金属膜120との界面)で反射する。出射面113は、反射光を基板110の外部に出射させる。
金属膜120は、基板110の成膜面112上に配置されている。これにより、成膜面112に全反射条件で入射した光の光子と、金属膜120中の自由電子との間で相互作用(SPR)が生じ、金属膜120の表面上に局在場光(一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる)を生じさせることができる。
固定化膜130は、被検出物質を捕捉するための捕捉体を含み、金属膜120の基板110と対向しない面上の所定の領域に形成されている。すなわち、捕捉体は、金属膜120の所定の領域に固定化されている。このように捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。
自己組織化単分子膜(SAM)は、金属膜120上に配置されており、金属膜120に捕捉体または親水性高分子を固定するための土台としての役割を有する。SAMを構成する単分子としては、通常、炭素原子数4〜20程度のカルボキシアルカンチオールが使用され、特に好ましくは10−カルボキシ−1−デカンチオールが使用される。それを用いて形成されたSAMの光学的な影響が少ない(透明性が高く、屈折率が低くかつ膜厚が薄い)ことから、炭素原子数4〜20のカルボキシアルカンチオールは、SAMを構成する単分子として好ましい。これらのカルボキシアルカンチオールは、例えば、株式会社同仁化学研究所やシグマアルドリッチジャパン株式会社などから入手可能である。
親水性高分子層は、SAMと捕捉体との結合を介在しうるように形成されることが好ましい。親水性高分子層を構成する親水性高分子は、多糖類としてはカルボキシメチルデキストラン(CMD)などのデキストランが好ましく、樹脂としてはポリアクリル酸が好ましい。これらの高分子は、水酸基(−OH)およびカルボキシル基(−COOH)を有しており、水素結合による水分子の内包により非特異的タンパク質の吸着を防ぐことができる。
捕捉体の種類は、被検出物質を特異的に捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質と特異的に結合するタンパク質である。そのようなタンパク質の例には、抗原に対する抗体、基質または補酵素に対する酵素、ホルモンに対する受容体,抗体に対するプロテインAおよびプロテインG、ビオチンに対するアビジン類、カルシウムに対するカルモジュリン、糖に対するレクチンなどが含まれる。これらの中では、捕捉体は、抗体であることが好ましい。また、被検出物質が核酸である場合は、捕捉体は、被検出物質である核酸と特異的に結合しうる配列を有する核酸であってもよい。
次に、本実施の形態に係る検出チップ100の製造方法について、図3を参照して説明する。
第1工程では、その表面に金属膜120を配置されている、前述の基板110を準備する。前述のとおり、金属膜120の形成方法は、特に限定されない。金属膜120の形成方法の例には、電子ビーム加熱真空蒸着法や抵抗加熱真空蒸着法、マグネトロンスパッタ法、プラズマ支援スパッタ法、イオンアシスト蒸着法、イオンプレーティング法などの真空成膜法が含まれる。また、その表面に金属膜120を配置されている基板110を購入してもよい。
第2工程では、金属膜120に、1または2以上の貫通孔211を有するシール部材210を押し付ける。図3Aは、金属膜120上にシール部材210を載せた様子を示す図である。図3Bは、シール部材210に押圧を加えて、金属膜120にシール部材210を押し付けた様子を示す図である。
0.15≦A1/A2≦6.5 …(1)
0.05≦ΔT/T≦0.25 …(2)
第3工程では、上記の式(2)を満たすようにシール部材210を押し付けている状態で、シール部材210の貫通孔211に捕捉体を含む液体220を注入して、金属膜120上に固定化膜130を形成する。すなわち、金属膜120上の所定の領域に、捕捉体を固定化する。
まず、金属膜120上にSAMを形成する。第1押圧部材310の貫通孔311およびシール部材210の貫通孔211に、10−カルボキシ−1−デカンチオールを1mM含むエタノール溶液を1mL注入し、1時間静置して、金属膜120上にSAMを形成する。その後、貫通孔311および貫通孔211内の液体を除去し、エタノールおよびイソプロパノールでSAMを洗浄した後、エアガンで乾燥させる。
次いで、SAM上にカルボキシメチルデキストラン(CMD)からなる親水性高分子層を形成する。1mg/mLのCMDおよび10mMのNaClを含む25mMの2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝生理食塩水(pH6.0)1mLに、最終濃度がそれぞれ0.5mMになるように水溶性カルボジイミド(EDC)およびN−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)を混合する。その後、貫通孔311および貫通孔211内に露出したSAM上に混合液を滴下し、室温で1.5時間反応させて、親水性高分子層を形成する。その後、貫通孔311および貫通孔211内の混合液に1NのNaOH水溶液0.8mLを添加し、30分間反応させた後、貫通孔311および貫通孔211内の液体を除去し、超純水0.8mLで親水性高分子層を3回洗浄する。
次いで、親水性高分子層上に捕捉体を固定化する。貫通孔311および貫通孔211内に露出した親水性高分子層上に、25mg/mLのN−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)および25mg/mLの水溶性カルボジイミド(EDC)を含むMES緩衝生理食塩水(pH6.0)を0.2mL注入し、20分間反応させる。貫通孔311および貫通孔211内の液体を除去した後、捕捉体としての抗体を含む酢酸緩衝液(pH6.0)0.2mLを注入し、30分間反応させることで、親水性高分子層上に捕捉体を固定化する。貫通孔311および貫通孔211内の液体を除去した後、50mMのTris緩衝液(pH7.4)0.2mLを注入し、15分間反応させることで、未反応の活性化エステル基を不活性化する。
工程3(a)〜(c)により形成された固定化膜130を傷付けないよう貫通孔311および貫通孔211内の液体を除去した後、貫通孔311および貫通孔211内に露出した固定化膜130をエアガンで乾燥させる。その後、シール部材210、第1押圧部材310および第2押圧部材320を取り外す。
シクロオレフィンポリマー樹脂(ZEONEX;日本ゼオン株式会社)を用いて、断面形状が略台形の基板(プリズム)を作製した。基板の成膜面(20mm×10mm)上に、スパッタリング法により膜厚32〜52nmの金薄膜を形成した。
表1に示される7種類(No.1〜7)のシール部材を準備した。各シール部材は、フッ素ゴム(ゴム硬度A60)またはシリコーンゴム(ゴム硬度A50)から、金型を用いたプレス成形により作製した。表1において、A1は、平坦な金薄膜にシール部材を載せた時(金薄膜にシール部材を押し付けていない時)の、金薄膜とシール部材との接触面積(mm2)である。A2は、平坦な金薄膜にシール部材を載せた時(金薄膜にシール部材を押し付けていない時)の、金薄膜側の開口面積が最小の貫通孔の開口面積(mm2)である。Tは、シール部材に力を加えていない時の、シール部材の厚み(mm)である。
図12Aは、1つの貫通孔を有するシール部材(No.1,2,6に係るシール部材)を固定した第1押圧部材の平面図(基板側の面の図)であり、図12Bは、図12Aに示されるA−A線における部分拡大断面図であり、図12Cは、図12Aに示される第1押圧部材上に基板を配置した様子を示す平面図である。図13Aは、3つの貫通孔を有するシール部材(No.3〜5,7に係るシール部材)を固定した第1押圧部材の平面図(基板側の面の図)であり、図13Bは、図13Aに示されるA−A線における部分拡大断面図であり、図13Cは、図13Aに示される第1押圧部材上に基板を配置した様子を示す平面図である。
第1押圧部材310の貫通孔311およびシール部材210の貫通孔211に、ピペッターを用いて10−カルボキシ−1−デカンチオールを1mM含むエタノール溶液を1mL注入し、1時間静置して、金薄膜上にSAMを形成した。その後、貫通孔211,311内の液体を除去し、エタノールおよびイソプロパノールでSAMを洗浄した後、エアガンで乾燥させた。
次いで、1mg/mLのCMD(CMD−500−06I4;名糖産業株式会社:平均分子量50万,置換度0.51)および10mMのNaClを含む25mMの2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝生理食塩水(pH6.0)1mLに、最終濃度がそれぞれ0.5mMになるように水溶性カルボジイミド(EDC)およびN−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)をピペッターで添加し、さらにピペッターを用いて数回撹拌した。その直後に、シール部材210の貫通孔211内に露出したSAM上にピペッターを用いて混合液を滴下し、室温で1.5時間反応させて、親水性高分子層を形成した。その後、貫通孔211,311内の混合液に1NのNaOH水溶液0.8mLを添加し、30分間反応させた後、貫通孔211,311内の液体を除去し、超純水0.8mLで親水性高分子層を3回洗浄した。
次いで、シール部材210の貫通孔211内に露出した親水性高分子層上に、25mg/mLのN−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)および25mg/mLの水溶性カルボジイミド(EDC)を含むMES緩衝生理食塩水(pH6.0)をピペッターを用いて0.2mL注入し、20分間反応させた。貫通孔211,311内の液体を除去した後、抗トロポニンI(TnI)モノクローナル抗体を含む酢酸緩衝液(pH6.0)0.2mLを注入し、30分間反応させることで、親水性高分子層上に抗TnI抗体を固定化した。貫通孔211,311内の液体を除去した後、50mMのTris緩衝液(pH7.4)0.2mLをピペッターを用いて注入し、15分間反応させることで、未反応の活性化エステル基を不活性化した。
最後に、上記工程3(a)〜(c)により形成された固定化膜を傷付けないよう貫通孔211,311内の液体を除去した後、シール部材210の貫通孔211内に露出した固定化膜をエアガンで乾燥させた。その後、シール部材210、第1押圧部材310および第2押圧部材320を取り外した。
各実施例および各比較例について、シール部材からの液漏れの発生の有無、固定化膜の面積の変化、金薄膜の損傷の有無、および基板の複屈折の変化を評価した。評価結果を表2に示す。
110 基板
111 入射面
112 成膜面
113 出射面
120 金属膜
130 固定化膜
210 シール部材
211 貫通孔
220 捕捉体を含む液体
310 第1押圧部材
311 貫通孔
312 ピン
313 ピン圧入孔
314 ボルト
320 第2押圧部材
Claims (5)
- 表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するために使用される検出チップの製造方法であって、
その表面に表面プラズモン共鳴を発生させるための金属膜を配置されている、誘電体からなる基板を準備する工程と、
前記金属膜に、1または2以上の貫通孔を有し、かつ弾性体からなるシール部材を、以下の式(1)および式(2)を満たすように押し付ける工程と、
前記貫通孔に捕捉体を含む液体を提供して、前記金属膜上に前記捕捉体を固定化する工程と、
を含む、検出チップの製造方法。
0.15≦A1/A2≦6.5 …(1)
0.05≦ΔT/T≦0.25 …(2)
[上記式(1)および(2)において、A1は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜と前記シール部材が接触する面積(mm2)である。A2は、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記金属膜側の開口面積が最小の前記貫通孔の開口面積(mm2)である。Tは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記シール部材の押圧方向の厚み(mm)である。ΔTは、前記金属膜に前記シール部材を押し付けることによる、前記シール部材の押圧方向の厚みTの変化量(mm)である。] - 前記弾性体のゴム硬度(JIS K 6253)は、A50〜A80の範囲内である、請求項1に記載の検出チップの製造方法。
- 前記弾性体は、フッ素ゴムまたはシリコーンゴムである、請求項1または請求項2に記載の検出チップの製造方法。
- 前記金属膜に前記シール部材を押し付けていない時の、前記貫通孔の前記金属膜側の開口縁の曲率半径は、0.1mm以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
- 前記シール部材は、金属、樹脂または弾性体からなる押圧部材に固定された状態で、前記金属膜に押し付けられる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
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