JP6763553B2 - ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法 - Google Patents
ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法 Download PDFInfo
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Description
前記化学式(1)中、
Suは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
L1およびL2は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数2〜10の炭化水素基であり、
X1は、イミノ基(−NR1−)、エーテル基(−O−)、またはチオエーテル基(−S−)であり、
R1は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数2〜10の炭化水素基である。
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。
本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩は、前述のように、下記化学式(1)で表されることを特徴とする。
前記化学式(1)中、
Suは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
L1およびL2は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数2〜10の炭化水素基であり、
X1は、イミノ基(−NR1−)、エーテル基(−O−)、またはチオエーテル基(−S−)であり、
R1は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数2〜10の炭化水素基である。
前記化学式(2)中、
R2は、水素原子、保護基、または下記化学式(3)で表される基であり、
R3は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
R4は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
Yは、酸素原子または硫黄原子であり、
Zは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
mは、1〜10の整数である。
本発明のポリヌクレオチドの合成試薬(以下、「合成試薬」ともいう)は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする。本発明の合成試薬は、前記本発明のヌクレオシド誘導体を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の合成試薬は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩の説明を援用できる。本発明の合成試薬によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを合成できる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、前記合成工程において、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用いることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩および合成試薬の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドの製造方法によれば、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを製造できる。
本発明のポリヌクレオチドは、前述のように、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、およびポリヌクレオチドの製造方法の説明を援用できる。本発明のポリヌクレオチドによれば、例えば、後述するように、ターゲットに結合する結合核酸分子を製造できる。本発明のポリヌクレオチドにおいて、前記構成単位は、例えば、ポリヌクレオチドの一部であることを意味する。
本発明の結合核酸分子の製造方法は、前述のように、候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることを特徴とする。本発明の結合核酸分子の製造方法は、例えば、前記候補ポリヌクレオチドが、前記本発明のポリヌクレオチドであることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の結合核酸分子の製造方法は、例えば、前記本発明のヌクレオシド誘導体またはその塩、合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、およびポリヌクレオチドの説明を援用できる。本発明の結合核酸分子の製造方法において、前記候補ポリヌクレオチドは、前記本発明のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含む。このため、本発明の結合核酸分子の製造方法によれば、例えば、ターゲットに対し優れた結合能を示す結合核酸分子を製造できる。
以下に示す合成例により、IA8を調製した。
収量:0.443g 収率:86.7%
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 223.2, calculated for [(M+H)+]= 223.0
1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ7.27 (1H, s) 3.53 (2H, t) 3.46 (2H, t) 1.45 (9H, s)
収量:108mg 収率:52.4%
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found= 296.2, calculated for [(M+H)+]= 296.1
1HNMR(400 MHz, CDCl3) δ8.75 (1H, s) 8.10 (1H, s) 4.47 (2H, t) 3.60 (2H, q) 1.39 (9H, s)
収量:78mg 収率:53%
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 333.1, calculated for [(M+H)+] = 333.2
found = 355.3, calculated for [(M+Na)+] = 355.2
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ8.53 (1H, s), 7.94 (1H, s), 4.85 (2H, t), 4.43 (2H, t), 3.59 (2H, q), 3.00 (2H, t), 1.41 (1H, s)
収量:128mg 収率:104.1%
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 233.1, calculated for [(M+H)+] = 233.2
found = 255.2, calculated for [(M+Na)+] = 255.2
found = 271.2, calculated for [(M+K)+] = 271.2
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.68 (1H, s), 8.49 (1H, s), 4.84 (2H, t), 4.60 (2H, t), 3.24 (2H, t)
収量:84mg 収率:49.7%
ESI-MS (positive ion mode) m/z, found = 513.1, calculated for [(M+H)+] = 513.2,
found = 535.2, calculated for [(M+Na)+] = 535.2,
found = 551.1, calculated for [(M+K)+] = 551.2,
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 511.3, calculated for [(M-H)-] = 511.2
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.51 (1H, s), 8.30 (1H, s), 8.22 (1H,s), 7.05 (1H, d), 6.89 (1H, d), 6.11 (1H, t), 5.25 (2H, d), 5.13 (1H, t), 4.70 (2H, t), 4.32 (2H, t), 3.77 (1H, d), 3.58 (2H, m), 3.11 (2H, t), 2.12 (2H, m)
収量:57.96μmol 収率:37%
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 590.9, calculated for [(M-H)-] = 591.1
理論収量:57.96μmol
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 641.3, calculated for [(M-H)-] = 641.2
粗収量:16.65μmol 収率:28.7%
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 751.0, calculated for [(M-H)-] = 751.1
収量:8.39μmol 収率:67.2%
ESI-MS (negative ion mode) m/z, found = 697.9, calculated for [(M-H)-] = 699.1
IA8を用いて、sIgAに結合する結合核酸分子およびアミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できることを確認した。
アデニン、グアニンまたはシトシンを含むデオキシリボヌクレオチド(それぞれ、dATP、dGTP、およびdCTP)に加え、デオキシリボヌクレオチドとしてIA8を用いて作製した候補ポリヌクレオチドを用いた以外は、SELEX法によりターゲットに対する結合核酸分子を取得した。具体的には、ビーズ(Dynabeads MyOne Carboxylic Acid、Invitrogen社)にターゲットであるsIgA(MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製)またはヒト唾液アミラーゼ(Lee BioSolutions, Inc社製)を、添付のプロトコルに基づいて結合させた。前記結合後、セレクションバッファー(SBバッファー:40mmol/L HEPES、125mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、0.01%Tween(登録商標)20、pH7.5)で洗浄し、ターゲットビーズを調製した。5’末端をビオチン修飾した相補鎖(フォワード(Fw)プライマー領域−N30(30塩基)−リバース(Rv)プライマー領域)と、フォワードプライマーおよびDNAポリメラーゼ(KOD Dash、東洋紡社製)と、dATP、dGTP、dCTPおよびIA8とを用いて、IA8が挿入されたdsDNAを調製した。つぎに、前記ビーズ(Dynabeads MyOne Carboxylic Acid)に前記dsDNAを結合させた後、0.02mol/L NaOH水溶液によりss(single strand)DNAを溶出した。さらに、0.08mol/L 塩酸水溶液で中和することで、ssDNAのライブラリを調製した。20pmolのライブラリを250μgの前記ターゲットビーズと25℃、15分の条件で混合後、前記SBバッファーでビーズを洗浄した。そして、7mol/Lの尿素水溶液によりビーズ結合ssDNAを溶出した。溶出したssDNAを前記フォワードプライマーとビオチン修飾したリバースプライマーとを用いてPCRにより増幅した。なお、前記PCRでは、デオキシリボヌクレオチドとして、dATP、チミンを含むデオキシリボヌクレオチド(dTTP)、dGTP、およびdCTPを用いた。得られたdsDNAを磁気ビーズ(Dynabeads MyOne SA C1 magnetic beads、Invitrogen社製)に結合させた後、0.02mol/L NaOH水溶液によりフォワード鎖を溶出し、除去した。前記除去後、前記磁気ビーズを前記SBバッファーで洗浄した。前記相補鎖が固相化された磁気ビーズと、フォワードプライマーおよびDNAポリメラーゼ(KOD Dash、東洋紡社製)と、dATP、dGTP、dCTP、およびIA8とを用いて、前述の方法でIA8が挿入されたdsDNAを調製した。つぎに、0.02mol/L NaOH水溶液によりフォワード鎖を溶出することによりssDNAのライブラリを調製し、このライブラリを次のラウンドに使用した。同様の工程を8ラウンド実施することで、sIgAまたはアミラーゼに結合する核酸分子をセレクション後、フォワードプライマーと、ビオチン修飾していないリバースプライマーを用いてPCRを行なった。そして、シーケンサー(GS junior sequencer、Roche社製)により、得られた核酸分子のシーケンスを行った。
アミラーゼ結合核酸分子(配列番号1)
5’-GGAATCAGTCCGCCGCTAATACGCTGGTATGGTTGAAGTGCGTATTAGACATGTGAACGATCCTGTGCCCGATAAAG-3’
sIgA結合核酸分子(配列番号2)
5’-GGAATCAGTCCGCCGCTAATACTAGTCATCGCTTTTAATTTCGCATTGTACCGTGAACGATCCTGTGCCCGATAAAG-3’
前記アミラーゼ結合核酸分子とアミラーゼとの結合および前記sIgA結合核酸分子とsIgAとの結合を下記SPR条件により測定した。なお、前記アミラーゼ結合核酸分子および前記sIgA結合核酸分子は、下記リガンド2として、その3’末端に20塩基長のポリdTを付加したものを使用した。さらに、コントロールは、前記アミラーゼ結合核酸分子の結合を確認する系では、下記アナライトとして、前記sIgA、クロモグラニンA(CgA、Creative BioMart社製)、および牛血清アルブミン(BSA)を用い、前記sIgA結合核酸分子の結合を確認する系では、下記アナライトとして、前記アミラーゼ、CgA、およびBSAを用いた以外は、同様にして結合を確認した。
測定装置:ProteOn(商標)XPR36(BioRad社製)
測定チップ:ProteOn(商標)NLC Sensor Chip(BioRad社製)
リガンド1:5’末端をビオチン修飾したpolydT(20塩基長):5μmol/L
バッファー:40mmol/L HEPES、125mmol/L NaCl、1mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl、0.01% Tween(登録商標)20、pH7.4
リガンド2:200nmol/Lの3’末端にpolyA(20塩基長)を付加した結合核酸分子を含むバッファー
Ligand Flow Rate:25μL/min、80sec
アナライト(Analyte):400nmol/Lのターゲットを含むバッファー
Analyte Flow Rate:50μL/min
Contact Time:120sec
Dissociation:300sec
・アミラーゼ:α−アミラーゼ(Lee Biosolutions社製、カタログ番号:#120-10)
・sIgA: IgA (Secretory) ,Human(MP Biomedicals, LLC-Cappel Products社製、カタログ番号:#55905)
・CgA:Recombinant full length Human Chromogranin A(Creative BioMart社製、カタログ番号:#CHGA-26904TH)
・BSA:Bovine Serum Albumin(SIGMA社製、カタログ番号:#A7906)
前記リガンド2として、3’末端に20塩基長polyTを付加した前記アミラーゼ結合核酸分子を用い、アナライトであるアミラーゼの濃度を、12.5、25、50、100、または200nmol/Lとした以外は、前記(2)と同様にして、結合力の相対値(RU)を測定した。また、前記リガンド2として、3’末端に20塩基長polyTを付加した前記sIgA結合核酸分子を用い、アナライトであるsIgAの濃度を、12.5、25、50、100、または200nmol/Lとした以外は、前記(2)と同様にして、結合力の相対値(RU)を測定した。
前記アミラーゼ結合核酸分子とアミラーゼとの結合を下記キャピラリー電気泳動条件により測定した。なお、前記アミラーゼ結合核酸分子は、キット付属の蛍光色素で標識化したものを使用した。コントロールは、前記ターゲットにおいて、アミラーゼを添加しなかった以外は同様にして、測定した。
測定装置:SV1210形コスモアイ(日立ハイテクノロジー社)
測定チップ:i-チップ12(HitachiChemical社)
泳動ゲル:0.6%(Hydroxypropyl)methyl cellulose, viscosity 2.600-5,600(SIGMA社製、カタログ番号: #H7509)
ゲル溶解バッファー:40mmol/L HEPES(pH7.5)、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2
クローン:600nmol/Lのキット付属の蛍光色素で標識化したアミラーゼ結合核酸分子、40mmol/L HEPES(pH7.5)、125mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2を含む溶液
ターゲット:5.9μmol/Lのアミラーゼ(α-Amylase - High Purity ,Human 、Lee BioSolutions, Inc.社製、カタログ番号:#120-10)、40mmol/L HEPES(pH7.5)、125mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2を含む溶液
Folding:95℃、5min後、On ice 5min
Mixing:ターゲットを添加後、室温(25℃前後)、30分間、1000rpm
Injection Voltage:300V
Injection Time:120sec
Separation Voltage:350V
Separation Time:260sec
天然塩基のみを用いた場合、アミラーゼに結合する結合核酸分子を取得できないことを確認した。特に示さない限り、実施例2と同様の操作を行った。
AML2196R8m4(配列番号3)
GGTAAGACTCCCGCCAGATTTGGGTGGGGGGCGGGGGTGGAGGAGGTGGCGGTGAAGCCCTCGGTCGAAATC
AML1217R8m4(配列番号4)
GGAAACCCTGCGTCCTGAAATTGCGCTGCGATAGTGAAGGCATAACAGGTTCACTCATCTGTGCTGGCGGAATAG
Claims (10)
- 下記化学式(1)で表されることを特徴とする、ヌクレオシド誘導体またはその塩。
Suは、ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団またはヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団であり、保護基を有しても有しなくてもよく、
L1およびL2は、それぞれ独立して、直鎖もしくは分枝状の飽和または不飽和の炭素数2〜10の炭化水素基であり、
X1は、イミノ基(−NR1−)、エーテル基(−O−)、またはチオエーテル基(−S−)であり、
R1は、水素原子または直鎖もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の炭素数2〜10の炭化水素基である。 - X1が、イミノ基(−NR1−)である、請求項1記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
- L1が、ビニレン基(−CH=CH−)である、請求項1または2に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
- L2が、エチレン基(−CH2−CH2−)である、請求項1から3のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
- R1が、水素原子である、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
- 前記ヌクレオシド残基における糖骨格を有する原子団または前記ヌクレオチド残基における糖リン酸骨格を有する原子団が、下記化学式(2)で表される、請求項1から5のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体またはその塩。
R2は、水素原子、保護基、または下記化学式(3)で表される基であり、
R3は、水素原子、保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
R4は、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基、アミノ基、またはメルカプト基であり、
Yは、酸素原子または硫黄原子であり、
Zは、ヒドロキシル基またはイミダゾール基であり、
mは、1〜10の整数である。 - 請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの合成試薬。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を用い、ポリヌクレオチドを合成する合成工程を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチドの製造方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオシド誘導体もしくはその塩を含むヌクレオチド誘導体またはその塩を構成単位として含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
- 候補ポリヌクレオチドとターゲットとを接触させる接触工程、および
前記ターゲットと結合した前記候補ポリヌクレオチドを、前記ターゲットに結合する結合核酸分子として選抜する選抜工程を含み、
前記候補ポリヌクレオチドが、請求項9記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする、結合核酸分子の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
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