CN105492494B - 聚氨基酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物(例如，聚(γ‑谷氨酸)(γ‑PGA)与苯丙氨酸乙酯(PAE)的接枝共聚物(γ‑PGA‑PAE))、聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物、包含上述经过了离子化的接枝共聚物的纳米粒子、以及它们的制造方法。这样得到的纳米粒子作为用于制造疫苗的佐剂而有用。

Description

聚氨基酸的制造方法
技术领域
本发明涉及作为用于制造疫苗的佐剂而有用的、聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物(例如，聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)与苯丙氨酸乙酯(PAE)的接枝共聚物(γ-PGA-PAE))、聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物、包含上述经过了离子化的接枝共聚物的纳米粒子、以及它们的制造方法。
背景技术
近年来，已有利用纳米粒子作为药物的载体的研究(参见专利文献1及2)。
专利文献3公开了下述内容：聚氨基酸(例如，γ-PGA)、或聚氨基酸与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物(例如，γ-PGA-PAE)会促进树突细胞的分化成熟，即作为佐剂而发挥作用，以及其佐剂作用通过接枝共聚物的纳米粒子化而被增强。
另外，专利文献3的实施例1中公开了采用盐析法的γ-PGA-PAE的制造方法、以及由γ-PGA-PAE制造纳米粒子的方法，所述盐析法是在使碳二亚胺盐酸盐和PAE与γ-PGA反应之后进行脱盐的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平6-92870号公报
专利文献2：日本特开平6-256220号公报
专利文献3：国际公开第2006/112477号小册子
发明内容
发明要解决的问题
本发明要求在短时间内制造大量作为疫苗的佐剂而有用的由聚氨基酸 或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐形成的接枝共聚物的方法。
解决问题的方法
发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果，发现了一种通过在接枝共聚物的分离(isolate)中采用基于酸添加的沉淀法，从而在短期间内以高收率制造聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物的游离形式(free form)的方法。
进一步，本发明人等发现了一种通过对聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物的游离形式部分或全部地进行离子化，从而比现有技术更高效且再现性良好地获得纳米粒子的方法。通过该方法，能够进一步实现制造设备的缩小和废液的削减。另外，在聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物的游离形式的状态下，现有技术中难以实现纳米粒子化，而相对于此，通过对其部分或全部地进行离子化，容易实现纳米粒子化。
即，本发明涉及下述内容。
[1]接枝共聚物的制造方法，所述接枝共聚物是选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物，其中，该制造方法包括下述工序：
(1)使所述聚氨基酸或其盐与所述通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐缩合而得到接枝共聚物的工序；以及
(2)使工序(1)中得到的接枝共聚物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序。
[2]所述[1]所述的制造方法，其中，在工序(2)中，在0～80℃的温度下使接枝共聚物与酸作用。
[3]所述[1]所述的制造方法，其中，聚氨基酸为聚(γ-谷氨酸)。
[4]所述[1]所述的制造方法，其中，疏水性伯胺化合物为α-氨基酸衍生物。
[5]所述[4]所述的制造方法，其中，α-氨基酸衍生物为苯丙氨酸衍生物。
[6]所述[5]所述的制造方法，其中，苯丙氨酸衍生物为苯丙氨酸乙酯。
[7]根据所述[1]所述的方法制造的选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位] 所示的疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物。
[8]经过了离子化的接枝共聚物的制造方法，所述经过了离子化的接枝共聚物是选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物，其中，该制造方法包括下述工序：
使所述聚氨基酸或其盐与所述疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物与碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐、碱金属的碳酸氢盐、碱金属的磷酸盐、碱金属的磷酸一氢盐、碱金属的磷酸二氢盐、碱金属的有机酸盐、或碱金属的酸性氨基酸盐，从而对接枝共聚物进行离子化的工序。
[9]下述通式(II)所示的经过了离子化的接枝共聚物，
[化学式1]
[式中，M表示碱金属，A表示疏水性部位，n表示10～100,000的整数。3种单体单元间的斜线表示单体单元的排列顺序不规则。X表示通式(III)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式2]
Y表示通式(IV)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式3]
Z表示通式(V)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式4]
x、y及z满足下式:
[数学式1]
0≤x＜1；
0＜y＜1；
0＜z＜1；及
x+y+z＝1。]。
[10]所述[9]所述的经过了离子化的接枝共聚物，其中，通式(III)所示的单体单元的摩尔分数x为0。
[11]所述[9]所述的经过了离子化的接枝共聚物，其中，n为50～10,000。
[12]所述[9]所述的经过了离子化的接枝共聚物，其具有-15,000～0的疏水性参数K。
[13]纳米粒子的制造方法，所述纳米粒子包含选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物，其中，该制造方法包括下述工序：
对利用所述[8]所述的制造方法得到的经过了离子化的接枝共聚物进行纳米粒子化的工序。
[14]所述[13]所述的纳米粒子的制造方法，其包括下述工序：
(1)使选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐缩合的工序；
(2)使工序(1)中得到的缩合物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序；
(3)使在工序(2)中分离出的接枝共聚物与碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐、碱金属的碳酸氢盐、碱金属的磷酸盐、碱金属的磷酸一氢盐、碱金属的磷酸二氢盐、碱金属的有机酸盐、或碱金属的酸性氨基酸盐作用，从而对接枝共聚物进行离子化的工序；
(4)对工序(3)中得到的经过了离子化的接枝共聚物进行纳米粒子化的 工序。
[15]根据所述[13]的方法制造的纳米粒子，该纳米粒子包含选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物。
[16]所述[15]所述的纳米粒子，其被用作佐剂。
[17]疫苗，其包含所述[15]所述的纳米粒子。
发明的效果
根据本发明，能够比现有技术以更短时间、更高收率获得聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物。
进一步，根据本发明，能够高效且再现性良好地获得包含聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物的纳米粒子。
附图说明
[图1]图1是示出了基于本发明而得到的γ-PGA-PAE的纳米粒子作为疫苗的佐剂而具有优异的性能的图谱。
具体实施方式
本发明的第1方式涉及接枝共聚物及其制造方法，所述接枝共聚物是选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物。
基于本发明的第1方式的接枝共聚物的制造方法包括以下工序：
(1)使上述聚氨基酸或其盐与上述通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐缩合而得到接枝共聚物的工序；及
(2)使工序(1)中得到的接枝共聚物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序。
本说明书中，所述“聚氨基酸”表示由多个氨基酸键合而成的氨基酸链。
作为构成聚氨基酸的氨基酸，可列举：谷氨酸(例、α-谷氨酸、γ-谷氨酸)、天冬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸等。
另外，聚氨基酸中的构成氨基酸可以是L-型，也可以是D-型，还可以 是其混合物。
聚氨基酸中的构成氨基酸的键可以是肽键、酯键或醚键这样的肽键以外的键、或戊二醛或二异氰酸酯这样的借助接头(linker)的键，但一般而言为肽键。
在优选的实施方式中，聚氨基酸的数均分子量为1～20,000kDa、优选为20kDa～3,000kDa。需要说明的是，本说明书中的所述分子量可以是相对分子量，也可以是绝对分子量。例如，相对分子量表示利用在以下所示的SEC-HPLC测定中的分子量测定法而得到的数值；TSKgelα-M 300X7.8mm I.D.(dual),5mM NaNO3 DMSO:H2O(9:1),0.8mL/分,40℃,RI检测器,标准：普鲁兰(pullulan)(Shodex)。绝对分子量表示利用以下所示的SEC-HPLC条件下的分子量测定法而得到的数值；TSKgelGMPWXL,300X7.8mm I.D.(dual),0.1M NaNO3,0.8mL/min,40℃,RI检测器,粘度计,利用DLS检测器、SLS检测器同时检测。
作为聚氨基酸的具体例，可列举聚(γ-谷氨酸)、聚(α-天冬氨酸)、聚(ε-赖氨酸)、聚(α-谷氨酸)、聚(α-赖氨酸)，其中，优选聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)、及聚(α-天冬氨酸)。最优选聚(γ-谷氨酸)。
作为可在本发明中使用的聚氨基酸的盐，可列举例如：金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或酸性氨基酸形成的盐等。作为金属盐的优选例，可列举例如：钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐、钡盐等碱土金属盐；铝盐等。作为与有机碱形成的盐的优选例，可列举例如：与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己胺、N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基吗啉、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)等形成的盐。作为与无机酸形成的盐的优选例，可列举例如：与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。作为与有机酸形成的盐的优选例，可列举例如：与甲酸、乙酸、三氟乙酸、苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、乳酸、苯甲酸等形成的盐。作为与碱性氨基酸形成的盐的优选例，可列举例如：与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐，作为与酸性氨基酸形成的盐的优选例，可列举例如：与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。其中，优选药理学上可接受的盐，其中可列举钠盐、钾盐、锂盐等，特别优选钠盐。
本说明书中，在通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物中，代表“疏水性部位”的A-表示：具有苯环等芳环基团的衍生物、具有C3-8的碳链的衍生物、具有C8-22的直链脂肪链的衍生物、R1-(CHR2)-所示的衍生物、R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物。
作为以上述A-表示的“具有芳环基团的衍生物”，可列举例如：任选具有取代基的C6-14芳基(例如，苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基)、任选具有取代基的C7-16芳烷基(例如，苄基、苯乙基、萘甲基、苯丙基)、及任选具有取代基的芳香族杂环基等。
作为以上述A-表示的“任选具有取代基的芳香族杂环基”的芳香族杂环基，可列举例如：作为成环原子除了碳原子以外还含有选自氮原子、硫原子及氧原子中的1～4个杂原子的5～14元(优选为5～10元)的芳香族杂环基。
作为该“芳香族杂环基”的优选例，可列举：噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基等5～6元单环式芳香族杂环基；
苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并唑基、苯并异唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡嗪基、咪唑并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、吡唑并三嗪基、萘并[2,3-b]噻吩基、吩噻基、吲哚基、异吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基等8～14元稠合多环式(优选为2或3环式)芳香族杂环基。
以上述A-表示的“任选具有取代基的C6-14芳基”的能够取代的位置上的取代基数例如为1～5个、优选为1～3个。取代基数为2个以上的情况下，各取代基可以相同也可以不同。
作为该取代基，可以从任选被卤化的C1-6烷基(例如，甲基、氯甲基、二氟甲基、三氯甲基、三氟甲基、乙基、2-溴乙基、2,2,2-三氟乙基、四氟乙基、五氟乙基、丙基、2,2-二氟丙基、3,3,3-三氟丙基、异丙基、丁基、4,4,4-三氟丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、5,5,5-三氟 戊基、己基、6,6,6-三氟己基)、C6-14芳基(例如，苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基)、C7-16芳烷基(例如，苄基、苯乙基、萘甲基、苯丙基)、以及下述的取代基组a中选择。
[取代基组a]
(1)卤原子(例如，氟、氯、溴、碘)、
(2)硝基、
(3)氰基、
(4)羟基
(5)任选被卤化的C1-6烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基)、
(6)C6-14芳氧基(例如，苯氧基、萘氧基)、
(7)C7-16芳烷氧基(例如，苄氧基)、
(8)5～14元芳香族杂环氧基(例如，吡啶氧基)、
(9)3～14元非芳香族杂环氧基(例如，吗啉氧基、哌啶氧基)、
(10)C1-6烷基-羰氧基(例如，乙酰氧基、丙酰氧基)、
(11)C6-14芳基-羰氧基(例如，苯甲酰氧基、1-萘甲酰氧基、2-萘甲酰氧基)、
(12)C1-6烷氧基-羰氧基(例如，甲氧基羰氧基、乙氧基羰氧基、丙氧基羰氧基、丁氧基羰氧基)、
(13)单或二C1-6烷基-氨基甲酰氧基(例如，甲基氨基甲酰氧基、乙基氨基甲酰氧基、二甲基氨基甲酰氧基、二乙基氨基甲酰氧基)、
(14)C6-14芳基-氨基甲酰氧基(例如，苯基氨基甲酰氧基、萘基氨基甲酰氧基)、
(15)5～14元芳香族杂环羰氧基(例如，烟酰氧基)、
(16)3～14元非芳香族杂环羰氧基(例如，吗啉基羰氧基、哌啶基羰氧基)、
(17)任选被卤化的C1-6烷基磺酰氧基(例如，甲基磺酰氧基、三氟甲基磺酰氧基)、
(18)任选被C1-6烷基取代的C6-14芳基磺酰氧基(例如，苯基磺酰氧基、甲苯磺酰氧基)、
(19)任选被卤化的C1-6烷硫基(例如，甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基、戊硫基、己硫基)、
(20)5～14元芳香族杂环基(可列举例如：噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基等5～6元单环式芳香族杂环基；
苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并唑基、苯并异唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡嗪基、咪唑并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、吡唑并三嗪基、萘并[2,3-b]噻吩基、吩噻基、吲哚基、异吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基等8～14元稠合多环式(优选为2或3环式)芳香族杂环基。)、
(21)3～14元非芳香族杂环基(可列举例如：氮杂环丙基、环氧乙基、硫杂环丙基(thiiranyl)、氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、四氢噻吩基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、唑啉基、唑烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、四氢异噻唑基、四氢唑基、四氢异唑基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、二氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢哒嗪基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、硫代吗啉基、氮杂环庚基、二氮杂环庚基、氮杂基、氧杂环庚基、氮杂环辛基、二氮杂环辛基等3～8元单环式非芳香族杂环基；
二氢苯并呋喃基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并唑基、二氢苯并噻唑基、二氢苯并异噻唑基、二氢萘并[2,3-b]噻吩基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、4H-喹嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢噻吩并[2,3-c]吡啶基、四氢苯并氮杂基、四氢喹喔啉基、四氢菲啶基、六氢吩噻嗪基、六氢吩嗪基、四氢酞嗪基、四氢萘啶基、四氢喹唑啉基、四氢噌啉基、四氢咔唑基、四氢-β-咔啉基、四氢吖啶基、四氢吩嗪基、四氢噻吨基、八氢异喹啉基等9～14元稠合多环式(优选为2或3环式)非芳香族杂环基。)、
(22)任选被卤化的C1-6烷基-羰基(例如，乙酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基)、
(23)C6-14芳基-羰基(例如，苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲酰基)、
(24)5～14元芳香族杂环羰基(例如，烟酰基、异烟酰基、噻吩甲酰基、呋喃甲酰基)、
(25)3～14元非芳香族杂环羰基(例如，吗啉基羰基、哌啶基羰基、吡咯烷基羰基)、
(26)C1-6烷氧基-羰基(例如，甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、异丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、戊氧基羰基、己氧基羰基)、
(27)C6-14芳氧基-羰基(例如，苯氧基羰基、1-萘氧基羰基、2-萘氧基羰基)、
(28)C7-16芳烷氧基-羰基(例如，苄氧基羰基、苯乙氧基羰基)、
(29)羧基
(30)氨基甲酰基、
(31)单或二C1-6烷基-氨基甲酰基(例如，甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰基)、
(32)C6-14芳基-氨基甲酰基(例如，苯基氨基甲酰基)、
(33)5～14元芳香族杂环氨基甲酰基(例如，吡啶基氨基甲酰基、噻吩基氨基甲酰基)、
(34)3～14元非芳香族杂环氨基甲酰基(例如，吗啉基氨基甲酰基、哌啶基氨基甲酰基)、
(35)任选被卤化的C1-6烷基磺酰基(甲基磺酰基、二氟甲基磺酰基、三氟甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、异丙基磺酰基、丁基磺酰基、4,4,4-三氟丁基磺酰基、戊基磺酰基、己基磺酰基)、
(36)C6-14芳基磺酰基(例如，苯基磺酰基、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基)、
(37)5～14元芳香族杂环磺酰基(例如，吡啶基磺酰基、噻吩基磺酰基)、
(38)任选被卤化的C1-6烷基亚磺酰基(例如，甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基)、
(39)C6-14芳基亚磺酰基(例如，苯基亚磺酰基、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基)、
(40)5～14元芳香族杂环亚磺酰基(例如，吡啶基亚磺酰基、噻吩基亚磺酰基)、
(41)单或二C1-6烷基氨基(例如，甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异 丙基氨基、丁基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基、N-乙基-N-甲基氨基)、
(42)单或二C6-14芳基氨基(例如，苯基氨基)、
(43)5～14元芳香族杂环氨基(例如，吡啶基氨基)、
(44)C7-16芳烷基氨基(例如，苄基氨基)、
(45)甲酰基氨基、
(46)C1-6烷基-羰基氨基(例如，乙酰基氨基、丙酰基氨基、丁酰基氨基)、
(47)(C1-6烷基)(C1-6烷基-羰基)氨基(例如，N-乙酰基-N-甲基氨基)、
(48)C6-14芳基-羰基氨基(例如，苯基羰基氨基、萘基羰基氨基)、
(49)C1-6烷氧基-羰基氨基(例如，甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、丙氧基羰基氨基、丁氧基羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基)、
(50)C7-16芳烷氧基-羰基氨基(例如，苄氧基羰基氨基)、
(51)C1-6烷基磺酰基氨基(例如，甲基磺酰基氨基、乙基磺酰基氨基)、
(52)任选被C1-6烷基取代的C6-14芳基磺酰基氨基(例如，苯基磺酰基氨基、甲苯磺酰基氨基)、
(53)氨基
(54)C2-6烯基(例如，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、5-己烯基)、
(55)C2-6炔基(例如，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、4-甲基-2-戊炔基)、
(56)C3-10环烷基(例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.2.1]辛基、金刚烷基)、
(57)C3-10环烯基(例如，环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、
(58)C1-6环烷氧基-羰基(例如，环戊氧基)
(59)C7-16芳烷硫基(例如，S-苄硫基)
(60)巯基、
(61)磺基、以及
(62)胍基。
以上述A-表示的“任选具有取代基的C7-16芳烷基”的能够取代的位置上的取代基数例如为1～5个、优选为1～3个。取代基数为2个以上的情况下，各取代基可以相同也可以不同。
作为该取代基，可以从上述的取代基组a中选择。
以上述A-表示的“任选具有取代基的芳香族杂环”的能够取代的位置上的取代基数例如为1～5个、优选为1～3个。取代基数为2个以上的情况下，各取代基可以相同也可以不同。
作为该取代基，可以从任选被卤化的C1-6烷基(例如，甲基、氯甲基、二氟甲基、三氯甲基、三氟甲基、乙基、2-溴乙基、2,2,2-三氟乙基、四氟乙基、五氟乙基、丙基、2,2-二氟丙基、3,3,3-三氟丙基、异丙基、丁基、4,4,4-三氟丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、5,5,5-三氟戊基、己基、6,6,6-三氟己基)、C6-14芳基(例如，苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基)、C7-16芳烷基(例如，苄基、苯乙基、萘甲基、苯丙基)、以及上述的取代基组a中选择。
作为以上述A-表示的“具有C3-8的碳链的衍生物”，可列举例如：任选具有取代基的C3-8烷基(例如，丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、庚基、辛基)、及C3-10环烷基(例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.2.1]辛基、金刚烷基)等。
作为以上述A-表示的“任选具有取代基的C3-8烷基”的“C3-8烷基”，优选为丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基。
以上述A-表示的“任选具有取代基的C3-8烷基”的能够取代的位置上的取代基数例如为1～5个、优选为1～3个。取代基数为2个以上的情况下，各取代基可以相同也可以不同。
作为该取代基，可以从C6-14芳基(例如，苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基)、以及上述的取代基组a中选择。
作为以上述A-表示的“任选具有取代基的C3-8烷基”的取代基，优选为羟基、巯基、氨基、C6-14芳基、C7-16芳烷硫基、胍基、任选被卤化的C1-6烷硫基、C1-6烷氧基-羰基、C1-6环烷氧基-羰基、C7-16芳烷氧基-羰基、羧基、氨基甲酰基。
作为以上述A-表示的“具有C8-22的直链脂肪链的衍生物”，可列举例如：直链C8-22烷基(例如，辛基、壬基、癸基、十一碳烷基、十二碳烷基、十三碳烷基、十四碳烷基、十五碳烷基、十六碳烷基、十七碳烷基、十八碳烷基、十九碳烷基、二十碳烷基、二十一碳烷基、二十二碳烷基)等。
作为上述“R1-(CHR2)-所示的衍生物”的R1，可以从氢原子、或下述的取代基组b中选择。
[取代基组b]
(1)卤原子、
(2)氰基、
(3)羟基、
(4)任选具有取代基的C1-6烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基)、
(5)任选具有取代基的C6-14芳氧基(例如，苯氧基、萘氧基)、
(6)任选具有取代基的C7-16芳烷氧基(例如，苄氧基)、
(7)任选具有取代基的C1-6烷基-羰氧基(例如，乙酰氧基、丙酰氧基)、
(8)任选具有取代基的C1-6烷基-羰基(例如，乙酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基)、
(9)任选具有取代基的C6-14芳基-羰基(例如，苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲酰基)、
(10)任选具有取代基的5～14元芳香族杂环羰基(例如，烟酰基、异烟酰基、噻吩甲酰基、呋喃甲酰基)、
(11)任选具有取代基的3～14元非芳香族杂环羰基(例如，吗啉基羰基、哌啶基羰基、吡咯烷基羰基)、
(12)任选具有取代基的C1-6烷氧基-羰基(例如，甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、异丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、戊氧基羰基、己氧基羰基)、
(13)任选具有取代基的C6-14芳氧基-羰基(例如，苯氧基羰基、1-萘氧基羰基、2-萘氧基羰基)、
(14)任选具有取代基的C7-16芳烷氧基-羰基(例如，苄氧基羰基、苯乙氧基羰基)、
(15)羧基、
(16)氨基甲酰基、
(17)任选具有取代基的单或二C1-6烷基-氨基甲酰基(例如，甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰基)、
(18)任选具有取代基的C6-14芳基-氨基甲酰基(例如，苯基氨基甲酰基)、
(19)任选具有取代基的C1-6烷硫基(例如，甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基、戊硫基、己硫基)、
(20)任选具有取代基的C1-6烷基磺酰基(甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、异丙基磺酰基、丁基磺酰基、戊基磺酰基、己基磺酰基)、
(21)任选具有取代基的C1-6烷基亚磺酰基(例如，甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基)、
(22)任选具有取代基的单或二C1-6烷基氨基(例如，甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基、N-乙基-N-甲基氨基)、
(23)任选具有取代基的单或二C6-14芳基氨基(例如，苯基氨基)、
(24)任选具有取代基的C1-6烷基-羰基氨基(例如，乙酰基氨基、丙酰基氨基、丁酰基氨基)、
(25)任选具有取代基的C6-14芳基-羰基氨基(例如，苯基羰基氨基、萘基羰基氨基)、
(26)任选具有取代基的C1-6烷氧基-羰基氨基(例如，甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、丙氧基羰基氨基、丁氧基羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基)、
(27)任选具有取代基的C7-16芳烷氧基-羰基氨基(例如，苄氧基羰基氨基)、
(28)任选具有取代基的5～14元芳香族杂环基(可列举例如：噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基等5～6元单环式芳香族杂环基；
苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并唑基、苯并异唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、唑并吡啶基、噻唑并吡啶 基、咪唑并吡嗪基、咪唑并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、吡唑并三嗪基、萘并[2,3-b]噻吩基、吩噻基、吲哚基、异吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基等8～14元稠合多环式(优选为2或3环式)芳香族杂环基。)、
(29)任选具有取代基的C6-14芳基(例如，苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基)、
(30)C7-16芳烷硫基(例如，S-苄硫基)
(31)磺基、及
(32)巯基。
上述[取代基组b]中的任选具有取代基的C1-6烷氧基、任选具有取代基的C6-14芳氧基、任选具有取代基的C7-16芳烷氧基、任选具有取代基的C1-6烷基-羰氧基、任选具有取代基的C1-6烷基-羰基、任选具有取代基的C6-14芳基-羰基、任选具有取代基的5～14元芳香族杂环羰基、任选具有取代基的3～14元非芳香族杂环羰基、任选具有取代基的C1-6烷氧基-羰基、任选具有取代基的C6-14芳氧基-羰基、任选具有取代基的C7-16芳烷氧基-羰基、任选具有取代基的单或二C1-6烷基-氨基甲酰基、任选具有取代基的C6-14芳基-氨基甲酰基、任选具有取代基的C1-6烷硫基、任选具有取代基的C1-6烷基磺酰基、任选具有取代基的C1-6烷基亚磺酰基、任选具有取代基的单或二C1-6烷基氨基、任选具有取代基的单或二C6-14芳基氨基、任选具有取代基的C1-6烷基-羰基氨基、任选具有取代基的C6-14芳基-羰基氨基、任选具有取代基的C1-6烷氧基-羰基氨基、任选具有取代基的C7-16芳烷氧基-羰基氨基、任选具有取代基的5～14元芳香族杂环基、及任选具有取代基的C6-14芳基中的各个取代基，分别可以从上述的取代基组a中选择。
作为上述的“R1-(CHR2)-所示的衍生物”的R1，优选为氢原子、及任选具有取代基的C6-14芳基，进一步优选为苯基。
作为上述的“R1-(CHR2)-所示的衍生物”的R2，可以从下述的取代基组c中选择。
[取代基组c]
(1)C1-6烷氧基-羰基(例如，甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异 丙氧基羰基、丁氧基羰基、异丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、戊氧基羰基、己氧基羰基)、
(2)C1-6环烷氧基-羰基(例如，环戊氧基)
(3)C6-14芳氧基-羰基(例如，苯氧基羰基、1-萘氧基羰基、2-萘氧基羰基)、
(4)C7-16芳烷氧基-羰基(例如，苄氧基羰基、苯乙氧基羰基)、
(5)羧基、
(6)氨基甲酰基、
(7)单或二C1-6烷基-氨基甲酰基(例如，甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰基)、及
(8)C6-14芳基-氨基甲酰基(例如，苯基氨基甲酰基)。
作为上述的“R1-(CHR2)-所示的衍生物”的R2，优选为C1-6烷氧基-羰基、C1-6环烷氧基-羰基、C7-16芳烷氧基-羰基、羧基、氨基甲酰基，更优选为C1-6烷氧基-羰基，最优选为乙氧基羰基。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R3，可以从氢原子、或上述的取代基组b中选择。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R3，优选为氢原子、羟基、巯基、氨基、任选具有取代基的5～14元芳香族杂环基、C7-16芳烷硫基、及任选具有取代基的C6-14芳基，进一步优选为氢原子、羟基、巯基、氨基、任选具有取代基的咪唑基、任选具有取代基的吲哚基、S-苄硫基、及任选具有取代基的苯基，尤其优选吲哚基、S-苄硫基及任选具有取代基的苯基。最优选为苯基。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R4及R5，可以独立地从氢原子、或上述的取代基组a中选择。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R4及R5，优选为氢原子。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R6，可以从氢原子、或下述的取代基组d中选择。
[取代基组d]
(1)羟基、
(2)任选被卤化的C1-6烷基(例如，甲基、氯甲基、二氟甲基、三氯甲基、 三氟甲基、乙基、2-溴乙基、2,2,2-三氟乙基、四氟乙基、五氟乙基、丙基、2,2-二氟丙基、3,3,3-三氟丙基、异丙基、丁基、4,4,4-三氟丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、5,5,5-三氟戊基、己基、6,6,6-三氟己基)、
(3)C3-10环烷基(例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.2.1]辛基、金刚烷基)、
(4)任选具有取代基的5～14元芳香族杂环基(可列举例如：噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基等5～6元单环式芳香族杂环基；
苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并唑基、苯并异唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡嗪基、咪唑并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、吡唑并三嗪基、萘并[2,3-b]噻吩基、吩噻基、吲哚基、异吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基等8～14元稠合多环式(优选为2或3环式)芳香族杂环基。)、以及
(5)任选具有取代基的C6-14芳基(例如，苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基)。
上述的[取代基组d]中的任选具有取代基的5～14元芳香族杂环基、及任选具有取代基的C6-14芳基中的各个取代基，可以分别从上述的取代基组a中选择。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R6，优选为氢原子及甲基，最优选为氢原子。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R7，可以从上述的取代基组c中选择。
作为上述的“R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物”的R7，优选为C1-6烷氧基-羰基、C1-6环烷氧基-羰基、C7-16芳烷氧基-羰基、羧基、氨基甲酰基，更 优选为C1-6烷氧基-羰基，最优选为乙氧基羰基。
上述的“A-”中，优选为具有C3-8的碳链的衍生物、R1-(CHR2)-所示的衍生物、及R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物，进一步优选为R3-(CR4R5)-(CR6R7)-所示的衍生物。
作为通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物，优选为任选具有取代基的α-氨基酸衍生物。其氨基酸可以是L-型，也可以是D-型，还可以是其混合物。
作为可在本发明中使用的“任选具有取代基的α-氨基酸”的“α-氨基酸”，可列举例如：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、2-氨基丙二酸、2-氨基己二酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、5-甲基色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、别异亮氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、γ-甲基亮氨酸、苯基甘氨酸、2-氨基丁酸、半胱磺酸、高半胱磺酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩基甘氨酸、3-噻吩基甘氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-联苯丙氨酸、五甲基苯丙氨酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、1-氨基环丁烷-1-羧酸、1-氨基环戊烷-1-羧酸、1-氨基环己烷-1-羧酸、1-氨基环庚烷-1-羧酸等。优选为苯丙氨酸、苯基甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸。特别优选为苯丙氨酸。
可在本发明中使用的“α-氨基酸”也可以在能够取代的位置具有1～3个取代基。作为该取代基，可列举：卤原子、硝基、任选被1～3个卤原子取代的C1-6烷基、任选被1～3个卤原子取代的C7-13芳烷基(例如，苄基)、C1-6烷氧基等。
本说明书中，所述“衍生物”是指，通过利用官能团的导入、氧化、还原、原子的取代等使某化合物的分子内的小部分发生改变而生成的化合物及特性基，作为具体例，可列举例如：某化合物的羧酸、C1-18烷基酯、C6-18芳香族酯、C3-18环烷基酯、C1-18烷基单取代酰胺、C1-18烷基二取代酰胺、无取代酰胺等。作为其C1-18烷基取代基的例子，可列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基甲基、环丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、2,3-二甲基丙基、3,3-二甲基丙基、环丙基乙基、环丁基甲基、环丙基、正己基、正庚基、正 辛基、正壬基、正癸基、正十六碳烷基、正十八碳烷基等。
另外，还可以被氟、氯、溴、碘等卤原子或硝基等取代。
作为可在本发明中使用的“衍生物”，优选为C1-18烷基酯。
作为α-氨基酸衍生物，优选为苯丙氨酸衍生物，更优选为苯丙氨酸烷基酯，特别优选为苯丙氨酸乙酯。上述氨基酸衍生物可以是L-型，也可以是D-型，还可以是其混合物。
作为通式(I)所示的疏水性伯胺化合物的盐，可列举与作为上述聚氨基酸的盐而例示的盐相同的盐。
本说明书中所述“接枝共聚物”，指的是下述的通式(VI)所示的接枝共聚物。
[化学式5]
[式中，M表示碱金属，A表示疏水性部位，n表示10～100,000的整数。3种单体单元间的斜线表示单体单元的排列顺序不规则。x表示通式(III)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式6]
y表示通式(IV)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式7]
z表示通式(V)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式8]
x、y及z满足下式：
[数学式2]
0≤x＜1；
0≤y＜1；
0＜z＜1；及
x+y+z＝1。]
工序(1)中的通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐的使用量相对于聚氨基酸，通常为0.01～5当量、优选为0.1～1.5当量。
作为可在工序(1)中使用的缩合剂，可列举被用于通常的肽合成的缩合剂，可列举例如：水溶性碳二亚胺盐酸盐[例：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐](WSC-HCl)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉鎓n水合物(DMT-MM)、四氟硼酸N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺)脲鎓(TSTU)、四氟硼酸2-(5-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(TNTU)等。
工序(1)中的缩合剂的使用量相对于聚氨基酸，通常为0.01～5当量、优选为0.1～1.5当量。
上述工序(1)在不会对反应造成影响的溶剂中进行。作为这样的溶剂，可列举例如：水、或以下所示的有机溶剂和水的混合液等。作为该有机溶剂的例子，可列举：C1-3醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇)、二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙腈等极性高的非质子性溶剂等。
聚氨基酸为游离形式的情况下，在工序(1)中加入碱或其盐。作为在此使用的碱，可列举碱金属盐、碳酸盐、碳酸氢盐、有机碱等。
使用碱金属盐作为工序(1)中的碱的情况下，作为其例子，可列举氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等，优选氢氧化钠。
使用碳酸盐作为工序(1)中的碱的情况下，作为其例子，可列举碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾等，优选碳酸钠。
使用碳酸氢盐作为工序(1)中的碱的情况下，作为其例子，可列举例如碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾等，优选碳酸氢钠。
使用有机碱作为工序(1)中的碱的情况下，可以根据需要而使用例如三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、三乙醇胺、N-甲基吗啉、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。
工序(1)中的碱或其盐的使用量，相对于聚氨基酸，通常为0.01～100当量，优选为0.3～10当量、进一步优选为0.5～1.5当量。
聚氨基酸为上述所示的盐、钠盐的情况下，可以直接用于反应。
工序(1)的反应温度通常为-30～80℃，优选为-5～45℃、进一步优选为-5～30℃。
工序(1)的反应时间通常为0.5小时～7日，优选为1小时～2日。
对于工序(1)中得到的接枝共聚物，可以采取浓缩、提取、色谱法、超滤、离心浓缩等本身公知的精制方法，或者，也可以直接用于其后的工序。
工序(2)中，所述“与酸作用”是指，通过添加酸而将接枝共聚物所含的经过了去质子化的羧基(-COO-)进行质子化，从而使其成为羧基(-COOH)的状态。
作为可在工序(2)中使用的酸，可列举：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等无机酸、或甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、乳酸、苯甲酸等有机酸等，其中，优选盐酸、氢溴酸、或乙酸。
工序(2)通常在不会对反应造成影响的溶剂中进行。作为这样的溶剂，可列举例如：水、或以下所示的有机溶剂和水的混合液等。作为该有机溶剂的例子，可列举：C1-3醇、或二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙腈等极性高的非质子性溶剂等。或者，工序(2)也可以在无溶剂的条件下进行。
工序(2)的反应温度通常为-5～80℃，优选为-5～30℃。
在另外的优选实施方式中，工序(2)的反应温度为0～80℃。
只要在上述温度范围内，本反应也可以在升温条件或降温条件下进行。
本反应的反应温度进一步优选为40～70℃。
本说明书中的所述“室温”，只要没有特别说明则为1～30℃。
工序(2)的反应时间通常为0.5小时～7日，优选为1小时～2日。
在优选的实施方式中，优选使用盐酸、于60℃进行反应。
在上述方法中，通式(I)所示的疏水性伯胺化合物相对于聚氨基酸的导入率优选为1～99％、进一步优选为5～85％。
作为聚氨基酸，优选聚(γ-谷氨酸)。
作为通式(I)所示的疏水性伯胺化合物，优选为α-氨基酸衍生物，其中，优选为苯丙氨酸衍生物，尤其优选为苯丙氨酸乙酯。
这样地得到的接枝共聚物的数均分子量为1～2000kDa、优选为10～1000kDa。
本发明的第2方面涉及选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物、及其制造方法。
基于本发明的第2方面的经过了离子化的接枝共聚物的制造方法包括以下工序：
使上述聚氨基酸或其盐和上述疏水性伯胺化合物或其盐形成的接枝共聚物与碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐、碱金属的碳酸氢盐、碱金属的磷酸盐、碱金属的磷酸一氢盐、碱金属的磷酸二氢盐、碱金属的有机酸盐、或碱金属的酸性氨基酸盐作用，从而对接枝共聚物进行离子化的工序。
上述工序中成为原料的聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物，可以基于前述的制造聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物的方法、或专利文献3中记载的方法来制造。
作为聚氨基酸或其盐，优选聚(γ-谷氨酸)。
作为通式(I)所示的疏水性伯胺化合物，优选α-氨基酸衍生物，其中，优选苯丙氨酸衍生物，尤其优选苯丙氨酸乙酯。
在该工序中，所述“与碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐、碱金属的碳酸氢盐、碱金属的磷酸盐、碱金属的磷酸一氢盐、碱金属的磷酸二氢盐、碱金属的有机酸盐、或碱金属的酸性氨基酸盐作用”是指，对接枝共聚物所含的羧基(-COOH)进行去质子化，从而使其成为经过了去质子化的羧基(-COO-)的状态。
作为可在该工序中使用的碱金属的氢氧化物，可列举例如：氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等，优选氢氧化钠、氢氧化钾。更优选氢氧化钾。
该工序中的碱金属的氢氧化物的使用量相对于接枝共聚物，通常为 0.001～10当量。
作为可在该工序中使用的碱金属的碳酸盐，可列举例如：碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾等，优选碳酸钠、碳酸钾。更优选碳酸钾。
该工序中的碱金属的碳酸盐的使用量相对于接枝共聚物，通常为0.001～10当量。
作为可在该工序中使用的碱金属的碳酸氢盐，可列举例如：碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾等，优选碳酸氢钠、碳酸氢钾。更优选碳酸氢钾。
该工序中的碱金属的碳酸氢盐的使用量相对于接枝共聚物，为0.001～10当量。
作为可在该工序中使用的碱金属的磷酸盐，可列举例如：磷酸锂、磷酸钠、磷酸钾等，优选磷酸钠、磷酸钾。更优选磷酸钾。
该工序中的碱金属的磷酸盐的使用量相对于接枝共聚物，通常为0.001～10当量。
作为可在该工序中使用的碱金属的磷酸一氢盐，可列举例如：磷酸一氢锂、磷酸一氢钠、磷酸一氢钾等，优选磷酸一氢钠、磷酸一氢钾。更优选磷酸一氢钾。
该工序中的碱金属的磷酸一氢盐的使用量相对于接枝共聚物，通常为0.001～10当量。
作为可在该工序中使用的碱金属的磷酸二氢盐，可列举例如：磷酸二氢锂、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等，优选磷酸二氢钠、磷酸二氢钾。更优选磷酸二氢钾。
该工序中的碱金属的磷酸二氢盐的使用量相对于接枝共聚物，通常为0.001～10当量。
作为可在该工序中使用的碱金属的有机酸盐中使用的“有机酸盐”，可列举：与甲酸、乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯甲酸等形成的盐。其中，优选乳酸、乙酸、柠檬酸、苯甲酸，更优选乳酸、乙酸、苯甲酸。
作为可在该工序中使用的碱金属的有机酸盐，可列举例如：甲酸锂、乙酸锂、富马酸锂、草酸锂、酒石酸锂、马来酸锂、乳酸锂、柠檬酸锂、琥珀酸锂、苹果酸锂、苯甲酸锂、甲酸钠、乙酸钠、富马酸钠、草酸钠、酒石酸钠、马来酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、苹果酸钠、苯甲酸钠、甲酸 钾、乙酸钾、富马酸钾、草酸钾、酒石酸钾、马来酸钾、乳酸钾、柠檬酸钾、琥珀酸钾、苹果酸钾、苯甲酸钾等。优选为乳酸钠、乙酸钠、苯甲酸钠、乳酸钾、乙酸钾、苯甲酸钾，其中优选乳酸钾、乙酸钾、苯甲酸钾。
该工序中的碱金属的有机酸盐的使用量相对于接枝共聚物，通常为0.001～10当量。
作为可在该工序中使用的碱金属的酸性氨基酸盐中使用的“酸性氨基酸”，可列举天冬氨酸、谷氨酸等。其中优选天冬氨酸。
作为可在该工序中使用的碱金属的酸性氨基酸盐，可列举例如：天冬氨酸锂、谷氨酸锂、天冬氨酸钠、谷氨酸钠、天冬氨酸钾、谷氨酸钾等。优选为天冬氨酸钠、天冬氨酸钾。更优选为天冬氨酸钾。
该工序中的碱金属的酸性氨基酸盐的使用量相对于接枝共聚物，通常为0.001～10当量。
上述工序在不会对反应造成影响的溶剂中进行。作为这样的溶剂，可列举例如：水、或以下所示的有机溶剂和水的混合液等。作为该有机溶剂的例子，可列举：C1-3醇、二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙腈等极性高的非质子性溶剂、或丙酮、吡啶、乙酸甲酯等。
该工序的反应温度通常为-30～80℃，优选为-5～45℃、进一步优选为-5～30℃。
该工序的反应时间通常为0.1小时～7日，优选为0.5小时～2日。
这样地得到的经过了离子化的接枝共聚物的数均分子量为1～2,000kDa，优选为10～1,000kDa。
作为利用上述的方法制造的本发明的经过了离子化的接枝共聚物的例子，可列举通式(II)所示的经过了离子化的接枝共聚物。
[化学式9]
[式中，M表示碱金属，A表示疏水性部位，n表示10～100,000的整数。 3种单体单元间的斜线表示单体单元的排列顺序不规则。x表示通式(III)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式10]
y表示通式(IV)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式11]
z表示通式(V)所示的单体单元的摩尔分数，
[化学式12]
x、y及z满足下式：
[数学式3]
0≤x＜1；
0＜y＜1；
0＜z＜1；及
x+y+z＝1。]
在通式(IV)所示的单体单元中，作为M所示的碱金属，可列举锂、钠、钾等，其中，优选为钠、钾，最优选钾。
在通式(V)所示的单体单元中，作为A所示的疏水性部位，可列举与在上述通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物中以A表示的“疏水性部位”同样的部位。在通式(V)所示的单体单元中，作为-NH-A[式中，A表示疏水性部位]的具体例，可列举任选具有取代基的α-氨基酸衍生物。作为该“α-氨基酸衍生物”，优选为苯丙氨酸衍生物，更优选为苯丙氨酸烷基酯衍生物、特别优选为苯丙氨酸乙酯衍生物。该“氨基酸衍生物”可以是L-型，也可以是D-型，还可以是其混合物。
在上述通式(II)中，通式(III)所示的单体单元的摩尔分数x优选为0.01～0.99，更优选为0.15～0.95。
在上述通式(II)中，通式(IV)所示的单体单元的摩尔分数y优选为0.02～0.6，更优选为0.05～0.5。
在上述通式(II)中，通式(V)所示的单体单元的摩尔分数z优选为0.01～0.99，更优选为0.05～0.85。
在上述通式(II)中，x、y、z分别可以在上述的优选范围内取任意的数值，但x+y+z不超过1。
为了用于作为本发明的第3方面的纳米粒子的制造，经过了离子化的共聚物优选相应于接枝共聚物中的单体单元的总数和疏水性部位A的结构而具有适度的水溶性和适度的疏水性的平衡。
本说明书中的n表示接枝共聚物中的单体单元的总数。
在优选的实施方式中，n为50～10,000、进一步优选为100～2,000。
本说明书中的所述“疏水性参数K”，相当于使用1-辛醇和水作为溶剂时的辛醇/水分配系数，在本说明书中，记作Log Pow。
作为实际测量Log Pow的方法，可列举例如JIS-Z7260-107。但对于本发明的经过了离子化的聚氨基酸的接枝共聚物的情况而言，在测定浓度时由于难溶性而难以测定，因此可以采取对分配后的有机层及水层分别进行水解，从而对各自的氨基酸单体的浓度进行定量的方法。
作为“疏水性参数K”，也可以使用基于从化学结构出发的计算法即CLOGP法而得到的计算值来代替Log Pow的实测值。通过CLOGP法而计算出的“疏水性参数K”在本说明书中被记作CLOGP。
在优选的实施方式中，疏水性参数K为-15,000～0、进一步优选为-3,000～0。
本发明的第3方面进一步涉及纳米粒子及其制造方法，所述纳米粒子包含选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物。
基于本发明的第3方面的纳米粒子的制造方法包括以下工序：
(1)使选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)中的聚氨基酸或 其盐与通式(I):A-NH2[式中，A表示疏水性部位]所示的疏水性伯胺化合物或其盐进行缩合的工序；
(2)使工序(1)中得到的缩合物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序；
(3)使在工序(2)中分离出的接枝共聚物与碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐、或碱金属的碳酸氢盐作用，从而对接枝共聚物进行离子化的工序；
(4)对工序(3)中得到的经过了离子化的接枝共聚物进行纳米粒子化的工序。
上述工序(1)～(2)可以按照前述的聚氨基酸或其盐与通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物的制造方法来进行。
上述工序(3)可以按照前述的聚氨基酸或其盐与通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物的制造方法来进行。
上述工序(4)的对经过了离子化的接枝共聚物进行纳米粒子化的方法可以基于专利文献3中记载的方法来进行。例如，在采用沉淀法的情况下，可以通过预先将上述工序(3)中得到的经过了离子化的接枝共聚物溶解于良溶剂、再将其与不良溶剂混合来进行纳米粒子化。
作为“良溶剂”，可使用例如：二甲亚砜、醇类(甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇等)。
“不良溶剂”可使用水。在使用水作为不良溶剂的情况下，通常制成氯化钠、磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、碳酸钾、碳酸氢钾等的水溶液而使用。上述工序(3)中得到的经过了离子化的接枝共聚物的溶液与不良溶剂的混合可以利用间歇式及连续式中的任意方式进行。
另外，在对上述聚氨基酸或其盐与通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物进行离子化的工序中，通过控制离子化，可以调节未与通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐结合的聚氨基酸的COOH侧链的离子化比例。这样，通过调节离子化比例，可以制造出性质不同的纳米粒子。另外，通过使用本发明的制造方法，容易扩大规模(scale-up)，能够实现纳米粒子的大量合成。另外，在由接枝共聚物的游离形式制备纳米粒子的情况下，能够对纳米粒子化时的离子化量加以控制。此外，接枝共聚物的离子化的种类并不限于钠，能够基于各种离子种而实现选择性的离子化。
本说明书中的所述“接枝共聚物的游离形式”指的是，通式(VI)中的y为 0的情况，即，接枝共聚物中存在的全部羧基以COOH的形式存在的状态。
本说明书中的所述“经过了离子化的接枝共聚物”是指，通式(VI)中的y为0以外的情况，即，接枝共聚物中存在的羧基的全部或部分以盐的形式存在的状态。
本说明书中的所述“单体单元”表示，接枝共聚物等聚合物的结构单元。
所述“纳米粒子”是指，以由聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物形成的聚集体为主成分，与周围环境之间具有明确的界面，并且取大小为长径5000纳米(nm)以下的粒状形态。
就本发明的纳米粒子的形状而言，可以取球状、中空状、多孔球状等多种多样的形态。
另外，本发明的纳米粒子的粒径在生理学的条件下为1纳米(nm)～1500nm、优选为1nm～500nm、进一步优选为10nm～300nm。
本发明的“纳米粒子”也可以包含除聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物以外的物质。
例如，对于本发明的纳米粒子，可以通过使1种或2种以上的抗原包封于纳米粒子中、或固定化于纳米粒子表面而制成疫苗用佐剂来使用。
本说明书中的所述“抗原”是指能够引起免疫反应的物质，可以是例如人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)等这样的病毒、结核杆菌、破伤风杆菌等这样的病原性微生物等病原体本身或其一部分、或者蛋白质、肽、核酸，但并不限定于这些。这样的抗原可以与成为治疗、预防的对象的疾病相对应地进行适当选择。
本说明书中的所述“佐剂”是指，刺激免疫系统、使免疫反应增强的物质。
因此，本发明的第4方面涉及包含这样的纳米粒子的疫苗。
本发明的疫苗中，作为佐剂，除了包含前述的包含聚氨基酸与通式(I)所示的疏水性伯胺化合物的接枝共聚物的纳米粒子、及抗原以外，可以进一步包含溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、安抚剂(soothing agent)、防腐剂、抗氧化剂等。
作为溶剂，可列举例如：注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油等。
作为增溶剂，可列举例如：聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆甾醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。
作为悬浮剂，可列举例如：硬脂酸三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等表面活性剂；聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等亲水性高分子、氯化镁等。
作为等渗剂，可列举例如：葡萄糖、D-山梨糖醇、氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。
作为安抚剂，可列举例如：苄基醇等。
作为防腐剂，可列举例如：对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
作为抗氧化剂，可列举例如：亚硫酸盐、抗坏血酸、α-生育酚等。
本发明的疫苗可以是溶液、悬浮液、冷冻干燥物、粉末、胶囊剂、片剂等中的任意形态。本发明的疫苗为固体的情况下，可以在使用前将其悬浮或溶解于生理盐水等适当的溶剂中而使用。
本发明的疫苗是生物降解性的。这里的所述生物降解性是指，具有能够在体内被分解的结构，且其自身及其分解物或代谢产物是安全的、或者无毒或低毒性的。
本发明的疫苗能够对哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、猫、狗、牛、马、猴、人)实现安全的接种。
本发明的疫苗的接种量、接种方法、接种次数等可根据例如对象的年龄、状态、疾病的种类、抗原的种类等而适当选择。
作为本发明的疫苗的接种量，可列举例如：成人(体重约60kg)每1次以抗原量计为1mg～100mg。
作为本发明的疫苗的接种方法，可列举例如：口服接种、皮下注射、肌内注射、输液等。
本发明的疫苗的接种次数为1次～多次。
实施例
以下，结合实施例对本发明进行更为具体的说明，但更本发明并不现定于这些实施例。需要说明的是，以下，也将本发明的聚合物、即聚(γ-谷氨酸)与苯丙氨酸乙酯的接枝共聚物记作γ-PGA-PAE。以下所示的水可以替换为注射用水、离子交换水等。另外，在没有特殊说明的情况下，分子量为相对 分子量，是利用以下所示的SEC-HPLC测定中的分子量测定法而得到的数值；TSKgelα-M 300X7.8mm I.D.(dual),5mM NaNO3DMSO:H2O(9:1),0.8mL/分,40℃,RI检测器,标准：普鲁兰(Shodex)。
[实施例1]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(400mL)和NaHCO3(8.4g)并进行溶解。向其中加入γ-PGA(12.1g,148kDa)，并利用蒸馏水(60mL)洗涤并溶解之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(19.2g)，并利用蒸馏水(10mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(13.8g)，并利用蒸馏水(15mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了24小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(120mL)，并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，并利用蒸馏水(100mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(23.2g,收率约96.8％,PAE导入率55％,水分5.8％,85kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,3.6H),1.4-2.4(brm,6.7H),2.6-2.8(brm,1.2H),2.8-3.1(brm,3.0H),3.8-4.5(brm,4.1H),4.5-5.5(brm,0.4H),6.4-6.6(brm,0.1H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基(phenylalanyl)的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.3H).
[实施例2]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(400mL)和NaHCO3(8.4g)并进行溶解。向其中添加γ-PGA(12.1g,148kDa)，并利用蒸馏水(66mL)洗涤并溶解之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(19.2g)，并利用蒸馏水(15mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加PAE.HCl(13.8g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(120mL)，并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，并利用蒸馏水(100mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(21.1g,收率约94.5％,PAE导入率46％,水分4.5％,133kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.0H),1.4-2.4(brm,6.2H),2.6-2.8(brm,0.8H),2.8-3.1(brm,2.6H),3.9-4.5(brm,4.0H),4.5-5.5(brm,0.4H),6.4-6.6(brm,0.1H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.2H).
[实施例3]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中于室温下在蒸馏水(385mL)中量取1M氢氧化钠水溶液(90mL)，溶解γ-PGA(12.1g,148kDa)，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(19.2g)，并利用蒸馏水(4mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加PAE.HCl(13.8g)，利用蒸馏水(6mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(120mL)，并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，并利用蒸馏水(100mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(21.7g,收率约94.8％,PAE导入率59％,水分4.5％,286kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.1-1.2(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,6.9H),2.6-2.8(brm,0.6H),2.8-3.1(brm,2.4H),3.1-3.8(brm,7.2H),4.0(brs,2.0H),4.1-4.4(brm,2.5H),4.6-5.2(brm,0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.0(brm,2.6H),10.0-15.0(brs,0.2H).
[实施例4]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中于室温下在蒸馏水(385mL)中量取1M氢氧化钠水溶液(90mL)，溶解γ-PGA(12.1g,148kDa)，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(19.2g)，并利用蒸馏水(4mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加PAE.HCl(13.8g)，利用蒸馏水(6mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了22小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(120mL)，并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，并利用蒸馏水(100mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(26.8g,收率约93.6％,PAE导入率59％,水分23.6％,44kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.7-1.2(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,6.8H),2.6-2.8(brm,1.1H),2.8-3.1(brm,2.9H),3.8-5.1(brm,4.4H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.4H).
[实施例5]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(350mL)和1M NaOH(90mL)并进行了混合。向其中添加γ-PGA[12.1g,65kDa,D:L比(35:65)]，并利用蒸馏水(28mL)进行了洗涤。溶解后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(19.2g)，并利用蒸馏水(10mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加PAE.HCl(13.8g)，并利用蒸馏水(10mL)进行了洗涤。冰浴冷却下 搅拌1小时之后，于室温下进行了5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(120mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，并利用蒸馏水(100mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE[20.5g,收率约86.2％,PAE导入率72％,水分2.2％,247kDa,Glu D:L(36:64)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,6.8H),2.6-2.8(brm,0.9H),2.8-3.1(brm,2.5H),3.9-4.5(brm,4.7H),4.5-5.5(brm,0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-9.1(brm,2.6H).
[实施例6]γ-PGA-PAE的合成
在100mL Scott瓶中于室温下混合蒸馏水(39mL)和1M NaOH(9.0mL)。向其中溶解γ-PGA(1.2g,65kDa)之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.8g)。保持该状态搅拌5分钟，添加PAE.HCl(1.3g)。从冰浴冷却撤下后于室温保持该状态过夜反应，进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(11mL)，并进行了3小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(20mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(2.0g,收率约98.8％,PAE导入率52％,水分2.9％,89kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.3H),1.4-2.4(brm,7.9H),2.6-2.8(brm,0.9H),2.8-3.1(brm,2.6H),3.9-4.5(brm,4.8H),4.5-5.5(brm,0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.8H).
[实施例7]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(440mL)和γ-PGA钠盐[15.0g,29kDa,D:L比(83:17)]并进行溶解之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(19.2g)，保持该状态搅拌了5分钟。接着，添加了PAE.HCl(13.8g)。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(120mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，并利用蒸馏水(100mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE[18.2g,收率约91.2％,PAE导入率59％,水分3.5％,56kDa,Glu D:L比(50:50)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.0H),1.4-2.4(brm,5.7H),2.6-2.8(brm,0.5H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.9-4.5(brm,4.2H),4.5-5.5(brm, 0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.2H).
[实施例8]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(440mL)和γ-PGA钠盐(15.0g,29kDa)并进行溶解之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(19.2g)，保持该状态搅拌了5分钟。接着，添加了PAE.HCl(13.8g)。冰浴冷却下搅拌1.5小时之后，于室温下进行了20.5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(120mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，并利用蒸馏水(100mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(19.3g,收率约90.9％,PAE导入率70％,水分2.1％,54kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.4H),1.4-2.4(brm,5.4H),2.6-2.8(brm,0.7H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.9-4.5(brm,4.0H),4.5-5.5(brm,0.1H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.2H).
[实施例9]γ-PGA-PAE的合成
在20-mL样品瓶中量取NaHCO3(42mg)，于室温下溶解于蒸馏水(2.5mL)。添加γ-PGA(61mg,148kDa)并进行溶解之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下添加DMTMM(453mg)，保持该状态进行了7分钟搅拌。接着，添加了PAE.HCl(108mg)。冰浴冷却下进行1.0小时搅拌之后，于室温下进行了约15小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(0.47mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，进行了蒸馏水洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(103mg,PAE导入率68％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,2.9H),1.4-2.4(brm,5.9H),2.8-3.1(brm,2.0H),3.9-4.5(brm,4.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.2H).
[实施例10]γ-PGA-D-PAE的合成
在100mL Scott瓶中量取蒸馏水(39mL)和γ-PGA钠盐[1.62g,29kDa,D:L比(83:17)]并进行溶解之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加D-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(D-PAE.HCl)(1.30g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.3小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(14mL)，进行了1.5小时搅拌。 抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-D-PAE[1.90g,PAE导入率67％,水分2.41％,64kDa,Glu D:L比(66:34)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,6.0H),2.6-2.8(brm,0.6H),2.8-3.1(brm,2.4H),3.9-4.5(brm,4.4H),4.5-5.5(brm,0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.3H).
[实施例11]γ-PGA-D-PAE的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA[1.21g,65kDa,D:L比(35:65)]，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加D-PAE.HCl(1.30g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了21小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，进行了2.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-D-PAE[1.96g,PAE导入率56％,水分2.35％,98kDa,Glu D:L比(54:46)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.3H),1.4-2.4(brm,7.2H),2.6-2.8(brm,0.5H),2.8-3.1(brm,2.4H),3.9-4.5(brm,4.9H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.6H).
[实施例12]γ-PGA-DL-PAE的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA[1.21g,65kDa,D:L比(35:65)]，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加DL-PAE.HCl(1.30g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了21小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，进行了2.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-DL-PAE[2.06g,PAE导入率56％,水分2.51％,97kDa,Glu D:L比(45:55)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.3H),1.4-2.4(brm,7.2H),2.6-2.8(brm,0.5H),2.8-3.1(brm,2.5H),3.9-4.5(brm,4.7H),4.5-5.5(brm, 0.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.6H).
[实施例13]γ-PGA-PAE的合成
在100mL Scott瓶中量取NaHCO3(0.42g)、蒸馏水(49mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(0.61g,114kDa)，于室温下搅拌30分钟而将其溶解之后，在冰浴冷却下进行了15分钟搅拌。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(0.90g)，进行了5分钟搅拌。添加PAE.HCl(1.08g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.0小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(10mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于40℃进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.09g,PAE导入率67％,水分2.7％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.1H),1.4-2.4(brm,5.3H),2.6-2.8(brm,0.7H),2.8-3.1(brm,2.4H),3.9-5.5(brm,4.4H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.1H).
[实施例14]γ-PGA-PAE的合成
在50-mL锥形瓶中量取NaHCO3(0.42g)、蒸馏水(36mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(0.61g,114kDa)，于室温下搅拌30分钟而将其溶解之后，在冰浴冷却下进行了15分钟搅拌。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(0.90g)，进行了5分钟搅拌。添加PAE.HCl(1.08g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.0小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(10mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于40℃进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.14g,PAE导入率67％,水分2.9％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,5.2H),2.6-3.1(brm,3.0H),3.9-5.5(brm,4.0H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.1H).
[实施例15]γ-PGA-PAE的合成
在50-mL锥形瓶中量取NaHCO3(0.42g)、蒸馏水(30mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(0.61g,114kDa)，于室温下搅拌30分钟而将其溶解之后，在冰浴冷却下进行了15分钟搅拌。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(0.90g)，进行了5分钟搅拌。添加PAE.HCl(1.08g)，保持该状态于冰浴冷却下进行 了1.0小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(10mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于40℃进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.18g,PAE导入率70％,水分2.3％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,5.1H),2.6-3.1(brm,2.9H),3.9-5.5(brm,4.0H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.1H).
[实施例16]γ-PGA-PAE的合成
在30-mL锥形瓶中量取NaHCO3(0.42g)、蒸馏水(21mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(0.61g,114kDa)，于室温下搅拌30分钟而将其溶解之后，在冰浴冷却下进行了15分钟搅拌。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(0.90g)，进行了5分钟搅拌。添加PAE.HCl(1.08g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.0小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(10mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于40℃进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.21g,PAE导入率73％,水分2.6％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,5.0H),2.6-2.8(brm,0.3H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.9-5.5(brm,4.2H),6.4-6.6(brm,0.1H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.0H).
[实施例17]γ-PGA-PAE的合成
在20-mL样品瓶中于室温下混合蒸馏水(7.8mL)和1M NaOH(0.9mL)。向其中溶解γ-PGA(121mg,239kDa)之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(180mg)。保持该状态搅拌5分钟，添加PAE.HCl(130mg)。冰浴冷却下反应1小时、室温下反应6小时。于室温下滴加2M盐酸(1.4mL)，进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(185mg,PAE导入率50％,水分3.1％,797kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.3H),1.4-2.4(brm,8.0H),2.6-2.8(brm,1.0H),2.8-3.1(brm,2.5H),3.9-4.5(brm,5.0H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值), 7.6-8.7(brm,2.8H).
[实施例18]α-L-PGA-D-PAE的合成
在20-mL样品瓶中量取α-L-PGA钠盐(136mg)、蒸馏水(4.8mL)并进行了溶解。接着，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(180mg)，进行了5分钟搅拌。添加D-PAE.HCl(129mg)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了16小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(0.14mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了α-L-PGA-D-PAE(206mg,PAE导入率70％,水分2.20％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.03-1.05(brm,3.53H),1.50-2.35(brm,5.70H),2.50-2.60(brm,1.24H),2.60-2.85(brm,2.14H),2.85-3.05(brm,2.14H),3.10-3.25(brm,0.63H),3.50-3.80(brm,0.83H),3.90-5.00(brm,4.68H),7.04-7.35(brm,5H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.70-9.30(brm,2.48H).
[实施例19]α-L-PGA-L-PAE的合成
在20-mL样品瓶中量取α-L-PGA钠盐(136mg)、蒸馏水(4.8mL)并进行了溶解。接着，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(180mg)，进行了5分钟搅拌。添加L-PAE.HCl(129mg)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了16小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(0.14mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了α-L-PGA-L-PAE(216mg,PAE导入率69％,水分2.44％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.05-1.06(brm,3.52H),1.50-2.40(brm,5.71H),2.50-2.75(brm,1.59H),2.75-3.05(brm,2.41H),3.10-3.25(brm,0.75H),3.50-3.80(brm,0.59H),3.90-4.50(brm,4.56H),4.50-5.58(brm,0.02H),7.04-7.35(brm,5H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.70-9.30(brm,2.49H).
[实施例20]α-D-PGA-D-PAE的合成
在20-mL样品瓶中量取α-D-PGA钠盐(408mg)、蒸馏水(14.4mL)并进行了溶解。接着，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(540mg)，进行了5分钟搅拌。添加D-PAE.HCl(387mg)，保持该状态于冰浴冷却下 进行了1小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了12小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(0.5mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(15mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了α-D-PGA-D-PAE(579mg,PAE导入率77％,水分0.97％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.98-1.06(brm,3.35H),1.50-2.35(brm,5.18H),2.55-2.80(brm,0.96H),2.80-3.05(brm,2.31H),3.05-3.80(brm,2.72H),3.90-4.80(brm,4.35H),7.00-7.40(brm,5H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.70-9.30(brm,2.31H).
[实施例21]α-D-PGA-L-PAE的合成
在20-mL样品瓶中量取α-D-PGA钠盐(408mg)、蒸馏水(14.4mL)并进行了溶解。接着，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(540mg)，进行了5分钟搅拌。添加L-PAE.HCl(387mg)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了12小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(0.5mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(15mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了α-D-PGA-L-PAE(605mg,PAE导入率76％,水分1.09％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.98-1.04(brm,3.44H),1.50-2.40(brm,5.26H),2.55-2.75(brm,1.02H),2.80-3.05(brm,2.32H),3.05-3.80(brm,3.00H),3.90-4.70(brm,4.37H),7.00-7.45(brm,5H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.70-9.30(brm,2.34H).
[实施例22]αβ-DL-Poly Asp-D-PAE的合成
在20-mL样品瓶中量取αβ-DL-Poly Asp钠盐(136mg)、蒸馏水(4.8mL)并进行了溶解。接着，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(180mg)，进行了5分钟搅拌。添加D-PAE.HCl(129mg)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了13小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(0.2mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了αβ-DL-Poly Asp-D-PAE(183mg,PAE导入率约63％,水分2.37％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.75-1.25(brm,3.30H),1.60-2.80(brm,3.17H),2.80-3.75(brm,6.28H),3.75-4.15(brm,2.06H),4.15-5.50(brm,2.70H),6.90-7.45(brm,5H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值), 7.60-9.20(brm,2.35H).
[实施例23]αβ-DL-Poly Asp-L-PAE的合成
在20-mL样品瓶中量取αβ-DL-Poly Asp钠盐(136mg)、蒸馏水(4.8mL)并进行了溶解。接着，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(180mg)，进行了5分钟搅拌。添加L-PAE.HCl(129mg)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了16小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(0.2mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(5mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了αβ-DL-Poly Asp-L-PAE(176mg,PAE导入率约62％,水分2.68％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.80-1.30(brm,3.23H),1.60-2.80(brm,3.22H),2.80-3.80(brm,6.41H),3.80-4.20(brm,2.08H),4.20-5.30(brm,2.75H),6.90-7.45(brm,5H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.60-9.30(brm,2.35H).
[比较例1]γ-PGA-PAE的利用脱盐法的合成
在200-mL锥形瓶中量取NaHCO3(0.42g)、蒸馏水(100mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(0.61g)，于室温下搅拌30分钟而将其溶解之后，在冰浴冷却下进行了15分钟搅拌。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(0.90g)，进行了5分钟搅拌。添加PAE.HCl(1.08g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.0小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了22小时搅拌。接着，使用脱盐膜(Wako,Spectra/Poor 132124,15KDa cut off)进行了脱盐(将5L的水经3日而更换了2次)。将所得保持液(约200mL)冷冻后，进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.039g,水分5.85％)。向其中添加EtOH(80mL)，并在室温下进行振荡(200rpm,2小时)。进行离心分离(4500rpm,30分,5℃)，通过倾析而将上清液除去。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(0.97g,PAE导入率48％,水分1.85％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,4.0H),1.4-2.4(brm,10.1H),2.6-2.8(brm,0.6H),2.8-3.1(brm,3.2H),3.35-3.6(q,0.6H),3.9-5.5(brm,5.3H),5.7-6.0(0.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.6H).
[实施例24]聚(γ-谷氨酸)与苯丙氨酸苄酯的接枝共聚物(γ-PGA-Phe-OBn)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-苯丙氨酸苄酯盐酸盐(L-H-Phe-OBn.HCl)(1.1g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了17.5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(15mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，蒸馏水(50mL)进行了洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OBn(1.95g,收率约74.2％,Phe-OBn导入率63％,水分4.67％,72kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.2(brm,0.45H),1.3-2.35(brm,6.52H),2.6-2.8(brm,1.06H),2.8-3.2(brm,2.16H),4.0-4.4(brm,1.56H),4.4-4.6(brs,0.62H),4.6-4.9(brm,0.26H),4.9-5.2(brm,1.06H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.0(brm,1.83H).
[实施例25]γ-PGA-Phe-OBn的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加H-Phe-OBn.HCl(0.55g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了17.5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(15mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，蒸馏水(50mL)进行了洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OBn(1.39g,收率约72.6％,Phe-OBn导入率30％,水分5.57％,31kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.4-2.3(brm,13.99H),2.6-2.8(brm,2.72H),2.8-3.2(brm,4.06H),4.0-4.49(brm,3.70H),4.9-5.2(brm,1.33H),7.0-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.1(brm,3.90H).
[实施例26]聚(γ-谷氨酸)与苯丙氨酸环戊酯的接枝共聚物(γ-PGA-Phe-OcPen)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加(2S)-苯丙氨酸环戊酯盐酸盐[(2S)-H-Phe-OcPen.HCl](1.52g)，保持该状态于冰 浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了14小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OcPen(2.33g,收率约96.8％,Phe-OcPen导入率57％,水分2.88％,282kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.2(brm,0.43H),1.3-2.3(brm,14.97H),2.3-2.8(brm,1.60H),2.8-3.1(brm,2.25H),4.0-4.4(brm,2.65H),4.4-4.9(brs,0.24H),4.9-5.2(brm,1.06H),7.0-7.4(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.2(brm,2.57H).
[实施例27]γ-PGA-Phe-OcPen的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加(2S)-苯丙氨酸环戊酯盐酸盐[(2S)-H-Phe-OcPen.HCl](1.01g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了14小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OcPen(1.89g,收率约95.8％,Phe-OcPen导入率36％,水分3.51％,93kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.2(brm,0.55H),1.3-2.3(brm,19.20H),2.6-2.8(brm,1.48H),2.8-3.1(brm,2.94H),4.0-4.4(brm,3.77H),4.4-5.2(brm,1.55H),7.0-7.4(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.8-9.2(brm,3.45H).
[实施例28]聚(γ-谷氨酸)与苯丙氨酸叔丁酯的接枝共聚物(γ-PGA-Phe-OtBu)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐(L-H-Phe-OtBu.HCl)(1.94g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了19小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL) 进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OtBu(3.39g,收率约98.2％,Phe-OtBu导入率78％,水分25.04％,106kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.5(brm,9.31H),1.5-2.3(brm,5.27H),2.72(brm,0.68H),2.8-3.1(brm,2.31H),4.1-4.5(brm,2.09H),4.5-5.1(brm,0.05H),7.0-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.8(brm,2.24H).
[实施例29]γ-PGA-Phe-OtBu的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-苯丙氨酸叔丁酯盐酸盐(L-H-Phe-OtBu.HCl)(1.45g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了19小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OtBu(3.28g,收率约100.0％,Phe-OtBu导入率57％,水分29.72％,71kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.5(brm,9.31H),1.5-2.3(brm,5.27H),2.72(brm,0.68H),2.8-3.1(brm,2.31H),4.1-4.5(brm,2.09H),4.4-5.1(brm,0.05H),7.0-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.8(brm,2.24H).
[实施例30]聚(γ-谷氨酸)与苯丙氨酸甲酯的接枝共聚物(γ-PGA-Phe-OMe)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(L-H-Phe-OMe.HCl)(1.62g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了15小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(14mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了3次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OMe(2.24g,收率约99.6％,Phe-OMe导入率72％,水分4.78％,260kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.4-2.4(brm,5.53H),2.4-2.7(brm,0.50H),2.8-3.1(brm,2.49H),3.5-3.7(brm,3.00H),4.0-4.6(brm,2.36H),4.6-5.1 (brm,0.19H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.2(brm,2.25H).
[实施例31]γ-PGA-Phe-OMe的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(L-H-Phe-OMe.HCl)(1.22g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了15小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(14mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了3次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OMe(2.07g,收率约97.6％,Phe-OMe导入率53％,水分4.70％,205kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.4-2.4(brm,7.61H),2.5-2.7(brm,0.80H),2.8-3.1(brm,2.92H),3.5-3.7(brm,3.00H),4.0-4.6(brm,2.92H),4.6-5.2(brm,0.31H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.2(brm,2.71H).
[实施例32]聚(γ-谷氨酸)与苯丙氨酸的接枝共聚物(γ-PGA-Phe-OH)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-苯丙氨酸(L-H-Phe-OH)(1.24g)的盐酸水溶液(13.2mL)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了14小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(12mL)，并进行了2小时搅拌。取得析出物，利用蒸馏水(25mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-OH(0.26g,收率约17.3％,Phe-OH导入率19％,水分7.11％,271kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.5-2.4(brm,21.68H),2.4-2.8(brm,3.09H),2.8-3.2(brm,5.61H),4.0-5.2(brm,8.09H),5.3-6.2(brm,0.27),6.9-7.4(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-8.5(brm,4.98H).
[实施例33]聚(γ-谷氨酸)与苯丙氨酸酰胺的接枝共聚物(γ-PGA-Phe-NH2)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-苯丙氨酸酰胺(L-H-Phe-NH2)(1.24g)的盐酸水溶液(12mL)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了16小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(12mL)，并进行了2小时搅拌。取得析出物，利用蒸馏水(30mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Phe-NH2(1.043g,收率约63.3％,Phe-NH2导入率26％,水分8.79％,30kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.4-2.4(brm,20.81H),2.4-2.8(brm,3.57H),2.8-3.2(brm,7.33H),4.0-5.2(brm,8.82H),6.9-7.3(brm,6.57H,将苯丙氨酰基的苯基的质子5.0H设为6.57H时的相对值),7.3-7.7(1.09),7.7-8.5(brm,5.35H).
[实施例34]聚(γ-谷氨酸)和4-氟苯丙氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-p-F-Phe-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-4-氟苯丙氨酸乙酯盐酸盐(L-H-p-F-Phe-OEt.HCl)(1.40g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了12小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(50mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-p-F-Phe-OEt(2.22g,收率约96.2％,p-F-Phe-OEt导入率56％,水分3.25％,325kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.8-1.8(brm,3.38H).1.4-2.3(brm,7.10),2.4-2.7(brm,1.18),2.8-3.1(brm,2.55H),3.9-4.5(brm,4.78H),4.5-5.2(brm,0.27H),6.8-7.5(brm,4.00H；将苯基的质子设为4.0H时的相对值),7.7-9.2(brm,2.59H).
[实施例35]聚(γ-谷氨酸)与4-氯苯丙氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL) 并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加DL-4-氯苯丙氨酸乙酯盐酸盐(DL-H-p-Cl-Phe-OEt.HCl)(1.49g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了15.5小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(14mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(20mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt(2.26g,收率约96.6％,p-Cl-Phe-OEt导入率58％,水分3.65％,284kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.0-1.3(brm,3.30H).1.4-2.4(brm,6.95),2.4-2.7(brm,1.19),2.8-3.1(brm,2.68H),3.9-4.5(brm,4.70H),4.5-5.2(brm,0.20H),7.0-7.5(brm,4.00H；将苯基的质子设为4.0H时的相对值),7.7-9.2(brm,2.57H).
[实施例36]聚(γ-谷氨酸)与4-溴苯丙氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-p-Br-Phe-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加(S)-4-溴苯丙氨酸乙酯盐酸盐[(S)-H-p-Br-Phe-OEt.HCl](1.74g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了13小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(20mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-p-Br-Phe-OEt(2.43g,收率约97.2％,p-Br-Phe-OEt导入率56％,水分2.39％,185kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brm,3.34H).1.4-2.4(brm,7.17),2.4-2.7(brm,1.46),2.7-3.1(brm,2.76H),3.9-4.5(brm,4.90H),4.5-5.2(brm,0.33H),6.9-7.3(brm,4.00H；苯基的质子的4.0H中、将2.0H设为相对值),7.3-7.7(brm,2.0H),7.7-9.2(brm,2.63H).
[实施例37]聚(γ-谷氨酸)与4-硝基苯丙氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷 却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加D-p-硝基苯丙氨酸乙酯盐酸盐(D-H-p-NO2-Phe-OEt.HCl)(1.55g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了12小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(50mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt(2.39g,收率约95.7％,p-NO2-Phe-OEt导入率58％,水分3.42％,331kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.8-1.3(brm,3.28H).1.4-2.4(brm,6.90),2.4-2.7(brm,1.06),2.7-3.3(brm,3.76H),3.9-5.1(brm,1.25H),7.3-7.6(brm,2.00H；苯基的质子的4.0H中、将2.0H设为相对值),7.6-9.2(brm,0.03H).
[实施例38]聚(γ-谷氨酸)与O-(1-甲基乙基)-L-酪氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加O-(1-甲基乙基)-L-酪氨酸乙酯盐酸盐(L-H-p-OiPr-Phe-OEt.HCl)(1.62g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了14小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt(2.43g,收率约95.6％,p-OiPr-Phe-OEt导入率57％,水分2.82％,309kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brm,9.58H).1.5-2.4(brm,7.11),2.6-2.8(brm,0.85),2.8-3.1(brm,2.52H),3.9-4.9(brm,5.92H),6.78(brs,2.0H；苯基的质子的4.0H中、将2.0H设为相对值),7.0-7.1(brm,2.0H),7.8-9.2(brm,2.76H).
[实施例39]聚(γ-谷氨酸)与α-苯基甘氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-α-Phegly-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加D-α-苯基甘氨酸乙酯盐酸盐(D-H-α-Phegly-OEt.HCl)(1.22g)，保持该状态于冰 浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了13小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(20mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-α-Phegly-OEt(2.00g,收率约96.1％,α-Phegly-OEt导入率59％,水分3.18％,126kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brm,3.23H),1.5-2.3(brm,6.84H),2.4-2.7(brm,1.21H),2.7-3.0(brm,0.41H),4.0-4.2(brs,2.61H),4.3-4.5(brm,1.03H),4.5-5.2(brs,0.19H),5.3-5.4(brm,0.99H),7.0-7.6(brm,5.0H,将苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.8-9.2(brm,2.56H).
[实施例40]聚(γ-谷氨酸)与亮氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-Leu-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-亮氨酸乙酯盐酸盐(L-H-Leu-OEt.HCl)(1.47g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了6小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了2小时搅拌。取得析出物，利用蒸馏水(20mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Leu-OEt(2.25g,Leu-OEt导入率48％,水分5.13％,284kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.7-1.0(brm,6.5H,表示相对值),1.1-1.3(brm,1.0H),1.4-2.4(brm,10.1H),2.6-2.8(brm,1.2H),2.9-3.3(brm,1.3H),3.9-5.2(brm,4.7H),7.5-9.0(brm,2.7H).
[实施例41]聚(γ-谷氨酸)与异亮氨酸甲基酯的接枝共聚物(γ-PGA-Ile-OMe)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-异亮氨酸甲基酯盐酸盐(L-H-Ile-OMe.HCl)(1.47g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了6小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了2小时搅拌。取得析出物，利用蒸馏水(20mL)进行了3次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Ile-OMe (2.25g,Ile-OMe导入率55％,水分15.11％,209kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.7-0.9(brm,6.0H),1.0-1.3(brm,1.3H),1.3-1.5(brm,1.0H),1.6-2.4(brm,7.8H),2.6-2.9(brm,0.8H),2.9-3.3(brm,1.0H),3.5-3.7(brm,3.0H,将CO2Me的甲基设为3.0H时的相对值),4.0-5.2(brm,2.7H),7.8-9.8(brm,2.7H).
[实施例42]聚(γ-谷氨酸)与S-苄基半胱氨酸乙酯的接枝共聚物[γ-PGA-Cys(Bn)-OEt]的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-S-苄基半胱氨酸乙酯盐酸盐[L-H-Cys(Bn)-OEt.HCl](1.56g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1小时剧烈搅拌。接着，室温下进行了17小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(14mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Cys(Bn)-OEt[1.36g,Cys(Bn)-OEt导入率60％,水分3.40％,404kDa]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.0-1.2(brs,3.3H),1.4-2.4(brm,6.7H),2.4-2.7(brm,0.3H),2.6-2.8(brm,2.6H),2.8-3.1(brm,0.6H),4.0-4.5(brm,4.7H),4.5-5.2(brm,0.3H),7.1-7.5(brm,5.0H,将苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.2(brm,2.6H).
[实施例43]聚(γ-谷氨酸)与色氨酸乙酯的接枝共聚物(γ-PGA-Trp-OEt)的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-色氨酸乙酯盐酸盐(L-H-Trp-OEt.HCl)(1.52g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了22小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Trp-OEt(2.33g,Trp-OEt导入率56％,水分2.97％,217kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.8-1.2(brs,3.4H),1.5-2.4(brm,6.9H),2.5-2.8(brm,1.0H),2.9-3.3(brm,3.2H),3.9-5.2(brm,4.7H),6.8-7.6(brm,5.0H, 将除NH以外的吲哚基的质子设为5.0H时的相对值),7.7-9.5(brm,2.6H).
[实施例44]γ-PGA-Trp-OEt的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(9.0mL)、蒸馏水(35mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(1.21g,148kDa)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，进行了5分钟搅拌。添加L-色氨酸乙酯盐酸盐(L-H-Trp-OEt.HCl)(1.01g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了1.5小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了22小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(13mL)，并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-Trp-OEt(1.92g,Trp-OEt导入率33％,水分3.32％,47kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.8-1.2(brs,3.6H),1.5-2.4(brm,10.2H),2.6-2.8(brm,1.7H),2.9-3.3(brm,3.9H),3.9-5.2(brm,6.0H),6.9-7.6(brm,5.0H,将除NH以外的吲哚基的质子设为5.0H时的相对值),7.8-9.3(brm,3.3H).
[实施例45]γ-PGA-PAE的合成
在1-L四颈烧瓶中Na2CO3(1.59g),蒸馏水(500mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(3.64g)，利用蒸馏水(50mL)进行了洗涤。室温下进行搅拌而溶解后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(5.41g)，进行了5分钟搅拌。添加PAE.HCl(6.48g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了2.0小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(45mL)，并进行了1.5小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(50mL)进行了3次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(5.83g,PAE导入率48％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,7.4H),2.6-2.8(brm,0.9H),2.8-3.1(brm,2.9H),3.9-5.5(brm,5.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.5H).
[实施例46]γ-PGA-PAE的合成
在100mL Scott瓶中量取1M氢氧化钠水溶液(4.5mL),蒸馏水(20mL)并充分搅拌。于室温下添加γ-PGA(0.61g)，溶解后进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(0.90g)，进行了5分钟搅拌。添加PAE.HCl(0.65g)，保持该状态于冰浴冷却下进行了2.0小时剧烈搅拌。接着，于室温下进行了21小时搅拌。接着，滴加1M氢氧化钠水溶液(1.9mL)，进行了0.5小时 搅拌。接着，滴加2M HCl(13mL)，保持该状态进行了1h搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(10mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(0.99g,PAE导入率57％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.3H),1.4-2.4(brm,7.1H),2.8-3.1(brm,2.5H),3.9-5.5(brm,5.1H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-9.2(brm,2.6H).
[实施例47]γ-PGA-PAE(28％Na盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,PAE导入率55％)和DMSO(1.5mL)，室温下进行1小时搅拌，得到了溶液。将该溶液(1.5mL)滴加至蒸馏水(28.5mL)中。室温下进行搅拌的同时滴加0.1MNaOH水溶液(3.1mL)，将pH调整至10.0。其后，室温下进行搅拌的同时滴加0.01M HCl(0.05mL)。使该溶液冻结后进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(28％Na盐)(207mg,PAE导入率58％,Na:42000ppm,Cl:2271ppm)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,2.8H),1.4-2.4(brm,6.6H),2.8-3.1(brm,2.7H),3.8-4.5(brm,4.1H),4.5-5.5(brm,0.5H),6.4-6.6(brm,0.2H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.1H).
[实施例48]γ-PGA-PAE(26％Na盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,PAE导入率55％)和DMSO(1.5mL)，室温下进行1小时搅拌，得到了溶液。将该溶液(1.5mL)滴加至蒸馏水(28.5mL)中。室温下进行搅拌的同时滴加0.1MNaOH水溶液(2.8mL)，将pH调整至8.0。其后，室温下进行搅拌的同时滴加0.01M HCl(0.02mL)。使该溶液冻结后进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(26％Na盐)(210mg,PAE导入率56％,Na:35000ppm,Cl:15662ppm)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,2.8H),1.4-2.4(brm,6.8H),2.8-3.1(brm,2.7H),3.8-4.5(brm,4.1H),4.5-5.5(brm,0.5H),6.4-6.6(brm,0.2H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.0H).
[实施例49]γ-PGA-PAE(14％Na盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,PAE导入率55％)和DMSO(1.5mL)，室温下进行1小时搅拌，得到了溶液。将该溶液(1.5mL)滴加至蒸馏水(28.5mL)中。室 温下进行搅拌的同时滴加0.1M NaOH水溶液(2.3mL)，将pH调整至6.0。其后，室温下进行搅拌的同时滴加0.01M HCl(0.01mL)。使该溶液冻结后进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(14％Na盐)(217mg,PAE导入率53％,Na:22000ppm,Cl:13282ppm)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,2.9H),1.4-2.4(brm,7.0H),2.8-3.1(brm,2.4H),3.8-4.5(brm,3.9H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.4-6.6(brm,0.2H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,1.6H).
[实施例50]γ-PGA-PAE(0％Na盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,PAE导入率55％)和DMSO(1.5mL)，室温下进行1小时搅拌，得到了溶液。将该溶液(1.5mL)滴加至蒸馏水(28.5mL)中。室温下进行搅拌的同时滴加0.1MNaOH水溶液(0.9mL)，将pH调整至4.0。其后，室温下进行搅拌的同时滴加0.01M HCl(0.02mL)。使该溶液冻结后进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(0％Na盐)(244mg,PAE导入率51％,Na:6900ppm,Cl:13785ppm)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,2.8H),1.4-2.4(brm,6.6H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.8-4.5(brm,3.8H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.4-6.6(brm,0.3H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,1.4H).
[实施例51]γ-PGA-PAE(27％K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,PAE导入率55％)和DMSO(1.5mL)，室温下进行1小时搅拌，得到了溶液。将该溶液(1.5mL)滴加至蒸馏水(28.5mL)中。室温下进行搅拌的同时滴加0.1MKOH水溶液(3.1mL)，将pH调整至10.0。其后，室温下进行搅拌的同时滴加0.01M HCl(0.02mL)。使该溶液冻结后进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(27％K盐)(215mg,PAE导入率53％,K:62000ppm,Cl:22769ppm,105kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,2.7H),1.4-2.4(brm,7.0H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.8-4.5(brm,3.9H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.4-6.6(brm,0.3H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.4H).
[实施例52]γ-PGA-PAE(55％K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,PAE导入率55％)和DMSO(1.5mL)，室温下进行1小时搅拌，得到了溶液。将该溶液(1.5mL)滴加至蒸馏水(28.5mL)中。室温下进行搅拌的同时滴加0.1MKOH水溶液(2.8mL)，将pH调整至8.0。其后，室温下进行搅拌的同时滴加0.01M HCl(0.02mL)。使该溶液冻结后进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(55％K盐)(215mg,PAE导入率48％,K:42000ppm,Cl:19974ppm,125kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,2.8H),1.4-2.4(brm,7.2H),2.8-3.1(brm,2.4H),3.8-4.5(brm,3.8H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.4-6.6(brm,0.2H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,1.7H).
[实施例53]γ-PGA-PAE(12％K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,PAE导入率55％)和DMSO(1.5mL)，室温下进行1小时搅拌，得到了溶液。将该溶液(1.5mL)滴加至蒸馏水(28.5mL)中。室温下进行搅拌的同时滴加0.1MKOH水溶液(2.2mL)，将pH调整至6.0。其后，室温下进行搅拌的同时滴加0.01M HCl(0.02mL)。使该溶液冻结后进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE(12％K盐)(232mg,PAE导入率47％,K:33000ppm,Cl:11743ppm,138kDa)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.6-1.2(brs,2.9H),1.4-2.4(brm,7.2H),2.8-3.1(brm,2.4H),3.8-4.5(brm,4.0H),4.5-5.5(brm,0.4H),6.4-6.6(brm,0.3H),6.7-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.1H).
[实施例54]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(28％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率58％,实施例47)和DMSO(0.2mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米 粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.50M NaCl,30nm(PDI 0.29)；0.80M NaCl,167nm(PDI0.21)；0.95M NaCl,348nm(PDI 0.27)；1.10M NaCl,775nm(PDI 0.24)；1.25M NaCl,898nm(PDI 0.47)；1.40M NaCl,988nm(PDI 0.37)；1.55M NaCl,994nm(PDI 0.38)。
[实施例55]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(28％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率58％,实施例47)、DMSO(0.16mL)和蒸馏水(0.04mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.80M NaCl,98nm(PDI 0.21)；0.95M NaCl,197nm(PDI 0.25)；1.10M NaCl,357nm(PDI 0.43)；1.25M NaCl,577nm(PDI 0.45)；1.40M NaCl,741nm(PDI0.51)；1.55M NaCl,649nm(PDI 0.37)。
[实施例56]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(26％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率56％,实施例48)和DMSO(0.2mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度 的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.50M NaCl,43nm(PDI 0.19)；0.65M NaCl,145nm(PDI 0.16)；0.70M NaCl,278nm(PDI 0.29)；0.75M NaCl,282nm(PDI 0.28)；0.80M NaCl,578nm(PDI0.43)；0.95M NaCl,963nm(PDI 0.27)；1.10M NaCl,1539nm(PDI 0.26)。
[实施例57]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(26％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率56％,实施例48)、DMSO(0.16mL)和蒸馏水(0.04mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.70M NaCl,92nm(PDI 0.18)；0.75M NaCl,135nm(PDI 0.27)；0.80M NaCl,167nm(PDI 0.19)；0.95M NaCl,398nm(PDI 0.28)；1.10M NaCl,677nm(PDI0.38)。
[实施例58]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(14％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率53％,实施例49)和DMSO(0.2mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.40M NaCl,77nm(PDI 0.15)；0.50M NaCl,158nm(PDI 0.11)；0.60M NaCl,244nm(PDI 0.19)；0.65 M NaCl,310nm(PDI 0.22)；0.70M NaCl,489nm(PDI0.25)。
[实施例59]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(14％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率53％,实施例49)、DMSO(0.16mL)及蒸馏水(0.04mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.60M NaCl,113nm(PDI 0.11)；0.70M NaCl,184nm(PDI0.20)；0.75M NaCl,210nm(PDI 0.19)；0.80M NaCl,312nm(PDI 0.28)；0.90M NaCl,553nm(PDI 0.31)；1.00M NaCl,800nm(PDI 0.27)。
[实施例60]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(0％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率51％,实施例50)和DMSO(0.2mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.00M NaCl,155nm(PDI 0.11)；0.01M NaCl,217nm(PDI0.09)。
[实施例61]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
称量添加γ-PGA-PAE(0％,Na盐)(2.0mg,PAE导入率51％,实施例50)、 DMSO(0.16mL)及蒸馏水(0.04mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.00M NaCl,140nm(PDI 0.14)；0.01M NaCl,178nm(PDI0.07)；0.02M NaCl,220nm(PDI 0.09)。
[实施例62]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，室温下进行了搅拌。接着，滴加Na2CO3(12.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.95M NaCl,192nm(PDI 0.42)；1.10M NaCl,274nm(PDI0.28)；1.25M NaCl,494nm(PDI 0.32)；1.40M NaCl,810nm(PDI 0.42)；1.55M NaCl,871nm(PDI 0.42)。
[实施例63]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加Na2CO3(6.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公 司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，1.00M NaCl,184nm(PDI 0.23)；1.10M NaCl,335nm(PDI0.27)；1.15M NaCl,553nm(PDI 0.51)；1.20M NaCl,505nm(PDI 0.32)；1.25M NaCl,619nm(PDI 0.39)；1.30M NaCl,727nm(PDI 0.39)。
[实施例64]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加Na2CO3(3.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.60M NaCl,53nm(PDI 0.20)；0.80M NaCl,202nm(PDI 0.22)；0.85M NaCl,245nm(PDI 0.25)；0.90M NaCl,355nm(PDI 0.29)；0.95M NaCl,875nm(PDI0.59)；1.00M NaCl,676nm(PDI 0.50)。
[实施例65]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加Na2CO3(1.5mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL) 分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.20M NaCl,63nm(PDI 0.06)；0.25M NaCl,78nm(PDI 0.05)；0.30M NaCl,112nm(PDI 0.08)；0.35M NaCl,123nm(PDI 0.09)；0.40M NaCl,164nm(PDI0.10)；0.45M NaCl,210nm(PDI 0.16)；0.50M NaCl,459nm(PDI 0.42)；0.60M NaCl,719nm(PDI 0.36)。
[实施例66]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加Na2HPO4(12.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.50M NaCl,34nm(PDI 0.21)；0.60M NaCl,118nm(PDI 0.17)；0.70M NaCl,197nm(PDI 0.22)；0.80M NaCl,345nm(PDI 0.28)；0.90M NaCl,537nm(PDI0.35)；1.00M NaCl,642nm(PDI 0.28)。
[实施例67]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加Na2HPO4(6.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL) 分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.05M NaCl,31nm(PDI 0.14)；0.20M NaCl,56nm(PDI 0.07)；0.30M NaCl,88nm(PDI 0.10)；0.40M NaCl,137nm(PDI 0.11)；0.50M NaCl,236nm(PDI0.20)；0.60M NaCl,530nm(PDI 0.48)；0.70M NaCl,585nm(PDI 0.49)。
[实施例68]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加Na2HPO4(3.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.01M NaCl,365nm(PDI 0.21)；0.02M NaCl,595nm(PDI0.21)；0.04M NaCl,1195nm(PDI 0.25)；0.05M NaCl,1057nm(PDI 0.46)。
[实施例69]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)量取，于室温下进行了搅拌。接着，滴加K2CO3(12.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，1.40M KCl,415nm(PDI 0.55)；1.50M KCl,595nm(PDI 0.41)；1.60M KCl,902nm(PDI 0.54)。
[实施例70]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加K2CO3(6.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.60M KCl,83nm(PDI 0.29)；0.70M KCl,189nm(PDI 0.25)；0.80M KCl,421nm(PDI 0.30)；0.90M KCl,940nm(PDI 0.26)；0.95M KCl,1185nm(PDI0.07)。
[实施例71]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加K2CO3(3.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.50M KCl,103nm(PDI 0.11)；0.55M KCl,93nm(PDI 0.12)；0.60M KCl,161nm(PDI 0.16)；0.65M KCl,216nm(PDI 0.22)；0.70M KCl,308nm(PDI0.23)；0.75M KCl,398nm(PDI 0.31)；0.80M KCl,612nm(PDI 0.31)。
[实施例72]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加K2CO3(1.5mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.05M KCl,105nm(PDI 0.08)；0.08M KCl,153nm(PDI 0.08)；0.10M KCl,198nm(PDI 0.15)；0.12M KCl,266nm(PDI 0.20)；0.15M KCl,356nm(PDI0.18)；0.20M KCl,838nm(PDI 0.29)。
[实施例73]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加KHCO3(12.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.70M KCl,127nm(PDI 0.20)；0.80M KCl,263nm(PDI 0.28)；0.90M KCl,479nm(PDI 0.42)；1.00M KCl,1097nm(PDI 0.47)；1.10M KCl,2085nm(PDI0.15)。
[实施例74]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加KHCO3(6.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.50M KCl,40nm(PDI 0.16)；0.60M KCl,63nm(PDI 0.18)；0.70MKCl,141nm(PDI 0.18)；0.80M KCl,286nm(PDI 0.27)；0.90M KCl,679nm(PDI 0.49)；1.00MKCl,1228nm(PDI 0.04)。
[实施例75]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加KHCO3(3.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液的情况下的结果如下。即，0.20M KCl,58nm(PDI 0.07)；0.30M KCl,91nm(PDI 0.07)；0.40M KCl,161nm(PDI 0.11)；0.45M KCl,189nm(PDI 0.15)；0.50M KCl,303nm(PDI 0.25)；0.55MKCl,488nm(PDI 0.31)；0.60M KCl,672nm(PDI 0.28)。
[实施例76]γ-PGA-PAE的纳米粒子(K盐)的制备
量取γ-PGA-PAE(30mg,PAE导入率55％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加KHCO3(1.5mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE(K盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的KCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的KCl水溶液的情况下的结果如下。即，0.00M KCl,237nm(PDI 0.11)；0.005M KCl,242nm(PDI 0.11)；0.01M KCl,361nm(PDI 0.17)。
[实施例77]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在100-mL梨形瓶中量取γ-PGA-PAE(1.03g,水分2.21％)、DMSO(60mL)，于室温下进行搅拌，将其完全溶解。在内温18～30℃下滴加NaHCO3水溶液[将NaHCO3(50mg)利用蒸馏水(20.0mL)稀释而成]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后，利用DMSO洗液(20mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A(取样0.5mL用于研究)。
将NaCl(2.63g)溶解于大塚蒸馏水(100mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。
将溶液A和溶液B通过1/8”的管后以流速10mL/分混合。用1000-mL塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)接取混合液。在该混液中添加蒸馏水(约800mL)，制成脱盐用溶液。对该溶液进行了脱盐(脱盐条件SARTOCON(注册商标)Slice Cassette 2kDa,TM 20-22psi)。利用-40℃的冰柜使其冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子[957mg,收率95.7％,水分1.40％,PAE导入率57％,Z-Ave d.522nm(PDI 0.49)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,7.1H),2.6-2.8(brm,0.2H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.9-4.5(brm,4.8H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.5H).
[实施例78]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在100-mL梨形瓶中量取γ-PGA-PAE(3.075g,水分2.21％)、DMSO(45mL)，于室温下进行搅拌，将其完全溶解。在内温18～30℃下滴加NaHCO3水溶液[利用蒸馏水(6.0mL)稀释NaHCO3(300mg)而成。滴加后，利用蒸馏水(3.0mL)进行洗涤，然后再滴加该洗液]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后用DMSO洗液(6mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A(取样0.5mL用于研究)。
在1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)中量取NaCl(23.38g)、大塚蒸馏水(1000mL)，并进行溶解。利用0.2μm滤器对其进行过滤。将其作为溶液B。
将溶液A(约60mL)和溶液B(约70mL)通过1/8”的管后以流速10mL/分混合。用1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)接取混合液。在该混液中添加蒸馏水(约900mL)，制成脱盐用溶液。对该溶液进行了脱盐[脱盐条件SARTOCON(注册商标)Slice Cassette 10kDa(3051443901E-SG),TM 17-18psi,约12～16g/分,约3小时]。利用-40℃的冰柜使其冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子[2.68g,收率83.4％,水分6.72％,PAE导入率57％,Z-Ave d.79.5nm(PDI 0.28)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,7.0H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.9-4.5(brm,4.5H),4.5-5.5(brm,0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.5H).
1H NMR(500MHz,D2O-d6)δNo signal(无信号).提高增益而勉强进行观察时，极微弱地观察到了以下的峰。0.7-1.2(brs,3.0H),1.5-2.5(brm,5.1H),2.7-2.3(brm,1.8H),3.7-4.2(brm,2.0H),6.7-7.4(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值).
[实施例79]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在100-mL梨形瓶中量取γ-PGA-PAE(3.075g,水分2.21％)、DMSO(45mL)，于室温下进行搅拌，将其完全溶解。在内温18～30℃下滴加NaOH水溶液[利用蒸馏水(4.5mL)稀释1MNaOH(2.5mL)而成。滴加后，利用蒸馏水(2.0mL)进行洗涤，然后再滴加该洗液]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后用DMSO洗液(6mL)进行洗涤， 使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A。
在1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)中量取NaCl(17.53g)、大塚蒸馏水(1000mL)，并进行溶解。利用0.2μm滤器对其进行过滤。将其作为溶液B(取样0.5mL用于研究)。
将溶液A(约60mL)和溶液B(约70mL)通过1/8”的管后以流速10mL/分混合。用1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)接取混合液。在该混液中添加蒸馏水(约900mL)，制成脱盐用溶液。对该溶液进行了脱盐[脱盐条件SARTOCON(注册商标)Slice Cassette 10kDa(3051443901E-SG),TM 17-18psi,约12～16g/分,约3小时]。利用-40℃的冰柜使其冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子[2.76g,收率88.7％,水分3.50％,PAE导入率57％,Z-Ave d.80.2nm(PDI 0.21)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,7.1H),2.6-2.8(brm,0.2H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.9-4.5(brm,4.9H),4.5-5.5(brm,0.3H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.7H).
[实施例80]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在100-mL梨形瓶中量取γ-PGA-PAE(3.075g,水分2.21％)、DMSO(45mL)，于室温下进行搅拌，将其完全溶解。在内温18～30℃下滴加Na2CO3水溶液[利用蒸馏水(6.0mL)稀释Na2CO3(189mg)而成。滴加后，利用蒸馏水(3.0mL)进行洗涤，然后再滴加该洗液]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后用DMSO洗液(6mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A(取样0.5mL用于研究)。
在1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)中量取NaCl(25.13g)、大塚蒸馏水(1000mL)，并进行溶解。利用0.2μm滤器对其进行过滤。将其作为溶液B。
将溶液A(约60mL)和溶液B(约70mL)通过1/8”的管后以流速10mL/分混合。用1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)接取混合液。在该混液中添加蒸馏水(约900mL)，制成脱盐用溶液。对该溶液进行了脱盐[脱盐条件SARTOCON(注册商标)Slice Cassette 10kDa(3051443901E-SG),TM 17-18psi,约12～16g/分,约3小时]。利用-40℃的冰柜使其冻结。对其进行 冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子[2.75g,收率87.3％,水分4.64％,PAE导入率56％,Z-Ave d.98.5nm(PDI 0.25)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.3H),1.4-2.4(brm,7.1H),2.6-2.8(brm,0.2H),2.8-3.1(brm,2.3H),3.9-4.5(brm,4.7H),4.5-5.5(brm,0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.5H).
[实施例81]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在100-mL梨形瓶中量取γ-PGA-PAE(3.075g,水分2.21％)、DMSO(45mL)，于室温下进行搅拌，将其完全溶解。在内温18～30℃下滴加Na2CO3水溶液[利用蒸馏水(6.0mL)稀释Na2CO3(189mg)而成。滴加后，利用蒸馏水(3.0mL)进行洗涤，然后再滴加该洗液]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后用DMSO洗液(6mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A(取样0.5mL用于研究)。
在1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)中量取NaCl(17.53g)、大塚蒸馏水(1000mL)，并进行溶解。利用0.2μm滤器对其进行过滤。将其作为溶液B。
将溶液A(约60mL)和溶液B(约70mL)通过1/8”的管后以流速10mL/分混合。用1-L塑料瓶(Corning,贮瓶,PS制,430281)接取混合液。在该混液中添加蒸馏水(约900mL)，制成脱盐用溶液。对该溶液进行了脱盐[脱盐条件SARTOCON(注册商标)Slice Cassette 10kDa(3051443901E-SG),TM 17-18psi,约12～16g/分,约3小时]。利用-40℃的冰柜使其冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子[2.63g,收率83.4％,水分4.86％,PAE导入率57％,Z-Ave d.261.5nm(PDI 0.40)]。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.9-1.3(brs,3.2H),1.4-2.4(brm,7.0H),2.6-2.8(brm,0.2H),2.8-3.1(brm,2.2H),3.9-4.5(brm,4.7H),4.5-5.5(brm,0.2H),6.9-7.5(brm,5.0H,将苯丙氨酰基的苯基的质子设为5.0H时的相对值),7.6-8.7(brm,2.4H).
[实施例82]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在100-mL梨形瓶中量取γ-PGA-PAE(3.075g,水分2.21％)、DMSO(45mL)，于室温下进行搅拌，将其完全溶解。在内温18～30℃下滴加Na2CO3 水溶液[利用蒸馏水(6.0mL)稀释Na2CO3(189mg)而成。滴加后，利用蒸馏水(3.0mL)进行洗涤，然后再滴加该洗液]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后用DMSO洗液(6mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A(其中，取样0.5mL，用于本研究)。
将该溶液A的一部分(25μL)迅速混合至各种浓度的PBS水溶液(25μL)中，得到分散液。使用该分散液，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的PBS水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，X1 PBS,44nm(PDI 0.24)；X2 PBS,43nm(PDI 0.23)；X3 PBS,74nm(PDI 0.23)；X3.1 PBS,89nm(PDI 0.25)；X3.2 PBS,138nm(PDI 0.43)。
[实施例83]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在100-mL梨形瓶中量取γ-PGA-PAE(3.075g,水分2.21％)、DMSO(45mL)，于室温下进行搅拌，将其完全溶解。在内温18～30℃下滴加NaHCO3水溶液[利用蒸馏水(6.0mL)稀释NaHCO3(300mg)而成。滴加后，利用蒸馏水(3.0mL)进行洗涤，然后再滴加该洗液]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后用DMSO洗液(6mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A(其中，取样0.5mL，用于本研究)。
将该溶液A的一部分(25μL)迅速混合至各种浓度的AcONa水溶液(25μL)中，得到分散液。使用该分散液，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的AcONa水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.1M AcONa,38nm(PDI 0.25)；0.2M AcONa,36nm(PDI0.23)；0.3M AcONa,39nm(PDI 0.23)；0.4M AcONa,68nm(PDI 0.38)。
[实施例84]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
在5-mL样品瓶中量取γ-PGA-PAE(60mg,水分2.21％)、EtOH(4mL)，室温下进行搅拌，将其悬浮。室温下滴加NaHCO3水溶液[利用蒸馏水(3mL)溶解Na2CO3(63mg)，使用其中的0.36mL]。搅拌30分钟之后，滴加蒸馏水(1mL)，并利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)过滤所得溶液。将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(50μL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(50μL)中，得到分散液。使用该分散液，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.3M NaCl,35nm(PDI 0.39)；0.4M NaCl,63nm(PDI0.48)；0.45M NaCl,206nm(PDI 0.46)；0.5M NaCl,415nm(PDI 0.35)。
[实施例85]γ-PGA-Phe-OcPen的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Phe-OcPen(30mg,Phe-OcPen导入率57％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaOH水溶液(0.6mL,相当于0.051mmol)。进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-Phe-OcPen(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-Phe-OcPen的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-Phe-OcPen的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.40M NaCl,39nm(PDI 0.19)；0.50M NaCl,70nm(PDI0.18)；0.60M NaCl,124nm(PDI 0.16)；0.70M NaCl,199nm(PDI 0.25)；0.80M NaCl,314nm(PDI 0.28)；0.90M NaCl,670nm(PDI 0.59)。
[实施例86]γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Phe-OtBu(30mg,Phe-OtBu导入率57％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaHCO3(3.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-Phe-OtBu(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL) 分散所得残留物，得到了γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液的情况下的结果如下。即，0.20M NaCl,45nm(PDI 0.25)；0.30M NaCl,97nm(PDI 0.16)；0.40M NaCl,311nm(PDI 0.27)；0.45M NaCl,685nm(PDI 0.22)；0.50M NaCl,1066nm(PDI0.37)。
[实施例87]γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Phe-OtBu(30mg,Phe-OtBu导入率57％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaHCO3(1.5mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-Phe-OtBu(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.20M NaCl,49nm(PDI 0.46)；0.40M NaCl,80nm(PDI0.29)；0.50M NaCl,123nm(PDI 0.28)；0.60M NaCl,202nm(PDI 0.41)；0.70M NaCl,414nm(PDI 0.45)。
[实施例88]γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Phe-OtBu(0.90g,Phe-OtBu导入率57％)和DMSO(7.2mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaOH水溶液(1.8mL,相当于1.6mmol)。进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-Phe-OtBu(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL)。
首先，进行了NaCl水溶液的预考察。将γ-PGA-Phe-OtBu(Na盐)的DMSO水溶液的一部分(浓度100mg/mL,0.1mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.1mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.1mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1PBS(1.0mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。进而，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液的情况下的结果如下。即，0.20MNaCl,47nm(PDI 0.24)；0.45M NaCl,64nm(PDI 0.22)；0.50M NaCl,80nm(PDI 0.23)；0.55MNaCl,140nm(PDI 0.42)。
接着，扩大了规模。即，将上述的γ-PGA-Phe-OtBu(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL,8.0mL)迅速混合至0.60M NaCl水溶液(8.0mL)中，得到了分散液。通过离心过滤进行了脱盐/水洗(离心条件4500rpm,30分,5℃)。利用蒸馏水(25mL)分散所得残留物，并进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-Phe-OtBu的纳米粒子(849mg)。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了该纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。结果为105nm(PDI 0.40)。
[实施例89]γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Phe-OMe(30mg,Phe-OMe导入率53％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaHCO3(3.0mg)的水溶液(0.6mL)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-Phe-OMe(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.20M NaCl,76nm(PDI 0.11)；0.30M NaCl,154nm(PDI0.12)；0.35M NaCl,196nm(PDI 0.14)；0.40M NaCl,273nm(PDI 0.20)；0.50M NaCl,468nm(PDI 0.30)。
[实施例90]γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Phe-OMe(30mg,Phe-OMe导入率53％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaHCO3(1.5mg)的水溶液(0.6mL)，并进 行2小时搅拌，得到了γ-PGA-Phe-OMe(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.15M NaCl,114nm(PDI 0.05)；0.20M NaCl,173nm(PDI0.08)；0.25M NaCl,333nm(PDI 0.26)；0.30M NaCl,778nm(PDI 0.42)；0.40M NaCl,2673nm(PDI 0.17)。
[实施例91]γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Phe-OMe(0.90g,Phe-OMe导入率53％)和DMSO(7.2mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加了NaOH水溶液(1.8mL,相当于2.0mmol)。进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-Phe-OMe(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL)。
首先，进行了NaCl水溶液的预考察。将γ-PGA-Phe-OMe(Na盐)的DMSO水溶液的一部分(浓度100mg/mL,0.1mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.1mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.1mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1PBS(1.0mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。进而，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.20M NaCl,65nm(PDI 0.30)；0.45M NaCl,77nm(PDI 0.29)；0.60M NaCl,98nm(PDI0.39)；0.65M NaCl,114nm(PDI 0.44)；0.70M NaCl,135nm(PDI 0.78)；0.75M NaCl,170nm(PDI 0.94)。
接着，扩大了规模。即，将上述的γ-PGA-Phe-OMe(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL,8.0mL)迅速混合至0.70M NaCl水溶液(8.0mL)中，得到了分散液。通过离心过滤重复进行了脱盐/水洗(离心条件4500rpm,30 分,5℃)。利用蒸馏水(25mL)分散所得残留物，并进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-Phe-OMe的纳米粒子(857mg)。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了该纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。结果为145nm(PDI 0.57)。
[实施例92]γ-PGA-p-F-Phe-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-p-F-Phe-OEt(30mg,p-F-Phe-OEt导入率56％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaOH水溶液(0.6mL,相当于0.056mmol)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-p-F-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-p-F-Phe-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-p-F-Phe-OEt的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.40M NaCl,28nm(PDI 0.12)；0.50M NaCl,55nm(PDI0.10)；0.70M NaCl,107nm(PDI 0.22)；0.80M NaCl,244nm(PDI 0.23)；0.90M NaCl,545nm(PDI 0.30)；0.95M NaCl,782nm(PDI 0.27)；1.10M NaCl,897nm(PDI 0.25)。
[实施例93]γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt(0.90g,p-Cl-Phe-OEt导入率58％)和DMSO(7.2mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加了NaOH水溶液(1.8mL,相当于1.5mmol)。进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL)。
首先，进行了NaCl水溶液的预考察。将γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液的一部分(浓度100mg/mL,0.1mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.1mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.1mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(1.0mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。进而，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.20M NaCl,36nm(PDI 0.26)；0.25M NaCl,76nm(PDI 0.24)；0.30M NaCl,492nm(PDI 0.40)。
接着，扩大了规模。即，将上述的γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL,8.0mL)迅速混合至0.27M NaCl水溶液(8.0mL)中，得到了分散液。通过离心过滤重复进行了脱盐/水洗(离心条件4500rpm,30分,5℃)。利用蒸馏水(25mL)分散所得残留物，并进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-p-Cl-Phe-OEt的纳米粒子(839mg)。利用Zetasizer NanoZS(Malvern公司)测定了该纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。结果为67nm(PDI 0.29)。
[实施例94]γ-PGA-p-Br-Phe-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-p-Br-Phe-OEt(0.90g,p-Br-Phe-OEt导入率56％)和DMSO(7.2mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaOH水溶液(1.8mL,相当于1.5mmol)。进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-p-Br-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL)。
首先，进行了NaCl水溶液的预考察。将γ-PGA-p-Br-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液的一部分(浓度100mg/mL,0.1mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.1mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.1mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(1.0mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-p-Br-Phe-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。进而，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.30M NaCl,73nm(PDI 0.19)；0.35M NaCl,131nm(PDI 0.25)；0.40M NaCl,226nm(PDI 0.27)；0.45M NaCl,508nm(PDI 0.40)。
接着，扩大了规模。即，将上述的γ-PGA-p-Br-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度100mg/mL,8.0mL)迅速混合至0.32M NaCl水溶液(8.0mL)中，得到了分散液。通过离心过滤重复进行了脱盐/水洗(离心条件4500rpm,30 分,5℃)。利用蒸馏水(25mL)分散所得残留物，并进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-p-Br-Phe-OEt的纳米粒子(632mg)。利用ZetasizerNano ZS(Malvern公司)测定了该纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。结果为52nm(PDI 0.27)。
[实施例95]γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt(30mg,p-NO2-Phe-OEt导入率58％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaOH水溶液(0.6mL,相当于0.049mmol)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-p-NO2-Phe-OEt的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.30M NaCl,23nm(PDI 0.32)；0.40M NaCl,32nm(PDI 0.37)；0.45M NaCl,86nm(PDI 0.26)；0.50M NaCl,368nm(PDI 0.31)。
[实施例96]γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt(30mg,p-OiPr-Phe-OEt导入率57％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaOH水溶液(0.6mL,相当于0.049mmol)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-p-OiPr-Phe-OEt的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.20M NaCl,24nm(PDI 0.31)；0.25M NaCl,23nm(PDI 0.25)；0.30M NaCl,36nm(PDI 0.37)；0.35M NaCl,42nm(PDI 0.39)；0.40M NaCl,43nm(PDI 0.29)；0.50M NaCl,44nm(PDI 0.30)。
[实施例97]γ-PGA-α-Phegly-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-α-Phegly-OEt(30mg,α-Phegly-OEt导入率59％)和DMSO(2.4mL)，于室温下进行了搅拌。接着，滴加NaOH水溶液(0.6mL,相当于0.055mmol)，并进行2小时搅拌，得到了γ-PGA-α-Phegly-OEt(Na盐)的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。
将该溶液的一部分(浓度10mg/mL,0.2mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.2mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30分,5℃)。将利用蒸馏水(0.2mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用X1 PBS(0.2mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-α-Phegly-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。
接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-α-Phegly-OEt的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.40M NaCl,32nm(PDI 0.43)；0.45M NaCl,124nm(PDI 0.81)；0.50M NaCl,809nm(PDI 0.52)。
[实施例98]αβ-DL-PolyAsp-D-PAE的纳米粒子的制备
在5-mL样品瓶中量取αβ-DL-PolyAsp-D-PAE(50mg,PAE导入率63％)和DMSO(0.5mL)，室温下进行了溶解。室温下滴加Na2CO3水溶液[利用蒸馏水(9mL)溶解Na2CO3(63mg)而成的溶液中，使用了0.15mL]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后，利用DMSO洗液(0.5mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A。
将溶液A(50μL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(50μL)中，得到了αβ-DL-PolyAsp-D-PAE的纳米粒子的分散液。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了它们的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。 它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.25M NaCl,554nm(PDI 0.206)；0.20M NaCl,214nm(PDI0.064)；0.15M NaCl,132nm(PDI 0.030),0.10M NaCl,87nm(PDI 0.090)；0.05M NaCl,69nm(PDI 0.628)。
将溶液A(500μL)迅速混合至0.20M NaCl水溶液(500μL)中，得到了分散液(Z-Aved.,72nm,PdI 0.149)。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,15分,5℃)。对所得残留物进行冷冻干燥，得到了αβ-DL-PolyAsp-D-PAE的纳米粒子(7mg,PAE导入率70％)。
[实施例99]αβ-DL-PolyAsp-L-PAE的纳米粒子的制备
在5-mL样品瓶中量取αβ-DL-PolyAsp-L-PAE(50mg,PAE导入率63％)和DMSO(0.5mL)，室温下进行了溶解。室温下滴加Na2CO3水溶液[利用蒸馏水(9mL)溶解Na2CO3(63mg)而成的溶液中，使用了0.15mL]。搅拌30分钟之后，将所得溶液用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤。然后，利用DMSO洗液(0.5mL)进行洗涤，使洗液通过针筒式滤器而进行洗涤、过滤，并进行混合。将其作为溶液A。
将溶液A(50μL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(50μL)中，得到了αβ-DL-PolyAsp-L-PAE的纳米粒子的分散液。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了它们的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.25M NaCl,418nm(PDI 0.151)；0.20M NaCl,236nm(PDI0.199)；0.15M NaCl,126nm(PDI 0.108),0.10M NaCl,73nm(PDI 0.090)；0.05M NaCl,57nm(PDI 0.140)。
将溶液A(500μL)迅速混合至0.20M NaCl水溶液(500μL)中，得到了分散液(Z-Aved.,66nm,PdI 0.134)。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,15分,5℃)。对所得残留物进行冷冻干燥，得到了αβ-DL-PolyAsp-L-PAE的纳米粒子(7mg,PAE导入率71％)。
如上述实施例所示地，本发明能够在短时间内并且以高收率获得聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物的游离形式，能够以少量的溶剂量(溶液A和溶液B之和)获得经过了离子化的接枝共聚物。
[实施例100]γ-PGA的绝对分子量的测定
使用GPC-Max(Viscotek公司)、在SEC-HPLC条件[TSKgelGMPWXL,300X7.8mm I.D.(dual),0.1M NaNO3,0.8mL/min,40℃]下测定了按照实施例5及6而合成的γ-PGA[12.1g,65kDa,D:L(35:65)]的绝对分子量。将γ-PGA(129mg)分别溶解于NaHCO3(相对于γ-PGA总羧基为0.50,0.75,1.001.25,1.50eq、各25mL)之后，进行脱气，得到了5种经过了Na化的γ-PGA。对它们分别利用0.20μm的过滤器进行过滤，得到了用于GPC-Max的样品溶液。由5种经过了Na化的γ-PGA得到的分子量计算出了游离形式的γ-PGA的绝对分子量值。实施例5和6的绝对分子量均为62kDa。
实施例5和6的相对分子量分别为65kDa，这表示，本发明的γ-PGA的绝对分子量与相对分子量之间存在相关。
[实施例101]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.66g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.95g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.41g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.18g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至80℃，滴加2M盐酸而调整至pH4.0。于80℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.627g,收率约84.9％,PAE导入率61％,水分3.9％,91kDa)。
[实施例102]γ-PGA-PAE的合成
在2-L四颈烧瓶于室温下量取蒸馏水(950mL)和NaHCO3(4.00g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(5.81g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(8.61g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(11.4g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至80℃，滴加2M盐酸而调整至pH 1.4。于80℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(10.47g,收率约92.3％,PAE导入率 69.1％,水分3.4％,100kDa)。
[实施例103]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.66g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.95g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.41g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.18g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至60℃，滴加2M盐酸而调整至pH4.0。于60℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.541g,收率约86.9％,PAE导入率60％,水分2.4％,160kDa)。
[实施例104]γ-PGA-PAE的合成
在2-L四颈烧瓶于室温下量取蒸馏水(950mL)和NaHCO3(4.00g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(5.81g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(8.61g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(11.4g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至60℃，滴加2M盐酸而调整至pH 1.4。于60℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(10.30g,收率约91.2％,PAE导入率69％,水分3.6％,211kDa)。
[实施例105]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.66g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.95g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.41g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.18g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至40℃，滴加2M盐酸而调整至pH3.5。于40℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅 拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.880g,收率约91.3％,PAE导入率60％,水分4.3％,203kDa)。
[实施例106]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.66g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.95g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.41g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.18g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至40℃，滴加2M盐酸而调整至pH2.5。于40℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.622g,收率约89.9％,PAE导入率61％,水分3.0％,220kDa)。
[实施例107]γ-PGA-PAE的合成
在2-L四颈烧瓶于室温下量取蒸馏水(950mL)和NaHCO3(4.00g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(5.81g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(8.61g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(11.4g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至40℃，滴加2M盐酸而调整至pH 1.4。于40℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(10.26g,收率约92.4％,PAE导入率69％,水分3.1％,235kDa)。
[实施例108]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.63g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.91g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.35g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.13g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌 1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(3.3mL)而调整至pH 4.0。于室温下进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.596g,收率约87.1％,PAE导入率61％,水分3.4％,207kDa)。
[实施例109]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.63g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.91g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.35g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.13g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(3.6mL)而调整至pH 3.5。于室温下进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.621g,收率约90.5％,PAE导入率61％,水分3.5％,208kDa)。
[实施例110]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.63g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.91g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.35g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.13g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(3.8mL)而调整至pH 3.0。于室温下进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.543g,收率约90.4％,PAE导入率63％,水分3.2％,210kDa)。
[实施例111]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.63g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(0.91g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.35g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.13g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。于室温下滴加2M盐酸(4.4mL) 而调整至pH 2.0。于室温下进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.397g,收率约90.4％,PAE导入率61％,水分3.1％,205kDa)。
[实施例112]γ-PGA-PAE的合成
在500-mL四颈烧瓶中于室温下量取蒸馏水(150mL)和NaHCO3(0.66g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA[0.95g,47kDa,利用GPC-Max(Viscotek公司)测定了绝对分子量]并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.41g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.01g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至40℃，滴加2M盐酸而调整至pH 3.5。于40℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(1.50g,收率约92％,PAE导入率54％,水分3.8％,78kDa)。
[实施例113]γ-PGA-PAE的合成
在2-L四颈烧瓶于室温下量取蒸馏水(950mL)和NaHCO3(4.00g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(5.81g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(8.61g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(7.22g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至60℃，滴加2M盐酸而调整至pH 3.0。于60℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(9.18g,收率约88.8％,PAE导入率58％,水分3.4％,132kDa)。
[实施例114]γ-PGA-PAE的合成
在2-L四颈烧瓶于室温下量取蒸馏水(950mL)和NaHCO3(4.00g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(5.81g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(8.61g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(7.22g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小 时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至80℃，滴加2M盐酸而调整至pH 3.0。于80℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(9.77g,收率约88.2％,PAE导入率57％,水分3.6％,86kDa)。
[实施例115]γ-PGA-PAE的合成
在2-L四颈烧瓶于室温下量取蒸馏水(950mL)和NaHCO3(4.00g)并进行了溶解。向其中添加γ-PGA(5.81g,148kDa)并在减压下进行30分钟搅拌之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(8.61g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(5.17g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至80℃，滴加2M盐酸而调整至pH 3.0。于80℃进行1小时搅拌之后，冷却至室温并进行了2小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(18mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(8.25g,收率约84.4％,PAE导入率44％,水分4.3％,55kDa)。
[实施例116]γ-PGA-PAE的合成
在100mL Scott瓶中于室温下量取蒸馏水(35mL)和1M NaOH(9.0mL)。向其中添加γ-PGA[1.21g,47kDa,利用GPC-Max(Viscotek公司)测定了绝对分子量]，进行15分钟搅拌而使其溶解之后，进行了冰浴冷却。冰浴冷却下，添加WSC.HCl(1.80g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。保持该状态搅拌5分钟，添加L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(PAE.HCl)(1.30g)，并利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。冰浴冷却下搅拌1小时之后，于室温下进行了20小时搅拌。加热至40℃，滴加2M盐酸(1.7mL)而调整至pH 3.5。冷却至室温并进行了1小时搅拌。抽滤滤取析出物，利用蒸馏水(20mL)进行了2次洗涤。对其在减压下、于室温进行干燥，得到了γ-PGA-PAE(2.1g,收率约93％,PAE导入率62％,水分3.3％)。
[实施例117-1～117-5]γ-PGA-PAE Na盐的制备
量取γ-PGA-PAE(1.00g,PAE导入率57％)和蒸馏水(10mL)。室温下进行搅拌的同时，滴加1M NaOH水溶液，分别调整至表1所示的pH。使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行脱盐之后，利用蒸馏水(5mL)进行了洗涤。 重复3次脱盐和洗涤操作，使所得溶液冻结之后，进行冷冻干燥，分别得到了表1所示的γ-PGA-PAE。
[表1]
[实施例118-1～118-12]γ-PGA-PAE Na盐的制备
量取γ-PGA-PAE(0.8g,PAE导入率57％)和蒸馏水(8mL)。室温下进行搅拌的同时，分别滴加了表2所示量的1.74M Na2CO3水溶液。使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行脱盐之后，利用蒸馏水(3mL)进行了洗涤。重复3次超滤和洗涤操作，使所得溶液冻结之后，进行冷冻干燥，分别得到了表2所示的γ-PGA-PAE。
[表2]
[实施例119]γ-PGA-(Bn)Cys-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-(Bn)Cys-OEt(100mg,导入率60％,实施例42)、DMSO(5.0mL)及100mg/mL Na2CO3水溶液(0.084mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-(Bn)Cys-OEt的DMSO水溶液(浓度20mg/mL)。对所 得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度20mg/mL,0.05mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.05mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用1X PBS(pH 7.4,0.10mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-(Bn)Cys-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-(Bn)Cys-OEt的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.00M NaCl,33nm(PDI0.18)；0.10M NaCl,102nm(PDI 0.08)；0.20M NaCl,211nm(PDI 0.17)。
将NaCl(29.2mg)溶解于大塚蒸馏水(5mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度20mg/mL,3.0mL)混合至溶液B的一部分[0.10MNaCl水溶液(3.0mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(6.0mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(10mL)而制成分散液C。利用1XPBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(87nm,PDI 0.09)。利用-30℃的冰柜使分散液C(4mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-(Bn)Cys-OEt的纳米粒子(15mg)。
[实施例120]γ-PGA-Trp-OEt的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-Trp-OEt(100mg,导入率56％,实施例43)、DMSO(5.0mL)及100mg/mLNa2CO3水溶液(0.128mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-Trp-OEt的DMSO水溶液(浓度20mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度20mg/mL,0.05mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.05mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用1X PBS(pH 7.4,0.10mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-Trp-OEt的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-Trp-OEt的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.00M NaCl,55nm(PDI0.12)；0.05M NaCl,92nm(PDI 0.10)；0.10M NaCl,153nm(PDI 0.07)。
将NaCl(14.6mg)溶解于大塚蒸馏水(5mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度20mg/mL,3.0mL)混合至溶液B的一部分[0.05MNaCl水溶液(3.0mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(6.0mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(10mL)，得到分散液C。利用1XPBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(95nm,PDI 0.13)。利用-30℃的冰柜使分散液C(4mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-Trp-OEt的纳米粒子(16mg)。
[实施例121]γ-PGA-PAE的纳米粒子的制备
量取γ-PGA-PAE(200mg,导入率62％,实施例116)、DMSO(10.0mL)及100mg/mLNa2CO3水溶液(0.178mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE的DMSO水溶液(浓度20mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度20mg/mL,0.05mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.05mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用1X PBS(pH 7.4,0.10mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。它们在使用各种浓度的NaCl水溶液进行制备的情况下的结果如下。即，0.00M NaCl,56nm(PDI 0.13)；0.05M NaCl,73nm(PDI 0.12)；0.06M NaCl,80nm(PDI 0.10)；0.08M NaCl,91nm(PDI 0.10)；0.10MNaCl,124nm(PDI 0.10)。
将NaCl(32.7mg)溶解于大塚蒸馏水(7.0mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度20mg/mL,4.5mL)混合至溶液B的一部分[0.08MNaCl水溶液(4.5mL)]中，得到了分散液。 接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(15mL)，得到分散液C。利用1X PBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(75nm,PDI0.11)。利用-30℃的冰柜使分散液C(6.0mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子(31mg,PAE导入率59％,水分3.4％)。
疫苗的制造
[实施例122]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
量取γ-PGA-PAE的纳米粒子(84.3mg,PAE导入率57％,实施例77)、10X PBS(pH7.4,0.744mL)及大塚蒸馏水(6.698mL)，进行1小时搅拌，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的分散液(浓度10mg/mL)。将所得溶液的一部分(2.0mL)利用1X PBS(8.0mL)进行稀释，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的分散液(2mg/mL)(79nm,PDI 0.27)。
在所得分散液(0.75mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.225mL)和蒸馏水(1.975mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原1.5μg以上；30μg以上/mL的使用了0.05mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例123]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
在上述中得到的分散液(0.75mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.225mL)和蒸馏水(2.02mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例124]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
将γ-PGA-PAE的纳米粒子的分散液(1mL,20mg/mL,PAE导入率57％,分散有实施例78的纳米粒子的分散液)利用1X PBS(9.0mL)进行稀释，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的分散液(2mg/mL)(78nm,PDI 0.22)。
在所得分散液(0.75mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.225mL)和蒸馏水(1.975mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原1.5μg以上；30μg以上/mL的使用了0.05mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例125]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
在上述中得到的分散液(0.75mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.225mL)和蒸馏水(2.02mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例126]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
量取γ-PGA-PAE(150mg,导入率60％,实施例105)、DMSO(5.45mL)及Na2CO3水溶液(5.2mg/0.55mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE的DMSO水溶液(浓度25mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度25mg/mL,0.10mL)迅速混合至0.05M NaCl水溶液(0.10mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.20mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。利用1X PBS(0.25mL)分散所得残留物，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。即，为0.05M NaCl,185nm(PDI0.10)。
将NaCl(11.7mg)溶解于大塚蒸馏水(4.0mL)中，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度25mg/mL,2.6mL)混合至溶液B的一部分[0.05MNaCl水溶液(2.6mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐 的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(12mL)，得到分散液C。利用1XPBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(197nm,PDI 0.10)。利用-30℃的冰柜使分散液C(3.0mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子(6mg,PAE导入率57％,水分2.2％)。在分散液C(0.765mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(1.885mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原1.5μg以上；30μg以上/mL的使用了0.05mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例127]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
在上述得到的分散液C(0.765mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(1.930mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例128]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
量取γ-PGA-PAE(150mg,PAE导入率54％,实施例112)、DMSO(4.45mL)及Na2CO3水溶液(6.0mg/0.55mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE的DMSO水溶液(浓度30mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度30mg/mL,0.10mL)迅速混合至蒸馏水(0.10mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.20mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。将所得残留物利用1X PBS(0.30mL)进行分散，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。即，为0.00M NaCl,199nm(PDI 0.11)。
将大塚蒸馏水(4.0mL)利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶 液B。将溶液A的一部分(浓度30mg/mL,2.2mL)混合至溶液B的一部分[蒸馏水(2.2mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(12mL)，得到分散液C。利用1X PBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(138nm,PDI 0.11)。利用-30℃的冰柜使分散液C的一部分(3.0mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子(12mg,PAE导入率53％,水分3.8％)。在分散液C的一部分(0.39mL)依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(2.26mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”,1.5μg以上；30μg以上/mL的使用了0.05mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例129]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
在上述得到的分散液C(0.39mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(2.305mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例130]γ-PGA-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
在实施例121中得到的γ-PGA-PAE的纳米粒子的分散液C的一部分(0.301mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(2.394mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例131]γ-PGA-D-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
量取γ-PGA-PAE(250mg,PAE导入率56％,实施例11)、DMSO(5.25mL)及Na2CO3水溶液(23.3mg/mL；1.0mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了γ-PGA-PAE的DMSO水溶液(浓度40mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度40mg/mL,0.10mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.10mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.20mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。将所得残留物利用1X PBS(0.4mL)进行分散，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了γ-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。即，0.05M NaCl,173nm(PDI0.10)；0.10M NaCl,293nm(PDI 0.26)；0.15M NaCl,385nm(PDI 0.39)。
使NaCl(14.6mg)溶解于大塚蒸馏水(5.0mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度40mg/mL,3.0mL)混合至溶液B的一部分[蒸馏水(3.0mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(23mL)，得到分散液C。利用1X PBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(128nm,PDI 0.07)。利用-30℃的冰柜使分散液C的一部分(3.0mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了γ-PGA-PAE的纳米粒子(11mg,PAE导入率55％,水分3.0％)。在分散液C的一部分(0.422mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(2.273mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例132]α-D-PGA-L-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
量取α-PGA-PAE(150mg,PAE导入率69％,实施例21)、DMSO(11.9mL)及Na2CO3水溶液(6.4mg/0.6mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了α-PGA-PAE的DMSO水溶液(浓度12mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度12mg/mL,0.10mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.10mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5 (Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.20mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。将所得残留物利用1X PBS(0.12mL)进行分散，得到了α-PGA-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了α-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。即，0.05M NaCl,155nm(PDI0.16)；0.06M NaCl,178nm(PDI 0.18)。
使NaCl(24.5mg)溶解于大塚蒸馏水(7.0mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度12mg/mL,5.0mL)混合至溶液B的一部分[0.06MNaCl(5.0mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(11mL)，得到分散液C。利用1X PBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(129nm,PDI 0.22)。利用-30℃的冰柜使分散液C的一部分(3.0mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了α-PGA-PAE的纳米粒子(13mg,PAE导入率66％,水分1.7％)。在分散液C的一部分(0.352mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(2.343mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例133]α-L-PGA-L-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
量取α-PGA-PAE(60mg,PAE导入率69％,实施例19)、DMSO(9.4mL)及Na2CO3水溶液(6.3mg/0.6mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了α-PGA-PAE的DMSO水溶液(浓度6mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度6mg/mL,0.10mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.10mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.20mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。将所得残留物利用1X PBS(0.06mL)进行分散，得到了α-PGA-PAE的纳米粒子 的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了α-PGA-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。即，0.10M NaCl,86nm(PDI0.13)；0.12M NaCl,119nm(PDI 0.15)；0.14M NaCl,173nm(PDI 0.16)；0.15M NaCl,374nm(PDI 0.30)。
使NaCl(98.2mg)溶解于大塚蒸馏水(12.0mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度6mg/mL,9.0mL)混合至溶液B的一部分[0.14MNaCl(9.0mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(20mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(9mL)，得到分散液C。利用1X PBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(183nm,PDI 0.18)。利用-30℃的冰柜使分散液C的一部分(3.0mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了α-PGA-PAE的纳米粒子(6mg,PAE导入率57％,水分2.4％)。在分散液C的一部分(0.769mL)中依次混合10XPBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(1.926mL)、以及市售的HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL)，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例134]αβ-DL-Poly Asp-L-PAE的纳米粒子和HA抗原的混合液的制备
量取αβ-DL-Poly Asp-L-PAE(100mg,PAE导入率62％,实施例23)、DMSO(9.6mL)及Na2CO3水溶液(14.1mg/0.4mL)，于室温下进行2小时搅拌而进行溶解，得到了αβ-DL-PolyAsp-L-PAE的DMSO水溶液(浓度10mg/mL)。对所得溶液利用针筒式滤器(Corning,0.2μm)进行过滤，将其作为溶液A。
将该溶液A的一部分(浓度10mg/mL,0.05mL)迅速混合至各种浓度的NaCl水溶液(0.05mL)中，得到分散液。接着，使用Amicon Ultra 0.5(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(0.10mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了2次。将所得残留物利用1X PBS(0.05mL)进行分散，得到了αβ-DL-PolyAsp-L-PAE的纳米粒子的溶液(10mg/mL)。接着，利用Zetasizer Nano ZS(Malvern公司)测定了 αβ-DL-Poly Asp-L-PAE的纳米粒子的平均粒径[Z-Ave d.(nm)]和粒径分散指数(PDI)。即，0.05M NaCl,86nm(PDI 0.13)；0.10M NaCl,111nm(PDI 0.10)；0.15M NaCl,155nm(PDI 0.04)；0.18M NaCl,192nm(PDI 0.20)；0.20M NaCl,220nm(PDI 0.06)。
使NaCl(105.2mg)溶解于大塚蒸馏水(10.0mL)，利用针筒式滤器(0.2μm)进行了过滤。将其作为溶液B。将溶液A的一部分(浓度10mg/mL,7.0mL)混合至溶液B的一部分[0.18MNaCl(7.0mL)]中，得到了分散液。接着，使用Amicon Ultra 15(Millipore公司,10K)进行了脱盐(离心条件4500rpm,30min,5℃)。将利用蒸馏水(20mL)分散所得残留物之后再次进行脱盐的操作实施了5次。在所得残留物中加入蒸馏水(12mL)，得到分散液C。利用1X PBS(1.0mL)分散分散液C的一部分(0.05mL)，得到了纳米粒子的分散液(225nm,PDI 0.03)。利用-30℃的冰柜使分散液C的一部分(3.0mL)冻结。对其进行冷冻干燥，得到了αβ-DL-PolyAsp-L-PAE的纳米粒子(14mg,PAE导入率60％,水分4.5％)。在分散液C的一部分(0.337mL)中依次混合10X PBS(pH 7.4,0.30mL)和蒸馏水(2.358mL)、以及市售的HA抗原[DenkaSeiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL,HA抗原0.15μg以上；30μg以上/mL的使用了0.005mL)，制备了HA疫苗(3.0mL)。
[实施例135]
使用了HA抗原与γ-PGA-PAE的纳米粒子的混合液的细胞性免疫诱导实验
A.材料
含有0.05％tween 20的磷酸缓冲液(PBS-T),脱脂乳(和光纯药工业,198-10605),BSA(Sigma,A7030),HRP标记的抗小鼠IgG抗体(Abcam,Ab7068),TMB底物溶液(Sigma,T0440-100mL),TMB终止溶液(CST,7002L),孔板(96孔平底板,Nunc,112372),HA抗原[DenkaSeiken市售品,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为：每1株包含30μg以上/mL],氢氧化铝凝胶(经过灭菌)[Alum: 2.0mg/mL,容量1.0mL,pH 7.045,生理盐水(0.85％NaCl)],利用前述实施例的方法制备的各种γ-PGA-PAENP。各种疫苗溶液是HA抗原(0.1μg或0.01μg)及γ-PGA-PAE的纳米粒子(相当于100μg)的PBS(200μL)溶液。使用了小鼠(BALB/c系雌性小鼠,7周龄,Charles River LaboratoriesJapan株式会社)。
B.方法
将小鼠(BALB/c系雌性小鼠,7周龄)驯化喂养约1周之后，使用1-mL注射器、以4周间隔2次地将受试物质向小鼠的皮下进行200μL皮下给药。在最终免疫的2周之后采集了血清。血清的采集如下地进行：将在戊巴比妥麻醉下从心脏进行全血采集而得到的血液于常温下静置过夜之后，进行离心分离(3000rpm,20min)，将血清分注为2支，于-80℃进行冷冻。使用经过冷冻保存的血清评价了抗体效价。
受试物质的制备
(1)受试物质1的制备
在无菌的深低温小瓶(cryogenic vial)(Corning)中量取大塚蒸馏水(4.5mL)和X10 PBS(pH 7.4,0.50mL)，并进行充分搅拌。将该溶液利用针筒式滤器(0.2μm)进行过滤，得到溶液A。从该溶液A中量取3.0mL作为PBS的制备液(不含HA的空白溶液)。
(2)受试物质2的制备
在无菌的深低温小瓶(Corning)中量取大塚蒸馏水[利用针筒式滤器(0.2μm)进行过滤后的蒸馏水2650μL]和X10 PBS[pH 7.4,利用针筒式滤器(0.2μm)进行过滤后的300μL]，并进行充分搅拌。在该溶液中混合市售HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL:相当于各株的HA含量(相当量)为1.5μg以上；即，30μg以上/mL的使用了0.05mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)(“以上”的表述基于产品说明书)。该疫苗的HA浓度为0.5μg/mL以上。
(3)受试物质3的制备
在无菌的深低温小瓶(Corning)中量取大塚蒸馏水[利用针筒式滤器(0.2μm)进行过滤后的蒸馏水2695μL]和X10 PBS[pH 7.4,利用针筒式滤器(0.2μm)进行过滤后的X10PBS 300μL]，并进行充分搅拌。在该溶液中混合市售 HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL:相当于各株的HA含量(相当量)为0.15μg以上；即，30μg以上/mL的使用了0.005mL]，制备了HA疫苗(3.0mL)(“以上”的表述基于产品说明书)。该疫苗的HA浓度为0.05μg/mL以上。
(4)受试物质4的制备
在无菌的深低温小瓶(Corning)中量取氢氧化铝凝胶(Alum)(经过灭菌)[Alum:2.0mg/mL,容量1.0mL,pH 7.045,生理盐水(0.85％NaCl)]0.375mL，然后量取大塚蒸馏水(0.973mL)和X10 PBS(pH 7.4,0.15mL)，并进行充分搅拌。在该溶液中依次混合市售HA抗原[Denka Seiken,流感HA疫苗“SEIKEN”：有效成分包含以下的3株(A/California/7/2009(H1N1)pdm09株；A/Texas/50/2012(H3N2)株；B/Massachusetts/2/2012株),各株的HA含量(相当量)为每1株包含30μg以上/mL:相当于各株的HA含量(相当量)为0.075μg以上；即，30μg以上/mL的使用了0.0025mL]，制备了对照用HA疫苗(1.5mL)(”以上”的表述基于产品说明书)。该疫苗的HA浓度为0.05μg/mL以上。
(5)受试物质5的制备
代替Alum而使用了γ-PGA-PAE的纳米粒子的实施例127，与受试物质4同样地制备了HA疫苗(3.0mL)。该疫苗的HA浓度为0.05μg/mL以上。
(6)受试物质6的制备
代替Alum而使用了γ-PGA-PAE的纳米粒子的实施例129，与受试物质4同样地制备了HA疫苗(3.0mL)。该疫苗的HA浓度为0.05μg/mL以上。
(7)受试物质7的制备
代替Alum而使用了γ-PGA-PAE的纳米粒子的实施例130的γ-PGA-PAE，与受试物质4同样地制备了HA疫苗(3.0mL)。该疫苗的HA浓度为0.05μg/mL以上。
(8)受试物质8的制备
代替Alum而使用了γ-PGA-PAE的纳米粒子的实施例125，与受试物质4同样地制备了HA疫苗(3.0mL)。该疫苗的HA浓度为0.05μg/mL以上。
C.评价方法
作为评价项目，评价了单克隆抗体(mAb)对HA蛋白的效价。
将HA抗原(含有0.025μg以上,包被缓冲液(coating buffer)100μL)添加于孔板，冷藏过夜之后，使用洗板机(microplate washer)、利用PBS-T洗涤6次。向该孔板添加封闭缓冲液(block buffer)(200μL)，使其于室温下作用2小时之后，同样地利用PBS-T进行了6次洗涤。向该孔板添加[受试物质溶液(血清/空白等参见表3),100μL]，使其于室温下作用2小时之后，同样地利用PBS-T进行了6次洗涤。向该孔板添加抗小鼠IgG抗体(100μL)，使其于室温下作用2小时之后，同样地利用PBS-T进行了6次洗涤。向孔板添加TMB底物溶液(100μL)并使其于室温下作用10分钟之后，添加了TMB停止溶液(100μL)。使用平板读取器对在此得到的溶液测定了450nm的吸收。
[表3]
D.结果
这些结果(参见表3及图1)表明，本发明中制造/制备的γ-PGA-PAE的纳米粒子作为佐剂具有极为优异的性能。
[实施例136]γ-PGA-PAE Na盐的物性
上述合成的γ-PGA-PAE Na盐的相对分子量、单体单元中的x、y、z的值、及接枝共聚物中的单体单元的总数(n)如下表所示。
表中的相对分子量是利用SEC-HPLC测定中的分子量测定法而得到的。TSKgelα-M300X7.8mm I.D.(dual),5mM NaNO3DMSO:H2O(9:1),0.8mL/分,40℃,RI检测器,标准：普鲁兰(Shodex)。
表中的x、y及z的值可采用以下所示的实验方法、及以下所示的(式1)及(式2)所示的计算式而得到。作为例子，示出了γ-PGA-PAE(Na盐)的计算式。
x：如果下述的[y]、[z]确定，则可由式2算出。
y：可通过利用原子吸收光谱分析、LCMS进行Na离子的定量而算出。
z：作为PAE的导入率，利用1H-NMR而算出。
γ-PGA-PAE(Na盐)的分子量:可通过使用了SEC-HPLC的相对分子量的确定方法、或使用了基于GPC-Max(Viscotek公司)等的粘度计、DLS检测器、SLS检测器等的绝对分子量的确定而算出。
n：接枝共聚物中的谷氨酸单体数(Glu数)。
[数学式4]
γ-PGA-PAE(Na盐)的分子量＝[N末端的氢的分子量]+[(-Glu-OH-的分子量)×
([n]×[x])]+[(-Glu-ONa-的分子量)×([n]×[y])]+[(-Glu-Phe-OEt-的分子量)×([n]×[z])]
+[-C末端的羟基(或其钠盐)的分子量]＝[1.007947×1]+[(12.0111×5+1.007947)
×7+15.99943×3+14.00675×1+22.98977×0]×([n]×[x])+[(12.0111×5+1.007947×6+15.999
43×3+14.00675×1+22.98977×1)×([n]×[y])]+[(12.0111×16+1.007947×20+15.99943×4+
14.00675×2+22.98977×0)×([n]×[z])]+[15.99943×1+(1.007947×1或22.98977×1)]
(式1)
[数学式5]
[x]+[y]+[z]＝1 (式2)
接枝共聚物中的谷氨酸单体数(Glu数)是将上述的式子表格化至Excel.2010(Microsoft公司)、由所得实验结果而算出的。结果如下表所示。
表中的接枝共聚物中的单体单元的总数(n)是由接枝共聚物中的谷氨酸单体数(Glu数)而导出的数。
[表4]
*1 PAE侧链的乙基酯发生了相当于21％的水解。
[实施例137]疏水性参数K(Clog P)的算出(计算值)
利用ChemDraw Ultra(12.0.2.1076),Cambridgesoft计算出按照上述实施例制造的接枝共聚物(γ-PGA-PAE)及由其离子化而成的共聚物的Clog P值。结果如下表所示。
[表5]
[实施例138]疏水性参数K(logPow)的测定(实测值)
将按照实施例118-8合成的γ-PGA-PAE[37mg,n＝403,x:y:z(12:28:59)]悬浮于1-辛醇(和光特级,20mL)、蒸馏水(20mL)中进行搅拌，放置过夜。利用0.2μm的过滤器进行过滤。从有机层和水层分别利用移液管各取样5mL并混合，缓慢搅拌1h之后，静置。从有机层和水层分别利用移液管各取样2mL于25mL容量瓶中。在这些溶液中分别添加2M氢氧化钠水溶液(10mL)，在外温50℃下进行了2h水解。向各自中添加2M盐酸水溶液(10mL)而进行中和之后，进行定容。利用HPLC(Sunniest RP-AQUA 100X2.0mm i.d.3μm,UV 220nm,60℃,0.4mL/min；流动相A:0.1％TFA aq.；流动相B:0.1％TFA/MeCN；Program 0-5min 5％B,5-15min 5-35％B,15-18min 35％B,18-23min,75％B；23.01min 5％B,Cycle:30min.)对该来自水层的样品(A)和来自有机层的样品(B)中的苯丙氨酸进行了定量分析。
结果，(A)的苯丙氨酸含量为(A)0.012875mg、(B)的苯丙氨酸含量为 0.003700mg。由此，log Pow＝log10(0.003700/0.012875)＝log10(0.2874)＝-0.542。
工业实用性
根据本发明，能够在短时间内并且以高收率获得聚氨基酸或其盐与疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物的游离形式，并能够以少量的溶剂量获得经过了离子化的接枝共聚物。
所得接枝共聚物的游离形式不易发生潮解，因此易于操作，作为原材料而稳定，由于能够获知对于高分子结构的判定而言重要的N末端的状态，因此容易实现品质的管理。
进而，在对接枝共聚物的游离形式进行纳米粒子化时，通过调整离子种类、离子化量，能够取得接枝共聚物的疏水性的平衡，获得与目标相符的纳米粒子。
另外，满足本发明的经过了离子化的接枝共聚物能够实现制造纳米粒子的工序的高浓度化，尽管如此，也能够抑制所得纳米粒子的凝聚，可通过调整离子化量而提高形成/获得与目标相符的纳米粒子的再现性。

Claims (12)

1.接枝共聚物的制造方法，所述接枝共聚物是聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2所示的疏水性伯胺化合物或其盐的接枝共聚物，所述聚氨基酸选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)，在通式(I):A-NH2中，A表示疏水性部位，
其中，该制造方法包括下述工序：
(1)使所述聚氨基酸或其盐与所述通式(I)所示的疏水性伯胺化合物或其盐缩合而得到接枝共聚物的工序；以及
(2)在40～70℃的温度下使工序(1)中得到的接枝共聚物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，聚氨基酸为聚(γ-谷氨酸)。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，疏水性伯胺化合物为α-氨基酸衍生物。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，α-氨基酸衍生物为苯丙氨酸衍生物。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，苯丙氨酸衍生物为苯丙氨酸乙酯。
6.制造聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物的方法，所述聚氨基酸选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)，在通式(I):A-NH2中，A表示疏水性部位，
其中，该制造方法包括下述工序：
(1)使聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2所示的疏水性伯胺化合物或其盐缩合的工序，所述聚氨基酸选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)，在通式(I)中，A表示疏水性部位；
(2)使工序(1)中得到的缩合物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序；
(3)使在工序(2)中分离出的接枝共聚物与碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐、碱金属的碳酸氢盐、碱金属的磷酸盐、碱金属的磷酸一氢盐、碱金属的磷酸二氢盐、碱金属的有机酸盐、或碱金属的酸性氨基酸盐作用，从而对接枝共聚物进行离子化的工序。
7.下述通式(II)所示的经过了离子化的接枝共聚物，
式中，
M表示碱金属，
A表示疏水性部位，
n表示10～100,000的整数，
3种单体单元间的斜线表示单体单元的排列顺序不规则，
x表示通式(III)所示的单体单元的摩尔分数，
y表示通式(IV)所示的单体单元的摩尔分数，
z表示通式(V)所示的单体单元的摩尔分数，
x、y及z满足下式：
0≤x＜1；
0.05＜y＜0.5；
0＜z＜1；及
x+y+z＝1。
8.根据权利要求7所述的经过了离子化的接枝共聚物，其中，通式(III)所示的单体单元的摩尔分数x为0。
9.根据权利要求7所述的经过了离子化的接枝共聚物，其中，n为50～10,000。
10.根据权利要求7所述的经过了离子化的接枝共聚物，其具有-15,000～0的疏水性参数K。
11.纳米粒子的制造方法，所述纳米粒子包含聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2所示的疏水性伯胺化合物或其盐的经过了离子化的接枝共聚物，所述聚氨基酸选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)，在通式(I):A-NH2中，A表示疏水性部位，
该方法包括下述工序：
(1)使聚氨基酸或其盐与通式(I):A-NH2所示的疏水性伯胺化合物或其盐缩合的工序，所述聚氨基酸选自聚(γ-谷氨酸)、聚(α-谷氨酸)及聚(天冬氨酸)，在通式(I)中，A表示疏水性部位；
(2)使工序(1)中得到的缩合物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序；
(3)使在工序(2)中分离出的接枝共聚物与碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐、碱金属的碳酸氢盐、碱金属的磷酸盐、碱金属的磷酸一氢盐、碱金属的磷酸二氢盐、碱金属的有机酸盐、或碱金属的酸性氨基酸盐作用，从而对接枝共聚物进行离子化的工序；
(4)对工序(3)中得到的经过了离子化的接枝共聚物进行纳米粒子化的工序。
12.根据权利要求11的制造方法，该方法包括下述工序：
(2)在40～70℃的温度使工序(1)中得到的缩合物与酸作用从而分离接枝共聚物的工序。
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