JPWO2015064223A1 - ヌクレオシド誘導体又はその塩、ヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル又はその塩、ヌクレオシド誘導体の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩、並びにポリヌクレオチド - Google Patents

ヌクレオシド誘導体又はその塩、ヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル又はその塩、ヌクレオシド誘導体の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩、並びにポリヌクレオチド Download PDF

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Abstract

下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）の何れかの式で表されるヌクレオシド誘導体またはその塩。（式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）中、Ｒ１〜Ｒ５、Ａ１〜Ａ３、Ｂ、Ｘ、Ｙ、ｋは請求項１に記載の意味を表す。）

Description

本発明は、新規なヌクレオシド誘導体及びその塩、ヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル及びその塩、ヌクレオシド誘導体の３’−ホスホロアミダイト化物及びその塩、並びにポリヌクレオチドに関し、さらに詳しくは結合親和性に優れた核酸アプタマー、並びに核酸アプタマーを製造するために有用な新規なヌクレオシド誘導体等に関する。
標的物質に特異的に結合する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）アプタマーは、抗体に代わる分子認識が可能な生体物質として、生物工学的応用、薬剤への応用が検討されている。このような核酸アプタマーを得る方法として、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法が知られており、例えばランダムな配列を持った多数の核酸分子の混合物（ライブラリー）を用いてスクリーニングを行うことにより、目的の標的物質に特異的に結合する核酸アプタマーを見出すことができることが知られている。
一方、核酸アプタマーを医薬として利用した例も数々報告されている。例えば特許文献１には、特定の塩基配列を持ったＲＮＡアプタマーの発明が開示されており、ＲＮＡアプタマーがヒラメラブドウイルス（ＨＩＲＲＶ）やウイルスで発現するポリペプチドに特異的に結合し、宿主感染能を抑制する働きをすることが報告されている。
また、特許文献２には、イリノテカンやトポテカン等のカンプトテシン類に対して特異的に結合性する核酸アプタマー（人工核酸分子）の発明が開示されており、チミジン部位（Ｃ５位に結合）に炭素鎖を介してプリン構造を連結した修飾ヌクレオシド構造が優れた結合親和性を発揮することも報告されている。
特開２０１２−２００２０４号公報 特開２０１３−０４０１１８号公報
例えば、ＳＥＬＥＸ法を用いることによって、目的の標的物質に特異的に結合する核酸アプタマーを見出すことができるが、優れた核酸アプタマーを効率よく開発するためには、特許文献２に記載されている修飾ヌクレオシド構造のように、結合親和性に優れる新たな化学構造を見出すこともまた重要である。
即ち、本発明は結合親和性に優れる修飾ヌクレオシド構造を見出し、優れた核酸アプタマーを提供すること、並びに核酸アプタマーを製造するために有用な新規化合物を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プリン構造を連結した修飾ヌクレオシド構造に対して、さらにアミノ基等の窒素原子含有官能基、又はこのような官能基を含んだ炭素鎖を導入することにより、分子内又は分子間相互作用を形成して、結合親和性や標的多様性を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は以下の通りである。
＜１＞ 下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）の何れかの式で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩。
（式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）中、Ｒ1は水素原子（−Ｈ）、フッ素原子（−Ｆ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、又はメルカプト基（−ＳＨ）を、Ｒ2はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ3及びＲ4は水素原子（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＲ5 2）、メルカプト基（−ＳＨ）、又は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を、Ｒ5はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）又は炭素数１〜６の炭化水素基を、Ａ1は分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を、Ａ2及びＡ3はそれぞれ独立に分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１２の２価の炭化水素基を、Ｂは下記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ〜４）の何れかの式で表される塩基構造を、Ｘはそれぞれ独立にイミノ基（−ＮＲ5−）、エーテル基（−Ｏ−）、又はチオエーテル基（−Ｓ−）を、Ｙは水素原子（−Ｈ）、又は窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びハロゲン原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を、並びにｋは１又は２を表す。）

（式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）中、Ｒ6はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）、炭素数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
＜２＞ ＜１＞に記載のヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル又はその塩。
＜３＞ ＜１＞に記載のヌクレオシド誘導体の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩。
＜４＞ ＜２＞に記載の５’−リン酸エステル又はその塩、請求項３に記載の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩、又はこれらに標識物質を導入した標識ヌクレオチド誘導体を含む、ポリヌクレオチド合成用基質溶液。
＜５＞ ＜４＞に記載のポリヌクレオチド合成用基質溶液を含む、ポリヌクレオチド合成用試薬。
＜６＞ ＜２＞に記載の５’−リン酸エステル又はその塩、＜３＞に記載の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩、又はこれらに標識物質を導入した標識ヌクレオチド誘導体を合成用基質として用いることを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
＜７＞ ホスホロチオエート基を導入する工程を含む、＜６＞に記載のポリヌクレオチドの製造方法。
＜８＞ ＜２＞に記載のヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル及び／又はそのホスホロチオエート体を構成単位として含むポリヌクレオチド。
＜９＞ 核酸アプタマーである、＜８＞に記載のポリヌクレオチド。
＜１０＞ ＜８＞又は＜９＞に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドライブラリー。
＜１１＞ ＜１０＞に記載のポリヌクレオチドライブラリーを用いて標的物質結合性ポリヌクレオチドを選択する工程を含む、核酸アプタマーの選択方法。
＜１２＞下記（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーを含む血管内皮細胞増殖因子結合剤。
＜１３＞核酸アプタマーが一本鎖ＤＮＡである、＜１２＞に記載の血管内皮細胞増殖因子結合剤。
＜１４＞核酸アプタマーの長さが１５〜１００塩基である、＜１２＞または＜１３＞に記載の血管内皮細胞増殖因子結合剤。
＜１５＞核酸アプタマーの配列が、配列番号６〜３１、３３〜４０のいずれかの塩基番号２１〜５０の配列、または配列番号３２の塩基番号２１〜４９の配列（これらの配列におけるＴは上記（II）で表される化合物の残基を示す）を含む、＜１２＞〜＜１４＞のいずれかに記載の血管内皮細胞増殖因子結合剤。
＜１６＞下記（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーのライブラリーを用意する工程、およびライブラリーを血管内皮細胞増殖因子と反応させる工程、および血管内皮細胞増殖因子と結合した核酸アプタマーを選択して増幅する工程を含む、血管内皮細胞増殖因子結合剤のセレクション方法。
本発明によれば、結合親和性や標的多様性に優れた核酸アプタマーを提供すること、並びに核酸アプタマーを製造するために有用な新規化合物を提供することができる。また、本発明の５’−リン酸エステル又は３’−ホスホロアミダイト化物を用いてポリヌクレオチドを合成することにより、ＳＥＬＥＸ法によって創製される機能性ＤＮＡの高性能化や遺伝子標識の高密度化、アンチセンス・アンチジーン分子やｓｉＲＮＡへの機能付与等が達成できる。
dUadTP等を導入したポリヌクレオチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である（図面代用写真）。 dUdnTP等を導入したポリヌクレオチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である（図面代用写真）。 dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の２Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の２Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の２Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の２Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果である。 KK10を含むVEGF結合核酸アプタマーの配列を示す図（両端の配列（下線部）はプライマー配列を示し、二重下線部以外のTはKK10残基を示す）。 KK10を含むVEGF結合核酸アプタマーの配列を示す図（両端の配列（下線部）はプライマー配列を示し、二重下線部以外のTはKK10残基を示す）。 アプタマーKK10#36についてのKd値測定の結果を示す図。 アプタマーKK10#38についてのKd値測定の結果を示す図。
本発明のヌクレオシド誘導体及びその塩、ヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル及びその塩、ヌクレオシド誘導体の３’−ホスホロアミダイト化物、及びその塩、並びにポリヌクレオチドを説明するに当たり、具体例を挙げて説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
＜ヌクレオシド誘導体又はその塩＞
本発明の一態様であるヌクレオシド誘導体は、下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）の何れかの式で表されることを特徴とする。なお、かかるヌクレオシド誘導体から得られる塩も本発明の範囲に含まれるものとし、以下、ヌクレオシド誘導体とその塩を含めて「本発明のヌクレオシド誘導体等」と略す場合がある。
（式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）中、Ｒ1は水素原子（−Ｈ）、フッ素原子（−Ｆ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、又はメルカプト基（−ＳＨ）を、Ｒ2はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ3及びＲ4は水素原子（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＲ5 2）、メルカプト基（−ＳＨ）、又は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を、Ｒ5はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）又は炭素数１〜６の炭化水素基を、Ａ1は分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を、Ａ2及びＡ3はそれぞれ独立に分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１２の２価の炭化水素基を、Ｂは下記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ〜４）の何れかの式で表される塩基構造を、Ｘはそれぞれ独立にイミノ基（−ＮＲ5−）、エーテル基（−Ｏ−）、又はチオエーテル基（−Ｓ−）を、Ｙは水素原子（−Ｈ）、又は窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びハロゲン原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を、並びにｋは１又は２を表す。）

（式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）中、Ｒ6はそれぞれ独立に水素原子を、炭素数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
本発明者らは、結合親和性に優れる修飾ヌクレオシド構造を求めて鋭意検討を重ねた結果、特許文献２に記載されているようなプリン構造を連結した修飾ヌクレオシド構造に対して、さらにアミノ基等の窒素原子含有官能基、又はこのような官能基を含んだ炭素鎖を導入することにより、分子内又は分子間相互作用を形成して、結合親和性を向上させることができることを見出したのである。結合親和性に優れる修飾ヌクレオシド構造は、かかる構造を導入した核酸アプタマーの結合親和性や標的多様性を向上させることに繋がるため、本発明のヌクレオシド誘導体等は優れた核酸アプタマーを製造するために有用な化合物になる。
式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）中、Ｒ1は水素原子（−Ｈ）、フッ素原子（−Ｆ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ3）、又はメルカプト基（−ＳＨ）を表しているが、水素原子であること、即ち、ヌクレオシド誘導体等の糖部位は、デオキシリボースであることが好ましい。
Ｒ2はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）又はヒドロキシル基の保護基を表しているが、保護基はヒドロキシル基の保護基として利用されるものであれば特に限定されない。例えばメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のエーテル系保護基；アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基等のアシル系保護基；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリルエーテル系保護基等が挙げられる。
Ｒ3及びＲ4は水素原子（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＲ5 2）、メルカプト基（−ＳＨ）、又は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を表している。なお、「窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい」とは、アミノ基（−ＮＨ2）、ニトロ基（−ＮＯ2）、シアノ基（−ＣＮ）、イソシアネート基（−ＮＣＯ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メルカプト基（−ＳＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ3Ｈ）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオエステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基を炭素骨格の内部又は末端に含んでいてもよいことを意味する。従って、「窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基」としては、例えば−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＨのようなヒドロキシル基を含む炭素数２の炭化水素基、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3のようなエーテル基を炭素骨格の内部に含む炭素数２の炭化水素基、及び−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3のようなエーテル基を炭素骨格の末端に含む炭素数２の炭化水素基等が含まれる。
Ｒ3の炭素数は、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、好ましくは１５以下、より好ましくは１２以下である。Ｒ3は、水素原子（−Ｈ）、アミノ基（−ＮＨ2）、又はアミノ基（−ＮＨ2）、イミノ基（−ＮＲ5−）、エーテル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ5−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、及びチオエステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）からなる群より選択される少なくとも１種を含む炭素数２〜１５の炭化水素基であることが好ましい。Ｒ3の炭化水素基の具体的構造としては、下記式で表されるものが挙げられる。
（上記式中、Ｘはイミノ基（−ＮＲ5−）、エーテル基（−Ｏ−）、又はチオエーテル基（−Ｓ−）を、Ｒ’は炭素数１〜５の炭化水素基を、ａは０〜６の整数を表す。）
Ｒ4の炭素数は、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、好ましくは１５以下、より好ましくは１２以下である。Ｒ4は、ヒドロキシル基、アミノ基、又は窒素原子及び／若しくは酸素原子を含む炭素数２〜１５の炭化水素基であることが好ましい。Ｒ4の炭化水素基の具体的構造としては、下記式で表されるものが挙げられる。
（上記式中、Ｒ’は炭素数１〜５の炭化水素基を、ａは０〜６の整数を表す。）
Ｒ5はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６の炭化水素基を表しているが、Ｒ5の炭素数は、好ましくは５以下、より好ましくは４以下である。
Ａ1は分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を表しているが、Ａ1の炭素数は、好ましくは８以下、より好ましくは６以下である。Ａ1としては、エチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）、イソプロピレン基（−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−）、イソプロピレニレン基（−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）−）、ｎ−ブチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ｎ−ブタンジエニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−）等が挙げられる。
Ａ2及びＡ3はそれぞれ独立に分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１２の２価の炭化水素基を表しているが、Ａ2の炭素数は、好ましくは２以上であり、好ましくは１０以下、より好ましくは８以下である。Ａ3の炭素数は、好ましくは２以上であり、好ましくは１０以下、より好ましくは８以下である。Ａ1としては、エチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ビニレン基（−ＣＨ＝ＣＨ−）、プロピレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、イソプロピレン基（−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−）、ブチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、メチルブチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ジメチルブチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＣＨ2−）、エチルブチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ペンチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、へキシレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ヘプチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、オクチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）等が挙げられる。
Ｂは下記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ〜４）の何れかの式で表される塩基構造を表しているが、特に（ＩＩ−１）が好ましい。なお、式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ〜４）中の括弧書きは、Ａ1と糖部位との結合位置をそれぞれ表している。
Ｒ6はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表しているが、保護基はアミノ基の保護基として利用されるものであれば特に限定されない。例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル等のカルバメート系保護基；プロピオニル基、イソプロピオニル基、ベンゾイル基、イソブチル基等のアミド系保護基等；ｐ−トルエンスルホニル基、２−ニトロベンゼンスルホニル基等のスルホンアミド系保護基等が挙げられる。また、Ｒ6が炭化水素
基である場合の炭素数は、好ましくは２以上であり、好ましくは５以下、より好ましくは４以下である。
Ｘはそれぞれ独立にイミノ基（−ＮＲ5−）、エーテル基（−Ｏ−）、又はチオエーテル基（−Ｓ−）を表しているが、イミノ基（−ＮＲ5−）が好ましい。
Ｙは水素原子、又は窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びハロゲン原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を表しているが、Ｙの炭素数は、好ましくは２以上であり、好ましくは１８以下、より好ましくは１５以下である。Ｙは、メチル基（−ＣＨ3）、又はアミノ基（−ＮＨ2）、イミノ基（−ＮＲ5−）、エーテル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ5−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオエステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）、チオアミド基（−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ5−）、チオノエステル基（−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−）、ニトロ基（−ＮＯ2）、シアノ基（−ＣＮ）、フェニル基（−Ｃ6Ｈ5）、フェニレン基（−Ｃ6Ｈ4−）、ナフチレン基（−Ｃ12Ｈ8−）、トリフルオロメチル基（−ＣＦ3）、フッ素原子（−Ｆ）、及びタンパク質構成アミノ酸の側鎖構造を含むアシル基からなる群より選択される少なくとも１種を含む炭素数２〜１８の炭化水素基であることがより好ましい。Ｙの炭化水素基の具体的構造としては、下記式で表されるものが挙げられる。

（上記式中、Ｒ’は水素原子、メチル基、又はエチル基を、Ｒ’’はヒドロキシル基（−ＯＨ）又はニトロ基（−ＮＯ2）を、Ｚは酸素原子又は硫黄原子を、ａは１〜６の整数を表す。）
ｋは１又は２を表しているが、Ｒ5及びＹはそれぞれ水素原子であっても炭化水素基であってもよいため、Ｙに結合している窒素原子は第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム基の何れであってもよいことを意味する。
本発明のヌクレオシド誘導体等の製造方法は、特に限定されず、公知の合成法を適宜組み合わせて製造することができるが、例えば下記の手順に従って製造することができる。（１）６−クロロプリン等のハロゲン化プリンと一方のアミノ基に保護基が導入されているエチレンジアミン等のジアミン誘導体を準備し、ジアミン誘導体によるハロゲン化プリンの置換反応を進めることによって、プリン化合物にアミノ基を含んだ炭素鎖を導入することができる。
（２）アンモニウム基等の窒素原子含有官能基を含んだハロゲン化アルキルを準備し、プリン化合物のイミノ基を利用してハロゲン化アルキルの置換反応を進めることにより、窒素含有官能基を含んだもう１つの炭素鎖をプリン化合物に導入することができる。
（ｍは１〜１０の整数を、ｎは１〜１２の整数を表す。）
（３）例えば、特開２００７−０５６００１号公報に記載されている方法によって、塩基部位にアクリル酸構造を導入したヌクレオシド誘導体を合成することができる。このアクリル酸構造と炭素鎖を導入したプリン化合物のアミノ基とのアミド化反応によって、本発明のヌクレオシド誘導体等を合成することができる。
（ｍは１〜１０の整数を、ｎは１〜１２の整数を表す。）
＜ヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル又はその塩＞
本発明のヌクレオシド誘導体等は、結合親和性や標的多様性に優れる核酸アプタマーを製造するために有用な化合物であるが、本発明のヌクレオシド誘導体をリン酸化して得られるヌクレオチド、即ちヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステルも本発明の一態様である（以下、「本発明の５’−リン酸エステル」と略す場合がある。）。なお、本発明の５’−リン酸エステルから得られる塩も本発明の範囲に含まれるものとする。
本発明の５’−リン酸エステルは、例えば下記式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）の何れかの式で表すことができる。
なお、式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）中、ｍは１〜５の整数を、Ｚはそれぞれ独立に酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｒ6及びｋについてはそれぞれ前述した本発明のヌクレオシド誘導体等と同義である。
本発明の５’−リン酸エステルは、蛍光物質等の標識物質を導入した標識ヌクレオチド誘導体の形態であってもよい。標識物質を結合させた５’−リン酸エステルを構成単位として含むポリヌクレオチドは、有用なプローブ等となり得る。標識物質は、核酸の標識として用いられる公知の物質であれば特に限定されないが、例えば、フルオレスセイン，Ｃｙ５，テトラメチルカルボキシローダミン，ピレン等の蛍光標識物質が挙げられる。また、標識物質は、例えば５’−リン酸エステルのアミノ基に導入することができる。なお、蛍光標識以外にも、種々の機能性物質を本発明の５’−リン酸エステルに導入することにより、機能性修飾ポリヌクレオチド、例えば触媒、核酸アプタマーを合成することもできる。また、阻害剤を結合させることも可能である。
＜ヌクレオシド誘導体の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩＞
本発明のヌクレオシド誘導体等は、結合親和性や標的多様性に優れる核酸アプタマーを製造するために有用な化合物であるが、ホスホロアミダイト法に利用するために、本発明のヌクレオシド誘導体をアミダイト化して得られる３’−ホスホロアミダイト化物も本発明の一態様である（以下、「本発明のホスホロアミダイト化物」と略す場合がある。）。なお、本発明のホスホロアミダイト化物から得られる塩も本発明の範囲に含まれるものとする。
本発明のホスホロアミダイト化物は、例えば下記式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−６）の何れかの式で表すことができる。
なお、式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−６）中、Ｒ2は本発明のヌクレオシド誘導体等と同様に水素原子又はヒドロキシル基の保護基を表しているが、ヒドロキシル基の保護基としてジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル基であることが好ましい。また、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｒ6及びｋについてはそれぞれ前述した本発明のヌクレオシド誘導体等と同義である。
本発明のホスホロアミダイト化物は、本発明の５’−リン酸エステルと同様に、蛍光物質等の標識物質を導入した標識ヌクレオチド誘導体の形態であってもよい。なお、具体的な標識物質は、本発明の５’−リン酸エステルにおいて説明したものと同様である。
＜ポリヌクレオチド合成用基質溶液・ポリヌクレオチド合成用試薬・ポリヌクレオチドの製造方法＞
本発明の５’−リン酸エステル及びその塩、ホスホロアミダイト化物及びその塩、又はそれ並びにこれらに標識物質を導入した標識ヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチドを合成するために有用な合成用基質であるが、これらの少なくとも１種を含むポリヌクレオチド合成用基質溶液、このポリヌクレオチド合成用基質溶液を含むポリヌクレオチド合成用試薬、さらにこれらを合成用基質として用いるポリヌクレオチドの製造方法も本発明の一態様である。
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のヌクレオシド誘導体等は、結合親和性や標的多様性に優れる核酸アプタマーを製造するために有用な化合物であるが、本発明のヌクレオシド誘導体等を用いて製造される核酸、即ち本発明の５’−リン酸エステル及び／又はそのホスホロチオエート体を構成単位として含むポリヌクレオチドも本発明の一態様である（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と略す場合がある。）。なお、蛍光物質等の標識物質を導入した５’−リン酸エステルを構成単位として含む標識ポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれるものとする。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば下記式（Ｖ−１）〜（Ｖ−６）の何れかの式で表すことができるヌクレオチド構造を少なくとも含むものが挙げられる。
なお、式（Ｖ−１）〜（Ｖ−６）中、Ｚはそれぞれ独立に酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｒ6及びｋについてはそれぞれ前述した本発明のヌクレオシド誘導体等と同義である。また、式（Ｖ−１）〜（Ｖ〜６）中の括弧書きは、隣接したヌクレオチド構造との結合位置をそれぞれ表している。さらに、「そのホスホロチオエート体」とは、Ｚが硫黄原子であるものを意味するものとする。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の５’−リン酸エステル及び／又はそのホスホロチオエート体を構成単位として含むものであれば特に限定されないが、本発明の５’−リン酸エステル５’末端に含むものであることが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの塩基数は、通常１０以上、好ましくは１５以上であり、通常２００以下、好ましくは１００以下、より好ましくは７０以下である。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されず、例えば本発明の５’−リン酸エステルやホスホロアミダイト化物等を原料として利用して、公知の合成法により適宜製造することができる。例えば、ＤＮＡの製造の場合、ＤＮＡシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法又は固相ホスホルアミダイト法にてポリヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー等を用いて精製することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドにおけるホスホロチオエート体構造は、公知のホスホロチオエート基の導入方法を適宜採用して形成することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、蛍光物質等の標識物質が導入されたポリヌクレオチドであってもよいが、一本鎖にしてマイクロアレイのプローブに用いたりすることもできる。
また、本発明のポリヌクレオチドの用途は特に限定されず、触媒、核酸アプタマー等の公知の用途に適宜利用することができるが、核酸アプタマーとして利用することが好ましい。例えば、アンチセンス分子やアンチジーン分子等の遺伝子発現を調節するための核酸医薬として利用することもできる。本発明のポリヌクレオチドは、優れた細胞膜透過性や遺伝子抑制作用、副作用の緩和、ヌクレアーゼ耐性を発揮することができ、有効な核酸医薬として利用できる。
＜ポリヌクレオチドライブラリー・核酸アプタマーの選択方法＞
本発明のポリヌクレオチドは、ＳＥＬＥＸ法等に使用するポリヌクレオチドライブラリーに利用することができるが、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリー（以下、「本発明のポリヌクレオチドライブラリー」と略す場合がある。）、並びにこのポリヌクレオチドライブラリーを用いて標的物質結合性ポリヌクレオチドを選択する工程を含む核酸アプタマーの選択方法（以下、「本発明の選択方法」と略す場合がある。）も本発明の一態様である。
本発明のポリヌクレオチドライブラリーは、本発明のポリヌクレオチドを含むものであればその他については特に限定されないが、例えば本発明の５’−リン酸エステル等を用いて合成したランダム配列を含む複数種類のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
本発明の選択方法は、ポリヌクレオチドライブラリーを用いて標的物質結合性ポリヌクレオチドを選択する工程を含むものであればその他については特に限定されず、例えばＳＥＬＥＸ法において行われる工程を含むことができる。なお、ＳＥＬＥＸ法は、通常、標的物質をビーズ等の担体に固定化し、これにポリヌクレオチドライブラリーを添加し、標的物質に結合する核酸を回収し、回収したポリヌクレオチドを増幅し、増幅したポリヌクレオチドを再び標的物質に添加するという一連の工程を繰り返して、標的物質に対する特異性および結合力が高いポリヌクレオチドを濃縮し、その塩基配列を決定することで、標的物質結合性アプタマーを獲得する方法である。
本発明の選択方法によって、種々の生体関連物質等に対する核酸アプタマーや特定反応を触媒するリボザイム等、実用可能性があるさまざまな機能性核酸をスクリーニングすることができる。すなわち、ランダムなポリヌクレオチドを複数合成し、その中から酵素活性などを指標に特定のポリヌクレオチドを選択することにより、生理活性を有するアプタマーやリボザイムを得ることができる。
生体関連物質としては、酵素、抗体、サイトカインなどのタンパク質が例示される。具体的には、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）が挙げられ、下記（i）の修飾核酸の残基（ヌクレオチド残基）を含む核酸アプタマーはVEGF結合剤として有用である。
（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーとは、アデニン（A）、チミン（T）、グアニン（G）、シトシン（C）の４種類の天然の塩基のうちの１種類以上とともに、（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーを意味するが、（i）の修飾核酸はチミジン5’-三リン酸（dTTP）の誘導体であるため、チミン（T）の代わりに（i）の修飾核酸の残基が含まれる核酸アプタマーであることは好ましい。すなわち、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）の３種類の天然の塩基のうちの１種類以上とともに、（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーであることが好ましい。核酸アプタマー全長における（i）の修飾核酸の残基の割合は１０〜５０％であることが好ましい。
VEGF結合剤として使用し得る核酸アプタマーは、（i）の修飾核酸残基に加えて、他の修飾核酸残基が含まれてもよい。
このような核酸アプタマーは、DNA合成機などを使用して得ることができる。例えば、DNA合成機に、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）と、（i）の修飾核酸の3’-ホスホロアミダイトを用いて目的の配列の核酸アプタマーを合成することができる。
VEGF結合剤として使用し得る核酸アプタマーの具体的な態様としては、VEGF結合能を有する限り特に限定はされないが、核酸アプタマーの配列が配列番号６〜３１、３３〜４０のいずれかの塩基番号２１〜５０の配列、配列番号３２の塩基番号２１〜４９の配列を含む核酸アプタマーが挙げられる。これらの配列において、Tは上記（i）の修飾核酸残基を意味する。
なお、VEGFに結合する能力が維持される限り、これらの配列において１〜数個、例えば、１、２または３個の塩基が置換、欠失、挿入等されてよい。また、VEGF結合能が維持される限り、５’側および／または３’側に任意の長さの任意の配列が付加されてよい。
VEGF結合能としては、ヒトVEGFとKd（解離定数）が１０ｎＭ以下の親和性を示すことが好ましい。
本発明のVEGF結合剤は、アデニン（A）、チミン（T）、グアニン（G）、シトシン（C）の４種類の天然の塩基のうちの１種類以上とともに、（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーのライブラリーを用意し、それとVEGFを接触させ、VEGFと結合する核酸アプタマーを選択し、増幅することを繰り返すことによって核酸アプタマーのライブラリーからセレクションすることもできる。
本発明のVEGF結合剤は、VEGF検出のための分子プローブとして使用することができる。例えば、核酸アプタマーを蛍光色素などで標識し、VEGFの体内動態などをトレースすることができる。VEGFは癌や、糖尿病性網膜症などの異常血管新生、関節リウマチなどの炎症性疾患などで高発現することが知られているので、本発明のVEGF結合剤はこれらの疾患の診断試薬として使用することができる。
また、腫瘍組織では血管新生が亢進しており、腫瘍組織にはVEGFが集積するため、本発明の核酸アプタマーは、抗癌剤のDDS（薬剤伝達システム）のために使用することができる。アプタマーに抗癌剤の有効成分を結合させ、投与することで、抗癌剤を腫瘍組織に効率よく送達することができる。
例えば、本発明の核酸アプタマーと特開２０１３−４０１１８に開示されたカンプトテシン類との結合に関与する核酸アプタマーを連結し、これに、カンプトテシン類を結合させることで、カンプトテシン類を腫瘍組織に到達させるための医薬を作製することができる。
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
［N-Boc-ethylenediamine（化合物）の合成］
Ethylenediamine(4mL, 60mmol)をCHCl3(130mL)に加えて攪拌し、そこにCHCl3（20mL）に溶解したDi-tert-butyl dicarbonate(2g,9.16mmol)をＡｒ雰囲気下滴下した。１８時間撹拌し、TLCで確認後，減圧留去した。CHCl3でろ物をろ過し、濾液をカラムクロマトグラフィーにより精製した(10%MeOH/3%TEA/CHCl3)。これを減圧乾燥させることで化合物１を得た。なお、収量は1465mg、収率は99.9%であった。
1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ3.18 (2H,q) 2.80 (2H,t) 1.45 (9H,s)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 161.4, calculated for [(M+H)+]= 161.1
［(4-Bromobutyl)trimethylammonium Bromide（化合物２）の合成］
13%Trimethylamine in THF(2mL)へdry-THF(0.6mL)に溶解した1,4-Dibromobutane（0.6mL,5.1mmol）を加えてＡｒ雰囲気下で２４時間撹拌した。その後THFで濾過して、濾物を化合物２として得た。なお、収量は1091mg、収率は80.0%であった。
1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ3.81 (2H,t) 3.53 (2H,t) 3.49 (9H,s) 2.01 (4H,m)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 194.0, calculated for [(M)+]= 194.1
［化合物３の合成］
6-Chrolopurine (850mg, 5.5mmol)をn-BuOH(6mL)で懸濁させ、TEA(7.7mL)を加えて攪拌した。そこにn-BuOH(4mL)で溶かした化合物１(485mg, 3.03mmol)を加えて還流した。２時間後n-BuOH(3mL)に溶かした化合物１(485mg, 3.03mmpl)を追加して２時間還流した。反応終了後、減圧留去してCHCl3で濾過し、ろ物を化合物３として得た。なお、収量は1342mg、収率は88%であった。
1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ 8.23 (1H,s) 8.06(1H,s) 3.70 (2H,m) 3.42 (2H,t) 1.39 (9H,s)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 279.5, calculated for [(M+H)+]= 279.2
［化合物４の合成］
化合物3(1086mg, 3.9mmol)をdry-DMF(10mL)で溶解して氷冷化で３０分攪拌した後、Sodium hydride(60% in oil)(214mg, 5.35mmol)を素早く加えて０℃で１．５時間攪拌し、dry-DMF(10mL)で溶解した化合物２(1395mg, 4.67mmol)を加えてＡｒ雰囲気下室温で撹拌した。５時間後水を加えて減圧留去した。残渣をMeOHでとかして濾過し、濾液を減圧留去した。これを逆相カラムクロマトグラフィー(100%H2O→5%MeOH / H2O→10%MeOH / H2O)により精製し、化合物４をえた。なお、収量は1283mg、収率は70%であった。
1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ 8.27 (1H,s) 8.12(1H,s) 4.32 (2H,t) 3.69 (2H,m) 3.41 (2H,t) 3.12 (11H,s) 1.95 (2H,m)1.84 (2H,m) 1.40 (9H,s)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 392.3, calculated for [(M)+]= 392.3
［化合物５の合成］
化合物４(467mg, 0.99mmol)にTrifluoroacetate(14mL)を加えて１時間攪拌した。減圧留去し、Etherで濾過して濾物を化合物５として定量的に得た。なお、理論収量は0.99mmolである。
1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ 8.37 (1H,s) 8.22(1H,s) 4.34 (2H,t) 3.95 (2H,m) 3.42 (2H,t) 3.12 (11H,s) 1.96 (2H,m)1.85 (2H,m)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 292.4, calculated for [(M)+]= 292.2
＜実施例１＞
［化合物６の合成］
(E)-5-(2-carboxyvinyl)-2'-deoxyuridine(204mg, 686μmol)にHOBt・H2O(137mg,891μmol)とPyBOP(464mg, 891μmol)を加え、dry-DMF(8mL)で溶解しし、ここにDIPEA(1.2mL, 6.86mmol)を加えて攪拌してすぐにdry-DMF(2mL)で溶解した化合物5(0.99ｍmol)をＡｒ雰囲気下加えた。２時間攪拌した後に減圧留去して、逆相カラムクロマトグラフィー(100%H2O→3%MeOH / H2O→5%→8%→10%→12%→15%)により精製した化合物６を得た。なお、収量は330mg、収率は76%であった。
1HNMR(400 MHz, D2O)δ 8.01 (1H,s)8.27 (1H,s) 7.93(1H,s) 7.90 (1H,s) 6.78 (1H,d) 6.54 (1H,d) 6.06 (1H,t) 4.28 (1H,q) 4.05 (2H,t) 3.88 (1H,q)3.69 (1H,q) 3.59 (1H,q)3.41 (2H,q) 3.13 (2H,t) 2.88 (11H,s) 2.30-2.14 (2H,m) 1.69 (2H,m)1.60 (2H,m)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 572.5, calculated for [(M)+]= 572.3
＜実施例２＞
［化合物７の合成］
真空乾燥させた化合物６(108mg, 166μmol)をdry-DMF(5mL)で２回、dry-MeCN(2mL)で２回共沸し、dry-TMP(50mL)に溶解して氷冷下でPhosphoryl chloride (310μL, 3.31mmol）を加え、１０時間攪拌した。その後冷水30mLを加えて１０分攪拌させ、TEA(1.4mL, 9.93mmol)を加えてさらに１０分攪拌してクエンチした。減圧留去して、MeCNとEtherで結晶化させてろ物を得た。これを少量の水に溶かして陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物７を得た。なお、収量は53.1μmol、収率は32%であった。
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 652.3, calculated for [(M)+]= 652.3
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 649.7, calculated for [(M-2H)-]= 650.3
［化合物８の合成］
凍結乾燥させた化合物７(53.1μmol)をdry-DMF(2mL)で２回共沸させ、dry-DMF(1.2mL)に懸濁させ、dry-TEA(49μL, 350μmol)，Imidazole(14mg, 212μmol)，Triphenylphosphine(22mg, 85μmol)，2,2'-Dithiodipyridine(19mg, 85μmol)を加え、攪拌した。９時間後、Sodium perchlorate (67mg, 531μmol)を溶解したdry-Acetone16mLに反応液を加えて４℃で３０分静置し,沈殿物をdry-Ether(16mL)で６回デカンテーションした。この沈殿物を真空乾燥させることで，クルードとして化合物８を得た。なお、理論収量は53.1μmolである。
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 702.1, calculated for [(M)+]= 702.3
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 699.5, calculated for [(M-2H)-]= 700.3
＜実施例３＞
［化合物９(dUtaTP)の合成]
真空乾燥させた化合物８(53.1μmol, 38mg)をdry-DMF(2mL)で２回共沸させてdry-DMF(1mL)に懸濁させ、dry-n-Tributylamine(75μL, 314μmol)と0.5M n-Tributylamine pyrophosphate in DMF(0.8mL, 404μmol)を加えて攪拌した。１２時間後、1M TEABバッファー(5mL)でクエンチし、減圧留去した。これに水を加えてEtherで分液を３回し、水層を陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相HPLCを用いて精製し、凍結乾燥することで化合物９(dUtaTP)を得た。なお、収量は7.74μmol、収率は14.6%(from 化合物７)であった。
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 809.5, calculated for [(M-3H)-]= 809.6
［化合物１０の合成］
真空乾燥させた化合物３(666mg, 2.4mmol)をdry-DMF(5mL)で懸濁させ、氷冷下で３０分攪拌したあと、Sodium hydride(60% in oil) (180mg, 4.5mmol)を素早く入れてＡｒ雰囲気、氷冷下で１．５時間攪拌した。そこへ真空乾燥させたN-(4-Bromobutyl)phthalimide (886mg, 3.14mmol)を加えて、４時間後に減圧留去した。これをCHCl3で濾過し、濾液をカラムクロマトグラフィー(0%→0.5%→1%→2%→3%MeOH/CHCl3)により精製し，化合物１０を得た。なお、収量は847mg、収率は73.8%であった。
1HNMR(400 MHz, CDCl3)δ 8.34 (1H,s)7.84 (2H,m) 7.76 (1H,s)7.72(2H,m) 4.25 (2H,t) 3.83−3.71(4H,m) 3.43 (2H,q) 1.94 (2H,m) 1.73 (2H,m) 1.41 (9H,s)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 480.2, calculated for [(M+H)+]=480.2
［化合物１１の合成］
化合物１０(847mg, 1.77mmol)をEtOH(19mL)に懸濁させ、Hydrazine monohydrate(429μL, 8.83mmol)を加えて攪拌した。４時間後、冷EtOHで濾過したあと濾液を減圧留去し、クルードの化合物１１を定量的に得た。なお、理論収量は1.77mmolであった。
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 350.3, calculated for [(M+H)+]=350.2
［化合物１２の合成］
化合物１１(1.77mmol)をdry-MeOH(9mL)で溶かし、TEA(2.5mL, 9.1mmol)とEthyl Trifluoroacetate (1.1mL, 9.1mmol)を加えてＡｒ雰囲気下で攪拌した。２時間後、減圧留去してカラムクロマトグラフィーにより精製(0%→0.5%→1%→1.5%→2%→2.5%→3%MeOH/CHCl3)し，化合物１２を得た。なお、収量は740mg、収率は91.2%(from 化合物１０)であった。
1HNMR(400 MHz, CDCl3)δ 8.35 (1H,s)7.75 (1H,s) 4.25 (2H,t) 3.81 (2H,m) 3.52-3.41 (4H,m) 1.98 (2H,m) 1.64 (2H,m) 1.42 (9H,s)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 446.1, calculated for [(M+H)+]=446.2
［化合物１３の合成］
化合物１２(740mg, 1.66mmol)にTrifluoroacetate(10mL)を加えて攪拌し、１時間後、減圧留去して真空乾燥させた。その後水とEtherで分液して、水層を減圧留去し、化合物１３をクルードとして定量的に得た。なお、理論収量は1.66mmolであった。
1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ 8.34 (1H,s)8.30 (1H,s) 4.34 (2H,t) 4.03 (2H,m) 3.25-3.18 (4H,m) 1.93 (2H,m) 1.58 (2H,m)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 346.2, calculated for [(M+H)+]= 346.2
＜実施例４＞
［化合物１４の合成］
(E)-5-(2-carboxyvinyl)-2'-deoxyuridine(267mg, 0.91mmol)にdry-DMF(10mL)を加えて溶解し、HOBt・H2O(182mg, 1.18mmol)とPyBOP(616mg, 1.18mmol)とDIPEA(1.6mL, 9.1mmol)を加えて攪拌して、dry-DMF(10mL)で溶かした化合物13(1.66mmol)をＡｒ雰囲気下で加えた。２時間後、減圧留去してMeOHで濾過することにより、ろ物を化合物１４として得た。なお、収量は558mg、収率は98.1%であった。
1HNMR(400 MHz, CD3OD)δ 8.38 (1H,s)8.27 (1H,s) 8.08 (1H,s) 7.20 (1H,d) 7.04 (1H,d) 6.27 (1H,t) 4.42 (1H,q) 4.26 (2H,t) 3.95 (1H,q)3.85 (1H,q) 3.76 (1H,q)3.57 (2H,t) 3.52 (2H,t) 3.38 (2H,t)2.29 (2H,m) 1.86 (2H,m)1.67 (2H,m)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 624.1, calculated for [(M+H)+]= 624.2
＜実施例５＞
［化合物１５の合成］
真空乾燥した化合物１４(250mg, 0.4mmol)をdry-TMP 10mLで懸濁させ、Ａｒ雰囲気、氷冷下で４０分攪拌した。その後Phosphoryl chloride (100μL,1.07mmol)を加えて攪拌し、３０分後に追加でPhosphoryl chloride (85μL, 9.2mmol)を加え、１３．５時間後冷水60mLでクエンチして１時間攪拌した。TEAを加えてさらに１時間攪拌した。減圧留去後EtherとMeCNを加えて沈殿物をろ過した。同様の操作で別な化合物１４(145mg, 0.232mmol)を一リン酸化し、合わせて陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけた。フラクションを集めて減圧留去し、凍結乾燥することで化合物１５を得た。なお、収量は377μmol、収率は60%であった。
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 706.0, calculated for [(M+H)+]= 706.1
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 704.0, calculated for [(M-H)-]= 704.1
［化合物１６の合成］
凍結乾燥した化合物１５(377μmol)をdry-Pyridine(20mL)とdry-DMF(10mL)で各１回共沸させ、dry-DMF(2mL)で溶解し、dry-TEA(350μL, 2.5μmol)、Imidazole(103mg, 1.51mmol)，Triphenylphosphine(6.63μmol, 174mg)，2,2'-Dithiodipyridine(160mg, 726μmol)を加え、Ａｒ雰囲気下攪拌した。５時間後、Sodium perchlorate(462mg, 3.77mmol)をdry-Acetone(18mL)，dry-Ether(27mL)，dry-TEA(2mL)に溶解して、これに反応液を入れて、４℃で３０分静置し、沈殿物をdry-Ether(16mL)で６回デカンテーションした。沈殿物を真空乾燥させることで化合物１６をクルードで得た。なお、理論収量は377μmolである。
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 754.2, calculated for [(M-H)-]= 754.2
＜実施例６＞
［化合物１７(dUtfTP)の合成］
真空乾燥させた化合物１６(377μmol)をdry-Pyridine(5mL)で２回共沸させ、dry-DMF(1mL)で懸濁させて攪拌し、dry-n-Tributylamine(361μL, 1.15mmol)と0.5M n-Tributylamine pyrophosphate in DMF (3.74mL, 1.89mmol)を加えてＡｒ雰囲気下攪拌した。５時間後、1M TEABバッファー5mLでクエンチし、３０分攪拌後に減圧留去した。水を加えて、Etherで分液を３回し、水層を濃縮してから陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離した。目的のフラクションを回収した後、逆相HPLCにより精製し，凍結乾燥することで化合物１７(dUtfTP)を得た。なお、収量は93μmol、収率は24.7 %(from 化合物１５)であった。
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 864.1, calculated for [(M-H)-]= 864.1
＜実施例７＞
［化合物１８(dUamTP)の合成］

凍結乾燥した化合物１７(81μmol)に28%Aqueous ammonia (4mL)を加えて攪拌した。２時間後、ダイヤフラムポンプでAmmoniaを抜いて凍結乾燥し、逆相HPLCにより精製し、凍結乾燥することで化合物１８(dUamTP)を定量的に得た。
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 768.1, calculated for [(M-H)-]= 768.1
［化合物１９の合成］
Thiourea(1g, 13.1mmol)をEtOH(2mL)に懸濁させて攪拌し、1,2-Dibromobutane(4.1mL, 52.6mmol)を加えて５５〜６５℃で３時間還流させた後、追加で同量の1,2-Dibromobutaneを加えて２時間還流した。減圧留去した後、Etherで結晶化させてデカンテーションし、残渣を化合物１９として得た。なお、収量は2291mg、収率は94.2%であった。
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 105.2, calculated for [(M+H)+]= 105.0
＜実施例８＞
［化合物２０(dUguTP)の合成］
凍結乾燥した化合物１８(38.9μmol)を28%Aqueous ammonia(400μL)で溶解し、28%Aqueous Ammonia(400μL)に 化合物19(188mg, 1.01mmol)を溶解したものを加えて攪拌した。
２時間後、減圧留去して凍結乾燥させ、逆相HPLCによって精製し、凍結乾燥することで化合物２０(dUguTP)を定量的に得た。
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 810.1, calculated for [(M-H)-]= 810.2
＜実施例９＞
［化合物２１(dUdnTP)の合成］
dUamTP(6.76μmol)と1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene(30mg)をEtOH(1.0mL)に溶解したもの92μL(2.76mg, 13.5μmol)とNaHCO3(30mg)をWater(0.5mL)に溶解したもの23.6μL(1.42mg, 16.9μmol)を混合し、室温で５時間攪拌した。遠心分離を行って上澄み液を採取し、Etherで２回デカンテーションした後HPLC分取した。これを減圧留去して凍結乾燥し、滅菌水に溶解させて保存した。なお、収量は2.65μmol、収率は39%であった。
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 934.0, calculated for [(M-H)-]= 934.1
［化合物２２の合成］
Sodium 1-naphthol-5-sulfonate(1g,4.06mmol)とNaHSO3(3.4g,32.7mmol)を量りとってWater(12.3mL)を加えて攪拌した後、Ethylenediamine(814μL,12.2mmol)を加え、conc.HClでpHを８以下にして１３．５時間還流した。反応液をろ過してcold WaterとAcetonitrleで洗浄し、ろ物を真空乾燥した。なお、収量は791mg、収率は73%であった。
1HNMR(400 MHz, DMSO-D6) δ8.19(1H,d) 8.13(1H,d) 7.94(1H,d) 7.35(1H,t) 7.28(1H,t) 6.57(1H,d) 3.42 (2H,t) 3.15 (2H,t)
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 289.1, calculated for [(M+Na)+]= 289.1
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 265.0, calculated for [(M−H)-]= 265.1
［化合物２３の合成］
化合物２２(159mg, 597μmol)を1N NaOHaq(3mL)で溶解し、Chloroform(1.5mL)を加えて氷浴で３０分攪拌した。Chloroform(1.5mL)に溶解したTriphosgene(266,mg 895μmol)をゆっくり有機層に流し込み、１５分間攪拌した。水相をろ過してろ液を中圧カラムにより精製し、真空乾燥した。なお、収量は106-176mg、収率は56-97%であった。
1HNMR(400 MHz, D2O) δ8.67(1H,d) 8.20(2H,m) 7.76(1H,t) 7.65(2H,q) 4.06(2H,t) 3.76(2H,t)
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found= 291.0, calculated for [(M−H)-]= 291.1
化合物２３と化合物１８を下記式のように反応させることにより、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）におけるＹの位置に化合物２３の構造を導入した化合物を得ることができる。
また、化合物２３と同様にイソシアネート基（−ＮＣＯ）を形成することにより、化合物１８等と反応させてＹの位置に目的の構造を導入することができる。
＜実施例１０＞
［４種類の三リン酸体の酵素的導入］
500μLのマイクロチューブに、下記表１に示す組成（酵素は除く）で各基質を含む反応液をそれぞれ調製し、サーマルサイクラーを用いてdenature(95℃,1min)させ、Annealing(95℃→25℃,0.5℃/ min)した。続いてKOD Dashを加えてExtension(74℃，0.5 or 5min)した。伸長反応の確認は20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(300V，100mM，140min，45℃)の後、レーザー照射(488nm)によってイメージング(FAM)を行った。イメージングを図１に、対応表を表２に示す。
［dUdnTPの酵素的導入］
500μLのマイクロチューブに、下記表３に示す組成（酵素は除く）で反応液をそれぞれ調製し、１時間Annealing (95℃→25℃,0.5℃/ min)した。続いてKOD Dashを加えてExtension(74℃，0.5 or 5min)した。反応液の量×1.4倍の色素液でクエンチし、Denature (95℃，5min) した。伸長反応の確認は20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(300V，100mM，140min，45℃)の後、レーザー照射(488nm)によってイメージング(FAM)を行った。イメージングを図２に、対応表を表４に示す。
［修飾ヌクレオチドを含むDNAライブラリーの酵素的調製］
1.5mLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを500μLマイクロチューブに100μLずつ８本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットして以下の温度条件でPCRを行った。PCR産物の確認は10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。確認後、反応液を10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TB Buffer、200 or 300V、45 or 4℃、150~250分）により目的の70merのDNAバンドを外部レーザー（488nm）照射で検出し、ゲルから切り出した。切り出したゲルを、透析チューブを用いて透析（TB Buffer、100V、4℃、80分）を行った。抽出したDNA溶出液を遠心フィルターユニットにより脱塩し、凍結乾燥後、適量の滅菌水で溶解させて濃度を測定することでライブラリーを得た。
＜実施例１１＞
［NECEEMによるライブラリーのセレクション］
500μLマイクロチューブにイニシャルライブラリーを緩衝液中で1μMになるように調製した。緩衝液にはTris-HCl buffer（20mM Tris-HCl（pH 7.4）、1mM MgCl2、10mM NaCl）を用いた。これを遺伝子増幅装置にセットして、94℃で0.5分熱変性し0.5℃/分の降温速度で25℃まで下げてアニーリングを行った。その後、ポジティブコントロールには標的分子であるタンパク質がファイナル0.2μMになるように加えて37℃で30分インキュベートした。ネガティブコントロールにはバッファーを加えた。この際、ポジティブコントロールとネガティブコントロールともに、DNAの濃度は0.5μMとなるようにした。インキュベート後、NECEEMによって測定した。測定条件には下記の条件を用いた。ネガティブコントロールと比べて蛍光強度の増加がみられる部分を分取した。また、キャピラリー内壁へのDNAの吸着を確認するために、反応液をインジェクトする前にも分取している。
＜泳動条件＞
Capillary length: 80cm
Running buffer: 100mM Boric acid buffer(pH 8.4)
TemperatureCartridge : 25℃
Sample storage : 15℃
Dynamic range: 1000RFU
Excitation wavelength: 488nm
Emission wavelength: 520nm
［修飾ヌクレオチドを含むDNAライブラリーの酵素的調製］
1.5mLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを500μLマイクロチューブに100μLずつ８本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットして以下の温度条件でPCRを行った。PCR産物の確認は10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。確認後、反応液を10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TB Buffer、200 or 300V、45 or 4℃、150~250分）により目的の70merのDNAバンドを外部レーザー（488nm）照射で検出し、ゲルから切り出した。切り出したゲルを、透析チューブを用いて透析（TB Buffer、100V、4℃、80分）を行った。抽出したDNA溶出液を遠心フィルターユニットにより脱塩し、凍結乾燥後、適量の滅菌水で溶解させて濃度を測定することでライブラリーを得た。
［２ndＰＣＲ］
1.5mLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを500μLマイクロチューブに100μLずつ８本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットして以下の温度条件で対称PCRを行った。PCR産物の確認は10％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。反応液を酢酸ナトリウムでエタノール沈殿し、凍結乾燥した後、残渣を80μLの滅菌水に溶解した。
［λエキソヌクレアーゼによる相補鎖の分解］
1.5mLマイクロチューブに酵素を除く反応液を以下のように調製した。500μLマイクロチューブに90μLずつ８本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットしてアニーリング(降温速度1.2℃/min, 95→25℃)を行った。その後、λ-exonucleaseを10μL加えて、37℃で30分反応させた。相補鎖の分解の確認は10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、SYBR Goldで染色し、外部レーザー（488nm）照射によって行った。反応液をスピンカラム(10k)により脱塩し、凍結乾燥した残渣を滅菌水400μLで溶解した。
dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果を図３に、dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果を図４に、dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の２Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果を図５に、dUguTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の２Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果を図６に示す。１Ｒｏｕｎｄ目における標的分子ありと標的分子なしの面積の差は０．０１％、２Ｒｏｕｎｄ目における標的分子ありと標的分子なしの面積の差は０．５６％となり、濃縮割合は５６倍となった。また、１Ｒｏｕｎｄ目と２Ｒｏｕｎｄ目のcomplex peakの面積差は０．５８％となり、濃縮割合は３０倍（０．０２％→０．６０％）となった。
dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果を図７に、dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の１Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果を図８に、dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）なし）の２Ｒｏｕｎｄ目NECEEMのの測定結果を図９に、dUadTP-Library（標的分子（トロンビン）あり）の２Ｒｏｕｎｄ目のNECEEMの測定結果を図１０に示す。１Ｒｏｕｎｄ目における標的分子ありと標的分子なしの面積の差は０．０６％、２Ｒｏｕｎｄ目における標的分子ありと標的分子なしの面積の差は０．２８％となり、濃縮割合は４．７倍となった。また、１Ｒｏｕｎｄ目と２Ｒｏｕｎｄ目のcomplex peakの面積差は０．２３％となり、濃縮割合は４．３倍（０．０７％→０．３０％）となった。
＜実施例１２＞
上記化合物２０を化合物（i）（KK10）として、以下の実験に使用した。
CE-SELEXの実験方法
・用いたDNA
GOL#P1P:5’-TCG CTC GGC AGG ATC GCA AG-3’(5’リン酸化)（配列番号３）
GOL#P1F:5’-TCG CTC GGC AGG ATC GCA AG-3’(5’FITC化(6-FAM)) （配列番号３）
GOL#P2P:5’-TGC TGC CAC TGC TCC GTC CA-3’(5’リン酸化) （配列番号５）
GOL#P2H:5’-TGC TGC CAC TGC TCC GTC CA-3’（配列番号５）
GOL#T2H:5’-TGC TGC CAC TGC TCC GTC CAN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNC TTG CGA TCC TGC CGA GCG A-3’（配列番号４）
[修飾DNAライブラリーの酵素的調製]
1.5mLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを500μLマイクロチューブに100μLずつ8本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットして以下の温度条件でPCRを行った。PCR産物の確認は10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。確認後、反応液を10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TB Buffer、300V、4℃、200-240分）により目的の70merのDNAバンドを外部レーザー（488nm）照射で検出し、ゲルから切り出した。切り出したゲルを、透析チューブを用いて透析（TB Buffer、100V、4℃、80分）を行った。抽出したDNA溶出液を遠心フィルターユニットにより脱塩し、凍結乾燥後、適量の蒸留水で溶解させて濃度を測定することでライブラリーを得た。
[NECEEMによる修飾DNAライブラリーのセレクション]
500μLマイクロチューブに上記で合成したライブラリーを緩衝液中で1μMになるように調製した。緩衝液にはTris-HCl buffer（20mM Tris-HCl（pH 7.4）、1mM MgCl2、10mM NaCl）を用いた。これを遺伝子増幅装置にセットして、94℃で0.5分熱変性し2.5hかけて25℃まで下げてアニーリングを行った。その後、標的分子であるヒトVEGFタンパク質がファイナル0.5μM(1ラウンド目のみ)もしくは0.2μM(2ラウンド目以降)になるように加えて37℃で30分インキュベートした。ネガティブコントロールにはバッファーを加えた。この際、DNAの濃度は0.5μMとなるようにした。インキュベート後、非平衡キャピラリー電気泳動法（NECEEM）によって測定した。測定条件には下記の条件を用いた。ネガティブコントロールと比べて蛍光強度の増加がみられる部分を分取した。また、キャピラリー内壁へのDNAの吸着を確認するために、反応液をインジェクトする前にも分取している。
＜泳動条件＞
Capillary length: 80cm
Running buffer: 100mM Boric acid buffer (pH 8.4)
Temperature
Cartridge : 25℃
Sample storage : 15℃
Dynamic range: 1000RFU
Excitation wavelength: 488nm
Emission wavelength: 520nm
[分取液のPCR (1st PCR)による修飾DNAライブラリー濃縮の確認]
500μLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを遺伝子増幅装置にセットし、上記セレクションで濃縮された画分を鋳型にし、以下の温度条件で1st PCRを行った。PCR産物の確認は10％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。反応液を酢酸ナトリウムでエタノール沈殿し、凍結乾燥した後、残渣を200μLの蒸留水に溶解した。この溶液を2nd PCRの鋳型とした。
[2ndPCRおよび鋳型鎖の調製]
1.5mLマイクロチューブに反応液を以下のように調製した。これを500μLマイクロチューブに100μLずつ8本に小分けし、遺伝子増幅装置にセットして、上記で得られた1stPCR産物を鋳型とし、以下の温度条件で対称PCRを行った。PCR産物の確認は10％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（TBE Buffer、200V、45℃、35分）の後、外部レーザー（488nm）照射によって行った。反応液を酢酸ナトリウムでエタノール沈殿し、凍結乾燥した後、残渣を80μLの蒸留水に溶解した。定法に従って、GOL#P1P伸長鎖を、λ-exonucleaseを用いて選択的に分解し、次のラウンドの修飾DNAライブラリー調製のための鋳型鎖を得た。
上記の、NECEEMによるセレクションとPCRの操作を繰り返すことにより、VEGF結合アプタマーを選択した。KK10を含むライブラリーから得られたVEGF結合アプタマーの配列を図１１に示す。
Kd測定の結果
上記で得られたVEGF結合アプタマーのうち、一部のアプタマーの活性評価をCE（キャピラリー電気泳動）により行った。また、キャピラリーの長さは30.2cmのものを使用し、injection時間は12secとった。他の条件は同じである。複合体平均と標準偏差は3回測定により算出してある。結果を図１２〜図１３に示した。
いずれのアプタマーもVEGFと高親和性を示すことが分かった。
本発明のヌクレオシド誘導体等は、結合親和性に優れた核酸アプタマーを製造するための原料として利用することができ、核酸医薬、バイオマーカー検査薬、研究試薬等として応用することができる。

Claims (16)

  1. 下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）の何れかの式で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩。
    （式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）中、Ｒ1は水素原子（−Ｈ）、フッ素原子（−Ｆ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、又はメルカプト基（−ＳＨ）を、Ｒ2はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）又はヒドロキシル基の保護基を、Ｒ3及びＲ4は水素原子（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＲ5 2）、メルカプト基（−ＳＨ）、又は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を、Ｒ5はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）又は炭素数１〜６の炭化水素基を、Ａ1は分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１０の２価の炭化水素基を、Ａ2及びＡ3はそれぞれ独立に分岐構造及び／又は不飽和結合を含んでいてもよい炭素数２〜１２の２価の炭化水素基を、Ｂは下記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ〜４）の何れかの式で表される塩基構造を、Ｘはそれぞれ独立にイミノ基（−ＮＲ5−）、エーテル基（−Ｏ−）、又はチオエーテル基（−Ｓ−）を、Ｙは水素原子（−Ｈ）、又は窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びハロゲン原子からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい炭素数１〜２０の炭化水素基を、並びにｋは１又は２を表す。）
    （式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）中、Ｒ6はそれぞれ独立に水素原子（−Ｈ）、炭素数１〜６の炭化水素基、又はアミノ基の保護基を表す。）
  2. 請求項１に記載のヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル又はその塩。
  3. 請求項１に記載のヌクレオシド誘導体の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩。
  4. 請求項２に記載の５’−リン酸エステル又はその塩、請求項３に記載の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩、又はこれらに標識物質を導入した標識ヌクレオチド誘導体を含む、ポリヌクレオチド合成用基質溶液。
  5. 請求項４に記載のポリヌクレオチド合成用基質溶液を含む、ポリヌクレオチド合成用試薬。
  6. 請求項２に記載の５’−リン酸エステル又はその塩、請求項３に記載の３’−ホスホロアミダイト化物又はその塩、又はこれらに標識物質を導入した標識ヌクレオチド誘導体を合成用基質として用いることを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
  7. ホスホロチオエート基を導入する工程を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチドの製造方法。
  8. 請求項２に記載のヌクレオシド誘導体の５’−リン酸エステル及び／又はそのホスホロチオエート体を構成単位として含むポリヌクレオチド。
  9. 核酸アプタマーである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドライブラリー。
  11. 請求項１０に記載のポリヌクレオチドライブラリーを用いて標的物質結合性ポリヌクレオチドを選択する工程を含む、核酸アプタマーの選択方法。
  12. 下記（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーを含む血管内皮細胞増殖因子結合剤。
  13. 核酸アプタマーが一本鎖ＤＮＡである、請求項１２に記載の血管内皮細胞増殖因子結合剤。
  14. 核酸アプタマーの長さが１５〜１００塩基である、請求項１２または１３に記載の血管内皮細胞増殖因子結合剤。
  15. 核酸アプタマーの配列が、配列番号６〜３１、３３〜４０のいずれかの塩基番号２１〜５０の配列、または配列番号３２の塩基番号２１〜４９の配列（これらの配列におけるＴは上記（II）で表される化合物の残基を示す）を含む、請求項１２〜１４いずれか一項に記載の血管内皮細胞増殖因子結合剤。
  16. 下記（i）の修飾核酸の残基を含む核酸アプタマーのライブラリーを用意する工程、およびライブラリーを血管内皮細胞増殖因子と反応させる工程、および血管内皮細胞増殖因子と結合した核酸アプタマーを選択して増幅する工程を含む、血管内皮細胞増殖因子結合剤のセレクション方法。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6795211B2 (ja) * 2016-09-15 2020-12-02 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子、ｓＩｇＡ分析用センサ、およびｓＩｇＡの分析方法
WO2018051581A1 (ja) * 2016-09-15 2018-03-22 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
WO2018051580A1 (ja) * 2016-09-15 2018-03-22 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
CN109715644B (zh) * 2016-09-15 2022-03-22 日本电气方案创新株式会社 核苷衍生物或其盐、多核苷酸的合成试剂、多核苷酸的制造方法、多核苷酸和结合核酸分子的制造方法
JP6763553B2 (ja) * 2016-11-28 2020-09-30 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
JP2019149979A (ja) * 2018-03-05 2019-09-12 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）結合核酸分子、ｓＩｇＡ検出用センサ、ｓＩｇＡ検出試薬、およびｓＩｇＡの分析方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010019847A2 (en) * 2008-08-15 2010-02-18 Georgia State University Research Foundation, Inc. Aptamer inhibition of thrombus formation
JP2013040118A (ja) * 2011-08-12 2013-02-28 Gunma Univ 抗癌剤結合性核酸アプタマー及びその利用
WO2013099762A1 (ja) * 2011-12-28 2013-07-04 シスメックス株式会社 副腎皮質刺激ホルモンと結合する分子およびその利用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132418A (en) * 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) * 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4668777A (en) * 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4973679A (en) * 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
JP2012200204A (ja) 2011-03-25 2012-10-22 Tokyo Univ Of Marine Science & Technology ヒラメラブドウイルス結合性アプタマー

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010019847A2 (en) * 2008-08-15 2010-02-18 Georgia State University Research Foundation, Inc. Aptamer inhibition of thrombus formation
JP2013040118A (ja) * 2011-08-12 2013-02-28 Gunma Univ 抗癌剤結合性核酸アプタマー及びその利用
WO2013099762A1 (ja) * 2011-12-28 2013-07-04 シスメックス株式会社 副腎皮質刺激ホルモンと結合する分子およびその利用

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