CN114616259B - pH响应性破膜高分子材料及其制备方法与应用 - Google Patents

pH响应性破膜高分子材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种pH响应性破膜高分子材料及其制备方法与应用。该pH响应性破膜高分子材料具有式(I)所示结构。该高分子材料在正常生理pH下，呈疏水电中性，可自组装成PEG为壳层的纳米颗粒，与细胞膜的相互作用弱；当pH降低，可以质子化，形成疏水结构域和阳离子结构域组成的两亲性结构，与细胞膜具有强相互作用并且具有强破膜活性，因而可以高效、高选择性杀伤肿瘤细胞或细菌。
Figure DDA0003585641650000011

Description

pH响应性破膜高分子材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及高分子材料和药物技术领域，具体涉及一种pH响应性破膜高分子材料及其制备方法与应用。
背景技术
一些高分子可通过破坏细胞膜的方式杀伤肿瘤细胞及细菌等病原体，具有广谱杀伤效果、不易产生耐药等优点，在肿瘤及感染性疾病治疗中具有广阔应用前景。例如，LTX-315阳离子多肽通过瘤内注射应用于肿瘤治疗，可导致肿瘤细胞大量坏死，其联合易普利姆玛单抗、派姆单抗等药物，在黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤、乳腺癌中都取得了良好的效果，相关研究正处于临床一期实验(https://clinicaltrials.gov/)。LL-37多肽通过瘤内注射治疗黑色素瘤的研究也处于一期临床研究(https://clinicaltrials.gov/)。Maganins等多种抗菌肽在临床用于细菌感染性疾病的治疗。然而，由于这类药物不仅可以高效破坏肿瘤细胞及病原菌，也对正常组织细胞具有强细胞毒性，且多肽药物易被蛋白酶降解，多数药物均止步于临床研究，目前临床使用药物多为局部注射治疗。
有研究者利用正电性的伯胺或季胺盐单体与疏水单体开发出破膜高分子，如聚甲基丙烯酸酯、聚多肽等。这类高分子具有合成工艺简便，成本较低等优点，但将其推向临床应用仍需优化出破膜活性高、对正常组织细胞毒性低的材料。目前研究者们通过优化阳离子基团种类、疏水基团种类、两者比例或者空间分布等，来调节破膜高分子的两亲性平衡。但仍需大量工作来优化破膜高分子以满足临床需求。
高分子材料与细胞膜作用主要依靠静电和疏水相互作用，首先利用阳离子结构域通过静电相互作用结合到负电荷细胞膜上，然后其疏水结构域插入到细胞膜脂质层，在膜上形成不可修复的膜损伤，从而杀伤细胞。由阳离子基团和疏水基团组成的两亲性构象是高分子材料与细胞膜作用的关键结构，两者结构比例对其与细胞膜相互作用非常重要。通常来说，单纯阳离子高分子易与细胞膜结合但不易插入细胞膜，而疏水结构聚合物难以结合到细胞膜表面，无法有效破坏细胞膜。因此，设计高分子材料使其在正常组织呈现阳离子或疏水结构，而在病变部位转变为阳离子结构域和疏水结构域组成的两亲性构象，以解决破膜高分子材料毒性大的问题，具有重要的意义。
大量研究显示，肿瘤细胞通常是采用糖酵解的代谢方式，产生更多的乳酸和二氧化碳，而由于实体肿瘤组织中淋巴回流堵塞代谢废物无法正常排出，导致实体瘤的外周环境pH比正常体液的pH更低，通常为6.4～7.0之间。细菌感染部位同样具有酸性的微环境，有望成为抗菌高分子结构转变的响应因素。细菌感染可通过产生有机酸(包括乳酸和乙酸)导致局部pH降低，并且炎症部位会因乳酸的产生导致酸度加剧。合理设计高分子材料的结构，获得在肿瘤以及细菌感染环境下具有选择性地抗菌活性的药物，具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明提供了一类pH响应性高分子材料，该高分子材料在正常生理pH下，呈疏水电中性，可自组装成PEG为壳层的纳米颗粒，与细胞膜的相互作用弱；当pH降低，更多三级胺发生质子化，形成疏水结构域和阳离子结构域组成的两亲性结构，与细胞膜具有强相互作用并且具有强破膜活性，因而可以高效、高选择性杀伤肿瘤细胞或细菌。
具体技术方案如下：
具有式(I)所示结构的pH响应性高分子材料：
Figure BDA0003585641630000021
其中，R1选自：-R3-N(R4R5)；
R2选自：烷基、芳基、芳基取代的烷基；
R3选自：亚烷基；
R4、R5分别独立地选自烷基，或者R4、R5和与其相连的氮原子一起形成杂环烷基；
x大于0；
n+m不小于20。
本发明还提供了上述的pH响应性高分子材料的制备方法。
具体技术方案如下：
一种上述的pH响应性高分子材料的制备方法，包括如下步骤：
将mPEG-CPDB、单体1、单体2和引发剂溶于有机溶剂中，在氮气或者惰性气体的保护下密闭反应，即得；
其反应式如下：
Figure BDA0003585641630000031
本发明还提供了一种pH响应性高分子材料的纳米颗粒。
具体技术方案如下：
一种pH响应性高分子材料的纳米颗粒，由上述的pH响应性高分子材料在水介质中自组装形成。
本发明还提供了上述的pH响应性高分子材料的纳米颗粒的制备方法。
具体技术方案如下：
一种pH响应性高分子材料的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将所述pH响应性高分子材料溶于二甲基甲酰胺中，然后将所得溶液在搅拌状态下逐滴加入去离子水中，继续搅拌，透析除去溶剂，即得所述的pH响应性高分子材料的纳米颗粒。
本发明还提供了上述pH响应性高分子材料的应用。
具体技术方案如下：
上述的pH响应性高分子材料在预防和/或治疗肿瘤中的应用。
上述的pH响应性高分子材料在治疗细菌感染中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物。
具体技术方案如下：
一种预防和/或治疗肿瘤的药物，由活性成分和药学上可接受的辅料制备得到，所述活性成分包括上述的pH响应性高分子材料。
本发明还提供了一种治疗细菌感染的药物。
具体技术方案如下：
一种治疗细菌感染的药物，由活性成分和药学上可接受的辅料制备得到，所述活性成分包括上述的pH响应性高分子材料。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种pH响应性高分子材料，该高分子材料由亲水的聚乙二醇、侧基为亲疏水性质可转变的三级胺聚甲基丙烯酸酯及侧基为疏水基团的聚甲基丙烯酸酯组成。在正常生理pH下，该高分子材料中的三级胺呈疏水电中性，聚甲基丙烯酸酯片段呈疏水构象，并且，该高分子材料可以自组装形成PEG为壳层的纳米颗粒，与细胞膜的相互作用弱，从而使其在体内循环时具有对正常组织毒性小的优点，且PEG外壳能提高该高分子材料的生物相容性，延长其血液循环时间；在肿瘤组织或者细菌感染部位微酸的pH条件下，该高分子材料的三级胺部分会发生质子化，从而使聚甲基丙烯酸酯片段形成疏水结构域和阳离子结构域组成的两亲性结构，从而使其与细胞膜具有极强的相互作用以及很强的破膜活性，从而可以高效、高选择性地杀伤肿瘤细胞或者细菌。本发明的高分子材料能够用于制备抗肿瘤或者治疗细菌感染的药物，具有抗肿瘤和抗菌效果好，选择性高，毒性小的优点。
附图说明
图1为大分子链转移剂mPEG-CPDB的核磁谱图。
图2为甲基丙烯酸酯单体C5-MA的核磁谱图。
图3为甲基丙烯酸酯单体C6-MA的核磁谱图。
图4为甲基丙烯酸酯单体C7-MA的核磁谱图。
图5为甲基丙烯酸酯单体DI-MA的核磁谱图。
图6为实施例1制备的高分子材料P(C6-Mey)80、P(C6-Ey)80、P(C6-Buy)80(y＝10、20、30)的核磁谱图。
图7为实施例1制备的高分子材料P(C6-Hy)80、P(C6-IOy)80、P(C6-Ty)80(y＝5、10、20)的核磁谱图。
图8为实施例1制备的高分子材料P(C6-Ph20)80、P(C6-NPh20)80的核磁谱图。
图9为实施例1制备的高分子材料P(C6-Bny)80(y＝5、10、20、30、40)的核磁谱图。
图10为实施例1和实施例2中制备的高分子材料的质子化率随pH变化情况图。
图11为实施例1制备的高分子材料在pH7.4条件下的细胞毒性(a和b)以及在小鼠体内的最大致死剂量(c)。
图12为实施例1制备的高分子材料在pH6.8条件下的细胞毒性。
图13为实施例2制备的高分子材料P(C5-Bny)80(y＝20、30、35、40)的核磁谱图。
图14为实施例2制备的高分子材料P(C7-Bny)80(y＝20、30、40)的核磁谱图。
图15为实施例2制备的高分子材料P(DE-Bny)80(y＝20、30、35、40)的核磁谱图。
图16为实施例2制备的高分子材料在pH7.4和pH6.8条件下的细胞毒性。
图17为实施例3制备的不同聚合度的高分子材料的核磁谱图。
图18为实施例3制备的不同聚合度的高分子材料在pH6.8条件下的细胞毒性。
图19为实施例3制备的不同mPEG分子量的高分子材料的核磁谱图。
图20为实施例3制备的不同mPEG分子量的高分子材料在pH7.4和pH6.8条件下的细胞毒性。
图21为P(C6-Bn20)80纳米颗粒在不同pH条件下的电势(a)、粒径(b)、形貌(c)以及核磁谱图(d)。
图22为P(C6-Bn20)80纳米颗粒在不同pH条件下对不同肿瘤细胞的细胞毒性。
图23为不同温度以及不同内吞抑制剂对P(C6-Bn20)80纳米颗粒在不同pH条件下的细胞毒性的影响。
图24为Panc-02细胞与P(C6-Bn20)80高分子材料在不同pH条件下共孵育后的透射电镜图。
图25为经过P(C6-Bn20)80高分子材料处理后的Panc-02细胞的扫描电镜图。
图26为P(C6-Bn20)80高分子材料对Panc02细胞模型的体内抑瘤效果图。
图27为P(C6-Bn20)80高分子材料对B16-F10细胞、CT-26细胞以及A549细胞模型的体内抑瘤效果图。
图28为P(C6-Bn20)80和P(C7-Bn20)80的杀菌活性结果图，其中a为高分子材料在pH5.00、5.50、6.00、7.40下对大肠杆菌的杀伤效果；b-f为高分子材料在pH 6.00下对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌、粪肠球菌的杀伤效果。
图29为P(C6-Bn20)80和P(C7-Bn20)80在pH 7.40和6.00下和大肠杆菌孵育后，使用扫描电子显微镜SEM观察的细菌表面形貌图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明提供了一种具有式(I)所示结构的pH响应性高分子材料：
Figure BDA0003585641630000061
其中，R1选自：-R3-N(R4R5)；
R2选自：烷基、芳基、芳基取代的烷基；
R3选自：亚烷基；
R4、R5分别独立地选自烷基，或者R4、R5和与其相连的氮原子一起形成杂环烷基；
x大于0；
n+m不小于20。
在其中一些实施例中，R2选自：C1-C15烷基、C6-C14芳基、C6-C14芳基取代的C1-C15烷基。
在其中一些实施例中，R2选自：C1-C12烷基、苯基、萘基、苯基取代的C1-C3烷基、萘基取代的C1-C3烷基。
在其中一些实施例中，R2选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊烷基、己基、庚基、异辛基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、苯基、萘基、苄基、萘甲基。
在其中一些实施例中，R3选自：C1-C6亚烷基。
在其中一些实施例中，R3选自：C1-C3亚烷基。
在其中一些实施例中，R3选自：亚甲基、亚乙基、亚丙基。
在其中一些实施例中，R4、R5分别独立地选自C1-C6烷基，或者R4、R5和与其相连的氮原子一起形成5-10元杂环烷基。
在其中一些实施例中，R4、R5分别独立地选自C1-C4烷基，或者R4、R5和与其相连的氮原子一起形成5-8元杂环烷基。
在其中一些实施例中，R4、R5和与其相连的氮原子一起形成如下基团：
Figure BDA0003585641630000071
在其中一些实施例中，所述pH响应性高分子材料具有式(II)所示结构：
Figure BDA0003585641630000072
其中，R2选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊烷基、己基、庚基、异辛基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、苯基、萘基、苄基、萘甲基。
在其中一些实施例中，所述高分子材料具有式(III)所示结构：
Figure BDA0003585641630000073
其中，R2选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊烷基、己基、庚基、异辛基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、苯基、萘基、苄基、萘甲基。
在其中一些实施例中，所述pH响应性高分子材料具有式(IV)所示结构：
Figure BDA0003585641630000074
其中，R1选自：
Figure BDA0003585641630000075
Figure BDA0003585641630000081
在其中一些实施例中，n+m不小于30。
在其中一些实施例中，n+m不小于40。
在其中一些实施例中，n+m不小于50。
在其中一些实施例中，n+m不小于60。
在其中一些实施例中，n+m不小于70。
在其中一些实施例中，n+m为70-300。
在其中一些实施例中，n+m为75-200。
在其中一些实施例中，m为n+m的5-50％。
在其中一些实施例中，m为n+m的15-40％。
在其中一些实施例中，m为n+m的18-30％。
在其中一些实施例中，m为n+m的20-25％。
在其中一些实施例中，x为10-250。
在其中一些实施例中，所述pH响应性高分子材料具有如下式(V)或者式(VI)所示结构：
Figure BDA0003585641630000082
本发明所述化合物中，当任何变量(例如R2、R3等)在任何组分中出现超过一次，则其每次出现的定义独立于其它每次出现的定义。同样，允许取代基及变量的组合，只要这种组合使化合物稳定。自取代基划入环系统的线表示所指的键可连接到任何能取代的环原子上。如果环系统为多环，其意味着这种键仅连接到邻近环的任何适当的碳原子上。要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和下列提出的方法自可容易获得的原料容易合成的化合物。如果取代基自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结构稳定。短语“任选被一个或多个取代基取代”被认为与短语“任选被至少一个取代基取代”相当且在此情况下优选的实施方案将具有0-3个取代基。
本文所用术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如，“C1-C6烷基”中“C1-C6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如，“C1-C6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基。
术语“杂环烷基”为饱和的单环环状取代基，其中一个或多个环原子选自N、O或S(O)m(其中m是0-2的整数)的杂原子，其余环原子为碳，例如：哌啶基、吡咯烷基等。
本发明还提供了上述的pH响应性高分子材料的制备方法，包括如下步骤：
将mPEG-CPDB、单体1、单体2和引发剂溶于有机溶剂中，在氮气或者惰性气体的保护下密闭反应，即得；
其反应式如下：
Figure BDA0003585641630000091
在其中一些实施例中，所述反应的时间18～24小时，反应的温度为70～80℃。
在其中一些实施例中，所述有机溶剂为1,4-二氧六环。
在其中一些实施例中，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
本发明还提供了一种pH响应性高分子材料的纳米颗粒，由上述的pH响应性高分子材料在水介质中自组装形成。
本发明还提供了上述的pH响应性高分子材料的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将所述pH响应性高分子材料溶于二甲基甲酰胺中，然后将所得溶液在搅拌状态下逐滴加入去离子水中，继续搅拌，透析除去溶剂，即得所述的pH响应性高分子材料的纳米颗粒。
在其中一些实施例中，所述的pH响应性高分子材料的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将所述pH响应性高分子材料按配比45～55mg：1mL溶于二甲基甲酰胺中，然后将所得溶液在转速为1200～1700转/分钟的搅拌状态下逐滴加入去离子水中，继续以800～1200转/分钟的转速搅拌8～12分钟，使用截留分子量为10000～20000的透析袋透析除去溶剂，即得所述的pH响应性高分子材料的纳米颗粒。
本发明还提供了上述的pH响应性高分子材料在预防和/或治疗肿瘤中的应用。
在其中一些实施例中，所述肿瘤为胰腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、舌鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢上皮癌。
本发明还提供了上述的pH响应性高分子材料在治疗细菌感染中的应用。
在其中一些实施例中，所述细菌为革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性假单胞菌、革兰氏阳性葡萄球菌、革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性链球菌。
在其中一些实施例中，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌。
本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物，由活性成分和药学上可接受的辅料制备得到，所述活性成分包括上述的pH响应性高分子材料。
本发明还提供了一种治疗细菌感染的药物，由活性成分和药学上可接受的辅料制备得到，所述活性成分包括上述的pH响应性高分子材料。
本发明的用于预防和/或治疗肿瘤的药物以及治疗细菌感染的药物可以用于非人哺乳动物或者人。
本发明的用于预防和/或治疗肿瘤的药物以及治疗细菌感染的药物中所用的药学上可接受的辅料指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。
“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的活性成分(式I-式VI所示的pH响应性破膜高分子材料)以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
本发明的用于预防和/或治疗肿瘤的药物所用的药学上可接受的辅料包括但不限于如下材料中的一种或多种：溶剂、赋形剂、填料、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、润滑剂、润湿剂、悬浮剂、矫味剂和香料中的至少一种。
药学上可以接受的辅料部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure BDA0003585641630000111
Figure BDA0003585641630000112
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：
(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；
(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；
(c)保湿剂，例如，甘油；
(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；
(e)缓溶剂，例如，石蜡；
(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；
(g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；
(h)吸附剂，例如，高岭土；和
(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
以下为具体实施例。
以下实施例中通过RAFT聚合方法合成了式(I)所示的一系列破膜高分子材料。反应式如下：
Figure BDA0003585641630000121
其中，mPEG-CPDB为大分子链转移剂，单体1为侧基含有可质子化三级胺的甲基丙烯酸酯，单体2为侧基含有疏水基团的甲基丙烯酸酯。
其中，聚合反应的大分子链转移剂mPEG-CPDB参考相关文献(Ma,X.P.et al.
Ultra-pH-Sensitive Nanoprobe Library with Broad pH Tunability andFluorescence Emissions.J.Am.Chem.Soc.136,11085-11092(2014).)的制备方法合成。其核磁谱图如图1所示。
聚合反应所需的侧基含有三级胺的甲基丙烯酸酯单体部分可以直接从市面上购买获得，如果购买的单体中含有稳定剂对羟基苯甲醚(MEHQ)则需通过蒸馏除去，部分市面上没有的商品则需要通过醇与酰氯的反应合成得到。合成单体C5-MA、C6-MA、C7-MA、DI-MA的具体反应步骤参考相关文献(Li,H.J.et al.Smart Superstructures with UltrahighpH-Sensitivity for Targeting Acidic Tumor Microenvironment:Instantaneous SizeSwitching and Improved Tumor Penetration.ACS Nano.10,6753-6761(2016).)。
合成的C5-MA、C6-MA、C7-MA、DI-MA的结构式分别如下：
Figure BDA0003585641630000131
其核磁谱图如图2-图5所示。
含疏水基团的甲基丙烯酸酯单体(下文称为疏水单体)为直接购买获得，但商品化的产品中含有对苯二酚作为稳定剂，该稳定剂具有阻聚作用，因此通过常压或减压蒸馏得到可用于反应的疏水单体。具体蒸馏温度及压力见表1。
表1甲基丙烯酸酯蒸馏条件
Figure BDA0003585641630000132
实施例1：
一、R1为哌啶乙基(C6)、R2为不同疏水基团的高分子材料的制备和表征
本实施例制备了当三级胺为乙基派啶(C6)时，并含不同种类和比例疏水基团的高分子材料。这些高分子材料通过下述RAFT聚合法合成，反应方程式如下：
Figure BDA0003585641630000141
其中，R2为甲基(MeMA)、
Figure BDA0003585641630000142
(EMA)、
Figure BDA0003585641630000143
(BuMA)、
Figure BDA0003585641630000144
(IPMA)、
Figure BDA0003585641630000145
(IOMA)、
Figure BDA0003585641630000146
(HMA)、
Figure BDA0003585641630000147
(TMA)、
Figure BDA0003585641630000148
(BnMA)、
Figure BDA0003585641630000149
(PhMA)、
Figure BDA00035856416300001410
(NPhMA)。
具体步骤如下：
将0.2g mPEG113-CPDB(其中，PEG的分子量为5000)使用1,4-二氧六环溶解后置于反应容器中，根据表2所示摩尔比加入C6-MA单体以及对应的MeMA、EMA、BuMA、HMA、IOMA、TMA、BnMA、PhMA、NPhMA单体，混合均匀后加入2mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，使用液氮冷冻至固体后减压，恢复室温以释放反应溶液中的氧气，再次冷冻，如此反复数次直至反应容器中无氧气存在，充入高纯氮，在75℃下密闭反应18～24小时。反应结束后置于液氮中冷冻终止反应，将反应液融化后滴入正己烷中，得到相应的橘黄色的高分子材料聚合物。
本实施例制备的高分子材料聚合物的简称P(R1-R2(y))z(其中，P代表PEG，R1代表侧基含有三级胺的甲基丙烯酸酯单体的种类，R2代表含疏水基团的甲基丙烯酸酯单体种类，y代表疏水单体R2占两种单体的比例，z代表两种单体的总聚合度)以及投料比如表2所示，其中，反应物R1指代侧基含有三级胺的甲基丙烯酸酯单体1(本实施例为C6-MA)，反应物R2指代含疏水基团的甲基丙烯酸酯单体2。
表2系列高分子材料P(R1-R2(y))z的投料情况
Figure BDA00035856416300001411
Figure BDA0003585641630000151
Figure BDA0003585641630000161
所得高分子材料聚合物的核磁谱图如图6-图9所示：3.66ppm(a)为聚乙二醇链段氢原子(-CH2CH2O-)的质子信号峰，1.85ppm(g)为高分子主链上氢原子(-CH2-)的质子信号峰；0.9～1.05ppm(h)为侧链上甲基氢原子(-CH3)的质子信号峰，2.48ppm(b,-NCH2-)、1.62ppm(c,-CH2-)、1.47ppm(d,-CH2-)为C6杂环上氢原子的质子信号峰，2.62ppm(e,-CH2N-)、4.10ppm(f,-OCH2-)为侧链上氢原子的质子信号峰。对于P(C6-Mey)，其特征峰3.60ppm(1)为疏水侧链甲氧基上氢原子(-OCH3)的质子信号峰；P(C6-Ey)的特征峰4.05ppm(2,-OCH2-)、1.28ppm(3,-CH3)为疏水侧链乙基上氢原子的质子信号峰；P(C6-Buy)的特征峰4.09ppm(4,-OCH2-)、1.42ppm(5,-CH2CH2-)、0.97ppm(6,-CH3)为疏水侧链丁基上氢原子的质子信号峰。P(C6-Hy)，其特征峰4.09ppm(1,-OCH2-)、1.34ppm[2,-(CH2)4-]、0.88ppm(3,-CH3)为疏水侧链己基上氢原子的质子信号峰；P(C6-IOy)的特征峰4.09ppm(4,-OCH2-)、1.31ppm[5,-(CH2)4-]、0.90ppm(6,-CH3)为疏水侧链异辛基上氢原子的质子信号峰；P(C6-Ty)的特征峰4.09ppm(7,-OCH2-)、1.28ppm[8,-CH2)12-]、0.89ppm(9,-CH3)为疏水侧链丁基上氢原子的质子信号峰。对于P(C6-Bny)，其特征峰5.00ppm(1,-OCH2-)、7.34ppm[2,(-CH＝)5]为疏水侧链苄基上氢原子的质子信号峰。对于P(C6-Ph20)，其特征峰7.11ppm(1,-CH＝)、7.38ppm(2,-CH＝)、7.23ppm(3,-CH＝)为疏水侧链苯基上氢原子的质子信号峰；P(C6-NPh20)的特征峰5.13ppm(4,-OCH2-)、7.82ppm[5,(-CH＝)4]、7.48ppm[6,(-CH＝)2]为疏水侧链萘基上氢原子的质子信号峰。
根据核磁积分及氢原子质子信号峰位置，并结合GPC结果积分计算数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)以及单分散度(PDI)，并通过核磁共振氢谱积分计算分子量列于下表，判断成功合成了本实施例所设计的高分子材料，其聚合度控制在80左右(相关数据见表3)。其中表头上标a的分子量(Mw，Mn)以及分子量分布(PDI)通过GPC测试得到：将高分子溶于四氢呋喃中，终浓度为5～10mg/mL。采用配备Waters 1515高效液相色谱分离泵和Waters2414折射率检测器的凝胶渗透液相色谱检测。流动相为四氢呋喃，流速为0.3mL/min。对测试结果的峰面积进行积分，并与不同分子量标准品峰面积积分曲线拟合得到高分子的Mw，Mn及PDI。上标b的分子量(Mn)和聚合度通过1H NMR测试所得：将高分子溶解于氘代氯仿(CDCl3)中，终浓度为10mg/mL，内标为四甲基硅烷(TMS)。使用德国布鲁克400MHz核磁共振波谱仪扫描得到数据。将PEG峰面积积分对应的氢原子数定义为448，对剩余各个位置的氢原子质子信号峰积分并与PEG峰面积比对计算所得。
表3本实施例合成的高分子材料及其表征
Figure BDA0003585641630000171
Figure BDA0003585641630000181
注：a代表分子量(Mw，Mn)以及分子量分布为GPC测试所得；b分子量(Mn)和聚合度为通过1HNMR计算所得。
二、R1为哌啶乙基(C6)、R2为不同疏水基团的高分子材料纳米胶束颗粒的制备
本实施例合成的高分子材料具有亲水的聚乙二醇和疏水的聚甲基丙烯酸酯部分，在水中可自组装形成纳米胶束颗粒。具体操作如下：取50mg高分子材料于5mL样品瓶中，加入1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解备用。另取5mL无菌水于提前灭菌的25mL圆底烧瓶中，置于磁力搅拌台上，以RPM＝1500r/min的转速搅拌，将高分子材料的DMF溶液使用移液枪逐滴加入圆底烧瓶中。继续以RPM＝1000r/min的转速搅拌10min后，使用截留分子量14000的透析袋在4L超纯水中透析24小时，前6小时每1小时换一次水，后18小时每6小时换一次水。透析后用移液枪取出并定量，保存于4℃冰箱中。取100μL浓度为5mg/mL的纳米颗粒溶液，用pH 7.4的PB盐溶液稀释至1mL，装入纳米粒度仪的电势/粒径专用测试池中，测试粒径和电势。测试结果如表4所示，本实施例合成的高分子材料在水中自组装形成粒径约20-80nm的纳米胶束，其电势约为0mV，显示电中性。
表4系列高分子材料的pKa以及在pH 7.4的溶液中的粒径和电势表征
Figure BDA0003585641630000182
Figure BDA0003585641630000191
三、R1为哌啶乙基(C6)、R2为不同疏水基团的高分子材料在不同pH下的质子化情况
将本实施例制备的高分子材料溶解在含150mM NaCl的酸性溶液中，使所有三级胺质子化，再使用碱中和游离的氢离子，通过监测溶液pH的变化计算得到对应高分子材料的质子化程度及pKa(电离平衡常数)。具体操作如下：取10mg高分子材料于20mL样品瓶中，加入HCl水溶液(10mL,0.01M)使其溶解为澄清溶液。每次加入1～10μL的1M NaOH水溶液，使用pH计监测并记录溶液pH的变化，直至pH达到11。将pH滴定曲线的一阶导数的两个极值点确定为完全质子化(质子化率＝1)及完全非质子化(质子化率＝0)。当质子化率为0.5时，证明溶液体系中高分子材料已质子化部分与非质子化部分的摩尔量相同，根据解离平衡常数(pKa)的定义，将高分子材料的质子化率等于0.5定义为高分子材料的pKa。如图10所示，这类高分子材料的质子化率随着pH的变化有快速的变化，在很小的pH范围内即可实现大的pH突跃。且通过分析可知，随着高分子材料的疏水结构比例的增加，高分子材料的pKa依次下降且与含疏水基团的甲基丙烯酸酯单体的比例呈线性关系。因此通过调控高分子材料结构中疏水单体与三级胺之间的比例，可实现对破膜高分子pH依赖性质子化程度的调控。
四、R1为哌啶乙基(C6)、R2为不同疏水基团的高分子材料在正常组织和肿瘤组织特征pH下的细胞毒性
通过细胞毒性研究了本实施例制备的系列高分子材料在正常组织和肿瘤组织特征pH下的细胞毒性，筛选出在正常组织显示低细胞毒性而在肿瘤组织显示高细胞毒性的激活性破膜高分子。通过MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)评估药物在两种pH 7.4和pH 6.8条件下对肿瘤细胞的杀伤效果。使用6mol/L的HCl溶液调节DMEM培养基至pH＝6.8备用。将小鼠胰腺癌细胞Panc02(购自ATCC)在含10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。在pH 7.4及pH 6.8下，将不同浓度的材料(本实施例第二部分中制备的纳米胶束颗粒)与细胞(浓度为1×105个/mL)进行孵育，在37℃、二氧化碳培养箱中分别培养4小时或24小时后弃去原培养基，加入MTT(0.5mg/mL,100μL)溶液，置于37℃、二氧化碳培养箱中继续培养4小时。小心吸去培养液，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪测试OD 490nm吸光值。测试结果如图11所示。
由图11中的a图可知，在pH 7.4条件下，多数高分子材料与Panc02细胞的作用较弱，在高浓度下孵育24小时后对细胞的毒性较小，不具有明显的细胞毒性。根据MTT结果计算材料对Panc02细胞抑制率为10％时的浓度，将其定义为IC10。并将该值与高分子材料的不同疏水单体及比例做图分析，如图11中的b图所示，可以发现IC10均大于800μg/mL的材料，其疏水单体在所有甲基丙烯酸酯单体中所占比例不小于20％，且疏水基团R2为乙基(E)、丁基(Bu)等较短的烷基链或苄基(Bn)结构。当疏水基团R2为己基(H)、异辛基(IO)、十四烷基(T)等较长的烷基链时，高分子的细胞毒性较大，IC10较低，说明甲基丙烯酸酯单体疏水性的增加会增加高分子的毒性。
在pH 6.8条件下将所有高分子材料与Panc02细胞共孵育4小时以评估其在肿瘤酸度下的杀伤能力，其MTT结果如图12中的a图所示，图中颜色越深代表该高分子对细胞杀伤越强。由图12中a图可知，高分子材料呈现出剂量依赖的细胞杀伤能力。根据pH 6.8条件下MTT结果计算不同高分子对Panc02细胞生存抑制率为50％时的浓度，定义为IC50。并将该值与高分子材料的不同疏水单体及比例做图分析，如图12中的b图所示，可以发现疏水基团R2为己基(H)、异辛基(IO)、十四烷基(T)等较长的烷基链或苄基，疏水单体在所有甲基丙烯酸酯单体中的比例均在5～20％之间的高分子材料的细胞杀伤能力较强。
通过将pH 7.4条件下的IC10及pH 6.8条件下的IC50综合分析作图，得到了最优化的疏水单体种类及比例。
如图11中的b图所示，方框所示为IC10大于800μg/mL的高分子种类，如图12中b图所示，方框所示为IC50小于40μg/mL的高分子种类。将两个方框重叠后(如图12中的c图所示)，交集为高分子P(C6-Bn20)。该高分子在正常生理条件下(pH＝7.4)具有较低的细胞毒性(IC10＞800μg/mL)，同时在肿瘤微酸环境下(pH＝6.8)具有较强的细胞杀伤能力(IC50＝23.23μg/mL)。
进一步在小鼠体内通过测试最大致死剂量(MTD)研究这些高分子材料的毒性。将5周龄的ICR雌鼠(购自湖南史莱克景达实验动物有限公司)共72只，分为平均体重相近的6大组，每组6只。所对应的的材料分别为P(C6-Mey)80、P(C6-Buy)80、P(C6-Ey)80、P(C6-Bny)80、P(C6-Hy)80、P(C6-IOy)80、P(C6-Ty)80，其中y是指含疏水基团的甲基丙烯酸酯单体占所有甲基丙烯酸酯单体的百分比。每种材料均从10μg/g体重开始给药，同一剂量给药3只ICR雌鼠，若24小时后无实验动物死亡则给药剂量增加5μg/g再次给药，直至出现死亡实验鼠。将未出现死亡小鼠的最大剂量记为ICR小鼠的最大耐受剂量，并作图，如图11中的c图所示：当疏水基团R2为乙基(E)、丁基(Bu)等较短的烷基链或苄基(Bn)结构且其疏水单体在所有甲基丙烯酸酯单体中的占比不小于20％时，这些高分子的MTD大于100mg/kg。
相关数据如表5所示。
表5系列高分子材料在pH 7.4下与Panc02细胞孵育24小时后杀伤10％细胞的浓度(IC10),在pH 6.8下与Panc02细胞孵育4小时后杀伤50％细胞的浓度(IC50)，以及尾静脉注射到ICR小鼠后最高耐受剂量(MTD)
Figure BDA0003585641630000211
Figure BDA0003585641630000221
通过本实施例可以发现：当疏水基团为苄基且其疏水单体在所有甲基丙烯酸酯单体中的占比为20％时，高分子材料P(C6-Bn20)80在正常生理条件下(pH＝7.4)具有较低的细胞毒性(IC10＞800μg/mL)，同时在肿瘤微酸环境下(pH＝6.8)具有较强的细胞杀伤能力及体内毒性(IC50＝23.23μg/mL，MTD＞100mg/kg)，即在pH7.4和pH6.8条件下具有最强的选择性。
实施例2：
一、R2为苄基、R1为不同三级胺的高分子材料的制备和表征
本实施例通过RAFT聚合法合成了式(III)所示的系列高分子材料，反应方程式如下：
Figure BDA0003585641630000222
式中的R1为
Figure BDA0003585641630000223
(C5-MA)、
Figure BDA0003585641630000224
(C6-MA)、
Figure BDA0003585641630000225
(C7-MA)、
Figure BDA0003585641630000226
(DE-MA)。
其具体合成步骤如下：
将200mg mPEG113-CPDB使用1,4-二氧六环溶解后置于反应容器中，mPEG-CPDB与单体总摩尔比为1:80。按R1与R2的不同摩尔比(80:20、75:20、70:30、63:35、60:40)加入单体1和甲基丙烯酸苄基酯(Bn-MA)，混合均匀后加入2mg引发剂AIBN，冷冻至固体后减压，恢复室温以释放反应溶液中的氧气，再次冷冻，如此反复数次直至反应容器中无氧气存在，充入高纯氮密闭反应18-24小时。反应结束后置于液氮中冷冻终止反应，将反应液融化后滴入正己烷中，得到橘黄色的高分子材料聚合物。
本实施例制备的高分子材料聚合物的简称以及投料比如表6所示，其中，反应物R1指代侧基含有三级胺的甲基丙烯酸酯单体1，反应物R2指代含疏水基团的甲基丙烯酸酯单体2(本实施例为甲基丙烯酸苄基酯(Bn-MA))。
表6系列高分子材料的合成条件及其pKa
Figure BDA0003585641630000231
本实施例制备的高分子材料的核磁谱图如图13-图15所示：3.66ppm(a)为聚乙二醇链段氢原子(-CH2CH2O-)的质子信号峰，1.85ppm(b)为高分子主链上氢原子(-CH2-)的质子信号峰；0.9～1.05ppm(e)为侧链上甲基氢原子(-CH3)的质子信号峰，2.62ppm(d,-CH2N-)、4.10ppm(c,-OCH2-)为侧链上氢原子的质子信号峰，5.00ppm(f,-OCH2-)、7.34ppm[g,(-CH＝)5]为疏水侧链苄基上氢原子的质子信号峰。对于P(C5-Bnx)，其特征峰2.55ppm(1,-NCH2-)、1.78ppm(2,-CH2-)为C5杂环上氢原子的质子信号峰。对于P(C7-Bnx)，其特征峰2.65ppm(1,-NCH2-)、1.68ppm(2,-CH2-)、1.60(3,-CH2-)为C7杂环上氢原子的质子信号峰。对于P(DE-Bnx)，其特征峰2.50ppm(1,-NCH2-)、1.00ppm(2,-CH3)为DE烷基链上氢原子的质子信号峰。核磁数据显示成功合成了上述式(III)所示的系列分子量、R1与R2摩尔比可控的高分子材料。
二、R2为苄基、R1为不同三级胺的高分子材料纳米颗粒的制备
本实施例合成的高分子材料在水中自组装形成纳米颗粒的具体操作如下：取50mg高分子材料于5mL样品瓶中，加入1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解备用。另取5mL无菌水于提前灭菌的25mL圆底烧瓶中，置于磁力搅拌台上，以RPM＝1500r/min的转速搅拌，将高分子材料的DMF溶液使用移液枪逐滴加入圆底烧瓶中。继续以RPM＝1000r/min的转速搅拌10min后，使用截留分子量14000的透析袋在4L超纯水中透析24小时，前6小时每1小时换一次水，后18小时每6小时换一次水。透析后用移液枪取出并定量，保存于4℃冰箱中。使用粒径电势仪测试所得产品的粒径和电势。测试结果显示本实施例合成的高分子材料在水中自组装形成粒径约50-60nm的纳米胶束，其电势约为0mV，显示电中性。
三、同样地，如图10(i-k)所示，通过滴定实验，证明了这类高分子的质子化程度随着pH也会发生突跃，且其pKa随着三级胺疏水性及苄基参杂比例的增多而降低。
四、R2为苄基、R1为不同三级胺的高分子材料在正常组织和肿瘤组织特征pH下的细胞毒性
实验方法同实施例1。
实验结果如图16和表7所示：具有一定比例的含苄基疏水侧链的高分子材料纳米颗粒可以实现在不同pH下对肿瘤细胞的选择性杀伤，在pH 6.8下显示更强的细胞毒性，并且高分子材料P(C7-Bn20)80、P(C7-Bn30)80、P(C7-Bn40)80及P(DE-Bn25)80、P(DE-Bn30)80、P(DE-Bn40)80在pH 7.4下显示低细胞毒性，其IC10>800μg/mL。进一步通过研究这些高分子材料纳米颗粒对ICR小鼠的MTD，结果显示当三级胺为DE时，虽然高分子材料纳米颗粒在pH 7.4显示较低的细胞毒性，但在体内仍具有一定的毒性。综合分析上述结果，高分子材料P(C6-Bn20)80纳米颗粒在pH7.4和pH6.8的条件下具有最强的选择性，且对小鼠的MTD较高。
表7系列高分子材料在pH 7.4下与Panc02细胞孵育24后杀伤10％细胞的浓度(IC10),在pH 6.8下与Panc02细胞孵育4后杀伤50％细胞的浓度(IC50)，以及尾静脉注射到ICR小鼠后最高耐受剂量(MTD)
Figure BDA0003585641630000241
Figure BDA0003585641630000251
实施例3分子量对高分子材料活性的影响
一、本实施例采用实施例1的方法合成并表征了一系列不同聚合度(Z，其值为含C6和Bn链段聚合度的和)的P(C6-Bn20)。具体核磁表征如图17所示，根据聚乙二醇链段氢原子的质子信号峰，3.66ppm(a,-CH2CH2O-)；以及侧链上氢原子的质子信号峰，2.48ppm(b,-NCH2-)、1.62ppm(c,-CH2-)、1.47ppm(d,-CH2-)计算积分面积和聚合度。
用MTT法(具体方法同实施例1)测试了不同聚合度的P(C6-Bn20)纳米颗粒(制备方法同实施例1)在pH 6.8条件下对Panc02细胞的杀伤能力。测试结果如图18所示：聚合度为20的时候，P(C6-Bn20)20对Panc02细胞的杀伤能力较弱；随着聚合度的提高，杀伤能力逐步增强，当聚合度为80及以上时，分子量对细胞的杀伤效果没有影响。
二、本实施例用一系列不同分子量的mPEG(分子量分别为750、2000和10000，对应于结构式中的x取值分别为16、44、224)作为链转移剂参照实施例1的方法合成了式I所示的高分子材料，按mPEG的分子量分别命名为P(C6-Bn20)-750、P(C6-Bn20)-2000、P(C6-Bn20)-10000。对该系列高分子材料进行核磁表征，谱图如图19所示，证明成功得到了所设计的聚合物。分别对该系列的高分子材料纳米颗粒(制备方法同实施例1)在pH 7.4和pH6.8的条件下进行细胞毒性的检测(具体方法同实施例1)，结果发现不同的PEG长度对其在pH 7.4下的细胞毒性影响不大，在800μg/mL下孵育24h后其细胞毒性较低(如图20中的a图所示)，且在pH 6.8下对其细胞毒性的影响也不大(如图20中的b图所示)。
实施例4：P(C6-Bn20)高分子纳米颗粒的理化性质研究
取实施例1制备的50mg P(C6-Bn20)80高分子固体于5mL样品瓶中，加入1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解备用。另取5mL无菌水于提前灭菌的25mL圆底烧瓶中，置于磁力搅拌台上，以RPM＝1500r/min的转速搅拌，将高分子的DMF溶液使用移液枪逐滴加入圆底烧瓶中，继续以RPM＝1000r/min的转速搅拌10min后，使用截留分子量14000的透析袋在4L超纯水中透析24小时，前6小时每1小时换一次水，后18小时每6小时换一次水。透析后用移液枪取出并定量，保存于4℃冰箱中。取100μL浓度为5mg/mL的纳米颗粒溶液，用对应pH的PB盐溶液稀释至1mL，装入纳米粒度仪的电势/粒径专用测试池中，使用纳米粒度及Zeta电位仪表征纳米颗粒的粒径及电势。如图21的a和b所示，当pH＝7.4时其粒径为55.8nm，电势仅为-0.2mV；当pH为6.9时，纳米颗粒的粒径和电势开始发生转变，电势为3.15mV，粒径为15.78nm，说明因三级胺结构的质子化，使纳米颗粒的结构发生剧烈变化；进一步地，当pH≤6.8时，纳米颗粒中较多的三级胺结构转变为正电性，形成阳离子区域，结构转变后粒径约为10nm，电势则大于9mV。通过TEM观察纳米颗粒在两种pH条件下的形貌，如图21的c所示，P(C6-Bn20)在pH 7.4条件下具有完整的颗粒形态，而当pH为6.8时，纳米颗粒基本转变为粒径约为10nm的小颗粒。
高分子中三级胺单元与溶液中游离氢离子的结合会导致高分子由疏水转变为亲水，进而暴露部分疏水内核。通过核磁共振氢谱测定疏水内核氢的信号强度可以佐证高分子的质子化过程。具体操作如下：取18mg高分子固体和0.054gNaCl加入6mL重水中，通过涡旋将固体尽量分散。再加入7μL氘代盐酸重水溶液，超声至高分子完全溶解得到澄清溶液。用重水和氘氧化钠配制0.1mol/L的溶液，逐次向高分子重水溶液中加入1μL氘氧化纳重水溶液，并通过pH计测定pH值，当pH为6.0、6.5、6.8、7.0、7.4时，分别取600μL至核磁管中。使用核磁共振仪测定样品的氢谱。通过核磁共振氢谱，在溶液体系中对三种不同pH下的P(C6-Bn20)80进行表征。由图21的d图可知，pH 7.4和7.0条件下P(C6-Bn20)80没有三级胺侧链上氢原子的信号，也没有苯环上氢原子的信号。然而随着pH降低至6.8及以下时，氢谱图上出现了三级胺侧链上氢原子的特征信号峰：1.59ppm(2)、1.80ppm(3)、3.18ppm(4)，以及苯环上氢原子的特征峰：7.42ppm(7)。该结果证明了三级胺及苯环结构在pH 7.4条件下被封闭于疏水内核中，而在肿瘤酸性条件下，分子间强烈的电荷排斥以及疏水性的降低，使聚集体变得松散，并暴露出能与细胞膜相互作用的链段。
采用MTT法(具体方法同实施例1)检测了P(C6-Bn20)80在不同pH值下对panc02细胞的浓度依赖性细胞毒性，结果如图22的a图所示：P(C6-Bn20)80在pH 7.4-6.9范围内毒性可以忽略不计，在pH 6.8-6.5范围内，当浓度为40μg/mL时，孵育4小时后，细胞存活率低于50％。
同时，采用MTT法(具体方法同实施例1)检测了P(C6-Bn20)80在不同pH值下对多种癌细胞的细胞毒性，在pH值为6.8时，P(C6-Bn20)80对多种癌细胞具有良好的杀伤效果，其中包括耐药细胞(A549/DDP和CAL-27/DDP)。该材料在pH 6.8下对多种肿瘤细胞的IC50值均低于50μg/mL(如图22中的b图所示)。同时在pH 7.4下对正常细胞高浓度孵育24小时无明显毒性(如图22中的c图所示)。
实施例5：P(C6-Bn20)80高分子材料杀伤细胞的作用机制验证研究
(1)本实施例进一步研究P(C6-Bn20)80高分子材料细胞内吞是否影响其对Panc02细胞的杀伤作用。分别使用内吞抑制剂或在4℃下共孵育的方法处理细胞。如图23的a所示，pH 7.4和6.8条件下，分别将Panc02细胞和P(C6-Bn20)80纳米颗粒预先在4℃放置30分钟，再次共孵育4小时，检测细胞存活率，细胞与纳米颗粒在37℃孵育作为对照。结果表明，温度的改变并不影响高分子纳米颗粒对细胞的杀伤效果。由于低温可抑制细胞内吞效应，因此可以推测P(C6-Bn20)80不通过经典的内吞途径发挥作用。此外，如图23的b所示，使用不同的内吞抑制剂将细胞预处理后再与P(C6-Bn20)80共孵育后，并不会对高分子的杀伤效果造成影响，与对照组的杀伤效果一致。进一步证明了P(C6-Bn20)80对细胞的杀伤不受内吞影响，仅通过破坏细胞的膜结构发挥作用。
(2)在100mm细胞培养皿中加入5×106个悬浮Panc02细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时待贴壁后，将培养基换为pH 6.8或7.4的含有100μg/mL P(C6-Bn20)-Fe的DMEM培养基。在不同的时间点使用细胞刮刀收集细胞，使用2.5％的戊二醛固定细胞4小时，然后使用PBS润洗三次，每次10～15分钟。接着使用四氧化锇固定细胞1～2小时，使用PBS润洗三次，每次10～15分钟。使用梯度浓度(25％,50％,75％,90％,100％)的乙醇对细胞进行梯度脱水，依次将相应浓度的乙醇加入细胞中浸泡10～15分钟，然后置于无水丙酮中浸泡10～15分钟。然后细胞在丙酮:包埋液＝3:1(v/v)的溶液中浸泡0.5h，在丙酮:包埋液＝1:1(v/v)的溶液中浸泡4h，置于纯包埋液中4℃下保存过夜。将样品装入包埋板，先在37℃下烘烤24小时，再置于60℃下烘烤48小时。样品用超微切片器(EM UC7，徕卡)切成约100nm厚的薄片，用乙酸二恶烷铀染色20分钟，柠檬酸铅染色12分钟，然后用透射电镜观察。如图24所示，在pH 7.4条件下，Panc02细胞与P(C6-Bn20)80共孵育50分钟后仍未观测到细胞膜结构的改变，细胞结构完整。相较之下，当pH为6.8时，共孵育仅10分钟即可观察到纳米颗粒附着于细胞膜上。随着孵育时间延长到25分钟时，发现细胞有明显的形态变化，且膜上出现小鼓泡。通过放大图进一步证明纳米颗粒导致细胞膜出现鼓泡。当共孵育时间超过35分钟后，细胞内容物流出。
(3)用铺片培养Panc02细胞24小时，待细胞在铺片上固定后，将铺片分为6组，分别为PBS处理的pH 7.4和pH6.8对照组、加入浓度为50μg/mL的P(C6-Bn20)作为实验组。材料处理2小时后，使用质量浓度为2.5％的戊二醛溶液固定20分钟，随后用冷PBS洗三次，分别依次使用质量浓度为25％、50％、75％、90％、100％的乙醇水溶液逐级脱水，每浓度梯度20分钟，脱水后使用临界点干燥法干燥，使用真空喷镀仪均匀喷涂碳和金，使用场发射扫描电子显微镜SEM观察(仪器厂家：Carl Zeiss AG型号：Merlin)，结果如图25所示，在微酸环境下，P(C6-Bn20)80材料显示强破膜活性。如图25的a和b所示为小鼠胰腺癌细胞(Panc-02细胞)分别在pH 7.4及pH 6.8条件下的电镜照片。如图25的c所示为使用材料P(C6-Bn20)80在pH 7.4条件下与细胞作用后电镜图显示细胞膜无损伤，图25的d所示为pH 6.8条件下细胞与P(C6-Bn20)80作用后细胞膜完全破碎。
实施例6：P(C6-Bn20)80高分子材料体内抑瘤实验
通过C57小鼠胰腺癌肿瘤皮下模型(Panc-02细胞)、C57小鼠黑色素肿瘤皮下模型(B16-F10细胞)、BALB/c小鼠结直肠癌肿瘤皮下模型(CT-26细胞)、BALB/c Nude小鼠人肺癌肿瘤皮下模型(A549细胞)的体内实验验证P(C6-Bn20)80的肿瘤抑制效果。操作如下：
在雌性小鼠(C57BL/6，6-8周)背部皮下注射1×106个/mL Panc02细胞悬液(100μL)，以建立胰腺癌皮下肿瘤模型；在雌性小鼠(C57BL/6，6-8周)背部皮下注射1×106个/mLB16-F10细胞悬液(100μL)，以建立黑色素瘤皮下肿瘤模型；在雌性小鼠(BALb/c，6-8周)背部皮下注射5×105个/mL CT26细胞悬液(100μL)，以建立结直肠癌皮下肿瘤模型；在雌性小鼠(Nu-/-Nu-/-，6-8周)背部皮下注射5×106个/mL A549细胞悬液(100μL)，以建立肺癌皮下肿瘤模型。待肿瘤长至50～100mm3(肿瘤体积＝长×宽×宽/2)。分组完毕后，通过尾静脉给药。另设阴性对照组，仅注射等体积的PBS溶液。使用游标卡尺测量肿瘤大小，记录小鼠体重。Panc02模型的体内抑瘤效果如图26所示，根据肿瘤生长曲线可以看出，相较于PBS组，三个给药组(药物为P(C6-Bn20)80纳米颗粒材料)的肿瘤体积均得到一定程度的抑制，其中剂量为50mg/kg给药组的肿瘤体积的增长显著减缓。同时小鼠经历整个治疗周期后，实验组与PBS对照组的体重无差异，该治疗过程不会造成小鼠体重减轻。通过离体肿瘤称重可以发现不同剂量的给药组相较于PBS对照组均较轻，其中剂量为50mg/kg的给药组离体肿瘤重量也是最小的。离体肿瘤重量与肿瘤生长曲线结果相一致。在其他肿瘤模型中(给药剂量为50mg/kg)，P(C6-Bn20)80材料对各类肿瘤模型均具有较好的抑制效果(图27)。
实施例7：高分子材料在不同pH下对细菌的杀伤效果
本实施例研究了本发明的高分子材料在酸性条件下杀伤细菌的作用，实验发现，本发明的高分子材料可以在感染的酸度下高效杀伤细菌。
挑取细菌(大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌ATCC6538、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853、粪肠球菌ATCC29212)的单克隆菌落于1mL LB肉汤中，37℃下震荡(220rpm)培养过夜。然后吸取5μL细菌悬浮液接种到1mL新鲜LB肉汤中，并在37℃下震荡培养过夜后，将菌液在10000rpm下离心1min，倾去上层清液后，加入1mLPBS重悬清洗再离心，重复清洗三次后用PBS重悬。
将大肠杆菌的菌液用pH为5.00、5.50、6.00、7.40的M9培养基稀释至1×106CFU/mL，然后将上述菌液分别与等体积的浓度为32μg/mL和0μg/mL的高分子材料溶液(分别用对应pH为5.00、5.50、6.00、7.40的M9培养基配制)混合，37℃下孵育1h后，通过稀释平板菌落计数法对其杀菌性能进行评价。其中以未加入高分子材料溶液的样品作为对照组，每个pH设置对应的对照组。细菌存活率通过公式(1)计算。结果参见图28中的a图。
Figure BDA0003585641630000291
其中，以未加入高分子材料溶液的样品作为对照组，NSample和NControl分别是相同稀释倍数下实验组和对照组中存活的菌落数(CFU)。所得结果为平行样的平均值，n＝3。
所使用的高分子材料包括：P(C6-Bn20)80纳米颗粒和P(C7-Bn20)80纳米颗粒。如图28中的a图，P(C6-Bn20)80纳米颗粒和P(C7-Bn20)80纳米颗粒对大肠杆菌的杀伤呈现pH依赖性，在pH 7.40下对细菌没有明显的杀伤，而在酸性条件下(pH为5.00、5.50、6.00)呈现出较高的杀伤活性。利用同样的实验方法发现：P(C6-Bn20)80纳米颗粒和P(C7-Bn20)80纳米颗粒在32μg/mL的浓度下、pH 6.00条件下对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯、铜绿假单胞菌、粪肠球菌等具有高效的杀伤作用，结果参见图28中的b图-f图。
进一步挑取大肠杆菌(ATCC 25922)的单克隆菌落于1mL LB肉汤中，37℃下震荡(220rpm)培养过夜。然后吸取200μL细菌悬浮液接种到20mL新鲜LB肉汤中，并在37℃下震荡培养3h，获得对数期细菌，将菌液在4000rpm下离心10min，倾去上层清液后，加入1mL PBS重悬清洗再离心，重复清洗三次后用PBS重悬。
将菌液用pH为6.00和7.40的M9培养基稀释至2×109CFU/mL，然后将上述菌液分别与等体积的浓度为256μg/mL和0μg/mL的高分子材料溶液(分别用对应pH为6.00和7.40的M9培养基配制)混合，37℃下孵育1h后，加入电镜固定液，固定过夜。使用PBS洗涤3次，每次孵育20min；接着分别使用30％、50％、70％、90％、95％的乙醇溶液梯度脱水，每次15min；然后使用无水乙醇孵育3次，每次15min；最后使用叔丁醇孵育两次，每次20min。样品冷冻干燥后，喷金，使用场发射扫描电子显微镜进行细菌形貌观测。结果参见图29，P(C6-Bn20)80纳米颗粒和P(C7-Bn20)80纳米颗粒在pH 7.4对大肠杆菌形貌没有明显的作用，而在pH 6.0下，经P(C6-Bn20)80纳米颗粒和P(C7-Bn20)80纳米颗粒处理后，细菌细胞膜明显出现孔洞，说明P(C6-Bn20)80纳米颗粒和P(C7-Bn20)80纳米颗粒在酸性条件下可以通过破坏细菌细胞膜而杀伤细菌。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (26)

1.具有式(I)所示结构的高分子材料：
Figure FDA0004097875770000011
其中，R1选自：-R3-N(R4Rs)；
R2选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苯基取代的C1-C3烷基；
R3选自：亚烷基；
R4、R5和与其相连的氮原子一起形成
Figure FDA0004097875770000012
或者
Figure FDA0004097875770000013
x大于0；
n+m不小于20，并且m为n+m的15-40％。
2.根据权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，R2选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苄基。
3.根据权利要求2所述的高分子材料，其特征在于，R2选自：丁基、苄基。
4.根据权利要求3所述的高分子材料，其特征在于，R2选自：苄基。
5.根据权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，R3选自：C1-C6亚烷基。
6.根据权利要求5所述的高分子材料，其特征在于，R3选自：亚甲基、亚乙基、亚丙基。
7.根据权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，具有式(II)所示结构：
Figure FDA0004097875770000014
其中，R2选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苄基。
8.根据权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，具有式(III)所示结构：
Figure FDA0004097875770000021
其中，R2选自：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苄基。
9.根据权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，具有式(IV)所示结构：
Figure FDA0004097875770000022
其中，R1选自：
Figure FDA0004097875770000023
10.根据权利要求1-9任一项所述的高分子材料，其特征在于，n+m不小于50。
11.根据权利要求10所述的高分子材料，其特征在于，n+m不小于70。
12.根据权利要求11所述的高分子材料，其特征在于，n+m为70-300。
13.根据权利要求12所述的高分子材料，其特征在于，n+m为75-200。
14.根据权利要求1-9任一项所述的高分子材料，其特征在于，m为n+m的18-30％。
15.根据权利要求14所述的高分子材料，其特征在于，m为n+m的20-25％。
16.根据权利要求1-9任一项所述的高分子材料，其特征在于，x为10-250。
17.根据权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，具有如下式(V)或者式(VI)所示结构：
Figure FDA0004097875770000031
18.一种高分子材料的纳米颗粒，其特征在于，由权利要求1-17任一项所述的高分子材料在水介质中自组装形成。
19.一种权利要求18所述的高分子材料的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述高分子材料溶于二甲基甲酰胺中，然后将所得溶液在搅拌状态下逐滴加入去离子水中，继续搅拌，透析除去溶剂，即得所述高分子材料的纳米颗粒。
20.根据权利要求19所述的高分子材料的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述高分子材料按配比45～55mg∶1mL溶于二甲基甲酰胺中，然后将所得溶液在转速为1200～1700转/分钟的搅拌状态下逐滴加入去离子水中，继续以800～1200转/分钟的转速搅拌8～12分钟，使用截留分子量为10000～20000的透析袋透析除去溶剂，即得所述高分子材料的纳米颗粒。
21.权利要求1-17任一项所述的高分子材料作为活性成分在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胰腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、舌鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢上皮癌。
23.权利要求1-17任一项所述的高分子材料作为活性成分在制备治疗细菌感染的药物中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性假单胞菌、革兰氏阳性葡萄球菌、革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性链球菌。
25.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌。
26.一种预防和/或治疗肿瘤、或者治疗细菌感染的药物，其特征在于，由活性成分和药学上可接受的辅料制备得到，所述活性成分包括权利要求1-17任一项所述的高分子材料。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104650307A (zh) * 2015-01-28 2015-05-27 华南理工大学 基于PDEAEMA的pH敏感五嵌段线性聚合物及胶束
CN109265680A (zh) * 2018-09-21 2019-01-25 中国科学院理化技术研究所 一种pH响应的ε-聚赖氨酸及其制备方法和应用
JP2019108473A (ja) * 2017-12-19 2019-07-04 国立大学法人山形大学 自立性高分子薄膜及びその製造方法、並びに、自立性高分子前駆体薄膜、それからなる密閉容器及び内包剤の放出方法
WO2020092633A1 (en) * 2018-10-30 2020-05-07 Vanderbilt University Graft copolymers, methods of forming graft copolymers, and methods of use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104650307A (zh) * 2015-01-28 2015-05-27 华南理工大学 基于PDEAEMA的pH敏感五嵌段线性聚合物及胶束
JP2019108473A (ja) * 2017-12-19 2019-07-04 国立大学法人山形大学 自立性高分子薄膜及びその製造方法、並びに、自立性高分子前駆体薄膜、それからなる密閉容器及び内包剤の放出方法
CN109265680A (zh) * 2018-09-21 2019-01-25 中国科学院理化技术研究所 一种pH响应的ε-聚赖氨酸及其制备方法和应用
WO2020092633A1 (en) * 2018-10-30 2020-05-07 Vanderbilt University Graft copolymers, methods of forming graft copolymers, and methods of use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pathway-dependent re-assembly of dual-responsive ABC terpolymer in water;Chunhui Luo 等;《Soft Matter》;2618-2626 *
Polymerization-Induced Self-Assembly Generating Vesicles with Adjustable pH-Responsive Release Performance;Xiao-Fei Xu 等;《Macromolecules》;1965-1975 *
The efficiency of cytosolic drug delivery using pH-responsive endosomolytic polymers does not correlate with activation of the NLRP3 inflammasome;Jessalyn J. Baljon 等;《Biomater. Sci.》;1888-1897 *

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