WO2023095840A1 - 植物性飲食品の製造方法、及び糖類低減用酵素剤 - Google Patents

植物性飲食品の製造方法、及び糖類低減用酵素剤 Download PDF

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WO2023095840A1
WO2023095840A1 PCT/JP2022/043400 JP2022043400W WO2023095840A1 WO 2023095840 A1 WO2023095840 A1 WO 2023095840A1 JP 2022043400 W JP2022043400 W JP 2022043400W WO 2023095840 A1 WO2023095840 A1 WO 2023095840A1
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maltotriose
drink
sugars
synthase
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PCT/JP2022/043400
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宗幸 高山
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天野エンザイム株式会社
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    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
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    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing plant-based food and drink. More specifically, the present invention relates to techniques for reducing sugars in plant-based food and drink using maltotriose synthase.
  • oat beverages are prepared by suspending the oat material in an aqueous medium and using one or more amylases to break down the starch in the oat material.
  • the amylase used at this time is ⁇ -amylase or a mixture of ⁇ -amylase and ⁇ -amylase.
  • the oat beverage prepared by this method exhibits moderate sweetness due to the production of maltose by the action of ⁇ -amylase (Patent Document 1).
  • a maltotriose synthase is an enzyme that catalyzes a reaction that hydrolyzes oligosaccharides contained in starch into maltotriose units.
  • a maltotriose synthase is known to be used for the production of maltotriose syrup (Patent Document 2).
  • Carbohydrate oxidase is an enzyme that has the property of oxidizing carbohydrates.
  • Carbohydrate oxidase is known to be used for the production of sugar acids represented by maltobionic acid (Patent Document 3).
  • Vegetable foods and drinks such as oat beverages contain large amounts of sugars represented by glucose and maltose. Therefore, the demand for sugar reduction has not been met.
  • the main purpose of this technology is to provide a technology for reducing sugars in plant-based food and drink.
  • the inventors of the present application have conducted intensive research on techniques for reducing sugars in plant-based food and drink. We discovered that it is possible to reduce the amount of sugar in the product, and completed this technology.
  • the present technology provides a method for producing a plant-based food or drink, which includes a step of allowing a maltotriose-generating enzyme to act on a plant-based raw material.
  • a maltotriose-generating enzyme to act on a plant-based raw material.
  • a raw material treated with ⁇ -amylase can be used.
  • a step of allowing carbohydrate oxidase to act on the plant raw material can be further performed.
  • oat milk can be produced as a vegetable food or drink.
  • the present technology also provides a saccharide-reducing enzymatic agent containing a maltotriose synthase.
  • the saccharide-reducing enzymatic agent according to the present technology can further contain saccharide oxidase.
  • the present technology further provides a method for reducing sugars in plant-based foods and drinks, which includes a step of allowing a maltotriose-generating enzyme to act on plant-based raw materials.
  • sucrose is a generic term for monosaccharides and disaccharides.
  • Method for producing plant-based food and drink, method for reducing sugars in plant-based food and drink> A method for producing a plant-based food and drink and a method for reducing sugars in a plant-based food and drink according to the present technology include a step of allowing a maltotriose-generating enzyme to act on a plant-based raw material (hereinafter also referred to as a “maltotriose-generating enzyme acting step”).
  • carbohydrate oxidase acting process the process of causing carbohydrate oxidase to act on the plant raw material
  • ⁇ -amylase acting process the process of causing ⁇ -amylase to act on the plant raw material
  • the recovery step of recovering the manufactured plant-based food and drink and the plant-based food and drink with reduced sugars is further can also be implemented. Each step will be described in detail below.
  • Plant-based raw materials The plant-based raw materials that can be used in this technology are not particularly limited in origin, type, etc., as long as they do not impair the effects of this technology. , can be freely selected.
  • legumes such as soy beans, green peas, lentils, chickpeas, black beans, fava beans, mung beans, lupine beans, kidney beans; wheat, barley , oats, rice, rye, buckwheat, millet, millet, and teff; Nuts such as pine nuts; hemp seeds (industrial hemp), chia seeds (Chia), Quinoa, amaranth (Amaranthus), canary seed, linseed and the like. In the present technology, these may be used alone, or two or more of them may be used in combination. Among these raw materials, cereals are preferred, and oats are more preferred.
  • the properties of the plant raw material when subjected to various enzymatic treatments are not particularly limited as long as the effects of the present technology are not impaired, but liquid, slurry, and paste are preferred.
  • an ⁇ -amylase-treated vegetable raw material for the treatment with a maltotriose synthase and/or carbohydrate oxidase, which will be described later.
  • a maltotriose synthase and/or carbohydrate oxidase which will be described later.
  • a maltotriose synthesizing enzyme that can be used in the present technology is an enzyme that acts on starch and has an activity that mainly produces maltotriose.
  • the maltotriose synthase that can be used in the present technology may be an enzyme that further has other actions as long as it has the activity of synthesizing maltotriose.
  • maltotriose synthase that can be used in the present technology is not particularly limited, for example, Streptomyces genus, Bacillus genus, Microbacterium genus, Cerulosimicrobium ( Cellulosimicrobium) maltotriose synthase derived from genus organisms.
  • One of these maltotriose synthases may be used alone, or a plurality of them may be used in combination.
  • maltotriose-generating enzymes maltotriose-generating enzymes derived from organisms belonging to the genus Microbacterium or those derived from organisms belonging to the genus Cerulosimicrobium are preferred, and more preferably derived from Microbacterium sp. maltotriose synthase.
  • enzymes exhibiting substrate specificity that act on amylose, amylopectin, glycogen and starch can be used.
  • Microbacterium sp.-derived maltotriose-synthesizing enzyme means a maltotriose-synthesizing enzyme produced by a microorganism classified as Microbacterium sp. Alternatively, it means a maltotriose synthase obtained by a genetic engineering technique using a maltotriose synthase gene. Therefore, a recombinant produced by a host microorganism introduced with a maltotriose synthase gene obtained from Microbacterium sp. Applicable.
  • the maltotriose synthase used in this technology can be prepared from the culture solution of the microorganism from which the above maltotriose synthase is derived.
  • a specific preparation method includes a method of recovering the maltotriose synthesizing enzyme from the culture solution or cells of the above microorganisms.
  • the enzyme when using a maltotriose synthesizing enzyme-secreting microorganism, the enzyme can be separated and/or purified after previously collecting the cells from the culture solution by filtration, centrifugation, or the like, if necessary.
  • non-secreting maltotriose-generating enzyme microorganisms after recovering the cells from the culture solution in advance as necessary, the cells are crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc.
  • the enzyme can then be isolated and/or purified.
  • known protein separation and/or purification methods can be used without particular limitation.
  • Various chromatographic methods using The separated and/or purified enzyme can be pulverized by a drying method such as freeze-drying or vacuum drying, and pulverized using a suitable excipient and/or drying aid in the drying method. can also Also, the separated and/or purified enzyme can be liquefied by adding appropriate additives and performing filtration sterilization.
  • a commercial product can be used as the maltotriose synthase, and a preferred example of a commercial product is AMT1.2L manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • the pH, temperature, duration of action, etc. can be set according to the physicochemical properties of the maltotriose synthase to be used, such as optimum pH, stable pH range, optimum temperature, and temperature stability.
  • the pH can be set to, for example, pH 5.0 to 8.0, preferably pH 5.5 to 7.5, more preferably pH 6.0 to 7.0.
  • the temperature can be set to, for example, 30°C to 70°C, preferably 35°C to 65°C, more preferably 40°C to 60°C.
  • the duration of action can be set to, for example, 10 minutes to 12 hours, preferably 30 minutes to 6 hours, more preferably 1 hour to 3 hours.
  • Optimal reaction conditions can be determined through preliminary experiments.
  • the amount of maltotriose synthase added in the maltotriose synthase action step can be freely set as long as it does not impair the effect of this technology.
  • the amount used per 1 g of the vegetable raw material is, for example, 0.1 U or more. From the viewpoint of further enhancing the effect of reducing sugars and the effect of enhancing sweetness, the amount of the maltotriose synthase used per 1 g of the vegetable raw material is preferably 0.5 U or more, more preferably 1 U or more, still more preferably 5 U or more. More preferably, it can be set to 10U or more.
  • the upper limit of the range of the amount of the maltotriose synthase used per 1 g of the plant raw material is not particularly limited, but is set to, for example, 1500 U or less, 300 U or less, 150 U or less, 100 U or less, 50 U or less, 20 U or less, or 15 U or less. be able to.
  • the activity of the maltotriose synthase is the value measured by the starch saccharification activity measurement method described in the examples below.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not particularly limited as long as it is capable of oxidizing carbohydrates, but enzymes that oxidize disaccharides or oligosaccharides are preferred. Specific examples include proteins having the physicochemical properties described below.
  • sugars (monosaccharides and disaccharides) in the manufactured plant-based food and drink can be further reduced by causing carbohydrate oxidase to act on the plant-based raw material.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology oxidizes sugars described later to produce sugar acids in the presence of oxygen. More specifically, sugar acid and hydrogen peroxide are produced by reacting a sugar described later with sugar oxidase that can be used in the present technology in the presence of oxygen.
  • Carbohydrate oxidases that can be used in the present technology include one or more carbohydrates selected from glucose, maltotriose, maltose, galactose, maltotetraose, lactose, cellobiose, and dextrin. Any protein that exhibits activity can be used.
  • the relative activity for each substrate is maltotriose: about 92%, maltose: about 86%, galactose: about 79%, maltotetraose: about 60%, lactose: about 58%, when the activity for glucose is 100%.
  • cellobiose about 53%, maltodextrin: about 24%.
  • the relative activity is 50% or more when the activity when glucose is used as a substrate is taken as the standard (100%), it is judged that "the present enzyme is a substrate that works well".
  • carbohydrate oxidase that is active not only on monosaccharides such as glucose but also on a wide range of carbohydrates such as disaccharides, it is possible to treat a wide range of carbohydrates that cannot be treated with existing glucose oxidases and oligosaccharide oxidases. It is possible to function carbohydrate oxidation in various fields.
  • a specific method for calculating the Km value (Michaelis constant) of a protein is not particularly limited, and a known method can be freely selected for calculation.
  • Methods for calculating the Km value of protein include, for example, Lineweaver-Burk plot, Eadie-Hofstee plot, Hanes-Woolf plot and the like, preferably Hanes-Woolf plot.
  • the Km value of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not particularly limited, it is preferably [Km value of glucose]/[Km value of maltose] ⁇ 1, and 0.4 ⁇ [Km value of glucose ]/[Km value of maltose] ⁇ 1.
  • (D) Molecular Mass Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology has a molecular mass of about 63 kDa as determined by the SDS-PAGE method.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology can be a carbohydrate oxidase that is stable in the vicinity of pH 5.0 to 10.5 under treatment conditions of 37° C. for 15 minutes. .
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology has the highest carbohydrate oxidase activity at around 20°C to 55°C under reaction conditions of pH 7.0 for 5 minutes. can be used.
  • (H) Temperature stability A carbohydrate oxidase that can be used in the present technology maintains an activity of 80% or more even after treatment at pH 7.0 for 15 minutes and at temperatures up to 45°C. Carbohydrate oxidase that can be used can be used.
  • Origin of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology described above is not particularly limited, but examples thereof include those derived from microorganisms belonging to the genus Acremonium.
  • the microorganism belonging to the Acremonium genus includes Acremonium chrysogenum.
  • acremonium chrysogenum-derived carbohydrate oxidase means a carbohydrate oxidase produced by a microorganism classified as Acremonium chrysogenum (whether a wild strain or a mutant strain). , or a carbohydrate oxidase obtained by genetic engineering using a carbohydrate oxidase gene. Therefore, a recombinant produced by a host microorganism into which a carbohydrate oxidase gene obtained from Acremonium chrysogenum (or a gene obtained by modifying the gene) has been introduced is also a "carbohydrate oxidase derived from Acremonium chrysogenum.” Applicable.
  • Acremonium chrysogenum from which carbohydrate oxidases that can be used in the present technology are derived examples include Acremonium chrysogenum NBRC30055 (NITE, Japan), ATCC15006 (ATCC, USA), and DSM880 (DSMZ, Germany). can be mentioned.
  • amino acid structure of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not limited, but can be specified by the following amino acid sequence, for example.
  • carbohydrate oxidase that can be used in this technology can be specified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the protein after modification may have the same function as the protein before modification. That is, the modification of the amino acid sequence does not substantially affect the function of the protein, and the function of the protein may be maintained before and after modification. Therefore, as another aspect of the present invention, a protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having carbohydrate oxidase activity I will provide a. "Deletion, substitution and/or addition of one to several amino acids constituting an amino acid sequence" typically refers to partial differences in amino acid sequences.
  • a difference in the amino acid sequence here is permissible as long as the carbohydrate oxidase activity can be maintained (the activity may vary slightly).
  • the positions where the amino acid sequences differ are not particularly limited, and differences may occur at multiple positions.
  • the plural here is, for example, a number corresponding to less than about 30% of the total amino acid sequence, preferably a number corresponding to less than about 20%, and more preferably a number corresponding to less than about 10%. , even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. That is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, even more preferably about 95% or more, most preferably about 99% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 refers to having
  • a method of obtaining a protein by causing conservative amino acid substitutions in amino acid residues that are not essential for carbohydrate oxidase activity is good.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain with similar properties.
  • Amino acid residues have, depending on their side chain, a basic side chain (e.g. lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (e.g. aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (e.g.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine). , tryptophan, histidine) are classified into several families. Conservative amino acid substitutions are preferably between amino acid residues within the same family.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acids can be determined, for example, by the following procedure.
  • the two sequences are aligned for optimal comparison.
  • gaps may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence.
  • comparison of two sequences and determination of identity can be realized using a mathematical algorithm.
  • mathematical algorithms that can be used for sequence comparison include Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 and Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, modified algorithm, but not limited to this.
  • Such algorithms are described in Altschul et al. (1990) J. Am. Mol. Biol. 215:403-10, incorporated in the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0).
  • Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al. (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402.
  • the default parameters of the corresponding programs eg, XBLAST and NBLAST
  • XBLAST and NBLAST the default parameters of the corresponding programs
  • a carbohydrate oxidase that can be used in this technology may be part of a larger protein (eg, a fusion protein).
  • Additional sequences in the fusion protein include, for example, sequences that aid in purification such as multiple histidine residues, additional sequences that ensure stability during recombinant production, and the like.
  • a protein having the above amino acid sequence can be easily prepared by genetic engineering techniques. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell (eg, Escherichia coli, yeast, filamentous fungus) with a DNA encoding the present protein, and recovering the protein expressed in the transformant. The recovered protein is appropriately prepared according to the purpose.
  • a suitable host cell eg, Escherichia coli, yeast, filamentous fungus
  • the recovered protein is appropriately prepared according to the purpose.
  • the present protein as a recombinant protein in this manner, various modifications are possible. For example, if a DNA encoding the present protein and other suitable DNA are inserted into the same vector, and the vector is used to produce a recombinant protein, the recombinant protein consists of any peptide or protein linked thereto.
  • the present protein can be obtained.
  • addition of sugar chains and/or lipids, or modification that causes N-terminal or C-terminal processing may be performed. Such modifications enable extraction of
  • the pH, temperature, duration of action, etc. can be set according to the physicochemical properties of the carbohydrate oxidase to be used, such as optimum pH, stable pH range, optimum temperature, and temperature stability.
  • the pH can be set to, for example, pH 4.0 to 8.0, preferably pH 4.5 to 7.5, more preferably pH 5.0 to 7.0.
  • the temperature can be set to, for example, 20°C to 60°C, preferably 25°C to 55°C, more preferably 30°C to 50°C.
  • the duration of action can be set to, for example, 10 minutes to 12 hours, preferably 30 minutes to 6 hours, more preferably 1 hour to 3 hours.
  • Optimal reaction conditions can be determined through preliminary experiments.
  • the amount of carbohydrate oxidase added in the carbohydrate oxidase action process can be freely set as long as it does not impair the effect of this technology.
  • the amount used per 1 g of the vegetable raw material is, for example, 0.1 U or more. From the viewpoint of further enhancing the effect, the amount of carbohydrate oxidase used per 1 g of the plant raw material is preferably 1 U or more, more preferably 5 U or more, still more preferably 10 U or more, and still more preferably 20 U or more.
  • the upper limit of the range of the amount of carbohydrate oxidase used per 1 g of the plant raw material is not particularly limited, but is, for example, 300 U or less, 200 U or less, 100 U or less, preferably 50 U or less, more preferably 30 U or less, and still more preferably 25 U or less. mentioned.
  • the activity of carbohydrate oxidase is a value measured by the glucose oxidase activity measurement method described in Examples described later.
  • the order of performing the carbohydrate oxidase action step is not limited as long as the effect of the present technology is not impaired, but it is preferable to perform the step after the maltotriose synthase action step or simultaneously with the maltotriose synthase action step.
  • an enzyme deactivation step may be performed after each enzymatic action step.
  • ⁇ -Amylase ⁇ -Amylase that can be used in the present technology is an enzyme that acts on starch and mainly hydrolyzes ⁇ -1,4 glycosidic bonds.
  • ⁇ -amylase that can be used in the present technology is not particularly limited, examples thereof include ⁇ -amylases derived from organisms belonging to the genus Aspergillus and Bacillus, preferably derived from organisms belonging to the genus Bacillus, and more preferably.
  • the pH, temperature, duration of action, etc. can be set according to the physicochemical properties of the ⁇ -amylase to be used, such as optimum pH, stable pH range, optimum temperature, and temperature stability.
  • the pH can be set to, for example, pH 5.0 to 8.0, preferably pH 5.5 to 7.5, more preferably pH 6.0 to 7.0.
  • the temperature can be set to, for example, 30°C to 80°C, preferably 40°C to 75°C, more preferably 50°C to 70°C.
  • the duration of action can be set to, for example, 10 minutes to 12 hours, preferably 30 minutes to 6 hours, more preferably 1 hour to 3 hours. Optimal reaction conditions can be determined through preliminary experiments.
  • the order of performing the ⁇ -amylase action step is not limited as long as the effect of the present technology is not impaired, but it is preferable to perform it before the maltotriose synthase action step or simultaneously with the maltotriose synthase action step.
  • an enzyme deactivation step may be performed after each enzymatic action step.
  • Recovery process is a process of recovering plant foods and drinks produced through a maltotriose synthase action process, and, if necessary, a carbohydrate oxidase action process, an ⁇ -amylase action process, etc. be.
  • a specific recovery method one or two or more recovery methods used in general plant-based food and drink production can be used in combination, depending on the type of plant-based food and drink to be produced.
  • Sugars are reduced in plant-based foods and drinks produced through a maltotriose synthase action step, optionally a carbohydrate oxidase action step, an ⁇ -amylase action step, etc. It is characterized by Specifically, for example, sugars (monosaccharides and saccharides) is 20 mg or less, preferably 15 mg or less, more preferably 10 mg or less per 1 mL or 1 g of the plant-based food or drink.
  • the plant-based food and drink manufactured through the maltotriose synthase action process, and optionally, the carbohydrate oxidase action process, ⁇ -amylase action process, etc. are used to reduce sugars (monosaccharides and disaccharides).
  • the amount of trisaccharides is increased.
  • the content of trisaccharides in a plant-based food or drink manufactured through a maltotriose synthase action step, optionally a carbohydrate oxidase action step, an ⁇ -amylase action step, etc. 8 mg or more, preferably 15 mg or more, more preferably 20 mg or more per 1 mL or 1 g of the plant-based food or drink.
  • a recovery step of recovering a plant-based food or drink having a trisaccharide content of 8 mg or more, preferably 15 mg or more, and more preferably 20 mg or more per 1 mL or 1 g of the plant-based food or drink can be performed.
  • One aspect of the method for producing a plant-based food and drink and the method for reducing sugars in the plant-based food and drink according to the present technology includes the following steps (1) and (2). Also, (3) may be included. Note that after step (2) or (3), (4) a step of deactivating the enzyme and/or (5) sugars (monosaccharides and disaccharides) were reduced and/or the amount of trisaccharides was increased. You may add the process of collect
  • Step of preparing a raw material containing vegetable carbohydrates (2) Step of treating the prepared raw material with a maltotriose synthase (3) Treating a raw material treated with a maltotriose synthase with a carbohydrate oxidase process
  • One aspect of the method for producing a plant-based food and drink and the method for reducing sugars in the plant-based food and drink according to the present technology includes the following steps (1) to (3). Also, (4) may be considered. In addition, after step (2), (3) or (4), (5) a step of inactivating the enzyme may be added, and (6) sugars (monosaccharides and disaccharides) are reduced and/or A step of recovering the plant-based food or drink with an increased amount of sugars may be added.
  • Step of preparing raw material containing vegetable carbohydrates (2) Step of treating prepared raw material with ⁇ -amylase (3) Step of treating raw material treated with ⁇ -amylase with maltotriose synthase ( 4) Step of treating with carbohydrate oxidase
  • the saccharide-reducing enzymatic agent according to the present technology contains a maltotriose synthase as an active ingredient.
  • carbohydrate oxidase and/or ⁇ -amylase can be contained as necessary. Since the details of the maltotriose synthase, carbohydrate oxidase, and ⁇ -amylase are the same as those of the enzymes that can be used in the above-described method for producing a plant-based food or drink, their explanations are omitted here.
  • the saccharide-reducing enzymatic agent contains the above-described maltotriose-generating enzyme, it may be composed only of the above-described maltotriose-generating enzyme. can be freely selected and contained.
  • Other ingredients that can be used include, for example, excipients, pH adjusters, colorants, corrigents, disintegrants, lubricants, stabilizers, and the like that are commonly used in formulations.
  • excipients for example, excipients, pH adjusters, colorants, corrigents, disintegrants, lubricants, stabilizers, and the like that are commonly used in formulations.
  • components having functions known or discovered in the future as appropriate depending on the purpose.
  • a low-sugar plant-based food or drink according to the present technology is a plant-based food or drink produced using the production method described above.
  • plant-based beverages include oat beverages, and more specifically oat milk (also referred to as “oat milk”).
  • oat milk also referred to as “oat milk”.
  • plant foods include plant yogurt.
  • the amount of sugars (monosaccharides and disaccharides) contained in the low-sugar plant-based food and drink according to this technology is not particularly limited.
  • the amount of sugars contained in the plant-based food or drink is 20 mg or less, preferably 15 mg or less, more preferably 10 mg or less per 1 mL or 1 g of the plant-based food or drink.
  • the low-sugar plant-based food and drink related to this technology can include those with increased amounts of trisaccharides in addition to reduced sugars (monosaccharides and disaccharides). Appropriate sweetness can be imparted by increasing trisaccharides.
  • the amount of trisaccharides contained in the low-sugar plant-based food or drink according to the present technology is also not particularly limited.
  • the amount of trisaccharide contained in the plant-based food or drink is 8 mg or more, preferably 15 mg or more, more preferably 20 mg or more per 1 mL or 1 g of the plant-based food or drink.
  • the ratio of trisaccharides to sugars is also not particularly limited. , 0.5 or more, preferably 0.8 or more, more preferably 1 or more, and even more preferably 2 or more.
  • a method for producing a plant-based food or drink comprising a step of allowing a maltotriose-generating enzyme to act on a plant-based raw material.
  • Enzymes used (1) ⁇ -amylase: “Kleistase SD8” ( ⁇ -amylase derived from Bacillus amyloliquefaciens, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) (2) ⁇ -amylase: “ ⁇ -amylase F “Amano”” ( ⁇ -amylase derived from Bacillus flexus, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) (3) Maltotriose synthase: "AMT1.2L” manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd., maltotriose synthase derived from Microbacterium sp.) (4) Carbohydrate oxidase: In this example, as an example of carbohydrate oxidase, carbohydrate oxidase (derived from Acremonium chrysogenum) purified by the method described in WO2014/042237 was used.
  • Enzyme activity measurement method [Starch saccharification activity measurement method: maltotriose synthase activity measurement method] The enzyme was allowed to act on soluble starch as a substrate, and the resulting reducing sugars were colorimetrically determined by the Somogyi-Nelson method. Weigh 0.5 mL of soluble starch solution and 0.4 mL of 0.1 mol/L acetic acid/sodium acetate buffer (pH 6.0) (containing 0.05 mol/ LCaCl2 ) into a 50 mL Nessler tube, shake well and mix 40 ⁇ 0. After standing at 5° C. for 10 to 15 minutes, 0.1 mL of the sample solution was added and immediately shaken.
  • Method for measuring glucose oxidase activity Method for measuring carbohydrate oxidase activity
  • An appropriate amount of the enzyme was weighed, and a cooled potassium phosphate/sodium hydroxide buffer (0.1 mol/L) of pH 7.0 was added to dissolve or uniformly disperse to make 50 mL, which was used as a sample solution.
  • 2.50 g of D(+)-glucose was weighed and dissolved by adding water to make 25 mL, which was used as a substrate solution.
  • Substrate solution 0.5 mL, potassium phosphate / sodium hydroxide buffer (0.1 mol / L, pH 7.0, containing phenol) 2 mL, peroxidase test solution (25 units / mL) 0.5 mL and 4-aminoantipyrine solution ( 1 ⁇ 250) was placed in a quartz cell and heated at 37° C. for 10 minutes. 0.1 mL of the sample solution was added to this solution, mixed well and heated at 37° C. to obtain a test solution.
  • a potassium phosphate/sodium hydroxide buffer 0.1 mol/L of pH 7.0 or water was used, and the same procedure as in the preparation of the test solution was performed to prepare a comparative solution.
  • the absorbance at a wavelength of 500 nm was measured 2 minutes and 5 minutes after the addition of the test solution and the comparison solution.
  • the amount of oxidized glucose was quantified from the molar extinction coefficient of the quinoneimine dye produced. One unit was defined as the amount of enzyme required to oxidize 1 ⁇ mol of glucose per minute under the conditions.
  • the prepared oat beverage was weighed into a 1.5 mL sample tube, 190 ⁇ L of 1 mol/L trichloroacetic acid was added, and left at room temperature for 10 minutes. After centrifugation (10000 rpm, 10 min), 1 mL of the supernatant was collected in a sample tube. The operation of adding 1 mL of diethyl ether (FUJIFILM reagent special grade) thereto, mixing, and recovering 1 mL of the aqueous layer by centrifugation was repeated twice.
  • diethyl ether (FUJIFILM reagent special grade)
  • the sugar produced in the analysis sample was analyzed by HPLC using an MCl GEL CK04S column (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). For comparison, the sugar content of commercially available oat milk was also analyzed.
  • Example 1 an oat beverage using a maltotriose synthase was prepared, and 200 mL was weighed and placed in a 500 mL Erlenmeyer flask. Carbohydrate oxidase derived from Acremonium chrysogenum was added thereto so that the glucose oxidase activity was 600 units, the Erlenmeyer flask was placed in a 40° C. water bath, and the reaction was carried out for 2 hours while stirring with a 2 mm diameter tube while sending an appropriate amount of air. let me After the enzymatic reaction, the oat beverage was placed in a boiling water bath and allowed to stand for 10 minutes to deactivate the enzyme. The quenched oat beverage was subjected to the prescribed treatment, and sugars produced were analyzed by HPLC using ICSep ICE-ION-300 column (Transgenomic Inc., New Haven, Conn., USA).
  • the prepared oat beverage was weighed into a 1.5 mL sample tube, 190 ⁇ L of 1 mol/L trichloroacetic acid was added, and left at room temperature for 10 minutes. After centrifugation (10000 rpm, 10 min), 1 mL of the supernatant was collected in a sample tube. The operation of adding 1 mL of diethyl ether (FUJIFILM reagent special grade) thereto, mixing, and recovering 1 mL of the aqueous layer by centrifugation was repeated twice.
  • diethyl ether (FUJIFILM reagent special grade)
  • the sugar produced in the analysis sample was analyzed by HPLC using an MCl GEL CK04S column (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). For comparison, the sugar content of commercially available oat milk was also analyzed.

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Abstract

植物性飲食品中の糖類を低減させる技術を提供すること。　本技術では、植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程を含む、植物性飲食品の製造方法及び植物性飲食品の糖類低減方法を提供する。本技術に係る製造方法では、植物性原料に糖質酸化酵素を作用させる工程をさらに行うことができる。本技術では、また、マルトトリオース生成酵素を含む、糖類低減用酵素剤を提供する。本技術に係る糖類低減用酵素剤には、糖質酸化酵素をさらに含むことができる。

Description

植物性飲食品の製造方法、及び糖類低減用酵素剤
　本発明は、植物性飲食品の製造方法に関する。より具体的には、本発明は、マルトトリオース生成酵素を用いて植物性飲食品中の糖類を低減させる技術に関する。
　近年、健康志向の高まりから植物性飲食品が注目されている。例えば、燕麦飲料は、水性媒体中に燕麦材料を懸濁し、１以上のアミラーゼを用いて燕麦材料の澱粉を分解することで調製される。このとき使用されるアミラーゼは、β－アミラーゼであるか、又はα－アミラーゼとβ－アミラーゼの混合物である。この方法により調製された燕麦飲料は、β－アミラーゼの作用によりマルトースが生成することで、程よい甘味を呈す（特許文献１）。
　ここで、本技術に用いる酵素について説明する。マルトトリオース生成酵素は、澱粉に含まれるオリゴ糖をマルトトリオース単位で加水分解する反応を触媒する酵素である。マルトトリオース生成酵素は、マルトトリオースシロップの製造に用いられることが知られている（特許文献２）。
　糖質酸化酵素は、糖質を酸化する性質を有する酵素である。糖質酸化酵素は、マルトビオン酸に代表される糖酸生成に用いられることが知られている（特許文献３）。
特開２０１８－０７５０２９号公報 特開平０３－２５１１７３号公報 国際公開第２０１４／０４２２３７号
　前述の通り、近年、健康志向の高まりから植物性飲食品が注目されているが、例えば、前記特許文献１に示す技術を用いて、α－アミラーゼに加えβ－アミラーゼで処理して得られた燕麦飲料等の植物性飲食品には、グルコース、マルトースに代表される糖類が多く含まれている。そのため、糖類低減の要望には応えられていなかった。
　そこで、本技術では、植物性飲食品中の糖類を低減させる技術を提供することを主目的とする。
　本願発明者らは、植物性飲食品中の糖類を低減させる技術について、鋭意研究を行った結果、植物性飲食品の植物性原料に、マルトトリオース生成酵素を作用させることで、植物性飲食品中の糖類を低減できることを見出し、本技術を完成するに至った。
　即ち、本技術では、植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程を含む、植物性飲食品の製造方法を提供する。
　本技術で用いる前記植物性原料としては、α－アミラーゼ処理された原料を用いることができる。
　本技術に係る製造方法では、植物性原料に糖質酸化酵素を作用させる工程をさらに行うことができる。
　本技術に係る製造方法では、植物性飲食品として、オートミルクを製造することができる。
　本技術では、また、マルトトリオース生成酵素を含む、糖類低減用酵素剤を提供する。
　本技術に係る糖類低減用酵素剤には、糖質酸化酵素をさらに含むことができる。
　本技術では、更に、植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程を含む、植物性飲食品の糖類低減方法を提供する。
　本技術において、「糖類」とは、単糖類及び二糖類の総称である。
　本技術によれば、植物性飲食品中の糖類を低減させることができる。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
　＜１．植物性飲食品の製造方法、植物性飲食品の糖類低減方法＞
　本技術に係る植物性飲食品の製造方法、及び植物性飲食品の糖類低減方法は、植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程（以下「マルトトリオース生成酵素作用工程」ともいう）を少なくとも行う方法である。また、植物性原料に糖質酸化酵素を作用させる工程（以下「糖質酸化酵素作用工程」ともいう）や植物性原料にα－アミラーゼを作用させる工程（以下「α－アミラーゼ作用工程」ともいう）を更に行うこともできる。その他、植物性飲食品の種類等に応じて、各工程の前後や各工程と同時に、本技術の効果を損なわない範囲において、一般的な食品の製造工程を行うことも可能である。また、本技術に係る植物性飲食品の製造方法、及び植物性飲食品の糖類低減方法では、製造された植物性飲食品や、糖類が低減した植物性飲食品を回収する回収工程を、更に実施することもできる。以下、各工程について詳細に説明する。
　（１）植物性原料
　本技術に用いることができる植物性原料は、本技術の効果を損なわない限り、植物性原料の起源、種類等は特に限定されず、目的の植物性飲食品に応じて、自由に選択することができる。例えば、大豆（Soy beans）、えんどう豆（Green peas）、レンズ豆（Lentils）、ひよこ豆（Chickpeas）、黒豆（Black beans）、空豆、緑豆、ルピン豆、インゲン豆等の豆類；小麦、大麦、燕麦（オート麦）、米、ライムギ、そば、ひえ、あわ、テフなどの穀類；アーモンド、ココナッツ、ピーナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピリナッツ、栗、ゴマ、松の実等のナッツ類；ヘンプシード（産業用ヘンプ）、チア種子（Chia）、キア（Quinoa）、アマランサス（Amaranthus）、カナリーシ―ド、アマニ等が挙げられる。本技術では、これらを単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの原料のなかでも、好ましくは、穀類が挙げられ、より好ましくは、燕麦（オート麦）が挙げられる。
　本技術において、各種酵素処理に供される際の植物性原料の性状も、本技術の効果を損なわない限り、特に限定されないが、好ましくは、液状、スラリー状、ペースト状が挙げられる。
　本技術において、後述するマルトトリオース生成酵素および／または糖質酸化酵素による処理を行う際の植物性原料は、α－アミラーゼ処理された植物性原料を用いることが好ましい。植物性原料をα－アミラーゼ処理することで、原料の粘度を低減させることができる。
　α－アミラーゼ処理された植物性原料を用いる場合、既にα－アミラーゼ処理された植物性原料を用いることもできるし、後述するα－アミラーゼ作用工程を行うことも可能である。
　（２）マルトトリオース生成酵素
　本技術に用いることができるマルトトリオース生成酵素は、デンプンに作用し主にマルトトリオースを生成する活性を有する酵素である。本技術に用いることができるマルトトリオース生成酵素としては、マルトトリオースを生成する活性がある限り、他の作用を更に有する酵素であってもよい。
　本技術では、植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させることで、製造された植物性飲食品中の糖類（単糖類及び二糖類）を低減させることができる。また、植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させることで、製造された植物性飲食品中の三糖類の量を増加させて、適度な甘みを付与することができる。
　本技術に用いることができるマルトトリオース生成酵素の由来は特に限定されないが、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属生物由来のマルトトリオース生成酵素が挙げられる。これらのマルトトリオース生成酵素は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのマルトトリオース生成酵素の中でも、好ましくはミクロバクテリウム属生物由来、又はセルロシミクロビウム属生物由来マルトトリオース生成酵素が挙げられ、より好ましくはミクロバクテリウム エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.）由来マルトトリオース生成酵素が挙げられる。具体的には、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン及びデンプンに作用する基質特異性を示す酵素を用いることができる。
　ここでの「ミクロバクテリウム エスピー由来マルトトリオース生成酵素」とは、ミクロバクテリウム エスピーに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するマルトトリオース生成酵素、あるいはマルトトリオース生成酵素遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたマルトトリオース生成酵素であることを意味する。従って、ミクロバクテリウム エスピーより取得したマルトトリオース生成酵素遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組換え体も「ミクロバクテリウム エスピー由来マルトトリオース生成酵素」に該当する。
　本技術に用いるマルトトリオース生成酵素は、上記のマルトトリオース生成酵素の由来元となる微生物の培養液より調製することができる。具体的な調製方法としては、上記の微生物の培養液又は菌体よりマルトトリオース生成酵素を回収する方法が挙げられる。例えば、マルトトリオース生成酵素分泌型微生物を用いる場合は、培養液から、必要に応じて予めろ過、遠心処理等によって菌体を回収した後、酵素を分離及び／又は精製することができる。また、マルトトリオース生成酵素非分泌型微生物を用いる場合は、必要に応じて予め培養液から菌体を回収した後、菌体を加圧処理、超音波処理等によって破砕して酵素を露出させた後、酵素を分離及び／又は精製することができる。酵素の分離及び／又は精製法としては、公知のタンパク質分離及び／又は精製法を特に限定されることなく用いることができ、例えば、遠心分離法、ＵＦ濃縮法、塩析法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等が挙げられる。分離及び／又は精製された酵素は、凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化することができ、また、当該乾燥法において適当な賦形剤及び／又は乾燥助剤を用いて粉末化することもできる。また、分離及び／又は精製された酵素は、適当な添加剤を加え、ろ過滅菌することで液状化することもできる。
　本技術では、マルトトリオース生成酵素として、市販品を用いることもでき、好ましい市販品の例として、天野エンザイム株式会社製のＡＭＴ１．２Ｌが挙げられる。
　マルトトリオース生成酵素作用工程の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いるマルトトリオース生成酵素の至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。ｐＨは例えば、ｐＨ５．０～８．０、好ましくはｐＨ５．５～７．５、より好ましくはｐＨ６．０～７．０に設定することができる。温度は例えば、３０℃～７０℃、好ましくは３５℃～６５℃、より好ましくは４０℃～６０℃に設定することができる。作用時間は例えば、１０分～１２時間、好ましくは３０分～６時間、より好ましくは１時間～３時間に設定することができる。なお、最適な反応条件は予備実験を通して決定することができる。
　マルトトリオース生成酵素作用工程におけるマルトトリオース生成酵素の添加量は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。植物性原料１ｇ当たりの使用量として、例えば０．１Ｕ以上が挙げられる。糖類低減効果及び甘味増強効果をより一層高める観点から、マルトトリオース生成酵素の植物性原料１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは０．５Ｕ以上、より好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは５Ｕ以上、一層好ましくは１０Ｕ以上に設定することができる。マルトトリオース生成酵素の植物性原料１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば、１５００Ｕ以下、３００Ｕ以下、１５０Ｕ以下、１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、２０Ｕ以下、又は１５Ｕ以下に設定することができる。
　なお、本技術において、マルトトリオース生成酵素の活性については、後述する実施例に記載のでんぷん糖化力活性測定法で測定した値である。
　（３）糖質酸化酵素
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、糖質を酸化できる酵素であれば特に限定されないが、好ましくは二糖以上のオリゴ糖を酸化する酵素である。具体的には、後述する理化学的性質を有するタンパク質が挙げられる。
　本技術では、植物性原料に糖質酸化酵素を作用させることで、製造された植物性飲食品中の糖類（単糖類及び二糖類）を更に低減させることができる。
　（Ａ）作用
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、酸素存在下において、後述する糖を酸化し糖酸を生成する。より詳しくは、酸素存在下において、後述する糖に、本技術に用いることができる糖質酸化酵素を作用させると、糖酸と過酸化水素が生成する。
　（Ｂ）基質特異性
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びデキストリンから選ばれる１以上の糖質に対し活性を示すタンパク質を用いることができる。各基質に対する相対活性は、グルコースに対する活性を１００％とした場合、マルトトリオース：約９２％、マルトース：約８６％、ガラクトース：約７９％、マルトテトラオース：約６０％、ラクトース：約５８％、セロビオース：約５３％、マルトデキストリン：約２４％である。
　なお、本技術においては、グルコースを基質とした場合の活性を基準（１００％）としたときの相対活性が５０％以上あれば、「本酵素が良好に作用する基質である」と判断した。
　このように、グルコースのような単糖類のみならず、二糖類以上の広範囲な糖質にも活性を示す糖質酸化酵素を用いれば、既存のグルコースオキシダーゼやオリゴ糖酸化酵素では対応できなかった広範囲な分野において、糖質酸化作用を機能させることが可能である。
　（Ｃ）Ｋｍ値
　本技術において、タンパク質のＫｍ値（ミカエリス定数）の具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。タンパク質のＫｍ値の算出方法として、例えば、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロット、Ｅａｄｉｅ－Ｈｏｆｓｔｅｅプロット、Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロット等が挙げられ、好ましくはＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロットが挙げられる。本技術に用いることができる糖質酸化酵素のＫｍ値は特に限定されないが、［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦１であることが好ましく、０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦１であることがより好ましい。
　（Ｄ）分子質量
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法による分子質量が約６３ｋＤａの糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｅ）至適ｐＨ
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、３７℃で５分間の反応条件において、ｐＨ５．０～９．０付近で最も糖質酸化酵素活性が高い糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｆ）安定ｐＨ範囲
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、３７℃で１５分間の処理条件において、ｐＨ５．０～１０．５付近において安定な糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｇ）至適温度
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ｐＨ７．０で５分間の反応条件において、２０℃～５５℃付近で最も糖質酸化酵素活性が高い糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｈ）温度安定性
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ｐＨ７．０で１５分間の処理条件において、４５℃までの温度条件で処理しても８０％以上の活性を維持することができる糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｉ）由来について
　以上説明した本技術に用いることができる糖質酸化酵素の由来は特に限定されないが、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する微生物に由来するものが挙げられる。この場合、アクレモニウム属に属する微生物としては、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）が挙げられる。
　ここでの「アクレモニウム・クリソゲナムに由来する糖質酸化酵素」とは、アクレモニウム・クリソゲナムに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産する糖質酸化酵素、あるいは糖質酸化酵素遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られた糖質酸化酵素であることを意味する。従って、アクレモニウム・クリソゲナムより取得した糖質酸化酵素遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組換え体も「アクレモニウム・クリソゲナムに由来する糖質酸化酵素」に該当する。
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素がそれに由来することとなるアクレモニウム・クリソゲナムの例としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５（ＮＩＴＥ、日本）、ＡＴＣＣ１５００６（ＡＴＣＣ、アメリカ）、ＤＳＭ８８０（ＤＳＭＺ、ドイツ）を挙げることができる。
　（Ｊ）アミノ酸配列
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素のアミノ酸構造は限定されないが、一例を挙げると、以下のアミノ酸配列により特定することができる。
　具体的には、本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列で特定することができる。
　ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、アミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで、本発明は他の態様として、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を提供する。「アミノ酸配列を構成する１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加」とは、典型的にアミノ酸配列の一部の相違のことをいう。
　ここでのアミノ酸配列の相違は、糖質酸化酵素活性が保持されうる限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限り、アミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは、例えば、全アミノ酸配列の約３０％未満に相当する数であり、好ましくは約２０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。
　即ち、配列番号１のアミノ酸配列と、例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、より一層好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有することを指す。
　また、好ましくは、糖質酸化酵素活性に必須でないアミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を生じさせることによって、タンパク質を得る方法がよい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基は、その側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる。この際、例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（即ち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数及びサイズも考慮に入れる。
　また、二つの配列の比較及び同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４―６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３―７７において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３―１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えばＮＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２としてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行えばよい。
　本発明のポリペプチド分子に等価なアミノ酸配列を得るには、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３としてＢＬＡＳＴポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためにはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５（１７）：３３８９－３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴを利用する場合は、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
　配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９９８）Ｃｏｍｐｕｔ　Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｓｃｉ．　４：１１―１７に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー（ＩＧＨ　Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）又はＩＳＲＥＣサーバーで利用可能なＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合は例えば、ＰＡＭ１２０残基質量表を利用し、ギャップ長ペナルティ＝１２、ギャップペナルティ＝４とすることができる。
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　上記アミノ酸配列を有するタンパク質は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母、糸状菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜調製される。このように組換えタンパク質として本タンパク質を得ることにすれば、種々の修飾が可能である。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本タンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
　糖質酸化酵素作用工程の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いる糖質酸化酵素の至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。ｐＨは例えば、ｐＨ４．０～８．０、好ましくはｐＨ４．５～７．５、より好ましくはｐＨ５．０～７．０に設定することができる。温度は例えば、２０℃～６０℃、好ましくは２５℃～５５℃、より好ましくは３０℃～５０℃に設定することができる。作用時間は例えば、１０分～１２時間、好ましくは３０分～６時間、より好ましくは１時間～３時間に設定することができる。なお、最適な反応条件は予備実験を通して決定することができる。
　糖質酸化酵素作用工程における糖質酸化酵素の添加量は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。植物性原料１ｇ当たりの使用量として、例えば０．１Ｕ以上が挙げられる。効果をより一層高める観点から、糖質酸化酵素の植物性原料１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは１Ｕ以上、より好ましくは５Ｕ以上、さらに好ましくは１０Ｕ以上、一層好ましくは２０Ｕ以上が挙げられる。糖質酸化酵素の植物性原料１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、好ましくは５０Ｕ以下、より好ましくは３０Ｕ以下、さらに好ましくは２５Ｕ以下が挙げられる。
　なお、本技術において、糖質酸化酵素の活性については、後述する実施例に記載のグルコースオキシダーゼ活性測定法で測定した値である。
　糖質酸化酵素作用工程を行う順番は、本技術の効果を損なわない限り限定されないが、マルトトリオース生成酵素作用工程の後、又は、マルトトリオース生成酵素作用工程と同時に行うことが好ましい。また、各酵素作用工程の後に、酵素の失活工程を行ってもよい。
　（４）α－アミラーゼ
　本技術に用いることができるα－アミラーゼは、デンプンに作用し主にα－１,４グリコシド結合を加水分解する酵素である。
　本技術に用いることができるα－アミラーゼの由来は特に限定されないが、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属生物由来のα－アミラーゼが挙げられ、好ましくはバチルス属生物由来、より好ましくはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、さらに好ましくはバチルス・アミロリケファシエンス由来のα－アミラーゼが挙げられる。
　α－アミラーゼ作用工程の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いるα－アミラーゼの至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。ｐＨは例えば、ｐＨ５．０～８．０、好ましくはｐＨ５．５～７．５、より好ましくはｐＨ６．０～７．０に設定することができる。温度は例えば、３０℃～８０℃、好ましくは４０℃～７５℃、より好ましくは５０℃～７０℃に設定することができる。作用時間は例えば、１０分～１２時間、好ましくは３０分～６時間、より好ましくは１時間～３時間に設定することができる。なお、最適な反応条件は予備実験を通して決定することができる。
　α－アミラーゼ作用工程を行う順番は、本技術の効果を損なわない限り限定されないが、マルトトリオース生成酵素作用工程の前、又は、マルトトリオース生成酵素作用工程と同時に行うことが好ましい。また、各酵素作用工程の後に、酵素の失活工程を行ってもよい。
　（５）回収工程
　回収工程は、マルトトリオース生成酵素作用工程、また、必要に応じて、糖質酸化酵素作用工程、α－アミラーゼ作用工程等を経て製造された植物飲食品を回収する工程である。具体的な回収方法は、製造する植物性飲食品の種類に応じて、一般的な植物性飲食品の製造における回収方法を、１種または２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
　マルトトリオース生成酵素作用工程、必要に応じて、糖質酸化酵素作用工程、α－アミラーゼ作用工程等を経て製造された植物性飲食品は、糖類（単糖類及び二糖類）が低減していることを特徴とする。具体的には、例えば、マルトトリオース生成酵素作用工程、必要に応じて、糖質酸化酵素作用工程、α－アミラーゼ作用工程等を経て製造された植物性飲食品中の糖類（単糖類及び二糖類）の含有量は、植物性飲食品１ｍＬ又は１ｇ当たり２０ｍｇ以下、好ましくは１５ｍｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ以下である。即ち、本技術では、糖類（単糖類及び二糖類）の含有量が植物性飲食品１ｍＬ又は１ｇ当たり２０ｍｇ以下、好ましくは１５ｍｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ以下の植物性飲食品を回収する回収工程を行うことができる。
　また、マルトトリオース生成酵素作用工程、必要に応じて、糖質酸化酵素作用工程、α－アミラーゼ作用工程等を経て製造された植物性飲食品は、糖類（単糖類及び二糖類）の低減に加え、三糖類の量が増加している。具体的には、例えば、マルトトリオース生成酵素作用工程、必要に応じて、糖質酸化酵素作用工程、α－アミラーゼ作用工程等を経て製造された植物性飲食品中の三糖類の含有量は、植物性飲食品１ｍＬ又は１ｇ当たり８ｍｇ以上、好ましくは１５ｍｇ以上、より好ましくは２０ｍｇ以上である。即ち、本技術では、三糖類の含有量が植物性飲食品１ｍＬ又は１ｇ当たり８ｍｇ以上、好ましくは１５ｍｇ以上、より好ましくは２０ｍｇ以上の植物性飲食品を回収する回収工程を行うことができる。
　本技術に係る植物性飲食品の製造方法、及び植物性飲食品の糖類低減方法の一態様は、以下の工程（１）～（２）を含む。また、（３）を含んでもよい。尚、工程（２）又は（３）の後に、（４）酵素を失活させる工程、及び／又は、（５）糖類（単糖類及び二糖類）が低減及び／又は三糖類の量が増加した植物性飲食品を回収する工程、を追加しても良い。
　（１）植物性糖質を含有する原料を用意する工程
　（２）用意した原料をマルトトリオース生成酵素で処理する工程
　（３）マルトトリオース生成酵素で処理した原料を糖質酸化酵素で処理する工程
　本技術に係る植物性飲食品の製造方法、及び植物性飲食品の糖類低減方法の一態様は、以下の工程（１）～（３）を含む。また、（４）をんでもよい。尚、工程（２）、（３）又は（４）の後に（５）酵素を失活させる工程を追加してもよく、また（６）糖類（単糖類及び二糖類）が低減及び／又は三糖類の量が増加した植物性飲食品を回収する工程、を追加しても良い。
　（１）植物性糖質を含有する原料を用意する工程
　（２）用意した原料をα－アミラーゼで処理する工程
　（３）α－アミラーゼで処理した原料をマルトトリオース生成酵素で処理する工程
　（４）糖質酸化酵素で処理する工程
　＜２．糖類低減用酵素剤＞
　本技術に係る糖類低減用酵素剤は、マルトトリオース生成酵素を有効成分として含有する。また、必要に応じて、糖質酸化酵素及び／又はα－アミラーゼを含有させることも可能である。マルトトリオース生成酵素、糖質酸化酵素、及びα－アミラーゼの詳細は、前述した植物性飲食品の製造方法に用いることができる酵素と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　糖類低減用酵素剤は、前述したマルトトリオース生成酵素を含有していれば、前述したマルトトリオース生成酵素のみで構成されていてもよいし、本技術の効果を損なわない限り、他の成分を１種又は２種以上、自由に選択して含有させることもできる。他の成分としては、例えば、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤等の成分を用いることができる。更に、公知の又は将来的に見出される機能を有する成分を、適宜目的に応じて併用することも可能である。
　＜３．低糖類植物性飲食品＞
　本技術に係る低糖類植物性飲食品は、前述した製造方法を用いて製造された植物性飲食品である。植物性飲料の具体例としては、燕麦飲料が挙げられ、より具体的にはオートミルク（「オーツミルク」とも称される）が挙げられる。植物性食品の具体例としては、植物性ヨーグルトが挙げられる。
　本技術に係る低糖類植物性飲食品に含まれる糖類（単糖類及び二糖類）の量は、特に限定されない。例えば、植物性飲食品に含まれる糖類の量として、植物性飲食品１ｍＬ又は１ｇ当たり２０ｍｇ以下、好ましくは１５ｍｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ以下である。
　本技術に係る低糖類植物性飲食品は糖類（単糖類及び二糖類）の低減に加え、三糖類の量が増加しているものを挙げることができる。三糖類の増加により適度な甘みを付与することができる。本技術に係る低糖類植物性飲食品に含まれる三糖類の量も、特に限定されない。例えば、植物性飲食品に含まれる三糖類の量として、植物性飲食品１ｍＬ又は１ｇ当たり８ｍｇ以上、好ましくは１５ｍｇ以上、より好ましくは２０ｍｇ以上である。
　また、糖類（単糖類＋二糖類）に対する三糖類の比率（三糖類／糖類（単糖類＋二糖類））も特に限定されないが、糖類低減効果と甘味増強効果の両方を得るためには、例えば、０．５以上、好ましくは０．８以上、より好ましくは１以上、より一層好ましくは２以上である。
　なお、本技術では、以下の構成とすることができる。
［１］
　植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程を含む、植物性飲食品の製造方法。
［２］
　植物性原料がα－アミラーゼ処理された原料である、［１］に記載の植物性飲食品の製造方法。
［３］
　植物性原料に糖質酸化酵素を作用させる工程をさらに含む、［１］又は［２］に記載の植物性飲食品の製造方法。
［４］
　植物性飲食品がオートミルクである、［１］から［３］のいずれか一項に記載の植物性飲食品の製造方法。
［５］
　マルトトリオース生成酵素を含む、糖類低減用酵素剤。
［６］
　糖質酸化酵素をさらに含む、［５］に記載の糖類低減用酵素剤。
［７］
　植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程を含む、植物性飲食品の糖類低減方法。
　以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　１．使用酵素
　（１）α－アミラーゼ：「クライスターゼＳＤ８」（天野エンザイム株式会社製、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のα－アミラーゼ）
　（２）β－アミラーゼ：「β－アミラーゼＦ「アマノ」」（天野エンザイム株式会社製、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ由来のβ－アミラーゼ）
　（３）マルトトリオース生成酵素：「ＡＭＴ１．２Ｌ」天野エンザイム株式会社製、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.由来のマルトトリオース生成酵素）
　（４）糖質酸化酵素：本実施例では、糖質酸化酵素の一例として、ＷＯ２０１４/０４２２３７に記載の方法で精製された糖質酸化酵素（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来）を用いた。
　２．酵素活性測定方法
　［でんぷん糖化力活性測定法：マルトトリオース生成酵素の活性測定方法］
　基質とする溶性デンプンに酵素を作用させ、生じた還元糖をソモギー・ネルソン法により比色定量した。
　５０ｍＬネスラー管に溶性デンプン溶液０．５ｍＬ及び０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）（０．０５ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２を含む）を０．４ｍＬ量り、よく振り混ぜ４０±０．５℃で１０～１５分間放置した後、試料溶液０．１ｍＬを加え、直ちに振り混ぜた。この液を４０±０．５℃で正確に１５分間放置した後、アルカリ性銅試液を１ｍＬ加え、振り混ぜて栓をし、沸騰水浴中で正確に２０分間加熱し、直ちに冷却した。冷却後、ネルソン液１ｍＬを加え、亜酸化銅の赤色沈殿が完全に溶けるまでよく振り混ぜた後、室温で２０分間放置し、水を２２ｍＬ加え、よく振り混ぜた。この液につき水を対照として、波長５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。１分間に１μｍｏｌのブドウ糖に相当する還元糖を生成するときを１単位とした。
　［グルコースオキシダーゼ活性測定法：糖質酸化酵素の活性測定方法］
　適当量の酵素を量り、冷却したｐＨ７．０のリン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加えて溶解又は均一に分散して５０ｍＬとしたものを試料液とした。Ｄ（＋）－グルコース２．５０ｇを量り、水を加えて溶かし、２５ｍＬとしたものを基質溶液とした。基質溶液０．５ｍＬ、リン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０、フェノール含有）２ｍＬ、パーオキシダーゼ試液（２５単位／ｍＬ）０．５ｍＬ及び４－アミノアンチピリン溶液（１→２５０）０．１ｍＬを石英セルに入れ、３７℃で１０分間加温した。この液に試料液０．１ｍＬを加えてよく混ぜて３７℃で加温し、検液とした。別に試料液の代わりにｐＨ７．０のリン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）又は水を用いて検液の調製と同様に操作し、比較液とした。検液及び比較液につき、試料液添加２分後及び５分後の波長５００ｎｍにおける吸光度を測定した。生成したキノンイミン色素のモル吸光係数から酸化されたグルコース量を定量した。条件下、１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化するのに必要な酵素量を１単位とした。
　３．実験例
　＜実験例１＞
　実験例１では、マルトトリオース生成酵素による糖類低減効果を調べた。
　（１）実験方法
　ビーカーにオートフラワー（スローフードキッチンＰＴＥＭＩＵＭ　ＯＡＴ　ＦＬＯＵＲ）を１２．５ｇ計り取り、液量が１００ｍＬになるように水を加えた。そこにα－アミラーゼを０．５（ｗ／ｗオートフラワー）％、マルトトリオース生成酵素をオートフラワー１ｇ当たり１２Ｕ加え、６０℃水浴中に入れ、溶液の温度が６０℃に達した後、２時間静置した。その後、煮沸水浴中に入れ１０分間静置し酵素を失活させオート飲料を調製した。マルトトリオース生成酵素をβ－アミラーゼ０．３（ｗ/ｗオートフラワー）％に置き換えたものをコントロールとした。
　調製したオート飲料を１．５ｍＬサンプルチューブに計り取り、１ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸を１９０μＬ添加し、１０分間室温に室温で静置した。遠心分離(１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ)し上清１ｍＬをサンプルチューブに回収した。そこにジエチルエーテル(ＦＵＪＩＦＩＬＭ試薬特級)を１ｍＬ加え混合、遠心分離で水層を１ｍＬ回収する作業を２回繰り返した。
　回収した水槽にエタノール(９９．５)（ＦＵＪＩＦＩＬＭ試薬特級）を等量加え、分析用サンプルとした。
　分析サンプルをＭＣｌ　ＧＥＬ　ＣＫ０４Ｓカラム(三菱化学社製)を用いてＨＰＬＣで生成した糖を分析した。比較のため市販されているオートミルクの糖量も分析した。
　（２）結果
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（３）考察
　表１に示す通り、β－アミラーゼ処理したオート飲料及び市販のオートミルクの糖類含有量は、いずれも２７ｍｇ／ｍＬ以上であった。一方、マルトトリオース生成酵素を使用することで、糖類の量を２０ｍｇ／ｍＬ以下にできることが確認された。
　＜実験例２＞
　実験例２では、糖質酸化酵素による糖類低減効果を確認した。
　（１）実験方法
　実施例１の方法に準じて、マルトトリオース生成酵素を使用したオート飲料を調製し、２００ｍＬ計り取り５００ｍＬ容三角フラスコに入れた。そこに、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来の糖質酸化酵素をグルコースオキシダーゼ活性が６００単位となるように添加、三角フラスコを４０℃水浴中に入れ、２ｍｍ径のチューブで適度な空気を送りながら撹拌し２時間反応させた。酵素反応後のオート飲料を煮沸水浴中に入れ１０分間静置し酵素を失活させた。失活させたオート飲料に既定の処理を行い、ＩＣＳｅｐ　ＩＣＥ－ＩＯＮ－３００　ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いてＨＰＬＣで生成した糖を分析した。
　（２）結果
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　（３）考察
　表２に示す通り、マルトトリオース生成酵素処理したオート飲料に更に糖質酸化酵素を作用させることで、糖類を更に低減できることが確認された。
　＜実験例３＞
　実験例３では、α－アミラーゼ作用工程を、マルトトリオース生成酵素作用工程前に、行った場合、更に、各種酵素作用条件を変更した場合の効果について確認した。
　（１）実験方法
　ビーカーにオートフラワー(スローフードキッチンＰＴＥＭＩＵＭ　ＯＡＴ　ＦＬＯＵＲ)を１２．５ｇ計り取り、液量が１００ｍＬになるように水を加えた。そこにα－アミラーゼを０．５（ｗ／ｗオートフラワー）％加え、６０℃水浴中に入れ、溶液の温度が６０℃に達した後、２時間静置した。その後、煮沸水浴中に入れ１０分間静置し酵素を失活させオート飲料原料を調製した。オート飲料原料に、マルトトリオース生成酵素をオートフラワー１ｇ当たり１．２～１２０Ｕ加え、４０℃又は５０℃水浴中に入れ、溶液の温度が６０℃に達した後、１～３時間静置した。その後、煮沸水浴中に入れ１０分間静置し酵素を失活させオート飲料を調製した。
　調製したオート飲料を１．５ｍＬサンプルチューブに計り取り、１ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸を１９０μＬ添加し、１０分間室温に室温で静置した。遠心分離(１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ)し上清１ｍＬをサンプルチューブに回収した。そこにジエチルエーテル(ＦＵＪＩＦＩＬＭ試薬特級)を１ｍＬ加え混合、遠心分離で水層を１ｍＬ回収する作業を２回繰り返した。
　回収した水槽にエタノール(９９．５)（ＦＵＪＩＦＩＬＭ試薬特級）を等量加え、分析用サンプルとした。
　分析サンプルをＭＣｌ　ＧＥＬ　ＣＫ０４Ｓカラム(三菱化学社製)を用いてＨＰＬＣで生成した糖を分析した。比較のため市販されているオートミルクの糖量も分析した。
　（２）結果
　結果を表３及び表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（３）考察
　表３および表４に示す通り、α－アミラーゼ処理後にマルトトリオース生成酵素処理をした場合でも、糖類低減効果が確認できた。また、マルトトリオース生成酵素の添加量、処理温度、処理時間を変えた場合でも、糖類低減効果が確認できた。

Claims (7)

  1. 　植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程を含む、植物性飲食品の製造方法。
  2. 　植物性原料がα－アミラーゼ処理された原料である、請求項１に記載の植物性飲食品の製造方法。
  3. 　植物性原料に糖質酸化酵素を作用させる工程をさらに含む、請求項１に記載の植物性飲食品の製造方法。
  4. 　植物性飲食品がオートミルクである、請求項１に記載の植物性飲食品の製造方法。
  5. 　マルトトリオース生成酵素を含む、糖類低減用酵素剤。
  6. 　糖質酸化酵素をさらに含む、請求項５に記載の糖類低減用酵素剤。
  7. 　植物性原料にマルトトリオース生成酵素を作用させる工程を含む、植物性飲食品の糖類低減方法。
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