JPWO2014042237A1 - 糖質酸化酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents
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- C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
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Abstract
Description
[1] 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
(1)作用:糖を酸化して糖酸を生成する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1。
[2] 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[1]に記載のタンパク質。
[3] 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
(1)作用:糖を酸化して糖酸を生成する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。
[4] [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[3]に記載のタンパク質。
[5] 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[4]に記載のタンパク質。
[6] 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
(1)作用:糖を酸化して糖酸を生成する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)至適pH:5.0〜9.0。
(4)安定pH範囲:5.0〜10.5。
(5)至適温度:20℃〜55℃。
(6)温度安定性:45℃以下で安定。
(7)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。
[7] [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[6]に記載のタンパク質。
[8] 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[7]に記載のタンパク質。
[9] 以下の理化学的性質を有するAcremonium属微生物由来のタンパク質。
(1)作用:糖を糖酸へ酸化する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1。
[10] 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[9]に記載のタンパク質。
[11] 以下の理化学的性質を有するAcremonium属微生物由来のタンパク質。
(1)作用:糖を糖酸へ酸化する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。
[12] [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[11]に記載のタンパク質。
[13] 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[12]に記載のタンパク質。
[14] 以下の理化学的性質を有するAcremonium属微生物由来のタンパク質。
(1)作用:糖を糖酸へ酸化する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)至適pH:5.0〜9.0。
(4)安定pH範囲:5.0〜10.5。
(5)至適温度:20℃〜55℃。
(6)温度安定性:45℃以下で安定
(7)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。
[15] [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[14]に記載のタンパク質。
[16] 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、[15]に記載のタンパク質。
[17] 前記Acremonium属微生物が、Acremonium chrysogenumである[9]から[16]に記載のタンパク質。
[18] 以下の(a)、(b)または(c)に記載のタンパク質。
(a)配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。
(c)配列番号10で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。
[19] [18]に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
[20] 以下の(a)、(b)または(c)に記載のDNAからなる遺伝子。
(a)配列番号6で表される塩基配列からなるDNA。
(b)配列番号6で表される塩基配列において、1から数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号6で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[21] 以下の(a)、(b)または(c)に記載のDNAからなる遺伝子。
(a)配列番号9で表される塩基配列からなるDNA。
(b)配列番号9で表される塩基配列において、1から数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号9で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[22] [19]から[21]のいずれか一項に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
[23] [22]に記載の組み換えベクターにより宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体。
[24] [1]から[18]のいずれか一項に記載のタンパク質の生産能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、[1]から[18]のいずれか一項に記載のタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。
[25] [23]に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物から糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。
[26] [1]から[18]のいずれか一項に記載のタンパク質を用いて、糖質から糖酸を製造する糖酸の製造方法。
[27] 食品内の糖質を酸化するための、[1]から[18]のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
[28] [27]に記載のタンパク質の使用を少なくとも行う卵白の脱糖方法。
[29] [28]に記載の脱糖方法を用いた脱糖卵白の製造方法。
[30] [27]に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うパンの品質および/またはドウの物性の改質方法。
[31] [30]に記載の改質方法を用いたパンの製造方法。
[32] [27]に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うラクトビオン酸の製造方法。
本発明に係るタンパク質は、後述する理化学的性質を有するタンパク質である。
本発明に係るタンパク質は、酸素存在下において、後述する糖を酸化し糖酸を生成する。より詳しくは、酸素存在下において、後述する糖に本発明に係るタンパク質を作用させると、糖酸と過酸化水素が生成する。
本発明に係るタンパク質は、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに対し活性を示す。各基質に対する本発明に係るタンパク質の相対活性は、グルコースに対する活性を100%とした場合、マルトトリオース:約92%、マルトース:約86%、ガラクトース:約79%、マルトテトラオース:約60%、ラクトース:約58%、セロビオース:約53%である(後述する実施例2参照)。
なお、本発明においては、グルコースを基質とした場合の活性を基準(100%)としたときの相対活性が50%以上あれば、「本酵素が良好に作用する基質である」と判断した。
本発明において、タンパク質のKm値(ミカエリス定数)の具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。本発明では、特に、後述する実施例8に記載の方法によって、Km値を算出した。本発明に係るタンパク質のKm値は特に限定されないが、[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1であることが好ましく、0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1であることがより好ましい。
本発明に係るタンパク質は、SDS−PAGE法による分子質量が約63kDaである。
本発明に係るタンパク質は、37℃で5分間の反応条件において、pH5.0〜9.0付近で最も糖質酸化酵素活性が高い。
本発明に係るタンパク質は、37℃で15分間の処理条件において、pH5.0〜10.5付近において安定である。
本発明に係るタンパク質は、pH7.0で5分間の反応条件において、20℃〜55℃付近で最も糖質酸化酵素活性が高い。
本発明に係るタンパク質は、pH7.0で15分間の処理条件において、45℃までの温度条件で処理しても80%以上の活性を維持する。
以上説明した本発明に係るタンパク質は、前述の理化学的性質に従来にない特徴を持つため、前述の理化学的性質で特定されるタンパク質であれば、その由来は特に限定されない。本発明においては、例えば、Acremonium属に属する微生物に由来するものが挙げられる。この場合、Acremonium属に属する微生物としては、Acremonium chrysogenumが挙げられる。
本発明に係るタンパク質は、前述の理化学的性質に従来にない特徴を持つため、前述の理化学的性質で特定されるタンパク質であれば、そのアミノ酸構造は限定されないが、一例を挙げると、以下のアミノ酸配列により特定することができる。
即ち、配列番号10のアミノ酸配列と、例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有することを指す。
(1)遺伝子
本発明では、前記タンパク質をコードする遺伝子を提供する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号10のアミノ酸配列をコードするDNAを含む。当該態様の具体例は、配列番号6または配列番号9の塩基配列からなるDNAである。
本発明に係る遺伝子は、適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明において用いることができるベクターの種類は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター(アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等)の形態をとり得る。
本発明に係る組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161−7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413−7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366−370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557−580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339−346(1989))、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470−1474(1984))等によって実施することができる。
本発明に係る糖質酸化酵素活性を有するタンパク質の製造方法は特に限定されず、公知の方法を自由に採用することができる。具体的には、本発明に係るタンパク質は、本発明に係るタンパク質の生産能を有する微生物または本発明に係る形質転換体を栄養培地で培養して得られる培養物から、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を採取することで製造することができる。
本発明のタンパク質の具体的な使用形態は特に限定されないが、例えば酵素剤の形態で提供することができる。酵素剤は、有効成分(本発明のタンパク質)の他、薬理学的に許容される添加剤を1種または2種以上自由に選択して含有させることができる。例えば、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D−グルコース、ソルビトール、D−マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
本発明に係るタンパク質は、卵白の脱糖に好適に用いることができる。
卵白内に含まれるグルコースなどの糖は、例えば、菓子などを製造する際、メイラード反応による着色を起こすという問題がある。そこで、従来から、菓子などの製造には、脱糖卵白が使用されている。
本発明に係るタンパク質は、パンの品質および/またはドウの物性の改質に好適に用いることができる。
具体的には、製パンに用いられる材料中に含まれる糖質を酸化して過酸化水素を発生させることにより、パンの生地(ドウ)を引き締め、製造工程におけるベタつきを軽減させて、ハンドリングし易く物性改良することができる。
本発明に係るタンパク質は、ラクトースに対しても作用するため、ラクトースを酸化させてラクトビオン酸を製造する方法に好適に用いることができる。
しかし、本発明に係るタンパク質を用いることで、酵素法によるラクトビオン酸の製造が可能となる。
<糖質酸化酵素活性測定方法>
0.15%(W/V)フェノール及び0.15%(W/V)トリトンX−100を含む0.1Mリン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液(pH7.0)2ml、10%マルトース一水和物溶液0.5ml、25U/mLペルオキシダーゼ溶液0.5ml、及び0.4%(W/V)4−アミノアンチピリン溶液0.1mlを混合し、37℃で10分保温後、酵素溶液0.1mlを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に、波長550nmに吸収を持つキノンイミン色素が生成されるため、1分間あたりの波長550nmにおける吸光度の増加を測定することにより糖質酸化活性を測定した。なお、1分間に1μmolのマルトース一水和物を酸化するのに必要な酵素量を1単位とした。
実施例1では、本発明に係る糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を精製した。なお、以下の実施例では、本発明に係るタンパク質の生産能を有する微生物の一例として、Acremonium属微生物であるAcremonium chrysogenumを用いた。
Acremonium chrysogenum NBRC30055、ATCC15006、DSM880の3株を前培養後、下記表1に示す組成の液体培地を用いて、30℃、6日間振盪培養を行った。培養後、培養液をNo.2のろ紙(アドバンテック東洋製)でろ過することにより、培養ろ液を回収した。得られた培養ろ液中の糖質酸化酵素活性を、前記糖質酸化酵素活性測定法にて測定した。その結果を表2に示す。
前記で得られた培養ろ液を、ラヂオライトファインフローA(昭和化学工業製)を用いて珪藻土ろ過し、次いでUF膜(AIP−1013D、旭化成製)にて濃縮後、65%飽和濃度になるよう硫酸アンモニウムを添加し、得られた上清に90%飽和濃度となるよう硫酸アンモニウムを添加した。得られた沈殿画分を、2M硫酸アンモニウムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解した。2M硫酸アンモニウムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)にて平衡化したHiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPカラム(GEヘルスケア製)に供し、2Mから0Mの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、吸着した糖質酸化酵素タンパク質を溶離させた。
実施例2では、各基質に対する基質特異性を調べた。
上記糖質酸化酵素活性測定法に準じ、各緩衝液(グリシン―塩酸緩衝液(pH2.0、pH3.0)、クエン酸―クエン酸ナトリウム緩衝液(pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0)、リン酸一カリウム―リン酸二カリウム緩衝液(pH6.0、pH7.0、pH8.0)、トリス―塩酸緩衝液(pH8.0、pH9.0)、炭酸ナトリウム―炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.0、pH10.0、pH11.0)、リン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液(pH7.0))中、37℃で5分間の反応条件下で測定した。また、リン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液(pH7.0)を用いたときの活性を100%として、それぞれの相対活性値を算出した。結果を図2の図面代用グラフに示す。至適pHは5.0〜9.0であった。
前記実施例1で精製したタンパク質溶液と、前記実施例3で用いた各pH緩衝液を等量混合し、37℃で15分処理後、上記糖質酸化酵素活性測定法にて活性を測定した。なお、基質としては、マルトースを用いた。また、リン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液(pH7.0)を用いて処理したときの活性を100%として、それぞれの相対活性値を算出した。結果を図3の図面代用グラフに示す。pH5.0からpH10.5の範囲では、85%以上の残存活性を有しており、pH5.0からpH10.5の範囲では安定であった。
マルトースを基質として、酸素の存在下にて、前記実施例1で精製したタンパク質をpH7.0、反応温度を20℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃及び65℃で5分間作用させ、過酸化水素を生成させた。生成した過酸化水素に、アミノアンチピリン、TOOS(株式会社同仁化学研究所製)の存在下でペルオキシダーゼを作用させ、生成したキノンイミン色素の呈する色調を波長555nmで測定し、定量した。また、反応温度を37℃としたときの活性を100%として、それぞれの相対活性値を算出した。結果を図4の図面代用グラフに示す。至適温度は20℃〜55℃であった。
前記実施例1で精製したタンパク質溶液を、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃及び80℃の各温度下、15分間熱処理した後、残存活性を上記糖質酸化酵素活性方法にて測定した。熱に対して未処理の活性を100%として、それぞれの残存活性値を算出した。結果を図5の図面代用グラフに示す。45℃、15分間の熱処理では、80%以上の残存活性を有しており、45℃までは安定であった。
前記実施例1で精製したタンパク質について、SDS−PAGE法により分子質量を算出した結果、約63kDaであることが分かった。
前記実施例1で精製したタンパク質について、グルコース、マルトースを基質として、上記糖質酸化酵素活性方法にて活性測定を行い、Hanes−Woolfプロットから、それぞれのミカエリス定数(Km)を求めた。この結果、グルコースに対するKm値は8mM、マルトースに対するKm値は14mMであることが判明した。
実施例9では、前記実施例1で精製したタンパク質およびグルコースオキシダーゼ(「ハイデラーゼ15」天野エンザイム株式会社製)を用いて、卵白の脱糖を行った。
卵白と卵黄を分け、泡だて器で卵白が泡立たない程度で水溶卵白と濃厚卵白を混合し、駒込ピペットを用いて、20mLずつ100mLフラスコに分注した。分注したそれぞれの100mLフラスコに、攪拌子を入れ、ウォーターバス付きスターラーで強めに攪拌することにより、卵白を調製した。
前記で調製した卵白に、前記実施例1で精製したタンパク質6Uもしくは15U、グルコースオキシダーゼ6Uもしくは15Uをそれぞれ添加し、水分の蒸発を防ぐためにアルミホイルでフタをして、反応をスタートさせた。
前記でサンプリングしたそれぞれの卵白について、残存するグルコース量を測定した。グルコース量の測定は、処理卵白溶液中のα‐D‐グルコースをムタロターゼによりβ‐D‐グルコースとした後、β‐NAD+存在下、グルコースデヒドロゲナーゼでD‐グルコノ‐1,5‐ラクトンへと変換する。その際に生じるβ‐NADH+を波長340nm
で測定することで定量した。
結果を図6の図面代用グラフに示す。図6の図面代用グラフに示す通り、グルコースオキシダーゼを用いた場合に比べ、本発明に係るタンパク質を用いて脱糖を行った場合の方が、脱糖後の卵白における残存グルコースの量が、優位に低下することが分かった。
実施例10では、卵白脱糖後の熱失活条件について検討を行った。
具体的には、実施例9と同様に調製した卵白に、本発明に係るタンパク質およびグルコースオキシダーゼを、それぞれ15U添加し、5時間脱糖反応を行った。脱糖反応後の卵白100μLを54、56、58℃の温度で、それぞれ1、3、5、8分加熱処理した後に氷冷し、各酵素の残存活性を測定した。
実施例11では、前記実施例1で精製したタンパク質、グルコースオキシダーゼ(「ハイデラーゼ15」天野エンザイム株式会社製)およびヘミセルラーゼ(「ヘミセルラーゼ「アマノ」90」天野エンザイム株式会社製)を用いて、パンの製造を行った。
山型パン用基本材料(強力粉260g;砂糖10.9g;食塩5.2g;ショートニング;7.8g;脱脂粉乳7.8g;ドライイースト3.1g;精製水192ml)またはこの材料に前記実施例1で精製したタンパク質10Uを添加したもの、同じくこの材料に前記実施例1で精製したタンパク質10Uとヘミセルラーゼ100ppmを添加したもの、グルコースオキシダーゼ10Uを添加したものをそれぞれ調製し、ホームベーカリーSD‐BMS102(パナソニック株式会社製)に供した。
焼きあがった各サンプルのパンの重量、ボリューム(菜種置換法)を測定した。また、焼き上がりから2時間後に、ボリューム(菜種置換法)を測定し、各サンプルのパンをそれぞれビニール袋に入れ、口を輪ゴムで縛り、25℃で4日間保管した。保管1日目にパンを2cmの厚さにスライスした。保管1日目と4日目にパンの中央部を直径47mmの円柱状にカットした。各サンプルのパンの硬さを、SUN RHEO METER COMPAC―100II(株式会社サン科学製)を用いて圧縮スピード1mm/秒で10mm圧縮したときの最大荷重で測定した。
前記で測定したボリュームを図10、パンの硬さを図11に示す。図10および11に示す通り、グルコースオキシダーゼに比べ、本発明に係るタンパク質を用いた方が、ボリュームが減り、硬さが増す結果となった。これは、生地の引き締め効果が強いことを意味する。即ち、本発明に係るタンパク質を用いれば、従来のグルコースオキシダーゼに比べて、少ない量でパンの物性を改善できることが分かった。また、ヘミセルラーゼとの併用で酵素無添加と同程度のボリュームにすることができた。グルコースオキシダーゼに比べ、本発明に係るタンパク質を用いた方が、生地のベタつきが減少し、機械に付着しにくくなり、製造時のハンドリングが向上することも分かった。
実施例12では、前記実施例1で精製したタンパク質、グルコースオキシダーゼ(「ハイデラーゼ15」天野エンザイム株式会社製)およびヘミセルラーゼ(「ヘミセルラーゼ「アマノ」90」天野エンザイム株式会社製)を用いて、パンの製造を行った。
山型パン用基本材料(強力粉260g;砂糖10.9g;食塩5.2g;ショートニング;7.8g;脱脂粉乳7.8g;ドライイースト3.1g;精製水192ml)またはこの材料に前記実施例1で精製したタンパク質17Uを添加したもの、同じくこの材料にグルコースオキシダーゼ17Uを添加したもの、ヘミセルラーゼ50ppmを添加したもの、アスコルビン酸50ppmを添加したものをそれぞれ調製し、ホームベーカリーSD―BMS102(パナソニック株式会社製)に供した。パン生地コースでスタートし、1時間終了後、パン生地を取り出し、トスロン密閉容器(角型)に入れ、室温にて30分放置した。
前記で調製した生地の扱いやすさを下記表5に示す。
実施例13では、前記実施例1で精製したタンパク質を用いて、ラクトビオン酸の製造を行った。
ラクトース一水和物0.75g、炭酸カルシウム0.225g、前記実施例1で精製したタンパク質3Uを含む溶液を3ml添加し、40℃、160rpmの条件で23時間振とうした。
反応後のサンプルを10分間煮沸した後、15,000rpmで10分間遠心した。得られた上澄みを0.45μmのフィルターでろ過し、HPLC分析に供した。HPLC分析条件は下記表6に示す通りである。
(a)染色体DNAの単離
Acremonium chrysogenum NBRC30055を下記表7に示すYPD培地100mlを入れた坂口フラスコを用いて、25℃、3日間培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。
前記実施例1で精製したタンパク質をアミノ酸配列解析に供し、内部アミノ酸配列(配列番号1、2、3)を決定した。
(c)PCRによるDNAプローブの作成
内部アミノ酸配列を基に2種の混合オリゴヌクレオチド(配列番号4、5)を合成し、PCRプライマーとした。これらのプライマーを用い、Acremonium chrysogenum NBRC30055の染色体DNAを鋳型として、以下の条件にてPCR反応を行った。
10×PCR反応緩衝液(TaKaRa社製) 5.0μL
dNTP混合液(それぞれ2.5mM、TaKaRa社製) 8.0μL
25mM MgCl2 5.0μL
50μM センス・プライマー 0.5μL
50μM アンチセンス・プライマー 0.5μL
蒸留水 29.5μL
染色体DNA溶液(100μg/mL) 1.0μL
La Taq DNAポリメラーゼ(TaKaRa社製) 0.5μL
ステージ1:変性(94℃、1分) 1サイクル
ステージ2:変性(94℃、30秒) 30サイクル
アニール(55℃、30秒)
伸長(72℃、1.5分)
ステージ3:伸長(72℃、3分) 1サイクル
Acremonium chrysogenum NBRC30055の染色体DNAのサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果、XbaI分解物中にプローブDNAとハイブリダイズする約3kbのシングルバンドが確認された。この約3kbのXbaIDNA断片をクローニングするため、以下の様に遺伝子ライブラリーを作製した。
上記(c)で得た1kbのDNA断片をDIG−High Prime(Roche社製)を用いてラベルした。これをDNAプローブとして、(d)で得た遺伝子ライブラリーをコロニー・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られたポジティブコロニーからプラスミドpUCGOOXを得た。
前記で得られたプラスミドpUCGOOXの塩基配列を定法に従って決定した。Acremonium chrysogenum NBRC30055由来糖質酸化酵素をコードする塩基配列(1681bp)を配列番号6に示す。
(a)mRNAの単離
前記実施例1に記載の培養条件でAcremonium chrysogenum NBRC30055を25℃、3日間培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。この菌体を用いてRNeasyプラントミニキット(株式会社QIAGEN製)によりTotal RNAを抽出した。得られたTotal RNAをGenElute(登録商標)ダイレクトmRNAミニプレップキット(シグマアルドリッチ株式会社製)に供し、mRNAを得た。
前記実施例14で得たAcremonium chrysogenum NBRC30055由来糖質酸化酵素をコードする塩基配列(1681bp)(配列番号6)を基に2種のオリゴヌクレオチド(配列番号7、8)を合成し、PCRプライマーとした。上記(a)で得たmRNAを鋳型にPrimeScript High Fidelity RT−PCR Kit(TaKaRa社製)を用いて以下の条件にてRT−PCR反応を行った。
dNTP混合液(それぞれ10mM、TaKaRa社製) 1.0μL
2μM アンチセンスプライマー 1.0μL
mRNA溶液 4.0μL
RNase Free dH2O 4.0μL
ステージ1:変性(65℃、5分) 1サイクル
ステージ2:冷却(4℃、∞) 1サイクル
変性・アニーリング済み反応液 10μL
5×PrimeScript Buffer(TaKaRa社製) 4μL
RNase Inhibitor(40U/μL)(TaKaRa社製) 0.5μL
PrimeScript RTase(for 2step)(TaKaRa社製) 0.5μL
RNase Free dH2O 5μL
ステージ1:42℃、30分 1サイクル
ステージ2:95℃、5分 1サイクル
ステージ3:4℃、∞ 1サイクル
PrimeSTAR Max Premix(2×)(TaKaRa社製) 50μL
20μMセンスプライマー 1μL
20μMアンチセンスプライマー 1μL
逆転写反応液 5μL
滅菌水 43μL
ステージ1:変性(98℃、10秒) 30サイクル
アニール(55℃、5秒)
伸長(72℃、2分)
得られた約1.5kbのDNA断片をSmaI処理したpBluescript II KS+ベクター(Stratagene社製)にクローニング後、得られたプラスミドpUCcGOOXの塩基配列を定法に従って決定した。Acremonium chrysogenum NBRC30055由来糖質酸化酵素をコードするcDNA(1518bp)を配列番号9に示す。配列番号9によりコードされるアミノ酸配列(アミノ酸)を配列番号10に示す。このアミノ酸配列中には、前述実施例15(b)で決定した内部アミノ酸配列(配列番号1、2、3)が見出された。
(a)発現プラスミドの構築
前記実施例15で使用した2種のオリゴヌクレオチド(配列番号7、8)を用い、アスペルギルス宿主細胞中での発現のためにAcremonium chrysogenum NBRC30055由来糖質酸化酵素をコードするcDNAを鋳型として以下の条件にてPCR反応を行った。
PrimeSTAR Max Premix(2×)(TaKaRa社製) 25μL
20μMセンスプライマー 1μL
20μMアンチセンスプライマー 1μL
プラスミドpUCcGOOX 1μL
滅菌水 22μL
ステージ1:変性(98℃、10秒) 33サイクル
アニール(55℃、5秒)
伸長(72℃、15秒)
前記で得られた発現プラスミドpCSGOOXGによるアスペルギルス・オリゼの形質転換を次のように行った。pyrG遺伝子の欠損株であるアスペルギルス・オリゼBB‐56pyrG‐を、前記表7に示す培地に0.2%ウリジン、0.1%ウラシルを添加した培地で30℃、一晩振とう培養した後、得られた菌体を細胞壁溶解液(20mg/ml Yatalase(TaKaRa社製)、0.3mg/ml Novozym−234(Novozymes社)、0.8M塩化ナトリウム、10mMリン酸緩衝液(pH6.0))に懸濁し、30℃で1〜2時間緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化させた。そしてプロトプラストを含む懸濁液をナイロンフィルターでろ過して残存する菌体を除去した。
アスペルギルス・オリゼBB‐56は以下のとおり寄託されている。
寄託機関:NITEバイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター(〒292‐0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2‐5‐8)
寄託日(受領日):2006年5月17日
寄託番号:NITE BP‐236
得られたサンプルをSDS‐PAGEに供した。その結果、図14に示すように、pCSGOOXGでは約63kDa付近に糖質酸化酵素と考えられる有意なタンパク質の生産が確認された。対象であるアスペルギルス・オリゼBB‐56の培養ろ液では同様のタンパク質の生産が確認されなかったため、本タンパク質は糖質酸化酵素cDNAの導入によるものと考えられた。
Claims (32)
- 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
(1)作用:糖を酸化して糖酸を生成する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1。 - 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項1に記載のタンパク質。
- 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
(1)作用:糖を酸化して糖酸を生成する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。 - [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項3に記載のタンパク質。
- 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項4に記載のタンパク質。
- 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
(1)作用:糖を酸化して糖酸を生成する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)至適pH:5.0〜9.0。
(4)安定pH範囲:5.0〜10.5。
(5)至適温度:20℃〜55℃。
(6)温度安定性:45℃以下で安定。
(7)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。 - [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項6に記載のタンパク質。
- 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項7に記載のタンパク質。
- 以下の理化学的性質を有するAcremonium属微生物由来のタンパク質。
(1)作用:糖を糖酸へ酸化する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1。 - 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項9に記載のタンパク質。
- 以下の理化学的性質を有するAcremonium属微生物由来のタンパク質。
(1)作用:糖を糖酸へ酸化する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。 - [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項11に記載のタンパク質。
- 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項12に記載のタンパク質。
- 以下の理化学的性質を有するAcremonium属微生物由来のタンパク質。
(1)作用:糖を糖酸へ酸化する。
(2)基質特異性:グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
(3)至適pH:5.0〜9.0。
(4)安定pH範囲:5.0〜10.5。
(5)至適温度:20℃〜55℃。
(6)温度安定性:45℃以下で安定
(7)分子質量:約63kDa(SDS−PAGE法による測定)。 - [グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項14に記載のタンパク質。
- 0.4≦[グルコースのKm値]/[マルトースのKm値]≦1である、請求項15に記載のタンパク質。
- 前記Acremonium属微生物が、Acremonium chrysogenumである請求項9から16に記載のタンパク質。
- 以下の(a)、(b)または(c)に記載のタンパク質。
(a)配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号10で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。
(c)配列番号10で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。 - 請求項18に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(a)、(b)または(c)に記載のDNAからなる遺伝子。
(a)配列番号6で表される塩基配列からなるDNA。
(b)配列番号6で表される塩基配列において、1から数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号6で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 以下の(a)、(b)または(c)に記載のDNAからなる遺伝子。
(a)配列番号9で表される塩基配列からなるDNA。
(b)配列番号9で表される塩基配列において、1から数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号9で表される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項19から21のいずれか一項に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
- 請求項22に記載の組み換えベクターにより宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載のタンパク質の生産能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、請求項1から18のいずれか一項に記載のタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。
- 請求項23に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物から糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載のタンパク質を用いて、糖質から糖酸を製造する糖酸の製造方法。
- 食品内の糖質を酸化するための、請求項1から18のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
- 請求項27に記載のタンパク質の使用を少なくとも行う卵白の脱糖方法。
- 請求項28に記載の脱糖方法を用いた脱糖卵白の製造方法。
- 請求項27に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うパンの品質および/またはドウの物性の改質方法。
- 請求項30に記載の改質方法を用いたパンの製造方法。
- 請求項27に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うラクトビオン酸の製造方法。
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