JPWO2015029892A1 - 水不溶性成形体の製造方法及び水不溶性成形体 - Google Patents

Abstract

ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体を、酸無水物を含む処理液で処理し、前記原料成形体を水不溶化させる工程を有する水不溶性成形体の製造方法であり、原料であるポリアニオン性多糖類本来の特性が保持されているとともに、化学架橋剤を用いる必要がないため安全性が高く、医療用材料、食品用材料、及び化粧品用材料等として有用な水不溶性成形体を簡便に製造することができる。

Description

本発明は、水不溶性成形体の製造方法、水不溶性成形体、癒着防止材、注入材、及び徐放性製剤に関する。

ヒアルロン酸やアルギン酸等のポリアニオン性多糖類は、適度な粘性、粘着性、保湿性、及び生体適合性を示すことが知られている。このため、これらのポリアニオン性多糖類及びその塩は、医療用材料、食品用材料、及び化粧品用材料等の原材料として幅広く用いられている。

なかでもヒアルロン酸は、保水性などの特徴的な物性に優れているとともに、安全性及び生体適合性が高いことから、食品、化粧品、及び医薬品等の様々な用途に利用されている。例えば医療分野では、ヒアルロン酸は関節潤滑剤や癒着防止材の原料などに利用されている。但し、原料となるヒアルロン酸ナトリウムは水溶性が高いため、用途によっては何らかの不溶化処理を施す必要がある。

これまで、カルボキシ基を利用した架橋反応によりヒアルロン酸ナトリウムを水不溶化させる方法について種々検討されている。例えば、特許文献１には、カルボジイミドを用いた架橋反応により、ヒアルロン酸やカルボキシメチルセルロース等のポリアニオン性多糖類の非水溶性誘導体を製造する方法が記載されている。

また、特許文献２及び３には、多価カチオンを用いてイオン結合させることにより、ヒアルロン酸やカルボキシアルキルセルロース等のポリアニオン性多糖類を水不溶化させる方法が記載されている。さらに、特許文献４には、金属塩を用いてカルボキシメチルセルロースをイオン交換し、水不溶化フィルムを得る方法が記載されている。

そして、特許文献５には、ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を酸性条件下で−２０℃に冷却し、分子内架橋を形成させて水不溶化する方法が記載されている。また、特許文献６には、粉末状ヒアルロン酸と無水酢酸とを濃硫酸の存在下で反応させてアセチル化することが記載されている。さらに、特許文献７には、アルコールを含む酸性の液を用いてヒアルロン酸ゲルを製造する方法が記載されている

特表２００３−５１８１６７号公報 特開平５−１２４９６８号公報 特開２００８−１３５１０号公報 特開平６−１２８３９５号公報 特開２００３−２５２９０５号公報 特開平８−５３５０１号公報 特開平５−５８８８１号公報

しかしながら、特許文献１に記載の方法では架橋剤を用いるため、医薬品等の人体に付与される用途等の安全性を考慮する場合には適用が困難な場合が多い。また、特許文献２〜４には、得られたフィルム等の水不溶性の程度については一切記載されていない。

さらに、特許文献５に記載の方法では、ヒアルロン酸ナトリウム水溶液のｐＨを１．２程度に調整する必要があるとともに、粘度が著しく上昇するため、成形等の取扱いが困難である。また、長期間にわたって凍結乾燥するため、冷却に要する電力コストの面においても課題があった。さらに、ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を酸性条件下におくと粘度が急激に上昇するため、成形が困難になり、用途が限定される場合がある。なお、特許文献５においては、分子内の架橋構造を確認しているが、不溶化の程度については言及していない。

また、特許文献６には、得られたヒアルロン酸のアセチル化物の水不溶性の程度については一切記載されていない。さらに、特許文献７に記載の方法で得られるヒアルロン酸ゲルは多量の水分を含むため、持ち上げることも難しい。このため、成形体の形状を維持したまま不溶化することは困難である。

本発明は、このような従来技術の有する問題点に鑑みてなされたものであり、その課題とするところは、原料であるポリアニオン性多糖類本来の特性が保持されているとともに、化学架橋剤を用いる必要がないため安全性が高く、医療用材料、食品用材料、及び化粧品用材料等として有用な水不溶性成形体を簡便に製造する方法を提供することにある。また、本発明の課題とするところは、上記の方法によって製造される水不溶性成形体、癒着防止材、注入材、及び徐放性製剤を提供することにある。

本発明者らは上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、酸無水物を含む処理液でポリアニオン性多糖類の水溶性塩を用いて形成した原料成形体を処理することによって、化学的架橋剤を用いることなく上記課題を達成することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、以下に示す水不溶性成形体の製造方法が提供される。
［１］ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体を、酸無水物を含む処理液で処理し、前記原料成形体を水不溶化させる工程を有する水不溶性成形体の製造方法。
［２］前記原料成形体の形状が、膜状、塊状、繊維状、棒状、管状、粉末状、粒子状、又はスポンジ状である前記［１］に記載の水不溶性成形体の製造方法。
［３］前記ポリアニオン性多糖類が、カルボキシアルキルセルロース、カルボキシメチルでんぷん、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、アルギン酸、ペクチン、及びカラギーナンからなる群より選択される少なくとも一種である前記［１］又は［２］に記載の水不溶性成形体の製造方法。
［４］前記酸無水物が、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水酪酸、無水フタル酸、及び無水マレイン酸からなる群より選択される少なくとも一種である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の水不溶性成形体の製造方法。
［５］前記処理液が、水及び水溶性有機溶媒の少なくともいずれかの媒体をさらに含む前記［１］〜［４］のいずれかに記載の水不溶性成形体の製造方法。
［６］前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、及びテトラヒドロフランからなる群より選択される少なくとも一種である前記［５］に記載の水不溶性成形体の製造方法。

また、本発明によれば、以下に示す水不溶性成形体が提供される。
［７］前記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法によって製造された水不溶性成形体。
［８］ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体から塩を構成するカチオン種の少なくとも一部を除去してなり、膨潤率が６，０００質量％以下である水不溶性成形体。
［９］ポリアニオン性多糖類からなる成形体であり、水により膨潤状態とした後に乾燥する操作を２回繰り返して得た乾燥体の質量が、前記操作前の乾燥質量の８０％以上である水不溶性成形体。
［１０］ｐＨ１２以上の水性媒体に溶解する前記［７］〜［９］のいずれかに記載の水不溶性成形体。
［１１］医療用材料、食品用材料、又は化粧品用材料である前記［７］〜［１０］のいずれかに記載の水不溶性成形体。

さらに、本発明によれば、以下に示す癒着防止材が提供される。
［１２］前記［７］〜［１１］のいずれかに記載の水不溶性成形体に、多価アルコール又は多価アルコール水溶液が保持されてなる癒着防止材。

また、本発明によれば、以下に示す注入材が提供される。
［１３］前記［７］〜［１１］のいずれかに記載の粉末状又は粒子状の水不溶性成形体を含有する注入材。
［１４］ヒアルロン酸の水溶性塩の水溶液をさらに含有する前記［１３］に記載の注入材。
［１５］関節変形治療用関節内注入材又は皮下注入材である前記［１３］又は［１４］に記載の注入材。

さらに、本発明によれば、以下に示す徐放性製剤が提供される。
［１６］前記［７］〜［１１］のいずれかに記載の水不溶性成形体と、薬学的に許容される有効成分とを含む徐放性製剤。

本発明の水不溶性成形体の製造方法によれば、原料であるポリアニオン性多糖類本来の特性が保持されているとともに、化学架橋剤を用いる必要がないため安全性が高く、医療用材料、食品用材料、及び化粧品用材料等として有用な水不溶性成形体を、化学的架橋剤を用いることなく簡便に製造することができる。

実施例１で得たヒアルロン酸ナトリウム膜（水不溶化処理前）の赤外吸収スペクトルである。 実施例１で得た水不溶性膜（水不溶化処理後）の赤外吸収スペクトルである。 実施例１で得たヒアルロン酸ナトリウム膜（水不溶化処理前）の蛍光Ｘ線スペクトルである。 実施例１で得た水不溶性膜（水不溶化処理後）の蛍光Ｘ線スペクトルである。

以下、本発明の実施の形態について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではない。

（水不溶性成形体及びその製造方法）
本発明の水不溶性成形体の製造方法は、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体を、酸無水物を含む処理液で処理し、原料成形体を水不溶化させて水不溶性成形体を形成する工程（水不溶化工程）を有する。以下、その詳細について説明する。

水不溶化工程で用いる原料成形体は、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩を用いて形成される。ポリアニオン性多糖類は、カルボキシ基やスルホン酸基等の負電荷を帯びた１以上のアニオン性基をその分子構造中に有する多糖類である。また、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩は、ポリアニオン性多糖類中のアニオン性基の少なくとも一部が塩を形成したものである。なお、ポリアニオン性多糖類中のアニオン性基は、多糖類の分子中に導入されたものであってもよい。

ポリアニオン性多糖類の具体例としては、カルボキシメチルセルロースやカルボキシエチルセルロース等のカルボキシアルキルセルロース、カルボキシメチルでんぷん、カルボキシメチルアミロース、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン−４−硫酸及びコンドロイチン−６−硫酸を含む）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、デルマタン硫酸、及びデルマタン−６−硫酸等を挙げることができる。これらのポリアニオン性多糖類は、一種単独で又は二種以上を組み合わせて用いることができる。

ポリアニオン性多糖類の水溶性塩としては、無機塩、アンモニウム塩、及び有機アミン塩等を挙げることができる。無機塩の具体例としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；亜鉛、鉄等の金属塩等を挙げることができる。

原料成形体は、例えば、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩を水に溶解させて得た水溶液を所望の形状に成形した後、乾燥等させることによって得ることができる。原料成形体の形状としては、例えば、膜状、塊状、繊維状、棒状、管状、粉末状、粒子状、及びスポンジ状等を挙げることができる。これらの形状の原料成形体を水不溶化させることによって、膜状、塊状、繊維状、棒状、管状、粉末状、粒子状、及びスポンジ状等の用途に応じた形状の水不溶性成形体を得ることができる。なお、必要に応じて、得られた水不溶性成形体をさらに成形して所望の形状に加工してもよい。

例えば、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩の水溶液を適当な容器に流し入れた後、乾燥又は凍結乾燥することによって、膜状（シート状）又は塊状（ブロック状、スポンジ状）の原料成形体を得ることができる。また、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩の水溶液をノズルから貧溶媒中に押し出すことによって、繊維状の原料成形体を得ることができる。ポリアニオン性多糖類の水溶性塩の水溶液を適当な管に充填した後、乾燥又は凍結乾燥することによって、棒状の原料成形体を得ることができる。また、乾燥したポリアニオン性多糖類を粉砕して粉体化することによって、粉末状又は粒子状の原料成形体を得ることができる。このように、本発明の水不溶性成形体の製造方法によれば、ポリアニオン性多糖類を所望とする形状に成形した後に水不溶化処理するため、用途に応じた形状の水不溶化物（水不溶性成形体）を得ることができる。

原料成形体を処理するために用いる処理液は、酸無水物を含有する。酸無水物の具体例としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水酪酸、無水フタル酸、及び無水マレイン酸等を挙げることができる。なかでも、無水酢酸及び無水プロピオン酸が好ましい。これらの酸無水物は、一種単独で又は二種以上を組み合わせて用いることができる。

処理液は、水及び水溶性有機溶媒の少なくともいずれかの媒体をさらに含むとともに、この媒体中に酸無水物が溶解又は分散していることが好ましい。このような媒体中に酸無水物が溶解又は分散した処理液を使用することで、原料成形体を十分かつ速やかに水不溶化させて水不溶性成形体を得ることができる。

水溶性有機溶媒の具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、及びテトラヒドロフラン等を挙げることができる。なかでも、メタノール、エタノール、及びジメチルスルホキシドが好ましい。これらの水溶性有機溶媒は、一種単独で又は二種以上を組み合わせて用いることができる。

処理液中の酸無水物の濃度は、通常、０．１〜５０質量％であり、５〜３０質量％であることが好ましい。酸無水物の濃度が０．１質量％未満であると、得られる水不溶性成形体の水不溶化の程度が不十分になる、或いは水不溶化に長時間を要する傾向にある。一方、酸無水物の濃度が５０質量％を超えると、効果が頭打ちになる傾向にある。

なお、ポリアニオン性多糖類は親水性が高いため、原料成形体をより十分かつ速やかに水不溶化させる観点から、処理液が媒体として水を含有することが好ましい。処理液中の水の含有量は、原料成形体が溶解又は膨潤しない程度とすることが好ましい。具体的には、処理液中の水の含有量は、０．０１〜５０質量％であることが好ましく、５〜２０質量％であることがさらに好ましい。処理液中の水の含有量が０．０１％未満であると、メタノール以外の溶媒では不溶化が不十分となる場合がある。また、処理液中の水の含有量が５０％超であると、得られる水不溶性成形体の形状維持が困難となる場合がある。

水不溶化工程においては、酸無水物を含む処理液で原料成形体を処理する。原料成形体を処理液で処理することによって原料成形体がその形状を維持したまま水不溶化され、水不溶性成形体が形成される。処理液で原料成形体を処理する方法は特に限定されないが、原料成形体の全体に処理液が接触するとともに、原料成形体の内部にまで処理液が浸透するように処理することが好ましい。具体的な処理方法としては、原料成形体を処理液中に浸漬する、原料成形体に処理液を塗布又は吹き付ける（噴霧する）等の方法を挙げることができる。

なお、粉末状又は粒子状の原料成形体を処理して水不溶化させる場合には、先ず、粉末状又は粒子状の原料成形体を、原料成形体を構成するポリアニオン性多糖類の水溶性塩の貧溶媒に分散させる。次いで、処理液を添加し、貧溶媒中に分散させた状態の粉末状又は粒子状の原料成形体と処理液を接触させ、原料成形体を処理液で処理すればよい。貧溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、及びテトラヒドロフラン等を用いることができる。これらの貧溶媒は、一種単独で又は二種以上を組み合わせて用いることができる。なお、この貧溶媒は、粉末状又は粒子状の原料成形体が溶解しない程度の微量な水を含有していてもよい。

また、処理の際の温度は、処理液の沸点を超えない温度であればよく、特に限定されない。ポリアニオン性多糖類の分解変性を抑制する観点、及び媒体や副生成物等の揮散を抑制する観点からは、処理の際の温度は０〜８０℃とすることが好ましく、０〜７０℃とすることがさらに好ましく、室温（２５℃）〜６０℃とすることが特に好ましい。但し、処理の際に処理液が揮散しない条件、例えば、ヒートプレスや熱ローラー等により処理すれば、分解変性等が生ずることなく、より短時間で水不溶性成形体を得ることができる。例えば、ヒートプレスや熱ローラー等により処理する場合、処理の際の温度は５０〜９０℃とすることが好ましく、処理時間は３０分以下とすることが好ましい。水不溶化工程の後、必要に応じて水や水溶性有機溶媒等を用いて洗浄すること等によって、本発明の水不溶性成形体を得ることができる。

ポリアニオン性多糖類のナトリウム塩を用いて形成した原料成形体を、無水酢酸のアルコール溶液で処理した場合に想定される反応を以下に示す。なお、想定した反応が水不溶化の一つの要因とはなりうるが、他の水不溶化要因との組み合わせ、あるいは全く別の要因により水不溶化している可能性もある。すなわち、本発明は想定される以下の反応によって何ら限定されるものではない。

反応式（１）中、Ｒ₁はポリアニオン性多糖類の主鎖を示し、Ｒ₂はアルコールの主鎖を示す。無水酢酸はアルコール存在下で開裂する際に、ポリアニオン性多糖類のナトリウムを奪い、カルボキシ基がナトリウム塩型から酸型となる。この点については、水不溶性成形体中のＮａ含量の測定、又は水不溶性成形体のアルカリ溶液による滴定によって確認することができる。

反応系に水が存在する場合には、上記反応式（１）で示される反応の他に、下記式（２）で示される反応が同時に進行し、カルボキシ基がナトリウム塩型から酸型となると予想される。

なお、得られる水不溶性成形体は、分子中のすべてのアニオン性基が酸型となってはいなくてもよい。

ポリアニオン性多糖類の水溶性塩を用いて形成した原料成形体を塩酸等の無機酸や酢酸等の有機酸に浸漬しても、十分に水不溶化した成形体を得ることは極めて困難である。また、処理液中の酸無水物を、この酸無水物に対応する酸に置き換えても水不溶性成形体を得ることはできない。このことから、ポリアニオン性多糖類のアニオン基が酸型に変化する以外の要因も加わり、水不溶性成形体が得られると予想される。

本発明の水不溶性成形体の製造方法においては化学的架橋剤を用いる必要がないため、得られる水不溶性成形体を構成する分子中に科学的架橋剤に由来する官能基等の構造が取り込まれることがない。このため、上記の製造方法によって製造される本発明の水不溶性成形体は、原料であるポリアニオン性多糖類本来の特性が保持されているとともに、安全性が高い。したがって、本発明の水不溶性成形体は、癒着防止材等の医療用材料の他、食品用材料や化粧品用材料として好適である。

なお、本明細書における「水不溶性」とは、水に容易に溶解しない性質を意味する。より具体的には、ポリアニオン性多糖類からなる本発明の水不溶性成形体は、水により膨潤状態とした後に乾燥する操作を２回繰り返して得た乾燥体の質量が、この操作前の乾燥質量の８０％以上である。

本発明の水不溶性成形体は、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体から塩を構成するカチオン種の少なくとも一部を除去することで製造される。そして、本発明の水不溶性成形体の膨潤率は、６，０００質量％以下であることが好ましく、９００質量％以下であることがさらに好ましく、１００〜５００質量％であることが特に好ましく、１５０〜３５０質量％であることが最も好ましい。このように、本発明の水不溶性成形体のうち、膨潤率が十分に低いものについては、癒着防止材等の医療用材料の他、食品用材料や化粧品用材料として好適である。本明細書における「膨潤率」とは、「水分保持前（膨潤前）の水不溶性成形体の質量」に対する、「水分保持後（膨潤後）の水不溶性成形体の質量」の割合（質量％）を意味する。なお、処理液中の水の量を、例えば２０質量％を超えない範囲で増加することで、比較的膨潤率の低い（例えば、６，０００質量％以下の）水不溶性成形体を製造することができる。また、処理液中の酸無水物の量を増加すること（例えば上限２０質量％）で、比較的膨潤率の低い（例えば、６，０００質量％以下の）水不溶性成形体を製造することができる。

本発明の水不溶性成形体は、化学的架橋剤を用いることなく、酸無水物を含む処理液でポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体を処理し、原料成形体を水不溶化させて得られたものである。このため、本発明の水不溶性成形体は、それを構成するポリアニオン性多糖類の分子が実質的に架橋していない。さらに、ポリアニオン性多糖類には、新たな共有結合が実質的に形成されていない。但し、本発明の水不溶性成形体を構成するポリアニオン性多糖類の分子間には、水素結合、疎水結合、及びファンデルワールス力などの物理的結合が形成されていると推測される。そのような物理的結合がポリアニオン性多糖類の分子間で形成されている点については、赤外吸収スペクトルを測定することによって確認することができる。

本発明の水不溶性成形体は、酸性からアルカリ性までの広範なｐＨ域において安定して水不溶性なものである。但し、本発明の水不溶性成形体は、例えばｐＨ１２以上の水性媒体に接触又は浸漬等した場合には、分子間同士の物理的結合が解離して容易に溶解しうる。

（癒着防止材及びその製造方法）
次に、本発明の癒着防止材の製造方法について説明する。本発明の癒着防止材の製造方法は、前述の水不溶性成形体に多価アルコール又は多価アルコール水溶液を保持させる工程を有する。多価アルコールの具体例としては、エチレングルコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、メチルグリセロール、ポリオキシエレングリコシド、マルチトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、還元水飴、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール、バリン、プロピレングリコール、グリセリン（グリセロール）、ポリグリセリン、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができる。なかでも、グリセリン、キシリトール、ソルビトール、低分子ポリエチレングリコール等、医療分野や食品分野で使用されている多価アルコールが好適に用いられる。これらの好適に用いられる多価アルコールは、市場から入手してそのまま使用できる。グリセリン、ソルビトール等については、日本薬局方に適合したものを用いることが望ましい。グリセリンは、静脈への注射剤としても使用されるほど安全性の高い素材であるために特に好ましい。

水不溶性成形体に多価アルコール又は多価アルコール水溶液を保持させる方法としては、例えば、水不溶性成形体を多価アルコール又は所定濃度の多価アルコール水溶液に浸漬する方法等がある。すなわち、所定形状の水不溶性成形体を多価アルコール水溶液に浸漬し、水不溶性成形体の内部を多価アルコール水溶液で置換することで、所望とする濃度の多価アルコール水溶液を保持させて、所望とする本発明の癒着防止材を得ることができる。

（注入材）
本発明の注入材は、前述の水不溶性成形体のうち、その形状が粉末状又は粒子状の水不溶性成形体を含有する。本発明の注入材は、水不溶化していないヒアルロン酸の水溶性塩の水溶液等の液媒体をさらに含有してもよい。本発明の注入材を構成する水不溶性成形体は、前述の通り、化学的架橋剤を用いることなく製造されうるものであり、原料であるポリアニオン性多糖類本来の特性が保持されているため、安全性に優れている。また、本発明の注入材は粉末状又は粒子状の水不溶性成形体を含有するために流動性が高く、粉末又は粒子の粒径を適宜調整することで、患部等に注射針を経由して容易に注入することができる。このため、本発明の注入材は、例えば、関節変形治療用関節内注入剤、及び皮下注入剤等として有用である。

（徐放性製剤）
本発明の徐放性製剤は、前述の水不溶性成形体と、薬学的に許容される有効成分とを含む。本発明の徐放性製剤を構成する水不溶性成形体は、前述の通り、化学的架橋剤を用いることなく製造されうるものであり、原料であるポリアニオン性多糖類本来の特性が保持されているため、安全性に優れている。また、水不溶性成形体は生体内で徐々に分解して吸収されるので、有効成分を徐々に放出することができる。なお、有効成分の種類は薬学的に許容されるものであれば特に限定されない。

徐放性製剤の態様としては、例えば、シート状に成形された水不溶性成形体に有効成分又はその溶液等を含浸させたものや、水不溶性成形体からなるカプセルと、このカプセル内に封入された有効成分とからなるもの等を挙げることができる。シートやカプセルの厚みや形状等を適宜設定することで、生体内での徐放性を制御することができる。

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例、比較例中の「％」は、特に断らない限り質量基準である。

（実施例１）
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量（公称値）：８０万、キッコーマンバイオケミファ社製）１．０ｇと水９９．０ｇを混合し、ビーカー中で撹拌して均一な水溶液を得た。得られた水溶液をステンレス製バットに流し入れ、３０℃で乾燥してヒアルロン酸ナトリウム膜を得た。得られたヒアルロン酸ナトリウム膜を１００ｍＬの処理液（１体積％無水酢酸／メタノール溶液）に浸漬し、室温で１８時間放置して水不溶化処理した。水不溶化処理した膜をメタノール、８０体積％メタノール水溶液、及び水の順で洗浄して水不溶性膜を得た。

図１は、実施例１で得たヒアルロン酸ナトリウム膜（水不溶化処理前）の赤外吸収スペクトルである。また、図２は、実施例１で得た水不溶性膜（水不溶化処理後）の赤外吸収スペクトルである。図１及び２に示すように、水不溶化処理することで、解離したカルボキシ基に由来する１４００ｃｍ^-1（矢印１（図１））及び１６００ｃｍ^-1（矢印２（図１））の吸収が減少し、非解離のカルボキシ基に由来する１２２０ｃｍ^-1（矢印３（図２））及び１７３０ｃｍ^-1（矢印４（図２））の吸収が増加したことが分かる。

図３は、実施例１で得たヒアルロン酸ナトリウム膜（水不溶化処理前）の蛍光Ｘ線スペクトルである。また、図４は、実施例１で得た水不溶性膜（水不溶化処理後）の蛍光Ｘ線スペクトルである。これらの図（スペクトル）を比較することで、水不溶化処理による膜中のナトリウムの変化量が分かる。すなわち、図３及び４に示すように、膜中のナトリウム量は、水不溶化処理によって１／４程度にまで減少したことが分かる。

また、実施例１で得たヒアルロン酸ナトリウム膜（水不溶化処理前）及び水不溶性膜（水不溶化処理後）について、¹³Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。その結果、水不溶化処理しても、Ｏ−アセチル基、及びカルボキシ基と水酸基とのエステル結合は観察されなかった。以上の結果から、水不溶化処理によって反応式（１）及び（２）で示される反応が生じており、これらの反応を含めた、いくつかの要因がヒアルロン酸ナトリウム膜の水不溶化に寄与していることが予想される。

（実施例２〜１３、比較例１〜３）
表１に示す種類のポリアニオン性多糖類の水溶性塩及び処理液を用いたこと以外は、前述の実施例１と同様にして水不溶性膜を得た。

（評価１：溶解度試験）
２ｃｍ角に切断した水不溶性膜を直径３．５ｃｍ、深さ１．５ｃｍの容器に入れ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）５ｍＬを加えた。この容器を３７℃に調整した振盪機に入れ、１０〜２０ｒｐｍで振盪した。水不溶性膜の経時的な状態変化を目視観察し、以下に示す評価基準にしたがって膜の水不溶性を評価した。結果を表２に示す。
◎：膜は水不溶化されており、原形が保持されていた。
○：膜は水不溶化されていたが、断片化していた。
△：膜は水不溶性のゲルとなっており、原形は保持されていなかった。
×：膜は水不溶化されておらず、溶解していた。

（評価２：膨潤率の測定）
以下の手順によって、作製した水不溶性膜の膨潤率を測定した。乾燥状態の水不溶性膜の質量を測定し「膨潤前質量」とした。次に、水不溶性膜を十分な水に浸漬し、室温で１時間静置した。十分膨潤した水不溶性膜の表面に付着した余分な水分を紙タオル等で除去し、質量を測定して「膨潤後質量」とした。「膨潤率」とは、「膨潤前質量」に対する「膨潤後質量」の割合（質量％）を意味する。結果を表２に示す。なお、実施例１で製造した水不溶性膜は、浸漬した水から持ち上げること、及びその表面に付着した余分な水分を除去することが困難であったため、膨潤率を測定することができなかった。

（評価３：非溶解率の測定）
作製した水不溶性膜を十分な量の水（２５℃）に１時間浸漬して膨潤させた後、クリーンベンチ等の送風下にて乾燥させた。膨潤と乾燥を２回繰り返す膨潤・乾燥処理を行った後、得られた乾燥体の質量を測定した。そして、下記式にしたがって非溶解率を算出した。結果を表２に示す。なお、実施例１で製造した水不溶性膜は、浸漬した水から持ち上げることが困難であったため、非溶解率を測定することができなかった。
非溶解率（％）＝（Ｙ／Ｘ）×１００
Ｘ：膨潤・乾燥処理前（初期）の水不溶性膜の乾燥体の質量（ｇ）
Ｙ：膨潤・乾燥処理後の水不溶性膜の乾燥体の質量（ｇ）

（比較例４）
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量（公称値）：８０万、キッコーマンバイオケミファ社製）１．０ｇと水９９．０ｇを混合し、ビーカー中で撹拌して均一にした後、１Ｎ塩酸を添加してｐＨ２．５の水溶液を調製した。得られた水溶液をステンレス製バットに流し入れ、３０℃で乾燥して膜を形成した。形成した膜について前述の「溶解度試験」を実施したところ、膜は吸水して塊状に膨潤し、原形を留めなかった。また、塊状に膨潤した膜は徐々に溶解して小さくなっていった。

（実施例１４）
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量（公称値）：８０万、キッコーマンバイオケミファ社製）１．０ｇと水９９．０ｇを混合し、ビーカー中で撹拌して均一な水溶液を得た。得られた水溶液をステンレス製バットに流し入れ、３０℃で乾燥してヒアルロン酸ナトリウム膜を得た。得られたヒアルロン酸ナトリウム膜を１００ｍＬの処理液（無水酢酸１００％）に浸漬して室温で１８時間放置したが、十分に水不溶化させることはできなかった。一方、得られたヒアルロン酸ナトリウム膜を１００ｍＬの処理液（無水酢酸１００％）に浸漬し、室温で１０日間放置して水不溶化処理した。水不溶化処理した膜をメタノール、８０体積％メタノール水溶液、及び水の順で洗浄して水不溶性膜を得た。得られた水不溶性膜について前述の「溶解度試験」を実施したところ、膜の原形は７２時間以上保持されていた。

（実施例１５）
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量（公称値）：８０万、キッコーマンバイオケミファ社製）１．０ｇと水９９．０ｇを混合し、ビーカー中で撹拌して均一な水溶液を得た。得られた水溶液をステンレス製バットに流し入れ、−３０℃で凍結させた後、棚加熱温度１２０℃で凍結乾燥することにより、ヒアルロン酸ナトリウムからなるスポンジ状の成形体を得た。得られたスポンジ状の成形体を１００ｍＬの処理液（１０％無水酢酸／メタノール溶液）に浸漬し、室温で１８時間放置して水不溶化処理した。水不溶化処理した成形体をメタノール、８０体積％メタノール水溶液、及び水の順で洗浄して、水不溶性のスポンジ状成形体を得た。得られた水不溶性のスポンジ状成形体について、前述の「溶解度試験」を実施したところ、スポンジ状の原形が７２時間以上保持されていた。

（実施例１６）
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量（公称値）：８０万、キッコーマンバイオケミファ社製）１０ｇを水９０ｇに溶解させて、均一で粘稠なヒアルロン酸ナトリウム水溶液を得た。得られたヒアルロン酸ナトリウム水溶液を１８ゲージ針を装着したシリンジに入れて押し出すことにより、繊維状の成形体を得た。得られたスポンジ状の成形体は粘度が高いため、繊維状に保持されていた。得られたスポンジ状の成形体を１００ｍＬの処理液（１０％無水酢酸／メタノール溶液）に浸漬し、室温で１８時間放置して水不溶化処理した。水不溶化処理した成形体をメタノール、８０体積％メタノール水溶液、及び水の順で洗浄して、水不溶性の繊維状成形体を得た。得られた水不溶性の繊維状成形体について、前述の「溶解度試験」を実施したところ、繊維状の原形が７２時間以上保持されていた。

（実施例１７）
実施例１５で製造した水不溶性のスポンジ状成形体を繭型に切り出した後、市販の化粧水を含浸させた。繭型のスポンジ状成形体は、化粧水に溶解することはなかった。また、肌への貼り付き性が高いため、目元貼付用の化粧材として使用することができた。

（実施例１８）
１２ｃｍ×９ｃｍのサイズに切り出した実施例５で製造した水不溶性膜を、１０体積％グリセリン水溶液に浸漬した後、風乾して滅菌用袋に封入した。２５ｋＧｙの放射線を照射して滅菌用袋ごと滅菌して癒着防止膜を得た。成犬（ビーグル犬、雌、１．５歳、体重約１０ｋｇ）を全身麻酔処置後に開腹し、腹側壁表皮を３ｃｍ角に剥離した。剥離部分を覆うように癒着防止膜を配置して閉腹した。２週間後、同犬を全身麻酔処置後に開腹したところ、癒着は発生していなかった。また、犬の体内に配置（埋植）した癒着防止膜は、埋植後２週間で消失していた。これは、生体内のナトリウムイオン等によって癒着防止膜を構成するヒアルロン酸のカルボキシ基が徐々に中和され、可溶性のヒアルロン酸塩と変化して溶解し、生体内に吸収されたものと推測される。これに対して、癒着防止膜を配置することなく閉腹した犬については、剥離部分と腸に癒着が生じていることが観察された。

（実施例１９〜２１）
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量（公称値）：８０万、キッコーマンバイオケミファ社製）１．０ｇと水９９．０ｇを混合し、ビーカー中で撹拌して均一な水溶液を得た。得られた水溶液をステンレス製バットに流し入れ、３０℃で乾燥してヒアルロン酸ナトリウム膜を得た。得られたヒアルロン酸ナトリウム膜を１００ｍＬの処理液（２０％無水酢酸／メタノール溶液）に浸漬し、室温（２５℃）で１８時間（実施例１９）、５０℃で１時間（実施例２０）、及び８５℃で５分間（実施例２１）放置して水不溶化処理した。水不溶化処理した膜をメタノール、８０体積％メタノール水溶液、及び水の順で洗浄して水不溶性膜を得た。得られた水不溶性膜について、前述の「評価１：溶解度試験」を行って水不溶性を評価した。その結果、いずれも水不溶化されており、７２時間以上膜の原形が保持されることを確認した。また、得られた水不溶性膜の膨潤率は、それぞれ２４４％（実施例１９）、１９２％（実施例２０）、及び１６１％（実施例２１）であった。

（評価４：溶解性）
実施例５で製造した水不溶性膜１ｇを１０体積％炭酸ナトリウム水溶液に浸漬したところ、３０分後に溶解した。一方、実施例５で製造した水不溶性膜１ｇを水に浸漬したところ、３０分経過しても溶解せず、原形を留めていた。以上より、本実施形態の水不溶性膜は、ナトリウム塩（ナトリウムイオン）存在下においてヒアルロン酸のカルボキシ基が中和され、可溶性のヒアルロン酸塩と変化して徐々に溶解することが確認された。

（評価５：分解性）
実施例５で製造した水不溶性膜１ｇを５０００ユニット／ｍＬのヒアルロニダーゼ水溶液に浸漬し、３７℃に調整した振盪機に入れて１０〜２０ｒｐｍで振盪した。一方、実施例５で製造した水不溶性膜１ｇをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃に調整した振盪機に入れて１０〜２０ｒｐｍで振盪する対照試験も行った。５日後、ＰＢＳ緩衝液に浸漬した水不溶性膜は原形を留めていたが、ヒアルロニダーゼ水溶液に浸漬した水不溶性膜は完全に溶解していた。本実施形態の水不溶性膜はヒアルロン酸骨格を保持しているため、ヒアルロニダーゼによって分解されたといえる。以上より、本実施形態の水不溶性膜は、生体内に配置された場合においても、水溶性ヒアルロン酸と同様の代謝経路によって代謝されると推測される。

（評価６：長期溶解度試験）
実施例５で製造した水不溶性膜を２ｃｍ角に切断し、直径３．５ｃｍ、深さ１．５ｃｍの容器に入れ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）５ｍＬを加えた。この容器を３７℃に調整した振盪機に入れ、１０〜２０ｒｐｍで振盪した。その結果、３ヶ月以上経過しても膜の原形が保持されていることが判明した。

（実施例２２）
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量（公称値）：８０万、キッコーマンバイオケミファ社製）の粉末１．０ｇをエタノール６４．０ｍＬに加え、ビーカー中で撹拌して分散液を得た。次に、水１６．０ｍＬを加えてさらに撹拌した。無水酢酸２０ｍＬを加えた後、室温で１８時間撹拌を続けて水不溶化処理した。水不溶化処理した粉末をメタノール、８０体積％メタノール水溶液、及び水の順で洗浄して、水不溶性粉末（水不溶性のヒアルロン酸粉末）を得た。得られた水不溶性粉末について、前述の「評価１：溶解度試験」を行って水不溶性を評価した。その結果、粉末の質量が７２時間以上保持されることを確認した。また、得られた水不溶性粉末を実施例１８と同様の動物実験に供試した。その結果、癒着防止効果を有することを確認した。

本発明の水不溶性成形体は、医療用材料、食品用材料、及び化粧品用材料等として有用である。

すなわち、本発明によれば、以下に示す水不溶性成形体の製造方法が提供される。
［１］ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体を、酸無水物を含む処理液で処理し、前記原料成形体の形状を維持したまま前記原料成形体を水不溶化して水不溶性成形体を形成する工程を有する水不溶性成形体の製造方法。
［２］前記原料成形体の形状が、膜状、塊状、繊維状、棒状、管状、粉末状、粒子状、又はスポンジ状である前記［１］に記載の水不溶性成形体の製造方法。
［３］前記ポリアニオン性多糖類が、カルボキシアルキルセルロース、カルボキシメチルでんぷん、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、アルギン酸、ペクチン、及びカラギーナンからなる群より選択される少なくとも一種である前記［１］又は［２］に記載の水不溶性成形体の製造方法。
［４］前記酸無水物が、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水酪酸、無水フタル酸、及び無水マレイン酸からなる群より選択される少なくとも一種である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の水不溶性成形体の製造方法。
［５］前記処理液が、水及び水溶性有機溶媒の少なくともいずれかの媒体をさらに含む前記［１］〜［４］のいずれかに記載の水不溶性成形体の製造方法。
［６］前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、及びテトラヒドロフランからなる群より選択される少なくとも一種である前記［５］に記載の水不溶性成形体の製造方法。

また、本発明によれば、以下に示す水不溶性成形体が提供される。
［７］前記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法によって製造された水不溶性成形体。
［８］ｐＨ１２以上の水性媒体に溶解する前記［７］に記載の水不溶性成形体。
［９］医療用材料、食品用材料、又は化粧品用材料である前記［７］又は［８］に記載の水不溶性成形体。

さらに、本発明によれば、以下に示す癒着防止材が提供される。
［１０］前記［７］〜［９］のいずれかに記載の水不溶性成形体に、多価アルコール又は多価アルコール水溶液が保持されてなる癒着防止材。

また、本発明によれば、以下に示す注入材が提供される。
［１１］前記［７］〜［９］のいずれかに記載の粉末状又は粒子状の水不溶性成形体を含有する注入材。
［１２］ヒアルロン酸の水溶性塩の水溶液をさらに含有する前記［１１］に記載の注入材。
［１３］関節変形治療用関節内注入材又は皮下注入材である前記［１１］又は［１２］に記載の注入材。

さらに、本発明によれば、以下に示す徐放性製剤が提供される。
［１４］前記［７］〜［９］のいずれかに記載の水不溶性成形体と、薬学的に許容される有効成分とを含む徐放性製剤。

例えば、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩の水溶液を適当な容器に流し入れた後、乾燥又は凍結乾燥することによって、膜状（シート状）又は塊状（ブロック状、スポンジ状）の原料成形体を得ることができる。また、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩の水溶液をノズルから貧溶媒中に押し出すことによって、繊維状の原料成形体を得ることができる。ポリアニオン性多糖類の水溶性塩の水溶液を適当な管に充填した後、乾燥又は凍結乾燥することによって、棒状の原料成形体を得ることができる。また、乾燥したポリアニオン性多糖類を粉砕して粉体化することによって、粉末状又は粒子状の原料成形体を得ることができる。このように、本発明の水不溶性成形体の製造方法によれば、ポリアニオン性多糖類の水溶性塩を所望とする形状に成形した後に水不溶化処理するため、用途に応じた形状の水不溶化物（水不溶性成形体）を得ることができる。

Claims (16)

1. ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体を、酸無水物を含む処理液で処理し、前記原料成形体を水不溶化させる工程を有する水不溶性成形体の製造方法。
2. 前記原料成形体の形状が、膜状、塊状、繊維状、棒状、管状、粉末状、粒子状、又はスポンジ状である請求項１に記載の水不溶性成形体の製造方法。
3. 前記ポリアニオン性多糖類が、カルボキシアルキルセルロース、カルボキシメチルでんぷん、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、アルギン酸、ペクチン、及びカラギーナンからなる群より選択される少なくとも一種である請求項１又は２に記載の水不溶性成形体の製造方法。
4. 前記酸無水物が、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水酪酸、無水フタル酸、及び無水マレイン酸からなる群より選択される少なくとも一種である請求項１〜３のいずれか一項に記載の水不溶性成形体の製造方法。
5. 前記処理液が、水及び水溶性有機溶媒の少なくともいずれかの媒体をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の水不溶性成形体の製造方法。
6. 前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、及びテトラヒドロフランからなる群より選択される少なくとも一種である請求項５に記載の水不溶性成形体の製造方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法によって製造された水不溶性成形体。
8. ポリアニオン性多糖類の水溶性塩からなる原料成形体から塩を構成するカチオン種の少なくとも一部を除去してなり、膨潤率が６，０００質量％以下である水不溶性成形体。
9. ポリアニオン性多糖類からなる成形体であり、水により膨潤状態とした後に乾燥する操作を２回繰り返して得た乾燥体の質量が、前記操作前の乾燥質量の８０％以上である水不溶性成形体。
10. ｐＨ１２以上の水性媒体に溶解する請求項７〜９のいずれか一項に記載の水不溶性成形体。
11. 医療用材料、食品用材料、又は化粧品用材料である請求項７〜１０のいずれか一項に記載の水不溶性成形体。
12. 請求項７〜１１のいずれか一項に記載の水不溶性成形体に、多価アルコール又は多価アルコール水溶液が保持されてなる癒着防止材。
13. 請求項７〜１１のいずれか一項に記載の粉末状又は粒子状の水不溶性成形体を含有する注入材。
14. ヒアルロン酸の水溶性塩の水溶液をさらに含有する請求項１３に記載の注入材。
15. 関節変形治療用関節内注入材又は皮下注入材である請求項１３又は１４に記載の注入材。
16. 請求項７〜１１のいずれか一項に記載の水不溶性成形体と、薬学的に許容される有効成分とを含む徐放性製剤。

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