JPWO2014208611A1 - ポリアミノ酸の製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体（例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）（γ-PGA）とフェニルアラニンエチルエステル（PAE）とのグラフト共重合体（γ-PGA-PAE））、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体、前記イオン化されたグラフト共重合体を含むナノ粒子、ならびにこれらの製造方法に関する。このようにして得られたナノ粒子は、ワクチンを製造するためのアジュバントとして有用である。

Description

本発明は、ワクチンを製造するためのアジュバントとして有用な、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体（例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）（γ-PGA）とフェニルアラニンエチルエステル（PAE）とのグラフト共重合体（γ-PGA-PAE））、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体、前記イオン化されたグラフト共重合体を含むナノ粒子、ならびにこれらの製造方法に関する。
 発明の背景
近年、ナノ粒子を薬物の担体として利用する研究がある（特許文献１および２参照）。
特許文献３は、ポリアミノ酸（例えば、γ-PGA）やポリアミノ酸と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体（例えば、γ-PGA-PAE）が、樹状細胞の分化成熟を促進すること、すなわちアジュバントとして作用すること、ならびにそのアジュバント作用がグラフト共重合体のナノ粒子化により増強されることを開示している。
また、特許文献３の実施例１は、γ-PGAにカルボジイミド塩酸塩とPAEを反応させたのちに脱塩する塩析法を用いるγ-PGA-PAEの製造方法ならびにγ-PGA-PAEからナノ粒子を製造する方法を開示している。
特開平６−９２８７０号公報 特開平６−２５６２２０号公報 国際公開第２００６／１１２４７７号パンフレット
ワクチンのアジュバントとして有用な、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体を、大量かつ短時間に製造する方法が求められている。
発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、グラフト共重合体の単離に酸添加による沈殿法を用いることによって、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体のフリー体を、短期間に高収率で製造する方法を見出した。
さらに、本発明者らは、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体のフリー体を部分的または全体にイオン化することにより、従来よりも高効率かつ再現性良くナノ粒子を得る方法を見出した。この方法により、さらに製造設備の縮小と廃液の削減が可能になる。また、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体のフリー体のままでは、従来はナノ粒子化が困難であったものに対しても部分的または全体にイオン化することにより、ナノ粒子化が容易となる。
すなわち、本発明は、
[１] ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体の製造方法であって、以下の工程：
（１）前記ポリアミノ酸またはその塩と、前記一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とを縮合させて、グラフト共重合体を得る工程；および
（２）工程（１）で得られたグラフト共重合体に酸を作用させて、グラフト共重合体を単離する工程
を含む、製造方法；
[２] 工程（２）において０〜８０℃の温度でグラフト共重合体に酸を作用させる、前記［１］記載の製造方法；
[３] ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）である、前記[１]記載の製造方法；
[４] 疎水性第１級アミン化合物が、α−アミノ酸誘導体である、前記[１]記載の製造方法；
[５] α−アミノ酸誘導体が、フェニルアラニン誘導体である、前記[４]記載の製造方法；
[６] フェニルアラニン誘導体が、フェニルアラニンエチルエステルである、前記[５]記載の製造方法；
[７] 前記[１]に記載の方法で製造された、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体；
[８] ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体の製造方法であって、以下の工程：
前記ポリアミノ酸またはその塩と、前記疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体に、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の炭酸水素塩、アルカリ金属のリン酸塩、アルカリ金属のリン酸一水素塩、アルカリ金属のリン酸二水素塩、アルカリ金属の有機酸塩、またはアルカリ金属の酸性アミノ酸塩を作用させて、グラフト共重合体をイオン化する工程を含む、製造方法；
[９] 一般式（ＩＩ）：
Figure 2014208611
 ［式中、Ｍはアルカリ金属を示し、Ａは疎水性部位を示し、ｎは１０〜１００，０００の整数を示す。３種類のモノマーユニット間の斜線はモノマーユニットの配列順序が不規則であることを示す。ｘは、一般式（ＩＩＩ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｙは、一般式（ＩＶ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｚは、一般式（Ｖ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｘ、ｙおよびｚは、下式：
Figure 2014208611
 を満たす。］で表されるイオン化されたグラフト共重合体；
[１０] 一般式（ＩＩＩ）で表されるモノマーユニットのモル分率ｘが０である前記[９]記載のイオン化されたグラフト共重合体；
[１１] ｎが５０〜１０,０００である、前記[９]記載のイオン化されたグラフト共重合体；
[１２] −１５,０００〜０の疎水性パラメーターＫを有する、前記[９]記載のイオン化されたグラフト共重合体；
[１３] ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体を含む、ナノ粒子の製造方法であって、
前記[８]記載の製造方法で得られたイオン化されたグラフト共重合体をナノ粒子化する工程を含む、ナノ粒子の製造方法；
[１４] 以下の工程：
（１） ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とを縮合させる工程；
（２） 工程（１）で得られた縮合物に酸を作用させて、グラフト共重合体を単離する工程；
（３） 工程（２）で単離したグラフト共重合体に、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の炭酸水素塩、アルカリ金属のリン酸塩、アルカリ金属のリン酸一水素塩、アルカリ金属のリン酸二水素塩、アルカリ金属の有機酸塩、またはアルカリ金属の酸性アミノ酸塩を作用させて、グラフト共重合体をイオン化する工程；
（４） 工程（３）で得られたイオン化されたグラフト共重合体を、ナノ粒子化する工程を含む、前記[１３]に記載のナノ粒子の製造方法；
[１５] 前記[１３]の方法で製造された、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体を含む、ナノ粒子；
[１６] アジュバントとして用いられる、前記[１５]記載のナノ粒子；
[１７] 前記[１５]記載のナノ粒子を含む、ワクチン；
に関する。
本発明によれば、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体を、従来よりも短時間で、高収率に得ることができる。
さらに、本発明によれば、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体を含むナノ粒子を高効率かつ再現性良く得ることができる。
本発明によるγ-PGA-PAEのナノ粒子がワクチンのアジュバントとして優れた性能を有しているいることを示すグラフ。
本発明の第１の態様は、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体、およびその製造方法に関する。
本発明の第１の態様によるグラフト共重合体の製造方法は、以下の工程：
（１）前記ポリアミノ酸またはその塩と、前記一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とを縮合させて、グラフト共重合体を得る工程；および
（２）工程（１）で得られたグラフト共重合体に酸を作用させて、グラフト共重合体を単離する工程
を含む。
本明細書中、「ポリアミノ酸」とは、複数のアミノ酸が結合したアミノ酸鎖を意味する。
ポリアミノ酸を構成するアミノ酸としては、グルタミン酸（例、α−グルタミン酸、γ−グルタミン酸）、アスパラギン酸、リジン、アスパラギン、アルギニン等が挙げられる。
また、ポリアミノ酸中の構成アミノ酸は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもその混合物であってもよい。
ポリアミノ酸中の構成アミノ酸の結合は、ペプチド結合、エステル結合やエーテル結合のようなペプチド結合以外の結合、あるいはグルタルアルデヒドやジイソシアネートのようなリンカーを介した結合でもよいが、ペプチド結合が一般的である。
好適な実施形態では、ポリアミノ酸は、数平均分子量が１〜２０,０００ｋＤａであり、好ましくは２０ｋＤａ〜３,０００ｋＤａである。なお、本明細書中の分子量とは、相対分子量であっても絶対分子量であってもよい。例えば、相対分子量は、以下に示すＳＥＣ−ＨＰＬＣ測定における分子量測定法で得られた数値のものを示す；ＴＳＫｇｅｌ α−Ｍ ３００Ｘ７．８ ｍｍ Ｉ． Ｄ． （ｄｕａｌ）, ５ ｍＭ ＮａＮＯ３ ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ （９：１）, ０．８ ｍＬ／分, ４０℃, ＲＩ検出器, スタンダード:プルラン(Ｓｈｏｄｅｘ)。絶対分子量は、以下の示すＳＥＣ−ＨＰＬＣ条件における分子量測定法で得られた数値のものを示す；ＴＳＫｇｅｌＧＭＰＷＸＬ, ３００Ｘ７．８ ｍｍ Ｉ． Ｄ． （ｄｕａｌ）, ０．１Ｍ ＮａＮＯ３, ０．８ｍＬ／ｍｉｎ, ４０℃, ＲＩ検出器, 粘度計, ＤＬＳ検出器,ＳＬＳ検出器による同時検出。
ポリアミノ酸の具体例としては、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−アスパラギン酸）、ポリ（ε−リジン）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（α−リジン）が挙げられるが、中でもポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（α−アスパラギン酸）が好ましい。最も好ましくは、ポリ（γ−グルタミン酸）である。
本発明において用いられるポリアミノ酸の塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ-メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）等との塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、乳酸、安息香酸等との塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましく、中でもナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などが挙げられるが、ナトリウム塩が特に好ましい。
本明細書中、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物において、「疎水性部位」を示すＡ−とは、ベンゼン環などの芳香環基を有する誘導体や、Ｃ３−８の炭素鎖を有する誘導体や、Ｃ８−２２の直鎖脂肪鎖を有する誘導体や、Ｒ１−（ＣＨＲ２）−で表される誘導体や、Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体を意味する。
上記Ａ−で表される「芳香環基を有する誘導体」としては、例えば、置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル）、置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル、フェニルプロピル）、および置換基を有していてもよい芳香族複素環基等が挙げられる。
上記Ａ−で表される「置換基を有していてもよい芳香族複素環基」の芳香族複素環基としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環基が挙げられる。
該「芳香族複素環基」の好適な例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの５ないし６員単環式芳香族複素環基；
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環基が挙げられる。
上記Ａ−で表される「置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基」の置換可能な位置における置換基の数は、例えば、１ないし５個、好ましくは１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
当該置換基としては、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基（例、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、テトラフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、２，２―ジフルオロプロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシル）、Ｃ６−１４アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル）、Ｃ７−１６アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル、フェニルプロピル）、および下記の置換基群ａから選ぶことができる。
［置換基群ａ］
（１）ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、
（２）ニトロ基、
（３）シアノ基、
（４）ヒドロキシ基
（５）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ）、
（６）Ｃ６−１４アリールオキシ基（例、フェノキシ、ナフトキシ）、
（７）Ｃ７−１６アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、
（８）５ないし１４員芳香族複素環オキシ基（例、ピリジルオキシ）、
（９）３ないし１４員非芳香族複素環オキシ基（例、モルホリニルオキシ、ピペリジニルオキシ）、
（１０）Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ基（例、アセトキシ、プロパノイルオキシ）、
（１１）Ｃ６−１４アリール−カルボニルオキシ基（例、ベンゾイルオキシ、１−ナフトイルオキシ、２−ナフトイルオキシ）、
（１２）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルオキシ基（例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシ）、
（１３）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ基（例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシ、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシ）、
（１４）Ｃ６−１４アリール−カルバモイルオキシ基（例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシ）、
（１５）５ないし１４員芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、ニコチノイルオキシ）、
（１６）３ないし１４員非芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、モルホリニルカルボニルオキシ、ピペリジニルカルボニルオキシ）、
（１７）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルホニルオキシ基（例、メチルスルホニルオキシ、トリフルオロメチルスルホニルオキシ）、
（１８）Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１４アリールスルホニルオキシ基（例、フェニルスルホニルオキシ、トルエンスルホニルオキシ）、
（１９）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオ）、
（２０）５ないし１４員芳香族複素環基（例えば、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの５ないし６員単環式芳香族複素環基；
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環基が挙げられる。）、
（２１）３ないし１４員非芳香族複素環基（例えば、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロイソチアゾリル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロピリダジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、アゼパニル、ジアゼパニル、アゼピニル、オキセパニル、アゾカニル、ジアゾカニルなどの３ないし８員単環式非芳香族複素環基；
ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソチアゾリル、ジヒドロナフト［２，３−ｂ］チエニル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル、４Ｈ−キノリジニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジニル、テトラヒドロベンゾアゼピニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロフェナントリジニル、ヘキサヒドロフェノチアジニル、ヘキサヒドロフェノキサジニル、テトラヒドロフタラジニル、テトラヒドロナフチリジニル、テトラヒドロキナゾリニル、テトラヒドロシンノリニル、テトラヒドロカルバゾリル、テトラヒドロ−β−カルボリニル、テトラヒドロアクリジニル、テトラヒドロフェナジニル、テトラヒドロチオキサンテニル、オクタヒドロイソキノリルなどの９ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）非芳香族複素環基が挙げられる。）、
（２２）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基（例、アセチル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル）、
（２３）Ｃ６−１４アリール−カルボニル基（例、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル）、
（２４）５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基（例、ニコチノイル、イソニコチノイル、テノイル、フロイル）、
（２５）３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基（例、モルホリニルカルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピロリジニルカルボニル）、
（２６）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニル）、
（２７）Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基（例、フェニルオキシカルボニル、１−ナフチルオキシカルボニル、２−ナフチルオキシカルボニル）、
（２８）Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、
（２９）カルボキシ基
（３０）カルバモイル基、
（３１）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルカルバモイル）、
（３２）Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、
（３３）５ないし１４員芳香族複素環カルバモイル基（例、ピリジルカルバモイル、チエニルカルバモイル）、
（３４）３ないし１４員非芳香族複素環カルバモイル基（例、モルホリニルカルバモイル、ピペリジニルカルバモイル）、
（３５）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルホニル基（メチルスルホニル、ジフルオロメチルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、４，４，４−トリフルオロブチルスルホニル、ペンチルスルホニル、ヘキシルスルホニル）、
（３６）Ｃ６−１４アリールスルホニル基（例、フェニルスルホニル、１−ナフチルスルホニル、２−ナフチルスルホニル）、
（３７）５ないし１４員芳香族複素環スルホニル基（例、ピリジルスルホニル、チエニルスルホニル）、
（３８）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル基（例、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル）、
（３９）Ｃ６−１４アリールスルフィニル基（例、フェニルスルフィニル、１−ナフチルスルフィニル、２−ナフチルスルフィニル）、
（４０）５ないし１４員芳香族複素環スルフィニル基（例、ピリジルスルフィニル、チエニルスルフィニル）、
（４１）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基（例、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）、
（４２）モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリールアミノ基（例、フェニルアミノ）、
（４３）５ないし１４員芳香族複素環アミノ基（例、ピリジルアミノ）、
（４４）Ｃ７−１６アラルキルアミノ基（例、ベンジルアミノ）、
（４５）ホルミルアミノ基、
（４６）Ｃ１−６アルキル−カルボニルアミノ基（例、アセチルアミノ、プロパノイルアミノ、ブタノイルアミノ）、
（４７）（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル−カルボニル）アミノ基（例、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ）、
（４８）Ｃ６−１４アリール−カルボニルアミノ基（例、フェニルカルボニルアミノ、ナフチルカルボニルアミノ）、
（４９）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ基（例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）、
（５０）Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニルアミノ基（例、ベンジルオキシカルボニルアミノ）、
（５１）Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ基（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ）、
（５２）Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１４アリールスルホニルアミノ基（例、フェニルスルホニルアミノ、トルエンスルホニルアミノ）、
（５３）アミノ基
（５４）Ｃ２−６アルケニル基（例、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、５−ヘキセニル）、
（５５）Ｃ２−６アルキニル基（例、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、４−メチル−２−ペンチニル）、
（５６）Ｃ３−１０シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、アダマンチル）、
（５７）Ｃ３−１０シクロアルケニル基（例、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、
（５８）Ｃ１−６シクロアルコキシ−カルボニル基（例、シクロペントキシ）
（５９）Ｃ７−１６アラルキルチオ基（例、S-ベンジルチオ）
（６０）メルカプト基、
（６１）スルホ基、及び
（６２）グアジニノ基。
上記Ａ−で表される「置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキル基」の置換可能な位置における置換基の数は、例えば、１ないし５個、好ましくは１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
当該置換基としては、上記の置換基群ａから選ぶことができる。
上記Ａ−で表される「置換基を有していてもよい芳香族複素環」の置換可能な位置における置換基の数は、例えば、１ないし５個、好ましくは１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
当該置換基としては、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基（例、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、テトラフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、２，２―ジフルオロプロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシル）、Ｃ６−１４アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル）、Ｃ７−１６アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル、フェニルプロピル）、および上記の置換基群ａから選ぶことができる。
上記Ａ−で表される「Ｃ３−８の炭素鎖を有する誘導体」としては、例えば、置換基を有していてもよいＣ３−８アルキル基（例、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル）、およびＣ３−１０シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、アダマンチル）等が挙げられる。
上記Ａ−で表される「置換基を有していてもよいＣ３−８アルキル基」の「Ｃ３−８アルキル基」として好ましくは、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチルである。
上記Ａ−で表される「置換基を有していてもよいＣ３−８アルキル基」の置換可能な位置における置換基の数は、例えば、１ないし５個、好ましくは１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
当該置換基としては、Ｃ６−１４アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル）、および上記の置換基群ａから選ぶことができる。
上記Ａ−で表される「置換基を有していてもよいＣ３−８アルキル基」の置換基として好ましくは、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキルチオ基、グアジニノ基、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、Ｃ１−６シクロアルコキシ−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基、カルボキシ基、カルバモイル基である。
上記Ａ−で表される「Ｃ８−２２の直鎖脂肪鎖を有する誘導体」としては、例えば、直鎖Ｃ８−２２アルキル基（例、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ヘンエイコシル、ドコシル）等が挙げられる。
上記「Ｒ１−（ＣＨＲ２）−で表される誘導体」のＲ１としては、水素原子、または下記の置換基群ｂから選ぶことができる。
［置換基群ｂ］
（１）ハロゲン原子、
（２）シアノ基、
（３）ヒドロキシ基、
（４）置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ）、
（５）置換基を有していてもよいＣ６−１４アリールオキシ基（例、フェノキシ、ナフトキシ）、
（６）置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、
（７）置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル−カルボニルオキシ基（例、アセトキシ、プロパノイルオキシ）、
（８）置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基（例、アセチル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル）、
（９）置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルボニル基（例、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル）、
（１０）置換基を有していてもよい５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基（例、ニコチノイル、イソニコチノイル、テノイル、フロイル）、
（１１）置換基を有していてもよい３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基（例、モルホリニルカルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピロリジニルカルボニル）、
（１２）置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニル）、（１３）置換基を有していてもよいＣ６−１４アリールオキシ−カルボニル基（例、フェニルオキシカルボニル、１−ナフチルオキシカルボニル、２−ナフチルオキシカルボニル）、
（１４）置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、
（１５）カルボキシ基、
（１６）カルバモイル基、
（１７）置換基を有していてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルカルバモイル）、
（１８）置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、
（１９）置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオ）、
（２０）置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルスルホニル基（メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、ペンチルスルホニル、ヘキシルスルホニル）、
（２１）置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル基（例、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル）、
（２２）置換基を有していてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基（例、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）、
（２３）置換基を有していてもよいモノ−またはジ−Ｃ６−１４アリールアミノ基（例、フェニルアミノ）、
（２４）置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル−カルボニルアミノ基（例、アセチルアミノ、プロパノイルアミノ、ブタノイルアミノ）、
（２５）置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルボニルアミノ基（例、フェニルカルボニルアミノ、ナフチルカルボニルアミノ）、
（２６）置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ基（例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）、
（２７）置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニルアミノ基（例、ベンジルオキシカルボニルアミノ）、
（２８）置換基を有していてもよい５ないし１４員芳香族複素環基（例えば、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの５ないし６員単環式芳香族複素環基；
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環基が挙げられる。）、
（２９）置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル）、
（３０）Ｃ７−１６アラルキルチオ基（例、S-ベンジルチオ）
（３１）スルホ基、および
（３２）メルカプト基。
上記の［置換基群ｂ］における置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ基、置換基を有していてもよいＣ６−１４アリールオキシ基、置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル−カルボニルオキシ基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基、置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルボニル基、置換基を有していてもよい５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、置換基を有していてもよい３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ−カルボニル基、置換基を有していてもよいＣ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基、置換基を有していてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルチオ基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル基、
置換基を有していてもよいモノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいモノ−またはジ−Ｃ６−１４アリールアミノ基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル−カルボニルアミノ基、置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルボニルアミノ基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ基、置換基を有していてもよいＣ７−１６アラルキルオキシ−カルボニルアミノ基、置換基を有していてもよい５ないし１４員芳香族複素環基、および置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基におけるそれぞれの置換基は、上記の置換基群ａからそれぞれ選ぶことができる。
上記の「Ｒ１−（ＣＨＲ２）−で表される誘導体」のＲ１として好ましくは、水素原子、および置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基であり、さらに好ましくはフェニルである。
上記の「Ｒ１−（ＣＨＲ２）−で表される誘導体」のＲ２としては、下記の置換基群ｃから選ぶことができる。
［置換基群ｃ］
（１）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニル）、
（２）Ｃ１−６シクロアルコキシ−カルボニル基（例、シクロペントキシ）
（３）Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基（例、フェニルオキシカルボニル、１−ナフチルオキシカルボニル、２−ナフチルオキシカルボニル）、
（４）Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、
（５）カルボキシ基、
（６）カルバモイル基、
（７）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルカルバモイル）、および
（８）Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）。
上記の「Ｒ１−（ＣＨＲ２）−で表される誘導体」のＲ２として好ましくは、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、Ｃ１−６シクロアルコキシ−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基、カルボキシ基、カルバモイル基であり、よりこの好ましくはＣ１−６アルコキシ−カルボニル基であり、最も好ましくはエトキシカルボニルである。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ３としては、水素原子、または上記の置換基群ｂから選ぶことができる。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ３として好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、置換基を有していてもよい５ないし１４員芳香族複素環基、Ｃ７−１６アラルキルチオ基、および置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基であり、さらに好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、置換基を有していてもよいイミダゾリル、置換基を有していてもよいインドリル、S-ベンジルチオ、および置換基を有していてもよいフェニルであり、とりわけインドリル、S-ベンジルチオおよび置換基を有していてもよいフェニルが好ましい。最も好ましくはフェニルである。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ４およびＲ５としては、独立して水素原子、または上記の置換基群ａから選ぶことができる。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ４およびＲ５として好ましくは、水素原子である。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ６としては、水素原子、または下記の置換基群ｄから選ぶことができる。
［置換基群ｄ］
（１）ヒドロキシ基、
（２）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基（例、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、テトラフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、２，２―ジフルオロプロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシル）、
（３）Ｃ３−１０シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、アダマンチル）、
（４）置換基を有していてもよい５ないし１４員芳香族複素環基（例えば、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの５ないし６員単環式芳香族複素環基；
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環基が挙げられる。）、および
（５）置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル）。
上記の［置換基群ｄ］における置換基を有していてもよい５ないし１４員芳香族複素環基、および置換基を有していてもよいＣ６−１４アリール基におけるそれぞれの置換基は、上記の置換基群ａからそれぞれ選ぶことができる。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ６として好ましくは、水素原子、およびメチルであり、水素原子が最も好ましい。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ７としては、上記の置換基群ｃから選ぶことができる。
上記の「Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体」のＲ７として好ましくは、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、Ｃ１−６シクロアルコキシ−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基、カルボキシ基、カルバモイル基であり、よりこの好ましくはＣ１−６アルコキシ−カルボニル基であり、最も好ましくはエトキシカルボニルである。
上記の「Ａ−」で好ましくは、Ｃ３−８の炭素鎖を有する誘導体、Ｒ１−（ＣＨＲ２）−で表される誘導体、およびＲ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体であり、さらに好ましくは、Ｒ３−（ＣＲ４Ｒ５）−（ＣＲ６Ｒ７）−で表される誘導体である。
一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物として、好ましくは、置換基を有していてもよいα−アミノ酸誘導体である。そのアミノ酸は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもその混合物であってもよい。
本発明で用いられる「置換基を有していてもよいα−アミノ酸」の「α−アミノ酸」としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、２-アミノマロン酸、２-アミノアジピン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、オルニチン、２,４-ジアミノ酪酸、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、５-メチルトリプトファン、チロシン、バリン、アロイソロイシン、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ-ロイシン、γ-メチルロイシン、フェニルグリシン、２-アミノ酪酸、システイン酸、ホモシステイン酸、１-ナフチルアラニン、２-ナフチルアラニン、２-チエニルグリシン、３-チエニルグリシン、３-ベンゾチエニルアラニン、４-ビフェニルアラニン、ペンタメチルフェニルアラニン、１-アミノシクロプロパン-１-カルボン酸、１-アミノシクロブタン-１-カルボン酸、１-アミノシクロペンタン-１-カルボン酸、１-アミノシクロヘキサン-１-カルボン酸、１-アミノシクロヘプタン-１-カルボン酸などが挙げられる。好ましくは、フェニルアラニン、フェニルグリシン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン、システイン、セリン、スレオニンである。特にフェニルアラニンが好ましい。
本発明で用いられる「α−アミノ酸」は、置換可能な位置に１ないし３個の置換基を有していてもよい。当該置換基としては、ハロゲン原子、ニトロ基、１ないし３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−6アルキル基、１ないし３個のハロゲン原子で置換されていてもよいＣ7−13アラルキル基（例、ベンジル）、Ｃ１−6アルコキシ基等が挙げられる。
本明細書中、「誘導体」とは、ある化合物の分子内の小部分を、官能基の導入、酸化、還元、原子の置換などで変化させることによって生成する化合物および特性基を意味し、具体例としては、例えば、ある化合物のカルボン酸、Ｃ１−１８アルキルエステル、Ｃ６−１８芳香族エステル、Ｃ３−１８シクロアルキルエステル、Ｃ１−１８アルキル一置換アミド、Ｃ１−１８アルキル二置換アミド、無置換アミド等が挙げられる。そのＣ１−１８アルキル置換基の例としてはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピルメチル、シクロブチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、２，３−ジメチルプロピル、３，３−ジメチルプロピル、シクロプロピルエチル、シクロブチルメチル、シクロプロピル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノナニル、ｎ−デカニル、ｎ−ヘキサデカニル、ｎ−オクタデカニルなどが挙げられる。
また、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子またはニトロ基などで置換されていてもよい。
本発明で用いられる「誘導体」として好ましくは、Ｃ１−１８アルキルエステルである。
α−アミノ酸誘導体としては、好ましくは、フェニルアラニン誘導体であり、フェニルアラニンアルキルエステル、特にフェニルアラニンエチルエステルが好ましい。前記アミノ酸誘導体は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもその混合物であってもよい。
一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物の塩としては、前記ポリアミノ酸の塩として例示した塩と同様のものが挙げられる。
本明細書中「グラフト共重合体」とは下記の一般式（ＶＩ）：
Figure 2014208611
 ［式中、Ｍはアルカリ金属を示し、Ａは疎水性部位を示し、ｎは１０〜１００，０００の整数を示す。３種類のモノマーユニット間の斜線はモノマーユニットの配列順序が不規則であることを示す。ｘは、一般式（ＩＩＩ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｙは、一般式（ＩＶ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｚは、一般式（Ｖ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｘ、ｙおよびｚは、下式：
Figure 2014208611
 を満たす。］で表されるグラフト共重合体をいう。
工程（１）における一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩の使用量は、ポリアミノ酸に対して、通常、０．０１〜５当量、好ましくは０．１〜１．５当量である。
工程（１）に用いられる縮合剤としては、通常のペプチド合成に使用される縮合剤が挙げられ、例えば、水溶性カルボジイミド.塩酸塩[例:１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド.塩酸塩]（ＷＳＣ．ＨＣｌ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル)−４−メチルモルホリニウムクロライドｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ）、２−（５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＮＴＵ）などが挙げられる。
工程（１）における縮合剤の使用量は、ポリアミノ酸に対して、通常、０．０１〜５当量、好ましくは０．１〜１．５当量である。
上記工程（１）は、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。このような溶媒としては、例えば、水や、以下に示す有機溶媒と水との混合液などが挙げられる。その有機溶媒の例としては、Ｃ１−３アルコール(例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ノルマルプロパノール)、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド(ＤＭＡｃ)、Ｎ−メチルピロリドン(ＮＭＰ)、アセトニトリルなどの極性の高い非プロトン性溶媒などが挙げられる。
ポリアミノ酸がフリー体の場合、工程（１）において塩基またはその塩を加える。そこで使用する塩基としては、アルカリ金属塩、炭酸塩、炭酸水素塩、有機塩基などが挙げられる。
工程（１）における塩基としてアルカリ金属塩を用いる場合、その例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどが挙げられるが、水酸化ナトリウムが好ましい。
工程（１）における塩基として炭酸塩を用いる場合、その例としては、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどが挙げられ、炭酸ナトリウムが好ましい。
工程（１）における塩基として炭酸水素塩を用いる場合、例えば、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどが挙げられ、炭酸水素ナトリウムが好ましい。
工程（１）における塩基として有機塩基を用いる場合、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を必要に応じて用いることができる。
工程（１）における塩基またはその塩の使用量は、ポリアミノ酸に対して、通常、０．０１〜１００当量であるが、好ましくは０．３〜１０当量であり、更に好ましくは０．５〜１．５当量である。
ポリアミノ酸が上記に示した塩やナトリウム塩の場合、そのまま反応に供することができる。
工程（１）の反応温度は、通常、−３０〜８０℃であるが、好ましくは−５〜４５℃であり、更に好ましくは−５〜３０℃である。
工程（１）の反応時間は、通常、０．５時間から７日であるが、好ましくは１時間〜２日である。
工程（１）で得られたグラフト共重合体は、濃縮、抽出、クロマトグラフィー、限外ろ過、遠心濃縮などの自体公知の精製手段に付してもよいし、あるいは、そのまま次の工程に用いてもよい。
工程（２）において、「酸を作用させる」とは、酸の添加によって、グラフト共重合体に含まれる脱プロトン化されたカルボキシル基（−ＣＯＯ−）をプロトン化して、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の状態にすることをいう。
工程（２）で用いられる酸としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸や、ギ酸、酢酸、トリプルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、乳酸、安息香酸などの有機酸などが挙げられ、中でも、塩酸、臭化水素酸や酢酸が好ましい。
工程（２）は、通常、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。このような、溶媒としては、例えば、水や、以下に示す有機溶媒と水との混合液などが挙げられる。その有機溶媒の例としては、Ｃ１−３アルコールや、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリルなどの極性の高い非プロトン性溶媒などが挙げられる。あるいは、工程（２）は溶媒無しで行ってもよい。
工程（２）の反応温度は、通常、−５〜８０℃であるが、好ましくは−５〜３０℃である。
別の好ましい実施形態では、工程（２）の反応温度は０〜８０℃である。
本反応は、上記温度範囲内であれば、昇温条件または降温条件下で行ってもよい。
本反応の反応温度は、４０〜７０℃が、さらに好ましい。
本明細書中の「室温」とは、特に述べない限り、１〜３０℃である。
工程（２）の反応時間は、通常、０．５時間から７日であるが、好ましくは１時間〜２日である。
好適な実施形態において、塩酸を用いて、６０℃で反応を行うことが好ましい。
上記方法において、ポリアミノ酸に対する一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物の導入率は、好ましくは１〜９９％、さらに好ましくは５〜８５％である。
ポリアミノ酸としては、ポリ（γ−グルタミン酸）が好ましい。
一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物としては、α−アミノ酸誘導体が好ましく、中でも、フェニルアラニン誘導体が好ましく、とりわけ、フェニルアラニンエチルエステルが好ましい。
このようにして得られたグラフト共重合体の数平均分子量は、１〜２０００ｋＤａであり、好ましくは１０〜１０００ｋＤａである。
本発明の第２の態様は、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体、およびその製造方法に関する。
本発明の第２の態様によるイオン化されたグラフト共重合体の製造方法は、以下の工程：
前記ポリアミノ酸またはその塩と、前記疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体に、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の炭酸水素塩、アルカリ金属のリン酸塩、アルカリ金属のリン酸一水素塩、アルカリ金属のリン酸二水素塩、アルカリ金属の有機酸塩、またはアルカリ金属の酸性アミノ酸塩を作用させて、グラフト共重合体をイオン化する工程、を含む。
上記工程の原料となるポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体は、前述のポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体を製造する方法や特許文献３に記載の方法に準じて製造することができる。
ポリアミノ酸またはその塩としては、ポリ（γ−グルタミン酸）が好ましい。
一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物としては、α−アミノ酸誘導体が好ましく、中でも、フェニルアラニン誘導体が好ましく、とりわけ、フェニルアラニンエチルエステルが好ましい。
この工程において、「アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の炭酸水素塩、アルカリ金属のリン酸塩、アルカリ金属のリン酸一水素塩、アルカリ金属のリン酸二水素塩、アルカリ金属の有機酸塩、またはアルカリ金属の酸性アミノ酸塩を作用させる」とは、グラフト共重合体に含まれるカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を脱プロトン化して、脱プロトン化されたカルボキシル基（−ＣＯＯ−）の状態にすることをいう。
この工程に用いられるアルカリ金属の水酸化物としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられ、好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムである。より好ましくは水酸化カリウムである。
この工程におけるアルカリ金属の水酸化物の使用量は、グラフト共重合体に対して、通常、０．００１〜１０当量である。
この工程に用いられるアルカリ金属の炭酸塩としては、例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどが挙げられ、好ましくは、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムである。より好ましくは炭酸カリウムである。
この工程におけるアルカリ金属の炭酸塩の使用量は、グラフト共重合体に対して、通常、０．００１〜１０当量である。
この工程に用いられるアルカリ金属の炭酸水素塩としては、例えば、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどが挙げられ、好ましくは、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムである。より好ましくは炭酸水素カリウムである。
この工程におけるアルカリ金属の炭酸水素塩の使用量は、グラフト共重合体に対して、０．００１〜１０当量である。
この工程に用いられるアルカリ金属のリン酸塩としては、例えば、リン酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどが挙げられ、好ましくは、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。より好ましくはリン酸カリウムである。
この工程におけるアルカリ金属のリン酸塩の使用量は、グラフト共重合体に対して、通常、０．００１〜１０当量である。
この工程に用いられるアルカリ金属のリン酸一水素塩としては、例えば、リン酸一水素リチウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸一水素カリウムなどが挙げられ、好ましくは、リン酸一水素ナトリウム、リン酸一水素カリウムである。より好ましくはリン酸一水素カリウムである。
この工程におけるアルカリ金属のリン酸一水素塩の使用量は、グラフト共重合体に対して、通常、０．００１〜１０当量である。
この工程に用いられるアルカリ金属のリン酸二水素塩としては、例えば、リン酸二水素リチウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどが挙げられ、好ましくは、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムである。より好ましくはリン酸二水素カリウムである。
この工程におけるアルカリ金属のリン酸二水素塩の使用量は、グラフト共重合体に対して、通常、０．００１〜１０当量である。
この工程に用いられるアルカリ金属の有機酸塩に用いる「有機酸塩」としては、ギ酸、酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、安息香酸などとの塩が挙げられる。中でも乳酸、酢酸、クエン酸、安息香酸が好ましく、乳酸、酢酸、安息香酸がより好ましい。
この工程に用いられるアルカリ金属の有機酸塩としては、例えば、ギ酸リチウム、酢酸リチウム、フマル酸リチウム、シュウ酸リチウム、酒石酸リチウム、マレイン酸リチウム、乳酸リチウム、クエン酸リチウム、コハク酸リチウム、リンゴ酸リチウム、安息香酸リチウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、フマル酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、フマル酸カリウム、シュウ酸カリウム、酒石酸カリウム、マレイン酸カリウム、乳酸カリウム、クエン酸カリウム、コハク酸カリウム、リンゴ酸カリウム、安息香酸カリウムなどが挙げられる。好ましくは、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、乳酸カリウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウムであり、中でも乳酸カリウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウムが好ましい。
この工程におけるアルカリ金属の有機酸塩の使用量は、グラフト共重合体に対して、通常、０．００１〜１０当量である。
この工程に用いられるアルカリ金属の酸性アミノ酸塩に用いる「酸性アミノ酸」としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。中でもアスパラギン酸が好ましい。
この工程に用いられるアルカリ金属の酸性アミノ酸塩としては、例えば、アスパラギン酸リチウム、グルタミン酸リチウム、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸カリウム、グルタミン酸カリウムなどが挙げられる。好ましくは、アスパラギン酸ナトリウム、アスパラギン酸カリウムである。より好ましくはアスパラギン酸カリウムである。
この工程におけるアルカリ金属の酸性アミノ酸塩の使用量は、グラフト共重合体に対して、通常、０．００１〜１０当量である。
上記工程は、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。このような、溶媒としては、例えば、水や、以下に示す有機溶媒と水との混合液などが挙げられる。その有機溶媒の例としては、Ｃ１−３アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリルなどの極性の高い非プロトン性溶媒や、アセトン、ピリジン、酢酸メチルなどが挙げられる。
この工程の反応温度は、通常、−３０〜８０℃であるが、好ましくは−５〜４５℃であり、更に好ましくは−５〜３０℃である。
この工程の反応時間は、通常、０．１時間から７日であるが、好ましくは０．５時間〜２日である。
このようにして得られたイオン化されたグラフト共重合体の数平均分子量は、１〜２,０００ｋＤaであり、好ましくは１０〜１,０００ｋＤaである。
上記の方法で製造される、本発明のイオン化されたグラフト共重合体の例としては、一般式（ＩＩ）：
Figure 2014208611
 ［式中、Ｍはアルカリ金属を示し、Ａは疎水性部位を示し、ｎは１０〜１００，０００の整数を示す。３種類のモノマーユニット間の斜線はモノマーユニットの配列順序が不規則であることを示す。ｘは、一般式（ＩＩＩ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｙは、一般式（ＩＶ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｚは、一般式（Ｖ）：
Figure 2014208611
 で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｘ、ｙおよびｚは、下式：
Figure 2014208611
 を満たす。］で表されるイオン化されたグラフト共重合体が挙げられる。
一般式（ＩＶ）で表されるモノマーユニットにおいて、Ｍで表されるアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウムなどが挙げられ、なかでも、ナトリウム、カリウムが好ましく、カリウムが最も好ましい。
一般式（Ｖ）で表されるモノマーユニットにおいて、Ａで表される疎水性部位としては、前記一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物において、Ａで表される「疎水性部位」と同様のものが挙げられる。一般式（Ｖ）で表されるモノマーユニットにおいて、−ＮＨ−Ａ［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］の具体例としては、置換基を有していてもよいα−アミノ酸誘導体が挙げられる。該「α−アミノ酸誘導体」としては、好ましくは、フェニルアラニン誘導体であり、フェニルアラニンアルキルエステル誘導体、特にフェニルアラニンエチルエステル誘導体が好ましい。該「アミノ酸誘導体」は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもその混合物であってもよい。
上記一般式（ＩＩ）において、一般式（ＩＩＩ）で表されるモノマーユニットのモル分率ｘが０．０１〜０．９９であることが好ましく、０．１５〜０．９５であることがより好ましい。
上記一般式（ＩＩ）において、一般式（ＩＶ）で表されるモノマーユニットのモル分率ｙが０．０２〜０．６であることが好ましく、０．０５〜０．５であることがより好ましい。
上記一般式（ＩＩ）において、一般式（Ｖ）で表されるモノマーユニットのモル分率ｚが０．０１〜０．９９であることが好ましく、０．０５〜０．８５であることがより好ましい。
上記一般式（ＩＩ）において、ｘ、ｙ、ｚはそれぞれ上記の好ましい範囲で任意の数値を取りうるが、ｘ＋ｙ＋ｚは１を超えない。
本発明の第３の態様であるナノ粒子の製造に用いるためには、イオン化された共重合体は、グラフト共重合体中のモノマーユニットの総数と疎水性部位Ａの構造に応じて、適度な水溶性と適度な疎水性のバランスを持つことが好ましい。
本明細書中のｎはグラフト共重合体中のモノマーユニットの総数を示す。
好適な実施形態では、ｎは５０〜１０，０００であり、さらに好ましくは１００〜２，０００である。
本明細書中の「疎水性パラメーターＫ」とは、溶媒として１−オクタノールと水を用いたオクタノール/水分配係数に相当し、本明細書中ではLog Powと表記される。
Log Powを実測する方法には、例えばJIS-Z7260-107が挙げられる。ただし、本発明のイオン化されたポリアミノ酸のグラフト共重合体の場合は、濃度測定の際に難溶解性のため測定が困難であるので、分配後の有機層および水層のそれぞれに対して加水分解を行い、それぞれのアミノ酸モノマーの濃度を定量する方法を採ってもよい。
「疎水性パラメーターＫ」には、Log Powの実測値の代替として、化学構造からの計算法であるCLOGP法による計算値を用いてもよい。CLOGP法により計算された「疎水性パラメーターＫ」は、本明細書中ではCLOGPと表記される。
好適な実施形態では、疎水性パラメーターＫは、−１５,０００〜０であり、さらに好ましくは、−３,０００〜０である。
本発明の第３の態様は、さらに、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体を含む、ナノ粒子、およびその製造方法に関する。
本発明の第３の態様によるナノ粒子の製造方法は、以下の工程：
（１） ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とを縮合させる工程；
（２） 工程（１）で得られた縮合物に酸を作用させて、グラフト共重合体を単離する工程；
（３） 工程（２）で単離したグラフト共重合体に、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、またはアルカリ金属の炭酸水素塩を作用させて、グラフト共重合体をイオン化する工程；
（４） 工程（３）で得られたイオン化されたグラフト共重合体を、ナノ粒子化する工程
を含む。
上記工程（１）〜（２）は、前述のポリアミノ酸またはその塩と一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体の製造方法に従って行うことができる。
上記工程（３）は、前述のポリアミノ酸またはその塩と一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体の製造方法に従って行うことができる。
上記工程（４）のイオン化されたグラフト共重合体をナノ粒子化する方法は、特許文献３に記載の方法に準じて行うことができる。例えば、沈殿法を用いる場合には、上記工程（３）で得られたイオン化されたグラフト共重合体を良溶媒に溶解しておいて、これと貧溶媒と混合することによってナノ粒子化することができる。
「良溶媒」としては、例えば、ジメチルスホキシド、アルコール類（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ノルマルプロパノール等）を用いることができる。
「貧溶媒」には水を用いることができる。水を貧溶媒として用いる場合には、通常、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等の水溶液として用いる。上記工程（３）で得られたイオン化されたグラフト共重合体の溶液と貧溶媒の混合は、バッチ式および連続式のどちらでも行うことができる。
また、上記ポリアミノ酸またはその塩と一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体をイオン化する工程において、イオン化を制御することで一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩と結合していないポリアミノ酸のＣＯＯＨ側鎖のイオン化割合を調節することができる。このように、イオン化割合を調節することで、性質の異なるナノ粒子を製造することができる。また、本発明の製造方法を用いることで、スケールアップが容易となり、ナノ粒子の大量合成が可能になる。また、グラフト共重合体のフリー体からナノ粒子を調製する場合、ナノ粒子化時のイオン化量をコントロールすることができる。さらには、グラフト共重合体のイオン化の種類はナトリウムに限られず、様々なイオン種による選択的なイオン化が可能である。
本明細書中の「グラフト共重合体のフリー体」とは、一般式（ＶＩ）において、ｙが０の場合、すなわち、グラフト共重合体に存在するカルボキシル基の全てが、ＣＯＯＨとして存在する状態をいう。
本明細書中の「イオン化されたグラフト共重合体」とは、一般式（ＶＩ）において、ｙが０以外の場合、すなわち、グラフト共重合体に存在するカルボキシル基の全てまたは一部が、塩として存在する状態をいう。
本明細書中の「モノマーユニット」とは、グラフト共重合体などのポリマーの構成単位を意味する。
「ナノ粒子」とは、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体により形成されるの集合体を主成分として、周囲環境との間に明瞭な界面を持ちながら大きさ長径５０００ナノメートル（ｎｍ）以下の粒状形態をとることをいう。
本発明のナノ粒子の形状は、球状、中空状、多孔球状など多様な形態をとりうる。
また、本発明のナノ粒子の粒子径は、生理学的条件下で、１ナノメートル（ｎｍ）〜１５００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１０ｎｍ〜３００ｎｍである。
本発明の「ナノ粒子」には、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体以外の物質を含んでもよい。
例えば、本発明のナノ粒子は、１種または２種以上の抗原をナノ粒子に内包させるか、あるいはナノ粒子表面に固定化することでワクチン用アジュバントとして用いることができる。
本明細書中の「抗原」とは、免疫反応を惹起できるものを意味し、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのようなウイルス、結核菌、破傷風菌などのような病原性微生物などの病原体自体またはその一部、あるいはタンパク質、ペプチド、核酸であってもよいが、これらに限定されない。このような抗原は治療や予防の対象とする疾患に併せて適宜選択することができる。
本明細書中の「アジュバント」とは、免疫系を刺激し、免疫反応を増強させる物質を意味する。
したがって、本発明の第４の態様は、このようなナノ粒子を含むワクチンに関する。
本発明のワクチンは、アジュバントとして、前述のポリアミノ酸と一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物とのグラフト共重合体を含むナノ粒子、および抗原を含む以外に、更に、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを含んでもよい。
溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油などが挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。
無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールなどが挙げられる。
本発明のワクチンは、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、粉末、カプセル剤、錠剤などいずれの形態であってもよい。本発明のワクチンが固体の場合は、使用前に、生理食塩水などの適切な溶媒に懸濁または溶解して用いることができる。
本発明のワクチンは、生分解性である。ここで、生分解性とは、生体内で分解されうる構造を有し、それ自体およびその分解物または代謝産物が安全なもの、あるいは無毒かまたは低毒性であるものをいう。
本発明のワクチンは、哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、サル、ヒト）に対して、安全に接種することができる。
本発明のワクチンの接種量、接種方法、接種回数等は、例えば、対象の年齢や状態、疾病の種類、抗原の種類等に応じて適宜選択できる。
本発明のワクチンの接種量としては、例えば、成人（体重約６０ｋｇ）１回あたり、抗原量として１ｍｇ〜１００ｍｇである。
本発明のワクチンの接種方法としては、例えば、経口接種、皮下注射、筋肉内注射、輸液などが挙げられる。
本発明のワクチンの接種回数は、1回ないし複数回である。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下、本発明のポリマーであるポリ（γ-グルタミン酸）とフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体をγ-PGA-PAEとも表記する。以下で示した水は、注射用水、イオン交換水などに置き換えが可能である。また、特に述べない限り、分子量は相対分子量であり、以下に示すＳＥＣ−ＨＰＬＣ測定における分子量測定法で得られた数値である；ＴＳＫｇｅｌ α−Ｍ ３００Ｘ７．８ ｍｍ Ｉ． Ｄ． （ｄｕａｌ）, ５ ｍＭ ＮａＮＯ３ ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ （９：１）, ０．８ ｍＬ／分, ４０℃, ＲＩ検出器, スタンダード:プルラン(Ｓｈｏｄｅｘ)。
[実施例1] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (400 mL)とNaHCO3 (8.4 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (12.1 g, 148 kDa)を加え、蒸留水 (60 mL)で洗浄して溶解した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (19.2 g)を添加し、蒸留水 (10 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (13.8 g）を添加し、蒸留水 (15 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で24時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (120 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (100 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (23.2 g, 収率 約96.8％, PAE導入率55％, 水分5.8％, 85 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 3.6H), 1.4-2.4 (brm, 6.7H), 2.6-2.8 (brm, 1.2H), 2.8-3.1 (brm, 3.0H), 3.8-4.5 (brm, 4.1H), 4.5-5.5 (brm, 0.4H), 6.4-6.6 (brm, 0.1H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.3H).
[実施例2] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (400 mL)とNaHCO3 (8.4 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (12.1 g, 148 kDa)を加え、蒸留水 (66 mL)で洗浄して溶解した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (19.2 g)を添加し、蒸留水 (15 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、PAE.HCｌ （13.8 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (120 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (100 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (21.1 g, 収率 約94.5％, PAE導入率46％, 水分4.5％, 133 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.0H), 1.4-2.4 (brm, 6.2H), 2.6-2.8 (brm, 0.8H), 2.8-3.1 (brm, 2.6H), 3.9-4.5 (brm, 4.0H), 4.5-5.5 (brm, 0.4H), 6.4-6.6 (brm, 0.1H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.2H).
[実施例3] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (385 mL)に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (90 mL)を量り、γ-PGA (12.1 g, 148 kDa)を溶解し、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (19.2 g)を添加し、蒸留水 (4 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、PAE.HCｌ （13.8 g）を添加し、蒸留水 (6 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (120 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (100 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (21.7 g, 収率 約94.8％, PAE導入率59％, 水分4.5％, 286 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.1-1.2 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 6.9H), 2.6-2.8 (brm, 0.6H), 2.8-3.1 (brm, 2.4H), 3.1-3.8 (brm, 7.2H), 4.0 (brs, 2.0H), 4.1-4.4 (brm, 2.5H), 4.6-5.2 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.0 (brm, 2.6H), 10.0-15.0 (brs, 0.2H).
[実施例4] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (385 mL)に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (90 mL)を量り、γ-PGA (12.1 g, 148 kDa)を溶解し、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (19.2 g)を添加し、蒸留水 (4 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、PAE.HCｌ （13.8 g）を添加し、蒸留水 (6 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で22時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (120 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (100 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (26.8 g, 収率 約93.6％, PAE導入率59％, 水分23.6％, 44 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.7-1.2 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 6.8H), 2.6-2.8 (brm, 1.1H), 2.8-3.1 (brm, 2.9H), 3.8-5.1 (brm, 4.4H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.4H).
[実施例5] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (350 mL)と1 M NaOH (90 mL)を量り、混合した。これにγ-PGA [12.1 g, 65 kDa, D:L比 (35:65)]を添加し、蒸留水 (28 mL)で洗浄した。溶解後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (19.2 g)を添加し、蒸留水 (10 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、PAE.HCｌ （13.8 g）を添加し、蒸留水 (10 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (120 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (100 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE [20.5 g, 収率 約86.2％, PAE導入率72％, 水分2.2％, 247 kDa, Glu D:L (36:64)]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 6.8H), 2.6-2.8 (brm, 0.9H), 2.8-3.1 (brm, 2.5H), 3.9-4.5 (brm, 4.7H), 4.5-5.5 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-9.1 (brm, 2.6H).
[実施例6] γ-PGA-PAEの合成
100-mL スコット瓶に室温で蒸留水 (39 mL)と1 M NaOH (9.0 mL)を混合した。これにγ-PGA (1.2 g, 65 kDa)を溶解した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.8 g)を添加した。そのまま5分間撹拌し、PAE.HCｌ （1.3 g）を添加した。氷冷から室温でそのまま終夜で反応し、20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (11 mL)を滴下し、3時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (20 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (2.0 g, 収率 約98.8％, PAE導入率52％, 水分2.9％, 89 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.3H), 1.4-2.4 (brm, 7.9H), 2.6-2.8 (brm, 0.9H), 2.8-3.1 (brm, 2.6H), 3.9-4.5 (brm, 4.8H), 4.5-5.5 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.8H).
[実施例7] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (440 mL)とγ-PGAナトリウム塩 [15.0 g, 29 kDa, D:L比 (83:17)]を量って溶解後に氷冷した。氷冷下でWSC.HCl (19.2 g)を添加し、そのまま5分間撹拌した。次いでPAE.HCｌ （13.8 g）を添加した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (120 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (100 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE [18.2 g, 収率 約91.2％, PAE導入率59％, 水分3.5％, 56 kDa, Glu D:L比 (50:50)]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.0H), 1.4-2.4 (brm, 5.7H), 2.6-2.8 (brm, 0.5H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.9-4.5 (brm, 4.2H), 4.5-5.5 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.2H).
[実施例8] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (440 mL)とγ-PGAナトリウム塩 (15.0 g, 29 kDa)を量って溶解後に氷冷した。氷冷下でWSC.HCl (19.2 g)を添加し、そのまま5分間撹拌した。次いでPAE.HCｌ （13.8 g）を添加した。氷冷下で1.5時間撹拌した後、室温で20.5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (120 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (100 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (19.3 g, 収率 約90.9％, PAE導入率70％, 水分2.1％, 54 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.4H), 1.4-2.4 (brm, 5.4H), 2.6-2.8 (brm, 0.7H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.9-4.5 (brm, 4.0H), 4.5-5.5 (brm, 0.1H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.2H).
[実施例9] γ-PGA-PAEの合成
20-mL サンプル瓶にNaHCO3 (42 mg)を量り、室温で蒸留水 (2.5 mL)に溶解した。γ-PGA (61 mg, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下でDMTMM (453 mg)を添加し、そのまま7分間撹拌した。次いでPAE.HCｌ （108 mg）を添加した。氷冷下で1.0時間撹拌した後、室温で約15時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (0.47 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (103 mg, PAE導入率68％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 2.9H), 1.4-2.4 (brm, 5.9H), 2.8-3.1 (brm, 2.0H), 3.9-4.5 (brm, 4.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.2H).
[実施例10] γ-PGA-D-PAEの合成
100-mL スコット瓶に蒸留水 (39 mL)とγ-PGAナトリウム塩 [1.62 g, 29 kDa, D:L比 (83:17)]を量って溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。D-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (D-PAE.HCｌ) （1.30 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.3時間激しく撹拌した。次いで室温で5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (14 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-D-PAE [1.90 g, PAE導入率67％, 水分2.41％, 64 kDa, Glu D:L比 (66:34)]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 6.0H), 2.6-2.8 (brm, 0.6H), 2.8-3.1 (brm, 2.4H), 3.9-4.5 (brm, 4.4H), 4.5-5.5 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.3H).
[実施例11] γ-PGA-D-PAEの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA [1.21 g, 65 kDa, D:L比 (35:65)]を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。 D-PAE.HCｌ （1.30 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で21時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、2.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-D-PAE [1.96 g, PAE導入率56％, 水分2.35％, 98 kDa, Glu D:L比 (54:46)]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.3H), 1.4-2.4 (brm, 7.2H), 2.6-2.8 (brm, 0.5H), 2.8-3.1 (brm, 2.4H), 3.9-4.5 (brm, 4.9H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.6H).
[実施例12] γ-PGA-DL-PAEの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA [1.21 g, 65 kDa, D:L比 (35:65)]を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。 DL-PAE.HCｌ （1.30 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で21時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、2.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-DL-PAE [2.06 g, PAE導入率56％, 水分2.51％, 97 kDa, Glu D:L比 (45:55)]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.3H), 1.4-2.4 (brm, 7.2H), 2.6-2.8 (brm, 0.5H), 2.8-3.1 (brm, 2.5H), 3.9-4.5 (brm, 4.7H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.6H).
[実施例13] γ-PGA-PAEの合成
100-mL スコット瓶にNaHCO3 (0.42 g)、蒸留水 (49 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (0.61 g, 114 kDa)を添加し、室温で30分撹拌して溶解後、氷冷して15分撹拌した。氷冷下で、WSC.HCl (0.90 g)を添加し、5分間撹拌した。PAE.HCｌ （1.08 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.0時間激しく撹拌した。次いで室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (10 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、40℃で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.09 g, PAE導入率67％, 水分2.7％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.１H), 1.4-2.4 (brm, 5.3H), 2.6-2.8 (brm, 0.7H), 2.8-3.1 (brm, 2.4H), 3.9-5.5 (brm, 4.4H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.1H).
[実施例14] γ-PGA-PAEの合成
50-mL三角フラスコにNaHCO3 (0.42 g)、蒸留水 (36 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (0.61 g, 114 kDa)を添加し、室温で30分撹拌して溶解後、氷冷して15分撹拌した。氷冷下で、WSC.HCl (0.90 g)を添加し、5分間撹拌した。PAE.HCｌ （1.08 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.0時間激しく撹拌した。次いで室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (10 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、40℃で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.14 g, PAE導入率67％, 水分2.9％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 5.2H), 2.6-3.1 (brm, 3.0H), 3.9-5.5 (brm, 4.0H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.1H).
[実施例15] γ-PGA-PAEの合成
50-mL三角フラスコにNaHCO3 (0.42 g)、蒸留水 (30 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (0.61 g, 114 kDa)を添加し、室温で30分撹拌して溶解後、氷冷して15分撹拌した。氷冷下で、WSC.HCl (0.90 g)を添加し、5分間撹拌した。PAE.HCｌ （1.08 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.0時間激しく撹拌した。次いで室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (10 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、40℃で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.18 g, PAE導入率70％, 水分2.3％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 5.1H), 2.6-3.1 (brm, 2.9H), 3.9-5.5 (brm, 4.0H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.1H).
[実施例16] γ-PGA-PAEの合成
30-mL 三角フラスコにNaHCO3 (0.42 g)、蒸留水 (21 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (0.61 g, 114 kDa)を添加し、室温で30分撹拌して溶解後、氷冷して15分撹拌した。氷冷下で、WSC.HCl (0.90 g)を添加し、5分間撹拌した。PAE.HCｌ （1.08 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.0時間激しく撹拌した。次いで室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (10 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、40℃で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.21 g, PAE導入率73％, 水分2.6％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 5.0H), 2.6-2.8 (brm, 0.3H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.9-5.5 (brm, 4.2H), 6.4-6.6 (brm, 0.1H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.0H).
[実施例17] γ-PGA-PAEの合成
20-mL サンプル瓶に室温で蒸留水 (7.8 mL)と1 M NaOH (0.9 mL)を混合した。これにγ-PGA (121 mg, 239 kDa)を溶解した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (180 mg)を添加した。そのまま5分間撹拌し、PAE.HCｌ （130 mg）を添加した。氷冷下で1時間、室温で6時間反応した。室温で2 M 塩酸 (1.4 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (185 mg, PAE導入率50％, 水分3.1％, 797 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.3H), 1.4-2.4 (brm, 8.0H), 2.6-2.8 (brm, 1.0H), 2.8-3.1 (brm, 2.5H), 3.9-4.5 (brm, 5.0H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.8H).
[実施例18] α-L-PGA-D-PAEの合成
20-mL サンプル瓶にα-L-PGA ナトリウム塩 (136 mg)、蒸留水 (4.8 mL)を量り、溶解した。続いて氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (180 mg)を添加し、5分間撹拌した。 D-PAE.HCｌ （129 mg）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で16時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (0.14 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとα-L-PGA-D-PAE (206 mg, PAE導入率70％, 水分2.20％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.03-1.05 (brm, 3.53 H), 1.50-2.35 (brm, 5.70H), 2.50-2.60 (brm, 1.24 H), 2.60-2.85 (brm, 2.14H), 2.85-3.05 (brm, 2.14H), 3.10-3.25 (brm, 0.63H), 3.50-3.80 (brm, 0.83H), 3.90-5.00 (brm, 4.68H), 7.04-7.35 (brm, 5H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.70-9.30 (brm, 2.48H).
[実施例19] α-L-PGA-L-PAEの合成
20-mL サンプル瓶にα-L-PGA ナトリウム塩 (136 mg)、蒸留水 (4.8 mL)を量り、溶解した。続いて氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (180 mg)を添加し、5分間撹拌した。 L-PAE.HCｌ （129 mg）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で16時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (0.14 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとα-L-PGA-L-PAE (216 mg, PAE導入率69％, 水分2.44％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.05-1.06 (brm, 3.52 H), 1.50-2.40 (brm, 5.71H), 2.50-2.75 (brm, 1.59 H), 2.75-3.05 (brm, 2.41H), 3.10-3.25 (brm, 0.75H), 3.50-3.80 (brm, 0.59H), 3.90-4.50 (brm, 4.56H), 4.50-5.58 (brm, 0.02H), 7.04-7.35 (brm, 5H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.70-9.30 (brm, 2.49H).
[実施例20] α-D-PGA-D-PAEの合成
20-mL サンプル瓶にα-D-PGA ナトリウム塩 (408 mg)、蒸留水 (14.4 mL)を量り、溶解した。続いて氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (540 mg)を添加し、5分間撹拌した。 D-PAE.HCｌ （387 mg）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で12時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (0.5 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (15 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとα-D-PGA-D-PAE (579 mg, PAE導入率77％, 水分0.97％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.98-1.06 (brm, 3.35 H), 1.50-2.35 (brm, 5.18H), 2.55-2.80 (brm, 0.96 H), 2.80-3.05 (brm, 2.31H), 3.05-3.80 (brm, 2.72H), 3.90-4.80 (brm, 4.35H), 7.00-7.40 (brm, 5H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.70-9.30 (brm, 2.31H).
[実施例21] α-D-PGA-L-PAEの合成
20-mL サンプル瓶にα-D-PGA ナトリウム塩 (408 mg)、蒸留水 (14.4 mL)を量り、溶解した。続いて氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (540 mg)を添加し、5分間撹拌した。 L-PAE.HCｌ （387 mg）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で12時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (0.5 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (15 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとα-D-PGA-L-PAE (605 mg, PAE導入率76％, 水分1.09％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.98-1.04 (brm, 3.44H), 1.50-2.40 (brm, 5.26H), 2.55-2.75 (brm, 1.02H), 2.80-3.05 (brm, 2.32H), 3.05-3.80 (brm, 3.00H), 3.90-4.70 (brm, 4.37H), 7.00-7.45 (brm, 5H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.70-9.30 (brm, 2.34H).
[実施例22] αβ-DL-Poly Asp-D-PAEの合成
20-mL サンプル瓶にαβ-DL-Poly Asp ナトリウム塩 (136 mg)、蒸留水 (4.8 mL)を量り、溶解した。続いて氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (180 mg)を添加し、5分間撹拌した。 D-PAE.HCｌ （129 mg）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で13時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (0.2 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとαβ-DL-Poly Asp-D-PAE (183 mg, PAE導入率約63％, 水分2.37％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.75-1.25 (brm, 3.30H), 1.60-2.80 (brm, 3.17H), 2.80-3.75 (brm, 6.28H), 3.75-4.15 (brm, 2.06H), 4.15-5.50 (brm, 2.70H), 6.90-7.45 (brm, 5H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.60-9.20 (brm, 2.35H).
[実施例23] αβ-DL-Poly Asp-L-PAEの合成
20-mL サンプル瓶にαβ-DL-Poly Asp ナトリウム塩 (136 mg)、蒸留水 (4.8 mL)を量り、溶解した。続いて氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (180 mg)を添加し、5分間撹拌した。 L-PAE.HCｌ （129 mg）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で16時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (0.2 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (5 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとαβ-DL-Poly Asp-L-PAE (176 mg, PAE導入率約62％, 水分2.68％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.80-1.30 (brm, 3.23H), 1.60-2.80 (brm, 3.22H), 2.80-3.80 (brm,6.41H), 3.80-4.20 (brm, 2.08H), 4.20-5.30 (brm, 2.75H), 6.90-7.45 (brm, 5H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.60-9.30 (brm, 2.35H).
[比較例1] γ-PGA-PAEの脱塩法による合成
200-mL 三角フラスコにNaHCO3 (0.42 g)、蒸留水 (100 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (0.61 g)を添加し、室温で30分撹拌して溶解後、氷冷して15分撹拌した。氷冷下で、WSC.HCl (0.90 g)を添加し、5分間撹拌した。PAE.HCｌ （1.08 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.0時間激しく撹拌した。次いで室温で22時間撹拌した。次いで脱塩膜 (Wako, Spectra/Poor 132124, 15 KDa cut off)を用いて脱塩した(5 Lの水を3日にわたり2回交換した)。得られた保持液 (約200 mL)を凍結後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE (1.039 g, 水分5.85％)が得られた。これにEtOH (80 mL)を加え、室温で振とう (200 rpm, 2時間)した。遠心分離(4500 rpm, 30分, 5 ℃)し、上澄みをデカントにて除去した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (0.97 g, PAE導入率48％, 水分1.85％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 4.0H), 1.4-2.4 (brm, 10.1H), 2.6-2.8 (brm, 0.6H), 2.8-3.1 (brm, 3.2H), 3.35-3.6 (q, 0.6H), 3.9-5.5 (brm, 5.3H), 5.7-6.0 (0.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.6H).
[実施例24] ポリ（γ-グルタミン酸）とフェニルアラニンベンジルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-Phe-OBn)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-フェニルアラニンベンジルエステル・塩酸塩 (L-H-Phe-OBn.HCｌ) （1.1 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で17.5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (15 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (50 mL)で洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OBn (1.95 g, 収率 約74.2％, Phe-OBn導入率63％, 水分4.67％, 72 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.2 (brm, 0.45H), 1.3-2.35 (brm, 6.52H), 2.6-2.8 (brm, 1.06H), 2.8-3.2 (brm, 2.16H), 4.0-4.4 (brm, 1.56H), 4.4-4.6 (brs, 0.62H), 4.6-4.9 (brm, 0.26H), 4.9-5.2 (brm, 1.06H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.0 (brm, 1.83H).
[実施例25] γ-PGA-Phe-OBnの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。H-Phe-OBn.HCｌ （0.55 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で17.5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (15 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (50 mL)で洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OBn (1.39 g, 収率 約72.6％, Phe-OBn導入率30％, 水分5.57％, 31 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.4-2.3 (brm, 13.99H), 2.6-2.8 (brm, 2.72H), 2.8-3.2 (brm, 4.06H), 4.0-4.49 (brm, 3.70H), 4.9-5.2 (brm, 1.33H), 7.0-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.1 (brm, 3.90H).
[実施例26] ポリ（γ-グルタミン酸）とフェニルアラニンシクロペンチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-Phe-OcPen)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。(2S)-フェニルアラニンシクロペンチルエステル・塩酸塩 [(2S)-H-Phe-OｃPen.HCｌ] （1.52 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で14時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OcPen (2.33 g, 収率 約96.8％, Phe-OcPen導入率57％, 水分2.88％, 282 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.2 (brm, 0.43H), 1.3-2.3 (brm, 14.97H), 2.3-2.8 (brm, 1.60H), 2.8-3.1 (brm, 2.25H), 4.0-4.4 (brm, 2.65H), 4.4-4.9 (brs, 0.24H), 4.9-5.2 (brm, 1.06H), 7.0-7.4 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.2 (brm, 2.57H).
[実施例27] γ-PGA-Phe-OcPenの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。(2S)-フェニルアラニンシクロペンチルエステル・塩酸塩 [(2S)-H-Phe-OｃPen.HCｌ] （1.01 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で14時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OcPen (1.89 g, 収率 約95.8％, Phe-OcPen導入率36％, 水分3.51％, 93 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.2 (brm, 0.55H), 1.3-2.3 (brm, 19.20H), 2.6-2.8 (brm, 1.48H), 2.8-3.1 (brm, 2.94H), 4.0-4.4 (brm, 3.77H), 4.4-5.2 (brm, 1.55H), 7.0-7.4 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.8-9.2 (brm, 3.45H).
[実施例28] ポリ（γ-グルタミン酸）とフェニルアラニンt-ブチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-Phe-OtBu)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-フェニルアラニンt-ブチルエステル・塩酸塩 (L-H-Phe-OtBu.HCｌ) （1.94 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で19時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OｔBu (3.39 g, 収率 約98.2％, Phe-OｔBu導入率78％, 水分25.04％, 106 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.5 (brm, 9.31H), 1.5-2.3 (brm, 5.27H), 2.72 (brm, 0.68H), 2.8-3.1 (brm, 2.31H), 4.1-4.5 (brm, 2.09H), 4.5-5.1 (brm, 0.05H), 7.0-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.8 (brm, 2.24H).
[実施例29] γ-PGA-Phe-OtBuの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-フェニルアラニンt-ブチルエステル・塩酸塩 (L-H-Phe-OtBu.HCｌ) （1.45 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で19時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OｔBu (3.28 g, 収率 約100.0％, Phe-OｔBu導入率57％, 水分29.72％, 71 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.5 (brm, 9.31H), 1.5-2.3 (brm, 5.27H), 2.72 (brm, 0.68H), 2.8-3.1 (brm, 2.31H), 4.1-4.5 (brm, 2.09H), 4.4-5.1 (brm, 0.05H), 7.0-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.8 (brm, 2.24H).
[実施例30] ポリ（γ-グルタミン酸）とフェニルアラニンメチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-Phe-OMe)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-フェニルアラニンメチルエステル・塩酸塩 (L-H-Phe-OMe.HCｌ) （1.62 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で15時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (14 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で3回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OMe (2.24 g, 収率 約99.6％, Phe-OMe導入率72％, 水分4.78％, 260 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.4-2.4 (brm, 5.53H), 2.4-2.7 (brm, 0.50H), 2.8-3.1 (brm, 2.49H), 3.5-3.7 (brm, 3.00H), 4.0-4.6 (brm, 2.36H), 4.6-5.1 (brm, 0.19H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.2 (brm, 2.25H).
[実施例31] γ-PGA-Phe-OMeの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-フェニルアラニンメチルエステル・塩酸塩 (L-H-Phe-OMe.HCｌ) （1.22 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で15時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (14 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で3回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OMe (2.07 g, 収率 約97.6％, Phe-OMe導入率53％, 水分4.70％, 205 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.4-2.4 (brm, 7.61H), 2.5-2.7 (brm, 0.80H), 2.8-3.1 (brm, 2.92H), 3.5-3.7 (brm, 3.00H), 4.0-4.6 (brm, 2.92H), 4.6-5.2 (brm, 0.31H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.2 (brm, 2.71H).
[実施例32] ポリ（γ-グルタミン酸）とフェニルアラニンのグラフト共重合体 (γ-PGA-Phe-OH)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-フェニルアラニン(L-H-Phe-OH) （1.24 g）の塩酸水溶液(13.2 mL)を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温14時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (12 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を取り出し、蒸留水 (25 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-OH (0.26 g, 収率 約17.3％, Phe-OH導入率19％, 水分7.11％, 271 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.5-2.4 (brm, 21.68H), 2.4-2.8 (brm, 3.09H), 2.8-3.2 (brm, 5.61H), 4.0-5.2 (brm, 8.09H), 5.3-6.2 (brm, 0.27), 6.9-7.4 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-8.5 (brm, 4.98H).
[実施例33] ポリ（γ-グルタミン酸）とフェニルアラニンアミドのグラフト共重合体 (γ-PGA-Phe-NH2)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-フェニルアラニンアミド(L-H-Phe-NH2) （1.24 g）の塩酸水溶液(12 mL)を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で16時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (12 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を取り出し、蒸留水 (30 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Phe-NH2 (1.043 g, 収率 約63.3％, Phe-NH2導入率26％, 水分8.79％, 30 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.4-2.4 (brm, 20.81H), 2.4-2.8 (brm, 3.57H), 2.8-3.2 (brm, 7.33H), 4.0-5.2 (brm, 8.82H), 6.9-7.3 (brm, 6.57H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトン5.0Hを6.57Hとした相対値), 7.3-7.7 (1.09), 7.7-8.5 (brm, 5.35H).
[実施例34] ポリ（γ-グルタミン酸）と4-フルオロフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-p-F-Phe-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-4-フルオロフェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (L-H-p-F-Phe-OEt.HCｌ) （1.40 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で12時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (50 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-p-F-Phe-OEt (2.22 g, 収率 約96.2％, p-F-Phe-OEt導入率56％, 水分3.25％, 325 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.8-1.8 (brm, 3.38H). 1.4-2.3 (brm, 7.10), 2.4-2.7 (brm, 1.18), 2.8-3.1 (brm, 2.55H), 3.9-4.5 (brm, 4.78H), 4.5-5.2 (brm, 0.27H), 6.8-7.5 (brm, 4.00H; フェニル基のプロトンを4.0Hとした場合の相対値とした), 7.7-9.2 (brm, 2.59H).
[実施例35] ポリ（γ-グルタミン酸）と4-クロロフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。DL-4-クロロフェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (DL-H-p-Cl-Phe-OEt.HCｌ) （1.49 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で15.5時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (14 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (20 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-p-Cl-Phe-OEt (2.26 g, 収率 約96.6％, p-Cl-Phe-OEt導入率58％, 水分3.65％, 284 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.0-1.3 (brm, 3.30H). 1.4-2.4 (brm, 6.95), 2.4-2.7 (brm, 1.19), 2.8-3.1 (brm, 2.68H), 3.9-4.5 (brm, 4.70H), 4.5-5.2 (brm, 0.20H), 7.0-7.5 (brm, 4.00H; フェニル基のプロトンを4.0Hとした場合の相対値とした), 7.7-9.2 (brm, 2.57H).
[実施例36] ポリ（γ-グルタミン酸）と4-ブロモフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-p-Br-Phe-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。(S)-4-ブロモフェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 [(S)-H-p-Br-Phe-OEt.HCｌ] （1.74 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で13時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (20 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-p-Br-Phe-OEt (2.43 g, 収率 約97.2％, p-Br-Phe-OEt導入率56％, 水分2.39％, 185 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brm, 3.34H). 1.4-2.4 (brm, 7.17), 2.4-2.7 (brm, 1.46), 2.7-3.1 (brm, 2.76H), 3.9-4.5 (brm, 4.90H), 4.5-5.2 (brm, 0.33H), 6.9-7.3 (brm, 4.00H; フェニル基のプロトンを4.0Hのうち、2.0Hを相対値とした), 7.3-7.7 (brm, 2.0H), 7.7-9.2 (brm, 2.63H).
[実施例37] ポリ（γ-グルタミン酸）と4-ニトロフェニルアラニンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。D-p-ニトロフェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (D-H-p-NO2-Phe-OEt.HCｌ) （1.55 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で12時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (50 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-p-NO2-Phe-OEt (2.39 g, 収率 約95.7％, p-NO2-Phe-OEt導入率58％, 水分3.42％, 331 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.8-1.3 (brm, 3.28H). 1.4-2.4 (brm, 6.90), 2.4-2.7 (brm, 1.06), 2.7-3.3 (brm, 3.76H), 3.9-5.1 (brm, 1.25H), 7.3-7.6 (brm, 2.00H; フェニル基のプロトンを4.0Hのうち、2.0Hを相対値とした), 7.6-9.2 (brm, 0.03H).
[実施例38] ポリ（γ-グルタミン酸）とO-(1-メチルエチル)-L-チロシンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。O-(1-メチルエチル)-L-チロシンエチルエステル・塩酸塩 (L-H-p-OiPr-Phe-OEt.HCｌ) （1.62 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で14時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt (2.43 g, 収率 約95.6％, p-OiPr-Phe-OEt導入率57％, 水分2.82％, 309 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brm, 9.58H). 1.5-2.4 (brm, 7.11), 2.6-2.8 (brm, 0.85), 2.8-3.1 (brm, 2.52H), 3.9-4.9 (brm, 5.92H), 6.78 (brs, 2.0H; フェニル基のプロトンを4.0Hのうち、2.0Hを相対値とした), 7.0-7.1 (brm, 2.0H), 7.8-9.2 (brm, 2.76H).
[実施例39] ポリ（γ-グルタミン酸）とα-フェニルグリシンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-α-Phegly-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。D-α-フェニルグリシンエチルエステル・塩酸塩 (D-H-α-Phegly-OEt.HCｌ) （1.22 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で13時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (20 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-α-Phegly-OEt (2.00 g, 収率 約96.1％,α-Phegly-OEt導入率59％, 水分3.18％, 126 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brm, 3.23H), 1.5-2.3 (brm, 6.84H), 2.4-2.7 (brm, 1.21H), 2.7-3.0 (brm, 0.41H), 4.0-4.2 (brs, 2.61H), 4.3-4.5 (brm, 1.03H), 4.5-5.2 (brs, 0.19H), 5.3-5.4 (brm, 0.99H), 7.0-7.6 (brm, 5.0H, フェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.8-9.2 (brm, 2.56H).
[実施例40] ポリ（γ-グルタミン酸）とロイシンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-Leu-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-ロイシンエチルエステル・塩酸塩 (L-H-Leu-OEt.HCｌ) （1.47 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で6時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を取り出し、蒸留水 (20 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Leu-OEt (2.25 g, Leu-OEt導入率48％, 水分5.13％, 284 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.7-1.0 (brm, 6.5H, 相対値を示す), 1.1-1.3 (brm, 1.0H), 1.4-2.4 (brm, 10.1H), 2.6-2.8 (brm, 1.2H), 2.9-3.3 (brm, 1.3H), 3.9-5.2 (brm, 4.7H), 7.5-9.0 (brm, 2.7H).
[実施例41] ポリ（γ-グルタミン酸）とイソロイシンメチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-Ile-OMe)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-イソロイシンメチルエステル・塩酸塩 (L-H-Ile-OMe.HCｌ) （1.47 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で6時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、2時間撹拌した。析出物を取り出し、蒸留水 (20 mL)で3回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Ile-OMe (2.25 g, Ile-OMe導入率55％, 水分15.11％, 209 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.7-0.9 (brm, 6.0H), 1.0-1.3 (brm, 1.3H), 1.3-1.5 (brm, 1.0H), 1.6-2.4 (brm, 7.8H), 2.6-2.9 (brm, 0.8H), 2.9-3.3 (brm, 1.0H), 3.5-3.7 (brm, 3.0H, CO2Meのメチル基を3.0Hとした相対値), 4.0-5.2 (brm, 2.7H), 7.8-9.8 (brm, 2.7H).
[実施例42] ポリ（γ-グルタミン酸）とS-ベンジルシステインエチルエステルのグラフト共重合体 [γ-PGA-Cys(Bn)-OEt]の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-S-ベンジルシステインエチルエステル・塩酸塩 [L-H-Cys(Bn)-OEt.HCl] （1.56 g）を添加し、そのまま氷冷下で1時間激しく撹拌した。次いで室温で17時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (14 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Cys(Bn)-OEt [1.36 g, Cys(Bn)-OEt導入率60％, 水分3.40％, 404 kDa]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.0-1.2 (brs, 3.3H), 1.4-2.4 (brm, 6.7H), 2.4-2.7 (brm, 0.3H), 2.6-2.8 (brm, 2.6H), 2.8-3.1 (brm, 0.6H), 4.0-4.5 (brm, 4.7H), 4.5-5.2 (brm, 0.3H), 7.1-7.5 (brm, 5.0H, フェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.2 (brm, 2.6H).
[実施例43] ポリ（γ-グルタミン酸）とトリプトファンエチルエステルのグラフト共重合体 (γ-PGA-Trp-OEt)の合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-トリプトファンエチルエステル・塩酸塩 (L-H-Trp-OEt.HCｌ) （1.52 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で22時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Trp-OEt (2.33 g, Trp-OEt導入率56％, 水分2.97％, 217 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.8-1.2 (brs, 3.4H), 1.5-2.4 (brm, 6.9H), 2.5-2.8 (brm, 1.0H), 2.9-3.3 (brm, 3.2H), 3.9-5.2 (brm, 4.7H), 6.8-7.6 (brm, 5.0H, NHを除くインドール基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.7-9.5 (brm, 2.6H).
[実施例44] γ-PGA-Trp-OEtの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (9.0 mL)、蒸留水 (35 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (1.21 g, 148 kDa)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、5分間撹拌した。L-トリプトファンエチルエステル・塩酸塩 (L-H-Trp-OEt.HCｌ) （1.01 g）を添加し、そのまま氷冷下で1.5時間激しく撹拌した。次いで室温で22時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (13 mL)を滴下し、1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-Trp-OEt (1.92 g, Trp-OEt導入率33％, 水分3.32％, 47 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.8-1.2 (brs, 3.6H), 1.5-2.4 (brm, 10.2H), 2.6-2.8 (brm, 1.7H), 2.9-3.3 (brm, 3.9H), 3.9-5.2 (brm, 6.0H), 6.9-7.6 (brm, 5.0H, NHを除くインドール基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.8-9.3 (brm, 3.3H).
[実施例45] γ-PGA-PAEの合成
1-L 四頸フラスコにNa2CO3 (1.59 g), 蒸留水 (500 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (3.64 g)を添加し、蒸留水 (50 mL)で洗浄した。室温で撹拌して溶解後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (5.41 g)を添加し、5分間撹拌した。PAE.HCｌ （6.48 g）を添加し、そのまま氷冷下で2.0時間激しく撹拌した。次いで室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (45 mL)を滴下し、1.5時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (50 mL)で3回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (5.83 g, PAE導入率48％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 7.4H), 2.6-2.8 (brm, 0.9H), 2.8-3.1 (brm, 2.9H), 3.9-5.5 (brm, 5.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.5H).
[実施例46] γ-PGA-PAEの合成
100-mL スコット瓶に1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (4.5 mL), 蒸留水 (20 mL)を量り、良く撹拌した。室温でγ-PGA (0.61 g)を添加し、溶解後に氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (0.90 g)を添加し、5分間撹拌した。PAE.HCｌ （0.65 g）を添加し、そのまま氷冷下で2.0時間激しく撹拌した。次いで室温で21時間撹拌した。次いで1 M 水酸化ナトリウム水溶液 (1.9 mL)を滴下し、0.5時間撹拌した。次いで2 M HCl (13 mL)を滴下し、そのまま1 h撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (10 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (0.99 g, PAE導入率57％)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.3H), 1.4-2.4 (brm, 7.1H), 2.8-3.1 (brm, 2.5H), 3.9-5.5 (brm, 5.1H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-9.2 (brm, 2.6H).
[実施例47] γ-PGA-PAE (28％ Na塩)の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, PAE導入率 55％）とDMSO (1.5 mL)を量り、室温で1時間撹拌すると溶液が得られた。この溶液 (1.5 mL)を蒸留水 (28.5 mL)に滴下した。室温で撹拌しながら0.1 M NaOH水溶液 (3.1 mL)を滴下し、pH 10.0に調整した。その後、室温で撹拌しながら0.01 M HCl (0.05 mL)を滴下した。この溶液を凍らせた後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE （28％ Na塩）(207 mg, PAE導入率 58％, Na:42000 ppm, Cl:2271 ppm)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 2.8H), 1.4-2.4 (brm, 6.6H), 2.8-3.1 (brm, 2.7H), 3.8-4.5 (brm, 4.1H), 4.5-5.5 (brm, 0.5H), 6.4-6.6 (brm, 0.2H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.1H).
[実施例48] γ-PGA-PAE (26％ Na塩)の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, PAE導入率 55％）とDMSO (1.5 mL)を量り、室温で1時間撹拌すると溶液が得られた。この溶液 (1.5 mL)を蒸留水 (28.5 mL)に滴下した。室温で撹拌しながら0.1 M NaOH水溶液 (2.8 mL)を滴下し、pH 8.0に調整した。その後、室温で撹拌しながら0.01 M HCl (0.02 mL)を滴下した。この溶液を凍らせた後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE （26％ Na塩）(210 mg, PAE導入率 56％, Na:35000 ppm, Cl:15662 ppm)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 2.8H), 1.4-2.4 (brm, 6.8H), 2.8-3.1 (brm, 2.7H), 3.8-4.5 (brm, 4.1H), 4.5-5.5 (brm, 0.5H), 6.4-6.6 (brm, 0.2H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.0H).
[実施例49] γ-PGA-PAE (14％ Na塩)の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, PAE導入率 55％）とDMSO (1.5 mL)を量り、室温で1時間撹拌すると溶液が得られた。この溶液 (1.5 mL)を蒸留水 (28.5 mL)に滴下した。室温で撹拌しながら0.1 M NaOH水溶液 (2.3 mL)を滴下し、pH 6.0に調整した。その後、室温で撹拌しながら0.01 M HCl (0.01 mL)を滴下した。この溶液を凍らせた後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE （14％ Na塩）(217 mg, PAE導入率 53％, Na:22000 ppm, Cl:13282 ppm)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 2.9H), 1.4-2.4 (brm, 7.0H), 2.8-3.1 (brm, 2.4H), 3.8-4.5 (brm, 3.9H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.4-6.6 (brm, 0.2H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 1.6H).
[実施例50] γ-PGA-PAE (0％ Na塩)の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, PAE導入率 55％）とDMSO (1.5 mL)を量り、室温で1時間撹拌すると溶液が得られた。この溶液 (1.5 mL)を蒸留水 (28.5 mL)に滴下した。室温で撹拌しながら0.1 M NaOH水溶液 (0.9 mL)を滴下し、pH 4.0に調整した。その後、室温で撹拌しながら0.01 M HCl (0.02 mL)を滴下した。この溶液を凍らせた後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE （0％ Na塩）(244 mg, PAE導入率 51％, Na:6900 ppm, Cl:13785 ppm)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 2.8H), 1.4-2.4 (brm, 6.6H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.8-4.5 (brm, 3.8H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.4-6.6 (brm, 0.3H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 1.4H).
[実施例51] γ-PGA-PAE (27％ K塩)の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, PAE導入率 55％）とDMSO (1.5 mL)を量り、室温で1時間撹拌すると溶液が得られた。この溶液 (1.5 mL)を蒸留水 (28.5 mL)に滴下した。室温で撹拌しながら0.1 M KOH水溶液 (3.1 mL)を滴下し、pH 10.0に調整した。その後、室温で撹拌しながら0.01 M HCl (0.02 mL)を滴下した。この溶液を凍らせた後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE （27％ K塩）(215 mg, PAE導入率 53％, K:62000 ppm, Cl:22769 ppm, 105 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 2.7H), 1.4-2.4 (brm, 7.0H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.8-4.5 (brm, 3.9H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.4-6.6 (brm, 0.3H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.4H).
[実施例52] γ-PGA-PAE (55％ K塩)の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, PAE導入率 55％）とDMSO (1.5 mL)を量り、室温で1時間撹拌すると溶液が得られた。この溶液 (1.5 mL)を蒸留水 (28.5 mL)に滴下した。室温で撹拌しながら0.1 M KOH水溶液 (2.8 mL)を滴下し、pH 8.0に調整した。その後、室温で撹拌しながら0.01 M HCl (0.02 mL)を滴下した。この溶液を凍らせた後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE （55％ K塩）(215 mg, PAE導入率 48％, K:42000 ppm, Cl:19974 ppm, 125 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 2.8H), 1.4-2.4 (brm, 7.2H), 2.8-3.1 (brm, 2.4H), 3.8-4.5 (brm, 3.8H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.4-6.6 (brm, 0.2H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 1.7H).
[実施例53] γ-PGA-PAE (12％ K塩)の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, PAE導入率 55％）とDMSO (1.5 mL)を量り、室温で1時間撹拌すると溶液が得られた。この溶液 (1.5 mL)を蒸留水 (28.5 mL)に滴下した。室温で撹拌しながら0.1 M KOH水溶液 (2.2 mL)を滴下し、pH 6.0に調整した。その後、室温で撹拌しながら0.01 M HCl (0.02 mL)を滴下した。この溶液を凍らせた後、凍結乾燥するとγ-PGA-PAE （12％ K塩）(232 mg, PAE導入率 47％, K:33000 ppm, Cl:11743 ppm, 138 kDa)が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.6-1.2 (brs, 2.9H), 1.4-2.4 (brm, 7.2H), 2.8-3.1 (brm, 2.4H), 3.8-4.5 (brm, 4.0H), 4.5-5.5 (brm, 0.4H), 6.4-6.6 (brm, 0.3H), 6.7-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.1H).
[実施例54] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (28％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率58％, 実施例４８）とDMSO (0.2 mL)を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10 mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.50 M NaCl, 30 nm (PDI 0.29); 0.80 M NaCl, 167 nm (PDI 0.21); 0.95 M NaCl, 348 nm (PDI 0.27); 1.10 M NaCl, 775 nm (PDI 0.24); 1.25 M NaCl, 898 nm (PDI 0.47); 1.40 M NaCl, 988 nm (PDI 0.37); 1.55 M NaCl, 994 nm (PDI 0.38)であった。
[実施例55] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (28％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率58％, 実施例４８）, DMSO (0.16 mL)と蒸留水(0.04 mL)を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.80 M NaCl, 98 nm (PDI 0.21); 0.95 M NaCl, 197 nm (PDI 0.25); 1.10 M NaCl, 357 nm (PDI 0.43); 1.25 M NaCl, 577 nm (PDI 0.45); 1.40 M NaCl, 741 nm (PDI 0.51); 1.55 M NaCl, 649 nm (PDI 0.37)であった。
[実施例56] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (26％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率58％, 実施例４９）とDMSO (0.2 mL)を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.50 M NaCl, 43 nm (PDI 0.19); 0.65 M NaCl, 145 nm (PDI 0.16); 0.70 M NaCl, 278 nm (PDI 0.29); 0.75 M NaCl, 282 nm (PDI 0.28); 0.80 M NaCl, 578 nm (PDI 0.43); 0.95 M NaCl, 963 nm (PDI 0.27); 1.10 M NaCl, 1539 nm (PDI 0.26)であった。
[実施例57] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (26％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率58％, 実施例４９）, DMSO (0.16 mL)と蒸留水(0.04 mL)を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.70 M NaCl, 92 nm (PDI 0.18); 0.75 M NaCl, 135 nm (PDI 0.27); 0.80 M NaCl, 167 nm (PDI 0.19); 0.95 M NaCl, 398 nm (PDI 0.28); 1.10 M NaCl, 677 nm (PDI 0.38)であった。
[実施例58] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (14％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率58％, 実施例５０）とDMSO (0.2 mL)を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.40 M NaCl, 77 nm (PDI 0.15); 0.50 M NaCl, 158 nm (PDI 0.11); 0.60 M NaCl, 244 nm (PDI 0.19); 0.65 M NaCl, 310 nm (PDI 0.22); 0.70 M NaCl, 489 nm (PDI 0.25)であった。
[実施例59] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (14％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率58％, 実施例５０）, DMSO (0.16 mL)と蒸留水(0.04 mL)を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.60 M NaCl, 113 nm (PDI 0.11); 0.70 M NaCl, 184 nm (PDI 0.20); 0.75 M NaCl, 210 nm (PDI 0.19); 0.80 M NaCl, 312 nm (PDI 0.28); 0.90 M NaCl, 553 nm (PDI 0.31); 1.00 M NaCl, 800 nm (PDI 0.27)であった。
[実施例60] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (0％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率51％, 実施例５１）とDMSO (0.2 mL)を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.00 M NaCl, 155 nm (PDI 0.11); 0.01 M NaCl, 217 nm (PDI 0.09)であった。
[実施例61] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE (0％, Na塩) （2.0 mg, PAE導入率51％, 実施例５１）とDMSO (0.16 mL)と蒸留水 (0.04 mL)を量添加し、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.00 M NaCl, 140 nm (PDI 0.14); 0.01 M NaCl, 178 nm (PDI 0.07); 0.02 M NaCl, 220 nm (PDI 0.09)であった。
[実施例62] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNa2CO3 (12.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.95 M NaCl, 192 nm (PDI 0.42); 1.10 M NaCl, 274 nm (PDI 0.28); 1.25 M NaCl, 494 nm (PDI 0.32); 1.40 M NaCl, 810 nm (PDI 0.42); 1.55 M NaCl, 871 nm (PDI 0.42)であった。
[実施例63] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNa2CO3 (6.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、1.00 M NaCl, 184 nm (PDI 0.23); 1.10 M NaCl, 335 nm (PDI 0.27); 1.15 M NaCl, 553 nm (PDI 0.51); 1.20 M NaCl, 505 nm (PDI 0.32); 1.25 M NaCl, 619 nm (PDI 0.39); 1.30 M NaCl, 727 nm (PDI 0.39)であった。
[実施例64] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNa2CO3 (3.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.60 M NaCl, 53 nm (PDI 0.20); 0.80 M NaCl, 202 nm (PDI 0.22); 0.85 M NaCl, 245 nm (PDI 0.25); 0.90 M NaCl, 355 nm (PDI 0.29); 0.95 M NaCl, 875 nm (PDI 0.59); 1.00 M NaCl, 676 nm (PDI 0.50)であった。
[実施例65] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNa2CO3 (1.5 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 63 nm (PDI 0.06); 0.25 M NaCl, 78 nm (PDI 0.05); 0.30 M NaCl, 112 nm (PDI 0.08); 0.35 M NaCl, 123 nm (PDI 0.09); 0.40 M NaCl, 164 nm (PDI 0.10); 0.45 M NaCl, 210 nm (PDI 0.16); 0.50 M NaCl, 459 nm (PDI 0.42); 0.60 M NaCl, 719 nm (PDI 0.36)であった。
[実施例66] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNa2HPO4 (12.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.50 M NaCl, 34 nm (PDI 0.21); 0.60 M NaCl, 118 nm (PDI 0.17); 0.70 M NaCl, 197 nm (PDI 0.22); 0.80 M NaCl, 345 nm (PDI 0.28); 0.90 M NaCl, 537 nm (PDI 0.35); 1.00 M NaCl, 642 nm (PDI 0.28)であった。
[実施例67] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNa2HPO4 (6.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.05 M NaCl, 31 nm (PDI 0.14); 0.20 M NaCl, 56 nm (PDI 0.07); 0.30 M NaCl, 88 nm (PDI 0.10); 0.40 M NaCl, 137 nm (PDI 0.11); 0.50 M NaCl, 236 nm (PDI 0.20); 0.60 M NaCl, 530 nm (PDI 0.48); 0.70 M NaCl, 585 nm (PDI 0.49)であった。
[実施例68] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNa2HPO4 (3.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.01 M NaCl, 365 nm (PDI 0.21); 0.02 M NaCl, 595 nm (PDI 0.21); 0.04 M NaCl, 1195 nm (PDI 0.25); 0.05 M NaCl, 1057 nm (PDI 0.46)であった。
[実施例69] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてK2CO3 (12.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、1.40 M KCl, 415 nm (PDI 0.55); 1.50 M KCl, 595 nm (PDI 0.41); 1.60 M KCl, 902 nm (PDI 0.54)であった。
[実施例70] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてK2CO3 (6.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.60 M KCl, 83 nm (PDI 0.29); 0.70 M KCl, 189 nm (PDI 0.25); 0.80 M KCl, 421 nm (PDI 0.30); 0.90 M KCl, 940 nm (PDI 0.26); 0.95 M KCl, 1185 nm (PDI 0.07)であった。
[実施例71] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてK2CO3 (3.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.50 M KCl, 103 nm (PDI 0.11); 0.55 M KCl, 93 nm (PDI 0.12); 0.60 M KCl, 161 nm (PDI 0.16); 0.65 M KCl, 216 nm (PDI 0.22); 0.70 M KCl, 308 nm (PDI 0.23); 0.75 M KCl, 398 nm (PDI 0.31); 0.80 M KCl, 612 nm (PDI 0.31)であった。
[実施例72] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてK2CO3 (1.5 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.05 M KCl, 105 nm (PDI 0.08); 0.08 M KCl, 153 nm (PDI 0.08); 0.10 M KCl, 198 nm (PDI 0.15); 0.12 M KCl, 266 nm (PDI 0.20); 0.15 M KCl, 356 nm (PDI 0.18); 0.20 M KCl, 838 nm (PDI 0.29)であった。
[実施例73] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてKHCO3 (12.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.70 M KCl, 127 nm (PDI 0.20); 0.80 M KCl, 263 nm (PDI 0.28); 0.90 M KCl, 479 nm (PDI 0.42); 1.00 M KCl, 1097 nm (PDI 0.47); 1.10 M KCl, 2085 nm (PDI 0.15)であった。
[実施例74] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてKHCO3 (6.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.50 M KCl, 40 nm (PDI 0.16); 0.60 M KCl, 63 nm (PDI 0.18); 0.70 M KCl, 141 nm (PDI 0.18); 0.80 M KCl, 286 nm (PDI 0.27); 0.90 M KCl, 679 nm (PDI 0.49); 1.00 M KCl, 1228 nm (PDI 0.04)であった。
[実施例75] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてKHCO3 (3.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いた場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M KCl, 58 nm (PDI 0.07); 0.30 M KCl, 91 nm (PDI 0.07); 0.40 M KCl, 161 nm (PDI 0.11); 0.45 M KCl, 189 nm (PDI 0.15); 0.50 M KCl, 303 nm (PDI 0.25); 0.55 M KCl, 488 nm (PDI 0.31); 0.60 M KCl, 672 nm (PDI 0.28)であった。
[実施例76] γ-PGA-PAEのナノ粒子 (K塩) の調製
γ-PGA-PAE （30 mg, PAE導入率55％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてKHCO3 (1.5 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-PAE （K塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のKCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL) で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL) が得られた。
続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のKCl水溶液を用いた場合に対して以下の結果であった。即ち、0.00 M KCl, 237 nm (PDI 0.11); 0.005 M KCl, 242 nm (PDI 0.11); 0.01 M KCl, 361 nm (PDI 0.17)であった。
[実施例77] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
100-mL ナス型フラスコにγ-PGA-PAE (1.03 g, 水分2.21％), DMSO (60 mL)を量り、室温で撹拌し、完全に溶解した。内温18〜30 ℃にてNaHCO3水溶液 [NaHCO3 (50 mg)を蒸留水 (20.0 mL)で希釈した]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (20 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした(検討用に0.5 mLをサンプリングした)。
NaCl (2.63 g)を大塚蒸留水 (100 mL)に溶解し、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。
溶液Aと溶液Bを1/8”のチューブを通じて流速 10 mL/分にて混合した。混合液を1000-mL プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)で受けた。この混液に蒸留水(約800 mL)を添加し、脱塩用溶液とした。この溶液を脱塩した (脱塩条件 SARTOCON（登録商標）Slice Cassette 2 kDa, TM 20-22 psi)。これを-40 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 [957 mg, 収率 95.7％, 水分 1.40％, PAE導入率 57％, Z-Ave d. 522 nm (PDI 0.49)]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 7.1H), 2.6-2.8 (brm, 0.2H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.9-4.5 (brm, 4.8H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.5H).
[実施例78] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
100-mL ナス型フラスコにγ-PGA-PAE (3.075 g, 水分2.21％), DMSO (45 mL)を量り、室温で撹拌し、完全に溶解した。内温18〜30 ℃にてNaHCO3水溶液 [NaHCO3 (300 mg)を蒸留水 (6.0 mL)で希釈した。滴下後、蒸留水 (3.0 mL)で洗浄し、更にこの洗液を滴下した]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (6 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした(検討用に0.5 mLをサンプリングした)。
1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)にNaCl (23.38 g)、大塚蒸留水 (1000 mL)を量り、溶解する。これを0.2 μmフィルターでろ過した。これを溶液Bとした。
溶液A (約60 mL)と溶液B (約70 mL)を1/8”のチューブを通じて流速 10 mL/分にて混合した。混合液を1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)で受けた。この混液に蒸留水(約900 mL)を添加し、脱塩用溶液とした。この溶液を脱塩した [脱塩条件 SARTOCON（登録商標） Slice Cassette 10 kDa (3051443901E-SG), TM 17-18 psi, 約12〜16 g/分, 約3時間]。これを-40 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 [2.68 g, 収率 83.4％, 水分 6.72％, PAE導入率 57％, Z-Ave d. 79.5 nm (PDI 0.28)]が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 7.0H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.9-4.5 (brm, 4.5H), 4.5-5.5 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.5H).
1H NMR (500 MHz, D2O-d6) δ No signal. ゲインを上げ、無理に観測すると極小さく以下のピークが観測された。0.7-1.2 (brs, 3.0H), 1.5-2.5 (brm, 5.1H), 2.7-2.3 (brm, 1.8H), 3.7-4.2 (brm, 2.0H), 6.7-7.4 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値).
[実施例79] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
100-mL ナス型フラスコにγ-PGA-PAE (3.075 g, 水分2.21％), DMSO (45 mL)を量り、室温で撹拌し、完全に溶解した。内温18〜30 ℃にてNaOH水溶液 [1 M NaOH (2.5 mL)を蒸留水 (4.5 mL)で希釈した。滴下後、蒸留水 (2.0 mL)で洗浄し、更にこの洗液を滴下した]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (6 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした。
1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)にNaCl (17.53 g)、大塚蒸留水 (1000 mL)を量り、溶解する。これを0.2 μmフィルターでろ過した。これを溶液Bとした(検討用に0.5 mLをサンプリングした)。
溶液A (約60 mL)と溶液B (約70 mL)を1/8”のチューブを通じて流速 10 mL/分にて混合した。混合液を1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)で受けた。この混液に蒸留水(約900 mL)を添加し、脱塩用溶液とした。この溶液を脱塩した [脱塩条件 SARTOCON（登録商標） Slice Cassette 10 kDa (3051443901E-SG), TM 17-18 psi, 約12〜16 g/分, 約3時間]。これを-40 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 [2.76 g, 収率 88.7％, 水分 3.50％, PAE導入率 57％, Z-Ave d. 80.2 nm (PDI 0.21)] が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 7.1H), 2.6-2.8 (brm, 0.2H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.9-4.5 (brm, 4.9H), 4.5-5.5 (brm, 0.3H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.7H).
[実施例80] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
100-mL ナス型フラスコにγ-PGA-PAE (3.075 g, 水分2.21％), DMSO (45 mL)を量り、室温で撹拌し、完全に溶解した。内温18〜30 ℃にてNa2CO3水溶液 [Na2CO3 (189 mg)を蒸留水 (6.0 mL)で希釈した。滴下後、蒸留水 (3.0 mL)で洗浄し、更にこの洗液を滴下した]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (6 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした(検討用に0.5 mLをサンプリングした)。
1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)にNaCl (25.13 g)、大塚蒸留水 (1000 mL)を量り、溶解する。これを0.2 μmフィルターでろ過した。これを溶液Bとした。
溶液A (約60 mL)と溶液B (約70 mL)を1/8”のチューブを通じて流速 10 mL/分にて混合した。混合液を1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)で受けた。この混液に蒸留水(約900 mL)を添加し、脱塩用溶液とした。この溶液を脱塩した [脱塩条件 SARTOCON（登録商標） Slice Cassette 10 kDa (3051443901E-SG), TM 17-18 psi, 約12〜16 g/分, 約3時間]。これを-40 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 [2.75 g, 収率 87.3％, 水分 4.64％, PAE導入率 56％, Z-Ave d. 98.5 nm (PDI 0.25)] が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.3H), 1.4-2.4 (brm, 7.1H), 2.6-2.8 (brm, 0.2H), 2.8-3.1 (brm, 2.3H), 3.9-4.5 (brm, 4.7H), 4.5-5.5 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.5H).
[実施例81] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
100-mL ナス型フラスコにγ-PGA-PAE (3.075 g, 水分2.21％), DMSO (45 mL)を量り、室温で撹拌し、完全に溶解した。内温18〜30 ℃にてNa2CO3水溶液 [Na2CO3 (189 mg)を蒸留水 (6.0 mL)で希釈した。滴下後、蒸留水 (3.0 mL)で洗浄し、更にこの洗液を滴下した]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (6 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした(検討用に0.5 mLをサンプリングした)。
1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)にNaCl (17.53 g)、大塚蒸留水 (1000 mL)を量り、溶解する。これを0.2 μmフィルターでろ過した。これを溶液Bとした。
溶液A (約60 mL)と溶液B (約70 mL)を1/8”のチューブを通じて流速 10 mL/分にて混合した。混合液を1-L プラボトル (コーニング, ストレージボトル, PS製, 430281)で受けた。この混液に蒸留水(約900 mL)を添加し、脱塩用溶液とした。この溶液を脱塩した [脱塩条件 SARTOCON（登録商標） Slice Cassette 10 kDa (3051443901E-SG), TM 17-18 psi, 約12〜16 g/分, 約3時間]。これを-40 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 [2.63 g, 収率 83.4％, 水分 4.86％, PAE導入率 57％, Z-Ave d. 261.5 nm (PDI 0.40)] が得られた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.9-1.3 (brs, 3.2H), 1.4-2.4 (brm, 7.0H), 2.6-2.8 (brm, 0.2H), 2.8-3.1 (brm, 2.2H), 3.9-4.5 (brm, 4.7H), 4.5-5.5 (brm, 0.2H), 6.9-7.5 (brm, 5.0H, フェニルアラニル基のフェニル基のプロトンを5.0Hとした相対値), 7.6-8.7 (brm, 2.4H).
[実施例82] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
100-mL ナス型フラスコにγ-PGA-PAE (3.075 g, 水分2.21％), DMSO (45 mL)を量り、室温で撹拌し、完全に溶解した。内温18〜30 ℃にてNa2CO3水溶液 [Na2CO3 (189 mg)を蒸留水 (6.0 mL)で希釈した。滴下後、蒸留水 (3.0 mL)で洗浄し、更にこの洗液を滴下した]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (6 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした(このうち、0.5 mLをサンプリングし、本検討に使用した)。
この溶液Aの一部 (25 μL)を、各種濃度のPBS水溶液 (25 μL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。この分散液を用い、γ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のPBS水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、X1 PBS, 44 nm (PDI 0.24); X2 PBS, 43 nm (PDI 0.23); X3 PBS, 74 nm (PDI 0.23); X3.1 PBS, 89 nm (PDI 0.25); X3.2 PBS, 138 nm (PDI 0.43)であった。
[実施例83] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
100-mL ナス型フラスコにγ-PGA-PAE (3.075 g, 水分2.21％), DMSO (45 mL)を量り、室温で撹拌し、完全に溶解した。内温18〜30 ℃にてNaHCO3水溶液 [NaHCO3 (300 mg)を蒸留水 (6.0 mL)で希釈した。滴下後、蒸留水 (3.0 mL)で洗浄し、更にこの洗液を滴下した]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (6 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした(このうち、0.5 mLをサンプリングし、本検討に使用した)。
この溶液Aの一部 (25 μL)を、各種濃度のAcONa水溶液 (25 μL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。この分散液を用い、γ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のAcONa水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.1M AcONa, 38 nm (PDI 0.25); 0.2M AcONa, 36 nm (PDI 0.23); 0.3M AcONa, 39 nm (PDI 0.23); 0.4M AcONa, 68 nm (PDI 0.38)であった。
[実施例84] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
5-mL サンプル瓶にγ-PGA-PAE (60 mg, 水分2.21％), EtOH (4 mL)を量り、室温で撹拌し、懸濁した。室温にてNaHCO3水溶液 [Na2CO3 (63 mg)を蒸留水 (3 mL)で溶解し、その内の0.36 mLを使用]を滴下した。30分撹拌後、蒸留水 (1 mL)を滴下し、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (50 μL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (50 μL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。この分散液を用い、γ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.3M NaCl, 35 nm (PDI 0.39); 0.4M NaCl, 63 nm (PDI 0.48); 0.45M NaCl, 206 nm (PDI 0.46); 0.5 M NaCl, 415 nm (PDI 0.35)であった。
[実施例85] γ-PGA-Phe-OcPenのナノ粒子の調製
γ-PGA-Phe-OcPen （30 mg, Phe-OcPen導入率57％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (0.6 mL, 0.051 mmol相当)を滴下した。2時間撹拌するとγ-PGA-Phe-OcPen （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-Phe-OcPenのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-Phe-OcPenのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.40 M NaCl, 39 nm (PDI 0.19); 0.50 M NaCl, 70 nm (PDI 0.18); 0.60 M NaCl, 124 nm (PDI 0.16); 0.70 M NaCl, 199 nm (PDI 0.25); 0.80 M NaCl, 314 nm (PDI 0.28); 0.90 M NaCl, 670 nm (PDI 0.59)であった。
[実施例86] γ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の調製
γ-PGA-Phe-OtBu （30 mg, Phe-OtBu導入率57％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaHCO3 (3.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-Phe-OtBu （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いた場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 45 nm (PDI 0.25); 0.30 M NaCl, 97 nm (PDI 0.16); 0.40 M NaCl, 311 nm (PDI 0.27); 0.45 M NaCl, 685 nm (PDI 0.22); 0.50 M NaCl, 1066 nm (PDI 0.37)であった。
[実施例87] γ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の調製
γ-PGA-Phe-OtBu （30 mg, Phe-OtBu導入率57％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaHCO3 (1.5 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-Phe-OtBu （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 49 nm (PDI 0.46); 0.40 M NaCl, 80 nm (PDI 0.29); 0.50 M NaCl, 123 nm (PDI 0.28); 0.60 M NaCl, 202 nm (PDI 0.41); 0.70 M NaCl, 414 nm (PDI 0.45)であった。
[実施例88] γ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の調製
γ-PGA-Phe-OtBu （0.90 g, Phe-OtBu導入率57％）とDMSO (7.2 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (1.8 mL, 1.6 mmol相当)を滴下した。2時間撹拌するとγ-PGA-Phe-OtBu （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL）が得られた。
まず、NaCl水溶液の予備調査を行った。γ-PGA-Phe-OtBu （Na塩）のDMSO水溶液の一部 (濃度100 mg/mL, 0.1 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.1 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.1 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (1.0 mL)で分散するとγ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。そしてナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いた場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 47 nm (PDI 0.24); 0.45 M NaCl, 64 nm (PDI 0.22); 0.50 M NaCl, 80 nm (PDI 0.23); 0.55 M NaCl, 140 nm (PDI 0.42)であった。
続いてスケールを上げた。即ち、0.60 M NaCl水溶液 (8.0 mL)中に先のγ-PGA-Phe-OtBu （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL, 8.0 mL）を速やかに混合すると分散液が得られた。遠心ろ過にて脱塩・水洗を行った(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (25 mL)で分散し、凍結乾燥するとγ-PGA-Phe-OtBuのナノ粒子 (849 mg)が得られた。これの平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。結果、105 nm (PDI 0.40)であった。
[実施例89] γ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の調製
γ-PGA-Phe-OMe （30 mg, Phe-OMe導入率53％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaHCO3 (3.0 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-Phe-OMe （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 76 nm (PDI 0.11); 0.30 M NaCl, 154 nm (PDI 0.12); 0.35 M NaCl, 196 nm (PDI 0.14); 0.40 M NaCl, 273 nm (PDI 0.20); 0.50 M NaCl, 468 nm (PDI 0.30)であった。
[実施例90] γ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の調製
γ-PGA-Phe-OMe （30 mg, Phe-OMe導入率53％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaHCO3 (1.5 mg)の水溶液 (0.6 mL)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-Phe-OMe （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.15 M NaCl, 114 nm (PDI 0.05); 0.20 M NaCl, 173 nm (PDI 0.08); 0.25 M NaCl, 333 nm (PDI 0.26); 0.30 M NaCl, 778 nm (PDI 0.42); 0.40 M NaCl, 2673 nm (PDI 0.17)であった。
[実施例91] γ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の調製
γ-PGA-Phe-OMe （0.90 g, Phe-OMe導入率53％）とDMSO (7.2 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (1.8 mL, 2.0 mmol相当)を滴下した。2時間撹拌するとγ-PGA-Phe-OMe （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL）が得られた。
まず、NaCl水溶液の予備調査を行った。γ-PGA-Phe-OMe （Na塩）のDMSO水溶液の一部 (濃度100 mg/mL, 0.1 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.1 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.1 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (1.0 mL)で分散するとγ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。そしてナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 65 nm (PDI 0.30); 0.45 M NaCl, 77 nm (PDI 0.29); 0.60 M NaCl, 98 nm (PDI 0.39); 0.65 M NaCl, 114 nm (PDI 0.44); 0.70 M NaCl, 135 nm (PDI 0.78); 0.75 M NaCl, 170 nm (PDI 0.94)であった。
続いてスケールを上げた。即ち、0.70 M NaCl水溶液 (8.0 mL)中に先のγ-PGA-Phe-OMe （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL, 8.0 mL）を速やかに混合すると分散液が得られた。遠心ろ過にて脱塩・水洗を繰り返し行った(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (25 mL)で分散し、凍結乾燥するとγ-PGA-Phe-OMeのナノ粒子 (857 mg)が得られた。これの平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。結果、145 nm (PDI 0.57)であった。
[実施例92] γ-PGA-p-F-Phe-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-p-F-Phe-OEt （30 mg, p-F-Phe-OEt導入率56％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (0.6mL, 0.056mmol相当)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-p-F-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-p-F-Phe-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-p-F-Phe-OEtのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.40 M NaCl, 28 nm (PDI 0.12); 0.50 M NaCl, 55 nm (PDI 0.10); 0.70 M NaCl, 107 nm (PDI 0.22); 0.80 M NaCl, 244 nm (PDI 0.23); 0.90 M NaCl, 545 nm (PDI 0.30); 0.95 M NaCl, 782 nm (PDI 0.27); 1.10 M NaCl, 897 nm (PDI 0.25)であった。
[実施例93] γ-PGA-p-Cl-Phe-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt （0.90 g, p-Cl-Phe-OEt導入率58％）とDMSO (7.2 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (1.8 mL, 1.5 mmol相当)を滴下した。2時間撹拌するとγ-PGA-p-Cl-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL）が得られた。
まず、NaCl水溶液の予備調査を行った。γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液の一部 (濃度100 mg/mL, 0.1 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.1 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.1 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (1.0 mL)で分散するとγ-PGA-p-Cl-Phe-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。そしてナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 36 nm (PDI 0.26); 0.25 M NaCl, 76 nm (PDI 0.24); 0.30 M NaCl, 492 nm (PDI 0.40)であった。
続いてスケールを上げた。即ち、0.27 M NaCl水溶液 (8.0 mL)中に先のγ-PGA-p-Cl-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL, 8.0 mL）を速やかに混合すると分散液が得られた。遠心ろ過にて脱塩・水洗を繰り返し行った(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (25 mL)で分散し、凍結乾燥するとγ-PGA-p-Cl-Phe-OEtのナノ粒子 (839 mg)が得られた。これの平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。結果、67 nm (PDI 0.29)であった。
[実施例94] γ-PGA-p-Br-Phe-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-p-Br-Phe-OEt （0.90 g, p-Br-Phe-OEt導入率56％）とDMSO (7.2 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (1.8 mL, 1.5 mmol相当)を滴下した。2時間撹拌するとγ-PGA-p-Br-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL）が得られた。
まず、NaCl水溶液の予備調査を行った。γ-PGA-p-Br-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液の一部 (濃度100 mg/mL, 0.1 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.1 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.1 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (1.0 mL)で分散するとγ-PGA-p-Br-Phe-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。そしてナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.30 M NaCl, 73 nm (PDI 0.19); 0.35 M NaCl, 131 nm (PDI 0.25); 0.40 M NaCl, 226 nm (PDI 0.27); 0.45 M NaCl, 508 nm (PDI 0.40)であった。
続いてスケールを上げた。即ち、0.32 M NaCl水溶液 (8.0 mL)中に先のγ-PGA-p-Br-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度100 mg/mL, 8.0 mL）を速やかに混合すると分散液が得られた。遠心ろ過にて脱塩・水洗を繰り返し行った(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (25 mL)で分散し、凍結乾燥するとγ-PGA-p-Br-Phe-OEtのナノ粒子 (632 mg)が得られた。これの平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。結果、52 nm (PDI 0.27)であった。
[実施例95] γ-PGA-p-NO2-Phe-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt （30 mg, p-NO2-Phe-OEt導入率58％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (0.6 mL, 0.049 mmol相当)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-p-NO2-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-p-NO2-Phe-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-p-NO2-Phe-OEtのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.30 M NaCl, 23 nm (PDI 0.32); 0.40 M NaCl, 32 nm (PDI 0.37); 0.45 M NaCl, 86 nm (PDI 0.26); 0.50 M NaCl, 368 nm (PDI 0.31)であった。
[実施例96] γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt （30 mg, p-OiPr-Phe-OEt導入率57％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (0.6 mL, 0.049 mmol相当)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-p-OiPr-Phe-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-p-OiPr-Phe-OEtのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.20 M NaCl, 24 nm (PDI 0.31); 0.25 M NaCl, 23 nm (PDI 0.25); 0.30 M NaCl, 36 nm (PDI 0.37); 0.35 M NaCl, 42 nm (PDI 0.39); 0.40 M NaCl, 43 nm (PDI 0.29); 0.50 M NaCl, 44 nm (PDI 0.30)であった。
[実施例97] γ-PGA-α-Phegly-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-α-Phegly-OEt （30 mg, α-Phegly-OEt導入率59％）とDMSO (2.4 mL)を量り、室温で撹拌した。続いてNaOH水溶液 (0.6 mL, 0.055 mmol相当)を滴下し、2時間撹拌するとγ-PGA-α-Phegly-OEt （Na塩）のDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。
この溶液の一部 (濃度10 mg/mL, 0.2 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.2 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30分, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.2 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物をX1 PBS (0.2 mL)で分散するとγ-PGA-α-Phegly-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。
続いてγ-PGA-α-Phegly-OEtのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.40 M NaCl, 32 nm (PDI 0.43); 0.45 M NaCl, 124 nm (PDI 0.81); 0.50 M NaCl, 809 nm (PDI 0.52)であった。
[実施例98] αβ-DL-PolyAsp-D-PAEのナノ粒子の調製
5-mL サンプル瓶にαβ-DL-PolyAsp-D-PAE （50 mg, PAE導入率 63％）とDMSO (0.5 mL)を量り、室温で溶解した。室温でNa2CO3水溶液 [Na2CO3 (63 mg)を蒸留水 (9 mL)で溶解したものの内、0.15 mLを使用]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (0.5 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした。
溶液A (50 μL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (50 μL)中に速やかに混合するとαβ-DL-PolyAsp-D-PAEのナノ粒子の分散液が得られた。それらの平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.25 M NaCl, 554 nm (PDI 0.206); 0.20 M NaCl, 214 nm (PDI 0.064); 0.15 M NaCl, 132 nm (PDI 0.030), 0.10 M NaCl, 87 nm (PDI 0.090); 0.05 M NaCl, 69 nm (PDI 0.628)であった。
溶液A (500 μL)を、0.20 M NaCl水溶液 (500 μL)に速やかに混合すると分散液が得られた(Z-Ave d., 72 nm, PdI 0.149)。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 15分, 5 ℃)。得られた残留物を凍結乾燥すると、αβ-DL-PolyAsp-D-PAEのナノ粒子 (7 mg, PAE導入率 70％)が得られた。
[実施例99] αβ-DL-PolyAsp-L-PAEのナノ粒子の調製
5-mL サンプル瓶にαβ-DL-PolyAsp-L-PAE （50 mg, PAE導入率 63％）とDMSO (0.5 mL)を量り、室温で溶解した。室温でNa2CO3水溶液 [Na2CO3 (63 mg)を蒸留水 (9 mL)で溶解したものの内、0.15 mLを使用]を滴下した。30分撹拌後、得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過した。そしてDMSO洗液 (0.5 mL)で洗浄し、洗液をシリンジフィルターを通じて洗浄・ろ過し、混合した。これを溶液Aとした。
溶液A (50 μL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (50 μL)中に速やかに混合するとαβ-DL-PolyAsp-L-PAEのナノ粒子の分散液が得られた。それらの平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.25 M NaCl, 418 nm (PDI 0.151); 0.20 M NaCl, 236 nm (PDI 0.199); 0.15 M NaCl, 126 nm (PDI 0.108), 0.10 M NaCl, 73 nm (PDI 0.090); 0.05 M NaCl, 57 nm (PDI 0.140)であった。
溶液A (500 μL)を、0.20 M NaCl水溶液 (500 μL)に速やかに混合すると分散液が得られた(Z-Ave d., 66 nm, PdI 0.134)。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 15分, 5 ℃)。得られた残留物を凍結乾燥すると、αβ-DL-PolyAsp-L-PAEのナノ粒子 (7 mg, PAE導入率 71％)が得られた。
上記実施例に示されるように、本発明は、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体のフリー体を短時間かつ高い収率で得ることができ、少量の溶媒量（溶液Ａと溶液Ｂの和）で、イオン化されたグラフト共重合体を得ることができた。
[実施例100] γ-PGAの絶対分子量の測定
実施例5および6に従い合成したγ-PGA [12.1 g, 65 kDa, D:L (35:65)]の絶対分子量をGPC-Max (Viscotek社) を用いてSEC-HPLC条件 [TSKgelGMPWXL, 300X7.8 mm I.D. (dual), 0.1 M NaNO3, 0.8 mL/min, 40 ℃]で測定した。γ-PGA (129 mg)をNaHCO3 (γ-PGA総カルボキシル基に対して0.50, 0.75, 1.00 1.25, 1.50eq、各25 mL)にそれぞれ溶解後、脱気して、5種のNa化したγ-PGAを得た。各々を0.20 μmのフィルターでろ過し、GPC-Maxに用いるサンプル溶液とした。5種のNa化したγ-PGAから得られた分子量から、フリー体のγ-PGAの絶対分子量値を算出した。実施例5と6の絶対分子量は、いずれも62 kDaであった。
実施例5と6の相対分子量はそれぞれ65 kDaであり、このことは本発明のγ-PGAの絶対分子量と相対分子量との間に相関があることを示す。
[実施例101] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.66 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.95 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.41 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.18 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。80℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 4.0に調整した。80℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.627 g, 収率 約84.9％, PAE導入率61％, 水分3.9％, 91 kDa)が得られた。
[実施例102] γ-PGA-PAEの合成
2-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (950 mL)とNaHCO3 (4.00 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (5.81 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (8.61 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (11.4 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。80℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 1.4に調整した。80℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (10.47 g, 収率 約92.3％, PAE導入率69.1％, 水分3.4％, 100 kDa)が得られた。
[実施例103] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.66 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.95 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.41 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.18 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。60℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 4.0に調整した。60℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.541 g, 収率 約86.9％, PAE導入率60％, 水分2.4％, 160 kDa)が得られた。
[実施例104] γ-PGA-PAEの合成
2-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (950 mL)とNaHCO3 (4.00 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (5.81 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (8.61 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (11.4 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。60℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 1.4に調整した。60℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (10.30 g, 収率 約91.2％, PAE導入率69％, 水分3.6％, 211 kDa)が得られた。
[実施例105] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.66 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.95 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.41 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.18 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。40℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 3.5に調整した。40℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.880 g, 収率 約91.3％, PAE導入率60％, 水分4.3％, 203 kDa)が得られた。
[実施例106] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.66 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.95 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.41 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.18 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。40℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 2.5に調整した。40℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.622 g, 収率 約89.9％, PAE導入率61％, 水分3.0％, 220 kDa)が得られた。
[実施例107] γ-PGA-PAEの合成
2-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (950 mL)とNaHCO3 (4.00 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (5.81 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (8.61 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (11.4 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。40℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 1.4に調整した。40℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (10.26 g, 収率 約92.4％, PAE導入率69％, 水分3.1％, 235 kDa)が得られた。
[実施例108] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.63 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.91 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.35 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.13 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (3.3 mL)を滴下してｐH 4.0に調整した。室温で2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.596 g, 収率 約87.1％, PAE導入率61％, 水分3.4％, 207 kDa)が得られた。
[実施例109] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.63 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.91 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.35 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.13 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (3.6 mL)を滴下してｐH 3.5に調整した。室温で2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.621 g, 収率 約90.5％, PAE導入率61％, 水分3.5％, 208 kDa)が得られた。
[実施例110] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.63 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.91 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.35 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.13 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (3.8 mL)を滴下してｐH 3.0に調整した。室温で2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.543 g, 収率 約90.4％, PAE導入率63％, 水分3.2％, 210 kDa)が得られた。
[実施例111] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.63 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (0.91 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.35 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.13 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。室温で2 M 塩酸 (4.4 mL)を滴下してｐH 2.0に調整した。室温で2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.397 g, 収率 約90.4％, PAE導入率61％, 水分3.1％, 205 kDa)が得られた。
[実施例112] γ-PGA-PAEの合成
500-mL 四頸フラスコに室温で蒸留水 (150 mL)とNaHCO3 (0.66 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA [0.95 g, 47 kDa, GPC-Max (Viscotek社)で絶対分子量を測定した]を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.41 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.01 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。40℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 3.5に調整した。40℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (1.50 g, 収率 約92％, PAE導入率54％, 水分3.8％, 78 kDa)が得られた。
[実施例113] γ-PGA-PAEの合成
2-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (950 mL)とNaHCO3 (4.00 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (5.81 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (8.61 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (7.22 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。60℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 3.0に調整した。60℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (9.18 g, 収率 約88.8％, PAE導入率58％, 水分3.4％, 132 kDa)が得られた。
[実施例114] γ-PGA-PAEの合成
2-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (950 mL)とNaHCO3 (4.00 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (5.81 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (8.61 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (7.22 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。80℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 3.0に調整した。80℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (9.77 g, 収率 約88.2％, PAE導入率57％, 水分3.6％, 86 kDa)が得られた。
[実施例115] γ-PGA-PAEの合成
2-L 四頸フラスコに室温で蒸留水 (950 mL)とNaHCO3 (4.00 g)を量り、溶解した。これにγ-PGA (5.81 g, 148 kDa)を添加し、減圧下で30分間撹拌した後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (8.61 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (5.17 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。80 ℃に加熱し、2 M 塩酸を滴下してｐH 3.0に調整した。80℃で1時間撹拌後、室温に冷却し2時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (18 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (8.25 g, 収率 約84.4％, PAE導入率44％, 水分4.3％, 55 kDa)が得られた。
[実施例116] γ-PGA-PAEの合成
100-mL スコット瓶に室温で蒸留水 (35 mL)と1M NaOH (9.0 mL)を量った。これにγ-PGA [1.21 g, 47 kDa, GPC-Max (Viscotek社)で絶対分子量を測定した]を添加し、15分間撹拌して溶解させた後、氷冷した。氷冷下で、WSC.HCl (1.80 g)を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。そのまま5分間撹拌し、L-フェニルアラニンエチルエステル・塩酸塩 (PAE.HCｌ) (1.30 g）を添加し、蒸留水 (5 mL)で洗浄した。氷冷下で1時間撹拌した後、室温で20時間撹拌した。40℃に加熱し、2 M 塩酸（1.7 mL）を滴下してｐH 3.5に調整した。室温に冷却し1時間撹拌した。析出物を吸引ろ取し、蒸留水 (20 mL)で2回洗浄した。これを減圧下、室温で乾燥するとγ-PGA-PAE (2.1 g, 収率 約93％, PAE導入率62％, 水分3.3％)が得られた。
[実施例117-1〜117-5] γ-PGA-PAE Na塩の調製
γ-PGA-PAE （1.00 g, PAE導入率 57％）と蒸留水 (10 mL)を量った。室温で撹拌しながら1 M NaOH水溶液を滴下し、それぞれ、表１に示すpHに調整した。アミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩後、蒸留水（5 mL）で洗浄した。脱塩と洗浄操作を3回繰り返し、得られた溶液を凍らせた後、凍結乾燥すると、それぞれ、表１に示すγ-PGA-PAEが得られた。
Figure 2014208611
[実施例118-1〜118-12] γ-PGA-PAE Na塩の調製
γ-PGA-PAE （0.8 g, PAE導入率 57％）と蒸留水 (8 mL)を量った。室温で撹拌しながら、それぞれ、表２に示す量の1.74M Na2CO3水溶液を滴下した。アミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩後、蒸留水（3 mL）で洗浄した。限外濾過と洗浄操作を3回繰り返し、得られた溶液を凍らせた後、凍結乾燥すると、それぞれ、表２に示すγ-PGA-PAEが得られた。
Figure 2014208611
[実施例119] γ-PGA-(Bn)Cys-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-(Bn)Cys-OEt （100 mg, 導入率60％, 実施例42）とDMSO (5.0 mL)と100 mg/mL Na２CO3水溶液（0.084 mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-(Bn)Cys-OEtのDMSO水溶液（濃度20mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度20 mg/mL, 0.05 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.05 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (pH 7.4, 0.10 mL)で分散するとγ-PGA-(Bn)Cys-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてγ-PGA-(Bn)Cys-OEtのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.00 M NaCl, 33 nm (PDI 0.18); 0.10 M NaCl, 102 nm (PDI 0.08); 0.20 M NaCl, 211 nm (PDI 0.17)であった。
NaCl (29.2 mg)を大塚蒸留水 (5 mL)に溶解し、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度20 mg/mL, 3.0 mL)を、溶液Bの一部［0.10 M NaCl水溶液 (3.0 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (6.0 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（10 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（87 nm, PDI 0.09）が得られた。分散液C（4 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-(Bn)Cys-OEtのナノ粒子 （15 mg）が得られた。
[実施例120] γ-PGA-Trp-OEtのナノ粒子の調製
γ-PGA-Trp-OEt （100 mg, 導入率56％, 実施例43）とDMSO (5.0 mL)と100 mg/mL Na２CO3水溶液（0.128 mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-Trp-OEtのDMSO水溶液（濃度20mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度20 mg/mL, 0.05 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.05 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (pH 7.4, 0.10 mL)で分散するとγ-PGA-Trp-OEtのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてγ-PGA-Trp-OEtのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.00 M NaCl, 55 nm (PDI 0.12); 0.05 M NaCl, 92 nm (PDI 0.10); 0.10 M NaCl, 153 nm (PDI 0.07)であった。
NaCl (14.6 mg)を大塚蒸留水 (5 mL)に溶解し、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度20 mg/mL, 3.0 mL)を、溶液Bの一部［0.05 M NaCl水溶液 (3.0 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (6.0 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（10 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（95 nm, PDI 0.13）が得られた。分散液C（4 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-Trp-OEtのナノ粒子 （16 mg）が得られた。
[実施例121] γ-PGA-PAEのナノ粒子の調製
γ-PGA-PAE （200 mg, 導入率62％, 実施例116）とDMSO (10.0 mL)と100 mg/mL Na２CO3水溶液（0.178 mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAEのDMSO水溶液（濃度20mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度20 mg/mL, 0.05 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.05 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (pH 7.4, 0.10 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。それらは各種濃度のNaCl水溶液を用いて調製した場合に対して以下の結果であった。即ち、0.00 M NaCl, 56 nm (PDI 0.13); 0.05 M NaCl, 73 nm (PDI 0.12); 0.06 M NaCl, 80 nm (PDI 0.10); 0.08 M NaCl, 91 nm (PDI 0.10); 0.10 M NaCl, 124 nm (PDI 0.10)であった。
NaCl (32.7 mg)を大塚蒸留水 (7.0 mL)に溶解し、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度20 mg/mL, 4.5 mL)を、溶液Bの一部［0.08 M NaCl水溶液 (4.5 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（15 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（75 nm, PDI 0.11）が得られた。分散液C（6.0 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 （31 mg, PAE導入率59％, 水分3.4％）が得られた。
ワクチンの製造
[実施例122] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
γ-PGA-PAEのナノ粒子（84.3 mg, PAE導入率57％,実施例77）と10X PBS (pH 7.4, 0.744 mL)と大塚蒸留水（6.698 mL）を量り、1時間撹拌してγ-PGA-PAEのナノ粒子の分散液（濃度10 mg/mL）が得られた。得られた溶液の一部（2.0 mL）を1X PBS (8.0 mL)で希釈し、γ-PGA-PAEのナノ粒子の分散液 (2 mg/mL)を得た（79 nm, PDI 0.27）。
得られた分散液 (0.75 mL)に10X PBS（pH 7.4, 0.225 mL）と蒸留水 (1.975 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 1.5 μg以上; 30μg以上/mLを0.05 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例123] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
上記で得られた分散液 (0.75 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.225 mL）と蒸留水 (2.02 mL)、そして市販の HA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 0.15 μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例124] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
γ-PGA-PAEのナノ粒子の分散液（1 mL, 20mg/mL, PAE導入率57％,実施例78を分散させたもの）を1X PBS (9.0 mL)で希釈し、γ-PGA-PAEのナノ粒子の分散液 (2 mg/mL)を得た（78 nm, PDI 0.22）。
得られた分散液 (0.75 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.225 mL）と蒸留水 (1.975 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 1.5 μg以上; 30μg 以上/mLを0.05 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例125] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
上記で得られた分散液 (0.75 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.225 mL）と蒸留水 (2.02 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原0.15 μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例126] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
γ-PGA-PAE （150 mg, 導入率60％,実施例105）とDMSO (5.45 mL)とNa２CO3水溶液（5.2mg/0.55mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAEのDMSO水溶液（濃度25mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度25 mg/mL, 0.10 mL)を、0.05 M NaCl水溶液 (0.10 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.20 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (0.25 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。即ち、0.05 M NaCl, 185 nm (PDI 0.10)であった。
NaCl (11.7 mg)を大塚蒸留水 (4.0 mL)に溶解し、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度25 mg/mL, 2.6 mL)を、溶液Bの一部［0.05 M NaCl水溶液 (2.6 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（12 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（197 nm, PDI 0.10）が得られた。分散液C（3.0 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 （6 mg, PAE導入率57％, 水分2.2％）が得られた。分散液C (0.765 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (1.885 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 1.5 μg以上; 30μg以上/mLを0.05 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例127] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
上記で得られた分散液C (0.765 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (1.930 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 0.15 μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例128] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
γ-PGA-PAE （150 mg, PAE導入率54％, 実施例112）とDMSO (4.45 mL)とNa２CO3水溶液（6.0mg/0.55mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAEのDMSO水溶液（濃度30mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度30 mg/mL, 0.10 mL)を、蒸留水 (0.10 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.20 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (0.30 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてγ-PGA-PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。即ち、0.00 M NaCl, 199 nm (PDI 0.11)であった。
大塚蒸留水 (4.0 mL)をシリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度30 mg/mL, 2.2 mL)を、溶液Bの一部［蒸留水 (2.2 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（12 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（138 nm, PDI 0.11）が得られた。分散液Cの一部（3.0 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 （12 mg, PAE導入率53％, 水分3.8％）が得られた。分散液Cの一部 (0.39 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (2.26 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」, 1.5 μg以上; 30μg以上/mLを0.05 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例129] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
上記で得られた分散液C (0.39 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (2.305 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 0.15 μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例130] γ-PGA-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
実施例121で得られたγ-PGA-PAEのナノ粒子の分散液Cの一部（0.301 mL）に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL)と蒸留水 (2.394 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, 0.15 μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例131] γ-PGA-D-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
γ-PGA-PAE （250 mg, PAE導入率56％, 実施例11）とDMSO (5.25 mL)とNa2CO3水溶液（23.3mg/mL; 1.0 mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとγ-PGA-PAEのDMSO水溶液（濃度40mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度40 mg/mL, 0.10 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.10 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.20 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (0.4 mL)で分散するとγ-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてγ-PGA- PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。即ち、0.05 M NaCl, 173 nm (PDI 0.10); 0.10 M NaCl, 293 nm (PDI 0.26); 0.15 M NaCl, 385 nm (PDI 0.39)であった。
NaCl (14.6 mg)を大塚蒸留水 (5.0 mL)に溶解させ、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度40 mg/mL, 3.0 mL)を、溶液Bの一部［蒸留水 (3.0 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（23 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（128 nm, PDI 0.07）が得られた。分散液Cの一部（3.0 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとγ-PGA-PAEのナノ粒子 （11 mg, PAE導入率55％, 水分3.0％）が得られた。分散液Cの一部 (0.422 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (2.273 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 0.15μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例132] α-D-PGA-L-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
α-PGA-PAE （150 mg, PAE導入率69％, 実施例21）とDMSO (11.9 mL)とNa2CO3水溶液（6.4mg/0.6mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとα-PGA-PAEのDMSO水溶液（濃度12mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度12 mg/mL, 0.10 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.10 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.20 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (0.12 mL)で分散するとα-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてα-PGA- PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。即ち、0.05 M NaCl, 155 nm (PDI 0.16); 0.06 M NaCl, 178 nm (PDI 0.18)であった。
NaCl (24.5 mg)を大塚蒸留水 (7.0 mL)に溶解させ、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度12 mg/mL, 5.0 mL)を、溶液Bの一部［0.06 M NaCl (5.0 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（11 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（129 nm, PDI 0.22）が得られた。分散液Cの一部（3.0 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとα-PGA-PAEのナノ粒子 （13 mg, PAE導入率66％, 水分1.7％）が得られた。分散液Cの一部 (0.352 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (2.343 mL)、そして市販のHA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原 0.15μg以上; 30μg 以上/mLを0.005 mL]を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例133] α-L-PGA-L-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
α-PGA-PAE （60 mg, PAE導入率69％, 実施例19）とDMSO (9.4 mL)とNa2CO3水溶液（6.3mg/0.6mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとα-PGA-PAEのDMSO水溶液（濃度6mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度6 mg/mL, 0.10 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.10 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.20 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (0.06 mL)で分散するとα-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてα-PGA- PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。即ち、0.10 M NaCl, 86 nm (PDI 0.13); 0.12 M NaCl, 119 nm (PDI 0.15); 0.14 M NaCl, 173 nm (PDI 0.16); 0.15 M NaCl, 374 nm (PDI 0.30)であった。
NaCl (98.2 mg)を大塚蒸留水 (12.0 mL)に溶解させ、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度6 mg/mL, 9.0 mL)を、溶液Bの一部［0.14 M NaCl (9.0 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (20 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（9 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（183 nm, PDI 0.18）が得られた。分散液Cの一部（3.0 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとα-PGA-PAEのナノ粒子 （6 mg, PAE導入率57％, 水分2.4％）が得られた。分散液Cの一部 (0.769 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (1.926 mL)、そして市販のHA抗原[デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む, HA抗原0.15 μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL）を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例134] αβ-Asp-L-PAEのナノ粒子とHA抗原の混合液の調製
αβ-Asp-PAE （100 mg, PAE導入率62％, 実施例23）とDMSO (9.6 mL)とNa2CO3水溶液（14.1mg/0.4mL）を量り、室温で2時間撹拌して溶解するとαβ-Asp-PAEのDMSO水溶液（濃度10mg/mL）が得られた。得られた溶液をシリンジフィルター (コーニング, 0.2 μm)でろ過し、これを溶液Aとした。
この溶液Aの一部 (濃度10 mg/mL, 0.05 mL)を、各種濃度のNaCl水溶液 (0.05 mL)中に速やかに混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ0.5 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (0.10 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を2回実施した。得られた残留物を1X PBS (0.05 mL)で分散するとα-PGA-PAEのナノ粒子の溶液 (10 mg/mL)が得られた。続いてα-PGA- PAEのナノ粒子の平均粒子径 [Z-Ave d. (nm)]と粒子径分散指数 (PDI)を、ゼータサイザーナノ ZS (マルバーン社)で測定した。即ち、0.05 M NaCl, 86 nm (PDI 0.13); 0.10 M NaCl, 111 nm (PDI 0.10); 0.15 M NaCl, 155 nm (PDI 0.04); 0.18 M NaCl, 192 nm (PDI 0.20); 0.20 M NaCl, 220 nm (PDI 0.06)であった。
NaCl (105.2 mg)を大塚蒸留水 (10.0 mL)に溶解させ、シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過した。これを溶液Bとした。溶液Aの一部 (濃度10 mg/mL, 7.0 mL)を、溶液Bの一部［0.18 M NaCl (7.0 mL)］中に混合すると分散液が得られた。続いてアミコンウルトラ15 (Millipore社, 10 K)を用いて脱塩した(遠心条件4500 rpm, 30 min, 5 ℃)。得られた残留物を蒸留水 (20 mL)で分散した後、再度脱塩する操作を5回実施した。得られた残留物に蒸留水（12 mL）を加えて分散液Cとした。分散液Cの一部（0.05 mL）を1X PBS (1.0 mL)で分散させると、ナノ粒子の分散液（225 nm, PDI 0.03）が得られた。分散液Cの一部（3.0 mL）を-30 ℃の冷凍庫で凍らせた。これを凍結乾燥するとαβ-Asp-PAEのナノ粒子 （14 mg, PAE導入率60％, 水分4.5％）が得られた。分散液Cの一部 (0.337 mL)に10X PBS (pH 7.4, 0.30 mL）と蒸留水 (2.358 mL)、そして市販のHA抗原[デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む , HA抗原 0.15μg以上; 30μg以上/mLを0.005 mL）を順次混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。
[実施例135]
HA抗原とγ-PGA-PAEのナノ粒子の混合液を用いた細胞性免疫誘導実験
Ａ．材料
0.05％ tween 20 含有リン酸緩衝液(PBS-T), スキムミルク (和光純薬工業, 198-10605), BSA (Sigma, A7030), HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Abcam, Ab7068), TMB substrate 溶液 (Sigma, T0440-100mL), TMB stop溶液 (CST, 7002L), ウェル (96-well flat-bottom plate, Nunc, 112372), HA抗原 [デンカ生研 市販品, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む], 水酸化アルミニウムゲル(滅菌済) [Alum: 2.0 mg/mL, 容量1.0 mL, pH 7.045, 生理食塩水(0.85％ NaCl)], 先の実施例の方法で調製した各種γ-PGA-PAE NP。各種ワクチン溶液は、HA抗原 (0.1 μgまたは0.01 μg)およびγ-PGA-PAEのナノ粒子(100 μg相当)のPBS (200 μL)溶液である。マウス (BALB/c系雌性マウス, 7週齢, 日本チャールズ・リバー株式会社)を用いた。
Ｂ．方法
約1週間、マウス (BALB/c系雌性マウス, 7週齢)を馴化飼育した後、被験物質を4週間間隔で2回、1-mLシリンジを用い、マウスの皮下に200 μL皮下投与した。最終免疫の2週間後に血清を採取した。血清の採取はペントバルビタール麻酔下で心臓より全採血して得た血液を常温で一晩静置した後、遠心分離(3000 rpm, 20 min)し、血清をそれぞれ2本に分注し、−80℃で凍結した。冷凍保存した血清を用い、抗体価を評価した。
被験物質の調製
（１）被験物質1の調製
無菌のクライオジェニックバイアル(コーニング)に大塚蒸留水(4.5 mL)とX10 PBS (pH 7.4, 0.50 mL)を量り、よく攪拌した。この溶液をシリンジフィルター (0.2 μm)でろ過し、溶液Aを得た。この溶液Aより3.0 mLを量りPBSの調製液（HAを含まないブランク溶液）とした。
（２）被験物質2の調製
無菌のクライオジェニックバイアル(コーニング)に大塚蒸留水[シリンジフィルター(0.2 μm)でろ過したもの2650 μL]と X10 PBS [pH 7.4, シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過したもの300 μL]を量り、よく攪拌した。この溶液に市販HA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む：各株のHA含量（相当量）1.5 μg以上に相当；即ち30μg以上/mLの0.05 mLを使用]を混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した（”以上”の表記は添付文書に基づく）。このワクチンのHA濃度は0.5μg/mL以上である。
（３）被験物質3の調製
無菌のクライオジェニックバイアル(コーニング)に大塚蒸留水[シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過したもの2695 μL]と X10 PBS [pH 7.4, シリンジフィルター (0.2 μm)でろ過したもの300 μL]を量り、よく攪拌した。この溶液に市販HA抗原 [デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む：各株のHA含量（相当量）0.15 μg以上に相当；即ち30μg以上/mLの0.005 mLを使用]を混合し、HAワクチンを調製（3.0 mL）した（”以上”の表記は添付文書に基づく）。このワクチンのHA濃度は0.05μg/mL以上である。
（４）被験物質4の調製
無菌のクライオジェニックバイアル(コーニング)に水酸化アルミニウムゲル(Alum)(滅菌済) [Alum: 2.0 mg/mL, 容量1.0 mL, pH 7.045, 生理食塩水(0.85％ NaCl)]を0.375 mL量り、次に大塚蒸留水(0.973 mL)と X10 PBS (pH 7.4, 0.15 mL)を量り、よく攪拌した。この溶液に市販HA抗原[デンカ生研, インフルエンザHAワクチン「生研」:有効成分に以下の3株を含む(A/カリフォルニア/7/2009(H1N1)pdm09 株; A/テキサス/50/2012(H3N2) 株; B/マサチュセッツ/2/2012 株), 各株のHA含量(相当量)は、1株あたり30μg以上/mLを含む：各株のHA含量（相当量）0.075 μg以上に相当；即ち30μg以上/mLの0.0025 mLを使用]を順次混合し、対照用HAワクチンを調製（1.5 mL）した（”以上”の表記は添付文書に基づく）。このワクチンのHA濃度は0.05μg/mL以上である。
（５）被験物質5の調製
Alumの代わりにγ-PGA-PAEのナノ粒子を用いた実施例127は、被験物質4と同様にして、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。このワクチンのHA濃度は0.05μg/mL以上である。
（６）被験物質6の調製
Alumの代わりにγ-PGA-PAEのナノ粒子を用いた実施例129は、被験物質4と同様にして、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。このワクチンのHA濃度は0.05μg/mL以上である。
（７）被験物質7の調製
Alumの代わりにγ-PGA-PAEのナノ粒子を用いた実施例130のγ-PGA-PAEは、被験物質4と同様にして、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。このワクチンのHA濃度は0.05μg/mL以上である。
（８）被験物質8の調製
Alumの代わりにγ-PGA-PAEのナノ粒子を用いた実施例125は、被験物質4と同様にして、HAワクチンを調製（3.0 mL）した。このワクチンのHA濃度は0.05μg/mL以上である。
Ｃ．評価方法
評価項目としてHAタンパクに対するモノクローナル抗体（mAb）の力価を評価した。
HA抗原 (0.025 μg以上含有, コーティングバッファー 100 μL)をウェルに添加し、一晩冷蔵後、マイクロプレートウォッシャーを用いPBS-Tで6回洗浄した。このウェルにブロックバッファー (200 μL)を添加し、室温で2時間作用させた後、同様にPBS-Tで6回洗浄した。このウェルに[被験物質溶液(血清・ブランクなど表３参照), 100 μL]を添加し、室温で2時間作用させた後、同様にPBS-Tで6回洗浄した。このウェルに抗マウス IgG 抗体 (100 μL)を添加し、室温で2時間作用させた後、同様にPBS-Tで6回洗浄した。ウェルにTMB substrate 溶液(100 μL)を添加して室温で10分間作用させた後、TMB 停止溶液(100 μL)を添加した。ここで得られた溶液を、プレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定した。
Figure 2014208611
Ｄ．結果
これらの結果（表３および図１参照）から、本発明で製造・調製したγ-PGA-PAEのナノ粒子がアジュバントとして極めて優れた性能を有していることが示された。
[実施例136］ γ-PGA-PAE Na塩の物性
上記で合成したγ-PGA-PAE Na塩の相対分子量、モノマーユニットにおける、x、ｙ、zの値、およびグラフト共重合体中のモノマーユニットの総数(n)を以下の表に示す。
表中の相対分子量は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ測定における分子量測定法で得た。ＴＳＫｇｅｌ α−Ｍ ３００Ｘ７．８ ｍｍ Ｉ． Ｄ． （ｄｕａｌ）, ５ ｍＭ ＮａＮＯ３ ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ （９：１）, ０．８ ｍＬ／分, ４０℃, ＲＩ検出器, スタンダード:プルラン(Ｓｈｏｄｅｘ)。
表中のx、y、およびzの値は以下に示す実験方法や以下に示す（式１）および（式２）で示す計算式を用いて得られる。例としてγ-PGA-PAE (Na塩)の算出式を示した。
x: 下記、[y], [z]が決定されると式２から算出される。
y: 原紙吸光分析やLCMSによるNaイオンの定量によって算出される。
z: PAEの導入率として1H-NMRで算出される。
γ-PGA-PAE (Na塩)の分子量: SEC-HPLCを使用した相対分子量の決定方法もしくはGPC-Max (Viscotek社)などによる粘度計, DLS検出器, SLS検出器などを使用した絶対分子量の決定により算出される。
n: グラフト共重合体中のグルタミン酸モノマーの数（Glu数）。
Figure 2014208611
Figure 2014208611
グラフト共重合体中のグルタミン酸モノマーの数（Glu数）は、上記の式をExcel. 2010 (Microsoft社)にシート化し、得られた実験結果から算出した。結果を以下の表に示す。
表中のグラフト共重合体中のモノマーユニットの総数(n)は、グラフト共重合体中のグルタミン酸モノマーの数（Glu数）から導き出した数である。
Figure 2014208611
[実施例137］ 疎水性パラメータＫ（Clog P）の算出 (計算値)
上記実施例に従い製造したグラフト共重合体中（γ-PGA-PAE）およびそれをイオン化したもののClog P値をChemDraw Ultra (12.0.2.1076), Cambridgesoftにより算出した。結果を以下の表に示す。
Figure 2014208611
[実施例138] 疎水性パラメータＫ(logPow)の測定 (実測値)
実施例118-8に従い合成したγ-PGA-PAE [37 mg, n = 403, x:y:z (12:28:59)]を1-オクタノール (和光特級, 20 mL), 蒸留水 (20 mL)に懸濁・攪拌し一夜放置した。0.2μmのフィルターでろ過した。有機層と水層からそれぞれホールピペットで5 mLずつをサンプリングして混合し、緩やかに1 h攪拌後、静置した。有機層と水層からホールピペットで2 mLずつをそれぞれ25 mLメスフラスコ中にサンプリングした。これらの溶液にそれぞれ2 M水酸化ナトリウム水溶液(10 mL)を添加し、外温50 ℃にて2 ｈ加水分解した。それぞれに2 M塩酸水溶液(10 mL)を添加して中和後、メスアップした。この水層由来のサンプル(A)と有機層由来のサンプル(B)中のフェニルアラニンをHPLC (Sunniest RP-AQUA 100X2.0 mm i.d. 3 μm, UV 220 nm, 60 ℃, 0.4 mL/min; 移動相A: 0.1％ TFA aq.; 移動相B: 0.1％ TFA/MeCN; Program 0-5 min 5％ B, 5-15 min 5-35％ B, 15-18 min 35％ B, 18-23 min, 75％ B; 23.01 min 5％ B, Cycle: 30 min.) にて定量分析した。
結果は、（Ａ）のフェニルアラニン含量が(A) 0.012875mgであり、(B)のフェニルアラニン含量が0.003700 mgであった。よってlog Pow = log10 (0.003700/0.012875) = log10 (0.2874) = −0.542である。
本発明によれば、ポリアミノ酸またはその塩と疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体のフリー体を短時間かつ高い収率で得ることができ、少量の溶媒量で、イオン化されたグラフト共重合体を得ることができる。
得られたグラフト共重合体のフリー体は、潮解しにくいため取扱い易く原材料として安定であり、高分子構造の判定に重要なN末の状態を知ることが可能であるため、品質の管理が容易である。
さらに、グラフト共重合体のフリー体をナノ粒子化する際、イオン種やイオン化量を調整することによってグラフト共重合体の疎水性のバランスをとり、目的に合わせたナノ粒子を得ることができる。
また、本発明によるイオン化されたグラフト共重合体は、ナノ粒子を製造する工程の高濃度化が可能であるにもかかわらず、得られるナノ粒子の凝集が抑制され、イオン化量を調整することにより、目的に合わせたナノ粒子を形成・取得する再現性が向上する。

Claims (17)

  1. ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体の製造方法であって、以下の工程：
    （１）前記ポリアミノ酸またはその塩と、前記一般式（Ｉ）で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とを縮合させて、グラフト共重合体を得る工程；および
    （２）工程（１）で得られたグラフト共重合体に酸を作用させて、グラフト共重合体を単離する工程
    を含む、製造方法。
  2. 工程（２）において０〜８０℃の温度でグラフト共重合体に酸を作用させる、請求項１記載の製造方法。
  3. ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）である、請求項１記載の製造方法。
  4. 疎水性第１級アミン化合物が、α−アミノ酸誘導体である、請求項１記載の製造方法。
  5. α−アミノ酸誘導体が、フェニルアラニン誘導体である、請求項４記載の製造方法。
  6. フェニルアラニン誘導体が、フェニルアラニンエチルエステルである、請求項５記載の製造方法。
  7. 請求項１に記載の方法で製造された、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体。
  8. ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体の製造方法であって、以下の工程：
    前記ポリアミノ酸またはその塩と、前記疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのグラフト共重合体に、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の炭酸水素塩、アルカリ金属のリン酸塩、アルカリ金属のリン酸一水素塩、アルカリ金属のリン酸二水素塩、アルカリ金属の有機酸塩、またはアルカリ金属の酸性アミノ酸塩を作用させて、グラフト共重合体をイオン化する工程を含む、製造方法。
  9. 一般式（ＩＩ）：
    Figure 2014208611
     ［式中、Ｍはアルカリ金属を示し、Ａは疎水性部位を示し、ｎは１０〜１００，０００の整数を示す。３種類のモノマーユニット間の斜線はモノマーユニットの配列順序が不規則であることを示す。ｘは、一般式（ＩＩＩ）：
    Figure 2014208611
     で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｙは、一般式（ＩＶ）：
    Figure 2014208611
     で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｚは、一般式（Ｖ）：
    Figure 2014208611
     で表されるモノマーユニットのモル分率を示し、ｘ、ｙおよびｚは、下式：
    Figure 2014208611
     を満たす。］で表されるイオン化されたグラフト共重合体。
  10. 一般式（ＩＩＩ）で表されるモノマーユニットのモル分率ｘが０である請求項９記載のイオン化されたグラフト共重合体。
  11. ｎが５０〜１０,０００である、請求項９記載のイオン化されたグラフト共重合体。
  12. −１５,０００〜０の疎水性パラメーターＫを有する、請求項９記載のイオン化されたグラフト共重合体。
  13. ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体を含む、ナノ粒子の製造方法であって、
    請求項８記載の製造方法で得られたイオン化されたグラフト共重合体をナノ粒子化する工程を含む、ナノ粒子の製造方法。
  14. 以下の工程：
    （１） ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とを縮合させる工程；
    （２） 工程（１）で得られた縮合物に酸を作用させて、グラフト共重合体を単離する工程；
    （３） 工程（２）で単離したグラフト共重合体に、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ金属の炭酸水素塩、アルカリ金属のリン酸塩、アルカリ金属のリン酸一水素塩、アルカリ金属のリン酸二水素塩、アルカリ金属の有機酸塩、またはアルカリ金属の酸性アミノ酸塩を作用させて、グラフト共重合体をイオン化する工程；
    （４） 工程（３）で得られたイオン化されたグラフト共重合体を、ナノ粒子化する工程を含む、請求項１３に記載のナノ粒子の製造方法。
  15. 請求項１３の方法で製造された、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、およびポリ（アスパラギン酸）よりなる群から選択されるポリアミノ酸またはその塩と、一般式（Ｉ）：Ａ−ＮＨ２［式中、Ａは、疎水性部位を示す。］で表される疎水性第１級アミン化合物またはその塩とのイオン化されたグラフト共重合体を含む、ナノ粒子。
  16. アジュバントとして用いられる、請求項１５記載のナノ粒子。
  17. 請求項１５記載のナノ粒子を含む、ワクチン。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105492494B (zh) * 2013-06-26 2018-05-22 武田药品工业株式会社 聚氨基酸的制造方法
CN107383362A (zh) * 2017-06-30 2017-11-24 华东师范大学 用于难溶性药物递送的助溶高分子载体材料及制备方法和应用
CN109485845B (zh) * 2018-09-13 2021-04-20 天津大学 一种疏水改性聚谷氨酸的制备方法及其促进海藻糖载入细胞的应用
CN109369913B (zh) * 2018-09-13 2021-09-14 天津大学 接枝疏水性氨基酸的pH响应性聚天冬氨酸及制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002519457A (ja) * 1998-06-30 2002-07-02 エムビーティー ホールディング アーゲー ポリアミドの熱グラフト類
JP2006510792A (ja) * 2002-12-04 2006-03-30 フラメル・テクノロジー 少なくとも１つの（オリゴ）アミノ酸基によって官能性をもたせたポリアミノ酸およびこれらの適用、特に医療適用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0692870A (ja) 1992-09-16 1994-04-05 Meiji Seika Kaisha Ltd 薬物担体用高分子および徐放性制ガン剤
JPH06256220A (ja) 1993-03-10 1994-09-13 Meiji Seika Kaisha Ltd 薬物担体用高分子
FR2786098B1 (fr) 1998-11-20 2003-05-30 Flamel Tech Sa Particules a base de polyaminoacide(s) et susceptibles d'etre utilisees comme vecteurs de principe(s) actif(s), suspension colloidale les comprenant et leurs procedes de fabrication
US7785612B2 (en) * 2005-04-20 2010-08-31 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Polyamino acid for use as adjuvant
JPWO2007024026A1 (ja) * 2005-08-25 2009-03-05 明石　満 Ｔ細胞認識エピトープペプチドを固定化又は内包化した生分解性ナノ粒子
JP2007297559A (ja) * 2006-05-02 2007-11-15 Rohto Pharmaceut Co Ltd アミノ酸修飾−（γ−ポリグルタミン酸）またはその塩、およびこれらの用途
US20110060123A1 (en) 2008-04-30 2011-03-10 Kazunori Kataoka Charge conversional ternary polyplex
US20110150837A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-23 Flamel Technologies Amphiphilic polymer functionalized by methionine
CN105492494B (zh) * 2013-06-26 2018-05-22 武田药品工业株式会社 聚氨基酸的制造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002519457A (ja) * 1998-06-30 2002-07-02 エムビーティー ホールディング アーゲー ポリアミドの熱グラフト類
JP2006510792A (ja) * 2002-12-04 2006-03-30 フラメル・テクノロジー 少なくとも１つの（オリゴ）アミノ酸基によって官能性をもたせたポリアミノ酸およびこれらの適用、特に医療適用

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