WO2023085324A1 - 冷凍パン生地用改質剤 - Google Patents

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WO2023085324A1
WO2023085324A1 PCT/JP2022/041731 JP2022041731W WO2023085324A1 WO 2023085324 A1 WO2023085324 A1 WO 2023085324A1 JP 2022041731 W JP2022041731 W JP 2022041731W WO 2023085324 A1 WO2023085324 A1 WO 2023085324A1
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WO
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bread dough
dough
amino acid
carbohydrate oxidase
frozen
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PCT/JP2022/041731
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English (en)
French (fr)
Inventor
メンデス デ オリヴェイラ ジャディール
Original Assignee
天野エンザイム株式会社
プロジン インダストリア コメルシオ エイレリ
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D6/00—Other treatment of flour or dough before baking, e.g. cooling, irradiating, heating
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

Definitions

  • This technology relates to a modifier for frozen bread dough. More specifically, the present technology relates to a modifier for frozen bread dough using carbohydrate oxidase, a method for producing frozen bread dough, and a method for producing bread.
  • Patent Literature 1 discloses a technique for improving dough firmness, stickiness, stability and toughness by using carbohydrate oxidase.
  • Patent Literature 2 discloses a technique for improving the rheological properties of flour soft mass by using an oxidoreductase capable of oxidizing maltose.
  • Patent Document 3 discloses a technique for stabilizing the gluten network of dough using enzymes such as hexose oxidase and glucose oxidase.
  • Patent Document 4 discloses a technology that uses sugar oxidase to tighten bread dough (dough), reduce stickiness in the manufacturing process, and facilitate handling.
  • the main purpose of this technology is to provide a technology for improving the quality of bread manufactured using frozen bread dough.
  • the present technology first provides a modifier for frozen bread dough containing carbohydrate oxidase.
  • the modifier for frozen bread dough according to the present technology has a volume-increasing effect, a texture-improving effect, and an appearance-improving effect.
  • the carbohydrate oxidase having the property of acting on one or more carbohydrates selected from glucose, maltotriose, maltose, galactose, maltotetraose, lactose, cellobiose, and maltodextrin. can be used.
  • a carbohydrate oxidase comprising a polypeptide shown in any one of (1) to (3) below can be used as the carbohydrate oxidase.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) A substrate equivalent to a polypeptide having one or several amino acid residues substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and (3) a polypeptide having a sequence identity of 90% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptides exhibiting substrate specificity comparable to
  • a dough preparation step of adding sugar oxidase to bread dough ingredients to prepare bread dough A freezing step of freezing the prepared dough;
  • a thawing step of thawing frozen bread dough containing carbohydrate oxidase A fermentation process of fermenting the bread dough after thawing, A heating step of heating the bread dough after fermentation; Also provided is a method of making bread in which
  • Modifier for frozen bread dough A modifier for frozen bread dough according to the present technology contains carbohydrate oxidase as an active ingredient.
  • the modifier for frozen bread dough according to the present technology has a volume-increasing effect, a texture-improving effect, and an appearance-improving effect.
  • the volume-increasing effect is the effect of increasing the volume of bread produced using the modifier for frozen bread dough according to this technology.
  • the effect of improving the texture is the effect of improving the texture of bread produced using the modifier for frozen bread dough according to the present technology. have.
  • the effect of improving appearance is the effect of improving the appearance of bread manufactured using the modifier for frozen bread dough according to this technology.
  • surface cuts called coupes are important in terms of appearance, and the present technology has the effect of improving the spread of surface cuts such as coupes.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not particularly limited as long as it is capable of oxidizing carbohydrates, but enzymes that oxidize oligosaccharides having two or more sugars are preferable. Specific examples include proteins having the physicochemical properties described below.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology oxidizes sugars described later to produce sugar acids in the presence of oxygen. More specifically, sugar acid and hydrogen peroxide are produced by reacting a sugar described later with sugar oxidase that can be used in the present technology in the presence of oxygen.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology exhibits activity on one or more carbohydrates selected from glucose, maltotriose, maltose, galactose, maltotetraose, lactose, cellobiose, and dextrin. Proteins can be used. The relative activity for each substrate is maltotriose: about 92%, maltose: about 86%, galactose: about 79%, maltotetraose: about 60%, lactose: about 58%, when the activity for glucose is 100%. , cellobiose: about 53%, maltodextrin: about 24%. In addition, in the present technology, if the relative activity is 50% or more when the activity when glucose is used as a substrate is taken as the standard (100%), it is judged that "the present enzyme is a substrate that works well".
  • carbohydrate oxidase that is active not only on monosaccharides such as glucose but also on a wide range of carbohydrates such as disaccharides, it is possible to treat a wide range of carbohydrates that cannot be treated with existing glucose oxidases and oligosaccharide oxidases. It is possible to function carbohydrate oxidation in various fields.
  • Km Value In the present technology, a specific method for calculating the Km value (Michaelis constant) of a protein is not particularly limited, and a known method can be freely selected for calculation. Methods for calculating the Km value of protein include, for example, Lineweaver-Burk plot, Eadie-Hofstee plot, Hanes-Woolf plot and the like, preferably Hanes-Woolf plot.
  • the Km value of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not particularly limited, it is preferably [Km value of glucose]/[Km value of maltose] ⁇ 1, and 0.4 ⁇ [Km value of glucose ]/[Km value of maltose] ⁇ 1.
  • a carbohydrate oxidase having a molecular mass of about 63 kDa according to the SDS-PAGE method can be used.
  • carbohydrate oxidase that can be used in the present technology, carbohydrate oxidase that exhibits the highest carbohydrate oxidase activity at around pH 5.0 to 9.0 under reaction conditions of 37° C. for 5 minutes can be used. .
  • Stable pH Range Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology can be stable in the vicinity of pH 5.0 to 10.5 under treatment conditions of 37° C. for 15 minutes.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology should have the highest carbohydrate oxidase activity at around 20°C to 55°C under reaction conditions of pH 7.0 for 5 minutes. can be done.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology can maintain 80% or more activity even when treated at pH 7.0 for 15 minutes and at temperatures up to 45°C. Carbohydrate oxidase can be used.
  • Origin The origin of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology described above is not particularly limited, but examples thereof include those derived from microorganisms belonging to the genus Acremonium.
  • the microorganism belonging to the genus Acremonium includes Acremonium chrysogenum.
  • carbohydrate oxidase derived from Acremonium chrysogenum means a carbohydrate oxidase produced by a microorganism classified as Acremonium chrysogenum (whether a wild strain or a mutant), or a carbohydrate It means that it is a carbohydrate oxidase obtained by a genetic engineering technique using an oxidase gene. Therefore, a recombinant produced by a host microorganism into which a carbohydrate oxidase gene obtained from Acremonium chrysogenum (or a gene obtained by modifying the gene) has been introduced also corresponds to "a carbohydrate oxidase derived from Acremonium chrysogenum".
  • Acremonium chrysogenum from which carbohydrate oxidases that can be used in the present technology are derived examples include Acremonium chrysogenum NBRC30055 (NITE, Japan), ATCC15006 (ATCC, USA), and DSM880 (DSMZ, Germany). can be done.
  • amino acid structure of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not limited, but can be specified by the following amino acid sequence, for example.
  • carbohydrate oxidase that can be used in this technology can be specified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the protein after modification may have the same function as the protein before modification. That is, the modification of the amino acid sequence does not substantially affect the function of the protein, and the function of the protein may be maintained before and after modification. Therefore, as another aspect of the present technology, a protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having carbohydrate oxidase activity I will provide a. "Deletion, substitution and/or addition of one to several amino acids constituting an amino acid sequence" typically refers to partial differences in amino acid sequences.
  • a difference in the amino acid sequence here is permissible as long as the carbohydrate oxidase activity can be maintained (the activity may vary slightly).
  • the positions where the amino acid sequences differ are not particularly limited, and differences may occur at multiple positions.
  • the plural here is, for example, a number corresponding to less than about 30% of the total amino acid sequence, preferably a number corresponding to less than about 20%, and more preferably a number corresponding to less than about 10%. , even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. That is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, even more preferably about 95% or more, most preferably about 99% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 refers to having
  • a method of obtaining a protein by causing conservative amino acid substitutions in amino acid residues that are not essential for carbohydrate oxidase activity is good.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain with similar properties.
  • Amino acid residues have, depending on their side chain, a basic side chain (e.g. lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (e.g. aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (e.g.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine). , tryptophan, histidine) are classified into several families. Conservative amino acid substitutions are preferably between amino acid residues within the same family.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acids can be determined, for example, by the following procedure.
  • the two sequences are aligned for optimal comparison.
  • gaps may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence.
  • comparison of two sequences and determination of identity can be realized using a mathematical algorithm.
  • mathematical algorithms that can be used for sequence comparison include Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 and Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, modified algorithm, but not limited to this.
  • Such algorithms are described in Altschul et al. (1990) J. Am. Mol. Biol. 215:403-10, incorporated in the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0).
  • Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al. (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402.
  • the default parameters of the corresponding programs eg, XBLAST and NBLAST
  • XBLAST and NBLAST the default parameters of the corresponding programs
  • a carbohydrate oxidase that can be used in this technology may be part of a larger protein (eg, a fusion protein).
  • Additional sequences in the fusion protein include, for example, sequences that aid in purification such as multiple histidine residues, additional sequences that ensure stability during recombinant production, and the like.
  • a protein having the above amino acid sequence can be easily prepared by genetic engineering techniques. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell (eg, Escherichia coli, yeast, filamentous fungus) with a DNA encoding the present protein, and recovering the protein expressed in the transformant. The recovered protein is appropriately prepared according to the purpose.
  • a suitable host cell eg, Escherichia coli, yeast, filamentous fungus
  • the recovered protein is appropriately prepared according to the purpose.
  • the present protein as a recombinant protein in this manner, various modifications are possible. For example, if a DNA encoding the present protein and other suitable DNA are inserted into the same vector, and the vector is used to produce a recombinant protein, the recombinant protein consists of any peptide or protein linked thereto.
  • the present protein can be obtained.
  • addition of sugar chains and/or lipids, or modification that causes N-terminal or C-terminal processing may be performed. Such modifications enable extraction of
  • the content of carbohydrate Oxidase in the modifier for frozen bread dough according to the present technology can be freely set as long as the effects of the present technology are not impaired.
  • the content is, for example, 0.001 U/mL to 10000 U/mL, preferably 0.01 U/mL to 5000 U/mL, more preferably 0.1 U/mL to 1000 U/mL. mL, more preferably 1 U/mL to 500 U/mL.
  • the modifier for frozen bread dough is powdery
  • the content is, for example, 0.001 U/g to 10000 U/g, preferably 0.01 U/g to 5000 U/g, more preferably 0.1 U/g. It can be up to 1000 U/g, more preferably 1 U/g to 500 U/g.
  • the modifier for frozen bread dough according to the present technology may be composed only of the above-described carbohydrate oxidase as long as it contains the above-described carbohydrate oxidase.
  • One or two or more other components may be freely selected and contained as long as the effect is not impaired.
  • Other ingredients that can be used include, for example, excipients, pH adjusters, colorants, corrigents, disintegrants, lubricants, stabilizers, and the like that are commonly used in formulations.
  • a method for manufacturing frozen bread dough according to the present technology is a method in which at least a dough preparation step and a freezing step are performed. Further, the bread manufacturing method according to the present technology is a method that performs at least a thawing process, a fermentation process, and a heating process. In addition, depending on the type of bread, etc., it is also possible to perform a general bread manufacturing process before, after, or simultaneously with each process, as long as the effects of the present technology are not impaired. Each step will be described in detail below in chronological order.
  • the dough preparation step is a step of adding sugar oxidase to bread dough ingredients to prepare bread dough. Specifically, it is a step of kneading bread dough ingredients to which carbohydrate oxidase has been added to prepare the dough.
  • a specific kneading method in the dough preparation step is not particularly limited as long as it does not impair the effect of the present technology, and a kneading method that is usually performed in the bread manufacturing method can be freely selected and used.
  • a method of mixing dough materials with a cooking utensil such as a rubber spatula and then kneading the mixture by hand or a method of kneading with a kneading machine can be used.
  • the dough preparation process it is possible to knead all the ingredients used for the bread dough at the same time. It can be kneaded by a free method according to the materials to be used and the purpose, such as a method of mixing several kinds of materials separately and kneading the mixed materials together.
  • the dough preparation process it is preferable that fermentation does not proceed excessively. If the fermentation proceeds excessively before freezing, the yeast may suffer freezing damage and the fermentation power after thawing may decrease. Therefore, in the dough preparation step, it is preferable to prepare the bread dough under the condition that the temperature of the bread dough material is 22° C. or less. Specific methods for lowering the temperature of bread dough ingredients include using ice, using refrigerated ingredients, cooling cooking utensils used for kneading, etc., as long as the effects of this technology are not impaired. One or two or more cooling methods can be freely selected and used.
  • this technology also includes the production of bread using the fermented seed method.
  • a general production method of the fermented seed method after mixing a part of the dough material, yeast and water, fermentation is performed to prepare a fermented seed, and after mixing the remaining dough material with the prepared fermented seed, In this method, the dough is fermented, then divided, shaped, and fermented for the final stage before baking.
  • the dough preparation process of the present technology it is also possible to prepare the dough by mixing the fermented seeds, the remaining dough ingredients, and the carbohydrate oxidase. At this time, it is preferable that the final fermentation does not proceed excessively.
  • the amount of carbohydrate oxidase added in the dough preparation process can be freely set as long as it does not impair the effect of this technology.
  • the lower limit of the amount to be added is, for example, 0.01 mU or more, preferably 0.1 mU or more, more preferably 0.5 mU or more, and still more preferably 1 mU or more, per 1 g of bread dough raw material.
  • the upper limit of the amount added can be, for example, 1 U or less, preferably 100 mU or less, and more preferably 10 mU or less per 1 g of bread dough raw material.
  • the bread dough ingredients used in the dough preparation process can be freely combined with the ingredients used for general bread dough as long as the effects of this technology are not impaired.
  • wheat flour such as soft flour, medium flour, semi-strong flour, strong flour, wheat flour derived from durum wheat, rice flour, rye flour, barley flour, oat flour, buckwheat flour, barnyard flour, millet flour, corn flour, and various grains Grain flour such as starch; Yeast such as dry yeast and fresh yeast; Additives for activating yeast such as yeast food; Salt, mayonnaise, sauce, soy sauce, various seasonings such as amino acids; Various materials such as powders that use milk as a main raw material; Oils and fats; Eggs (including whole eggs, egg yolks, egg whites, powdered eggs, etc.); Flavors, emulsifiers, bread improvers, thickeners, stabilizers, bacteriostatic agents , various additives such as enzymes other than carbohydrate oxidase.
  • the freezing step is a step of freezing the dough prepared in the dough preparation step.
  • a freezing method in the freezing step is not limited as long as the effect of the present technology is not impaired, and a general freezing method can be freely selected and used.
  • the freezing conditions in the freezing process are also not limited as long as they do not impair the effects of this technology.
  • the temperature condition for freezing is preferably ⁇ 25° C. or lower, more preferably ⁇ 30° C. or lower, and rapid freezing is preferred.
  • the conditions for frozen bread dough storage are not limited as long as the effect of the present technology is not impaired.
  • the temperature condition during frozen storage is preferably -8 to -22°C, more preferably -12 to -20°C.
  • the thawing step is a step of thawing frozen bread dough containing carbohydrate oxidase.
  • a thawing method in the thawing step is not limited as long as the effect of the present technology is not impaired, and a general thawing method can be freely selected and used. Examples thereof include room temperature thawing (1 to 30°C), room temperature thawing (15 to 25°C), refrigerated thawing (1 to 10°C), and microwave thawing.
  • the fermentation step is a step of fermenting the bread dough thawed in the thawing step.
  • a fermentation method in the fermentation process is not limited as long as the effect of the present technology is not impaired, and a general fermentation method can be freely selected and used.
  • the fermentation process referred to here is a process corresponding to the fermentation of the dough (primary fermentation (floor time), bench time, secondary fermentation (final fermentation, proofing)). In other words, it is not the fermentation when producing a fermented seed such as the liquid seed method.
  • the fermentation temperature in the fermentation process can be freely set according to the type of yeast used and the condition of the dough, as long as it does not impair the effect of this technology.
  • the fermentation temperature in the fermentation step is preferably set at 23-40°C, more preferably set at 26-35°C.
  • the fermentation time in the fermentation process can also be freely set according to the type and amount of yeast used and the condition of the dough, as long as it does not impair the effect of this technology.
  • the fermentation time in the fermentation step is preferably set to 30 minutes to 24 hours, more preferably 1 to 16 hours.
  • the fermentation process can be divided into multiple steps. For example, there is a method in which each step is performed in the order of primary fermentation (floor time) ⁇ division step described later ⁇ bench time ⁇ molding step described later ⁇ secondary fermentation (final fermentation, proofing).
  • the enzymatic reaction by carbohydrate oxidase can be allowed to proceed under the same conditions as the fermentation conditions, but it is also possible to provide an enzymatic treatment process separately from the fermentation process.
  • the enzyme treatment conditions can be freely set as long as the effects of the present technology are not impaired.
  • the pH, temperature, duration of action, etc. can be set according to the physicochemical properties of the carbohydrate oxidase to be used, such as optimum pH, stable pH range, optimum temperature, and temperature stability.
  • the pH can be set to, for example, pH 5.0 to 10.5, preferably pH 5.0 to 7.5.
  • the temperature can be set to, for example, 20°C to 55°C, preferably 30°C to 50°C, more preferably 35°C to 45°C.
  • the duration of action can be set to, for example, 1 to 12 hours, preferably 4 to 10 hours.
  • the dividing step is a step of dividing the prepared bread dough.
  • the dividing step is not essential, and can be performed as appropriate depending on the form of the bread to be manufactured.
  • the division process can be performed at any time after the dough preparation process. For example, after the dough preparation step, the dough is allowed to rest until it settles, then the dough is divided into desired sizes, and the divided dough can be frozen. Alternatively, after thawing the frozen dough, the dough may be divided into desired sizes, molded appropriately, and fermented, followed by the heating step described later.
  • the forming step is a step of forming the prepared bread dough.
  • the forming step is not essential, and can be performed as appropriate according to the shape of the bread to be manufactured.
  • the molding process can be performed at any time after the dough preparation process. For example, after the dough preparation step, the dough is allowed to rest until it settles, then the dough is shaped into a desired shape, and the shaped dough can be frozen. Alternatively, after thawing the frozen dough, the dough may be molded into a desired shape, and the dough may be appropriately fermented and then subjected to the heating step to be described later.
  • Heating step is a step of heating the bread dough after fermentation.
  • a heating method in the heating step is not limited as long as the effect of the present technology is not impaired, and a general heating method can be freely selected and used. Examples include baking, frying, steaming, and microwave heating.
  • the heating temperature in the heating process can be freely set according to the type and shape of the bread to be manufactured, the heating method, etc., as long as the effect of this technology is not impaired.
  • the heating temperature in the heating step is preferably set to 140 to 280°C, more preferably 160 to 240°C.
  • the heating time in the heating process can also be freely set according to the type and shape of the bread to be manufactured, the heating method, etc., as long as the effect of this technology is not impaired.
  • the heating time in the heating step is preferably set to 10 minutes to 2 hours, more preferably 15 minutes to 1 hour.
  • the following measurement method was used as a method for measuring the activity of carbohydrate oxidase.
  • Glucose oxidase activity measurement method A suitable amount of the enzyme was weighed, and a cooled potassium phosphate/sodium hydroxide buffer (0.1 mol/L) of pH 7.0 was added to dissolve or uniformly disperse to make 50 mL of the sample solution. 2.50 g of D(+)-glucose was weighed and dissolved by adding water to make 25 mL, which was used as a substrate solution.
  • Substrate solution 0.5 mL, potassium phosphate / sodium hydroxide buffer (0.1 mol / L, pH 7.0, containing phenol) 2 mL, peroxidase test solution (25 units / mL) 0.5 mL and 4-aminoantipyrine solution ( 1 ⁇ 250) was placed in a quartz cell and heated at 37° C. for 10 minutes. 0.1 mL of the sample solution was added to this solution, mixed well and heated at 37° C. to obtain a test solution.
  • a potassium phosphate/sodium hydroxide buffer 0.1 mol/L of pH 7.0 or water was used, and the same procedure as in the preparation of the test solution was performed to prepare a comparative solution.
  • the absorbance at a wavelength of 500 nm was measured 2 minutes and 5 minutes after the addition of the test solution and the comparison solution.
  • the amount of oxidized glucose was quantified from the molar extinction coefficient of the quinoneimine dye produced. One unit was defined as the amount of enzyme required to oxidize 1 ⁇ mol of glucose per minute under the conditions.
  • the rested bread dough was divided into 70 g pieces, rolled into balls, formed into cylinders with a length of 8 to 10 cm, placed in a mold, and arranged vertically so that the length was about 6 cm.
  • a modifier for frozen bread dough comprising carbohydrate oxidase.
  • the modifier for frozen bread dough according to [1] which has a volume-increasing effect.
  • carbohydrate oxidase has a property of acting on one or more carbohydrates selected from glucose, maltotriose, maltose, galactose, maltotetraose, lactose, cellobiose, and maltodextrin; Modifier for frozen bread dough according to any one of.
  • polypeptides consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) A substrate equivalent to a polypeptide having one or several amino acid residues substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and (3) a polypeptide having a sequence identity of 90% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptides exhibiting substrate specificity comparable to [7]
  • a thawing step of thawing frozen bread dough containing carbohydrate oxidase A fermentation process of fermenting the bread dough after thawing, A heating step of heating the bread dough after fermentation; bread manufacturing method.
  • a method of making bread dough A method of making bread dough.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) A substrate equivalent to a polypeptide having one or several amino acid residues substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and (3) a polypeptide having a sequence identity of 90% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptides exhibiting substrate specificity comparable to

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Abstract

冷凍パン生地を用いて製造されたパンの品質を向上させる技術を提供すること。　本技術では、糖質酸化酵素を含む、冷凍パン生地用改質剤を提供する。本技術に係る冷凍パン生地用改質剤は、体積増大作用、食感向上作用、および外観向上作用を有する。本技術では、また、パン生地材料に糖質酸化酵素を添加して、パン生地を調製する生地調製工程と、調製された生地を冷凍する冷凍工程と、を行う冷凍パン生地の製造方法、および、糖質酸化酵素を含有する冷凍パン生地を解凍する解凍工程と、解凍後のパン生地を発酵させる発酵工程と、発酵後のパン生地を加熱する加熱工程と、を行うパンの製造方法も提供する。

Description

冷凍パン生地用改質剤
　本技術は、冷凍パン生地用改質剤に関する。より具体的には、本技術は、糖質酸化酵素を用いた冷凍パン生地用改質剤、冷凍パン生地の製造方法、及びパンの製造方法に関する。
　近年、各種酵素を用いて、パンの品質を向上する技術が開発されている。例えば、特許文献１では、糖質酸化酵素を用いることで、ドウの堅さ、粘着性、安定性および頑丈性を改良する技術が開示されている。特許文献２では、マルトースを酸化することができる酸化還元酵素を用いることで、穀粉軟塊流動学的性質を改良する技術が開示されている。特許文献３では、ヘキソースオキシダーゼやグルコースオキシダーゼ等の酵素を用いて、生地のグルテンネットワークを安定化する技術が開示されている。
　また、特許文献４では、糖質酸化酵素を用いることで、パン生地（ドウ）を引き締め、製造工程におけるベタつきを軽減させて、ハンドリングし易くする技術が開示されている。
特表２００１－５２６０５８号公報 特表平１１－５０６３３８号公報 特表２０１７－５１０２８２号公報 国際公開第２０１４／０４２２３７号
　冷凍技術の発達と共に、冷凍したパン生地の流通が盛んになっているが、冷凍パン生地を用いて製造されたパンは、冷凍工程を経ないで製造されたパンに比べて、ボリュームが劣るといった問題があった。この原因は、冷凍保存中におけるパン生地中のグルテン構造の破壊や、パン生地中の氷結晶生成によるイーストの死滅と考えられている。
　また、冷凍技術が発展途上の国では、冷凍設備の品質が高くないため、冷凍パン生地自体の品質向上が求められている。
　そこで、本技術では、冷凍パン生地を用いて製造されたパンの品質を向上させる技術を提供することを主目的とする。
　前述した引用文献４で提案されている冷凍工程を経ないパンの製造技術では、糖質酸化酵素を用いることで、パン生地（ドウ）を引き締め、その結果、製造されたパンのボリュームが減り、硬さが増すことが報告されている。しかしながら、本願発明者らは、糖質酸化酵素を用いたパン生地を一旦冷凍保存した後、解凍・発酵工程を経て製造されたパンは、意外にも、パンのボリュームが増加することを見出し、本技術を完成するに至った。
　即ち、本技術では、まず、糖質酸化酵素を含む、冷凍パン生地用改質剤を提供する。本技術に係る冷凍パン生地用改質剤は、体積増大作用、食感向上作用、および外観向上作用を有する。
　本技術では、前記糖質酸化酵素として、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に作用する性質を有する糖質酸化酵素を用いることができる。
　また、本技術では、前記糖質酸化酵素として、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドからなる糖質酸化酵素を用いることができる。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド。
　本技術では、次に、パン生地材料に糖質酸化酵素を添加して、パン生地を調製する生地調製工程と、
　調製された生地を冷凍する冷凍工程と、
　を行う冷凍パン生地の製造方法を提供する。
　また、本技術では、糖質酸化酵素を含有する冷凍パン生地を解凍する解凍工程と、
　解凍後のパン生地を発酵させる発酵工程と、
　発酵後のパン生地を加熱する加熱工程と、
　を行うパンの製造方法も提供する。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
　＜１．冷凍パン生地用改質剤＞
　本技術に係る冷凍パン生地用改質剤は、糖質酸化酵素を有効成分として含有する。本技術に係る冷凍パン生地用改質剤は、体積増大作用、食感向上作用、および外観向上作用を有する。
　体積増大作用とは、本技術に係る冷凍パン生地用改質剤を用いて製造されたパンの体積（ボリューム）を増大させる作用である。
　食感向上作用とは、本技術に係る冷凍パン生地用改質剤を用いて製造されたパンの食感を改良する作用であり、本技術では、主に、パンのサクサク感を向上させる作用を有する。
　外観向上作用とは、本技術に係る冷凍パン生地用改質剤を用いて製造されたパンの外観を改良する作用である。例えば、バケットやバタール等のフランスパンでは、クープと呼ばれる表面の切れ目が外観上、重要であるが、本技術では、このクープのような表面の切れ目の広がりを向上させる作用を有する。
　以下、本技術に用いることができる糖質酸化酵素について、詳細に説明する。
　（１）糖質酸化酵素
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、糖質を酸化できる酵素であれば特に限定されないが、好ましくは２糖以上のオリゴ糖を酸化する酵素である。具体的には、後述する理化学的性質を有するタンパク質が挙げられる。
　Ａ．作用
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、酸素存在下において、後述する糖を酸化し糖酸を生成する。より詳しくは、酸素存在下において、後述する糖に、本技術に用いることができる糖質酸化酵素を作用させると、糖酸と過酸化水素が生成する。
　Ｂ．基質特異性
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びデキストリンから選ばれる１以上の糖質に対し活性を示すタンパク質を用いることができる。各基質に対する相対活性は、グルコースに対する活性を１００％とした場合、マルトトリオース：約９２％、マルトース：約８６％、ガラクトース：約７９％、マルトテトラオース：約６０％、ラクトース：約５８％、セロビオース：約５３％、マルトデキストリン：約２４％である。
　なお、本技術においては、グルコースを基質とした場合の活性を基準（１００％）としたときの相対活性が５０％以上あれば、「本酵素が良好に作用する基質である」と判断した。
　このように、グルコースのような単糖類のみならず、二糖類以上の広範囲な糖質にも活性を示す糖質酸化酵素を用いれば、既存のグルコースオキシダーゼやオリゴ糖酸化酵素では対応できなかった広範囲な分野において、糖質酸化作用を機能させることが可能である。
　Ｃ．Ｋｍ値
　本技術において、タンパク質のＫｍ値（ミカエリス定数）の具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。タンパク質のＫｍ値の算出方法として、例えば、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロット、Ｅａｄｉｅ－Ｈｏｆｓｔｅｅプロット、Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロット等が挙げられ、好ましくはＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロットが挙げられる。本技術に用いることができる糖質酸化酵素のＫｍ値は特に限定されないが、［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦１であることが好ましく、０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦１であることがより好ましい。
　Ｄ．分子質量
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法による分子質量が約６３ｋＤａの糖質酸化酵素を用いることができる。
　Ｅ．至適ｐＨ
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、３７℃で５分間の反応条件において、ｐＨ５．０～９．０付近で最も糖質酸化酵素活性が高い糖質酸化酵素を用いることができる。
　Ｆ．安定ｐＨ範囲
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、３７℃で１５分間の処理条件において、ｐＨ５．０～１０．５付近において安定な糖質酸化酵素を用いることができる。
　Ｇ．至適温度
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ｐＨ７．０で５分間の反応条件において、２０℃～５５℃付近で最も糖質酸化酵素活性が高い糖質酸化酵素を用いることができる。
　Ｈ．温度安定性
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ｐＨ７．０で１５分間の処理条件において、４５℃までの温度条件で処理しても８０％以上の活性を維持することができる糖質酸化酵素を用いることができる。
　Ｉ．由来について
　以上説明した本技術に用いることができる糖質酸化酵素の由来は特に限定されないが、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物に由来するものが挙げられる。この場合、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが挙げられる。
　ここでの「Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに由来する糖質酸化酵素」とは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産する糖質酸化酵素、あるいは糖質酸化酵素遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られた糖質酸化酵素であることを意味する。従って、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍより取得した糖質酸化酵素遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組換え体も「Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに由来する糖質酸化酵素」に該当する。
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素がそれに由来することとなるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの例としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　ＮＢＲＣ３００５５（ＮＩＴＥ、日本）、ＡＴＣＣ１５００６（ＡＴＣＣ、アメリカ）、ＤＳＭ８８０（ＤＳＭＺ、ドイツ）を挙げることができる。
　Ｊ．アミノ酸配列
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素のアミノ酸構造は限定されないが、一例を挙げると、以下のアミノ酸配列により特定することができる。
　具体的には、本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列で特定することができる。
　ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、アミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで、本技術は他の態様として、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を提供する。「アミノ酸配列を構成する１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加」とは、典型的にアミノ酸配列の一部の相違のことをいう。
　ここでのアミノ酸配列の相違は、糖質酸化酵素活性が保持されうる限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限り、アミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは、例えば、全アミノ酸配列の約３０％未満に相当する数であり、好ましくは約２０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。
　即ち、配列番号１のアミノ酸配列と、例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、より一層好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有することを指す。
　また、好ましくは、糖質酸化酵素活性に必須でないアミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を生じさせることによって、タンパク質を得る方法がよい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基は、その側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる。この際、例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（即ち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数及びサイズも考慮に入れる。
　また、二つの配列の比較及び同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４―６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３―７７において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３―１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。本技術の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えばＮＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２としてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行えばよい。
　本技術のポリペプチド分子に等価なアミノ酸配列を得るには、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３としてＢＬＡＳＴポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためにはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５（１７）：３３８９－３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴを利用する場合は、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　上記アミノ酸配列を有するタンパク質は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母、糸状菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜調製される。このように組換えタンパク質として本タンパク質を得ることにすれば、種々の修飾が可能である。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本タンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
　Ｋ．冷凍パン生地用改質剤中の糖質酸化酵素の含有量
　本技術に係る冷凍パン生地用改質剤における糖質酸化酵素の含有量は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。冷凍パン生地用改質剤が液状の場合の含有量は、例えば、０．００１Ｕ／ｍＬ～１００００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０１Ｕ／ｍＬ～５０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ～１０００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは１Ｕ／ｍＬ～５００Ｕ／ｍＬとすることができる。また、冷凍パン生地用改質剤が粉末状の場合の含有量は、例えば、０．００１Ｕ／ｇ～１００００Ｕ／ｇ、好ましくは０．０１Ｕ／ｇ～５０００Ｕ／ｇ、より好ましくは０．１Ｕ／ｇ～１０００Ｕ／ｇ、更に好ましくは１Ｕ／ｇ～５００Ｕ／ｇとすることができる。
　（２）その他の成分
　本技術に係る冷凍パン生地用改質剤は、前述した糖質酸化酵素を含有していれば、前述した糖質酸化酵素のみで構成されていてもよいし、本技術の効果を損なわない限り、他の成分を１種又は２種以上、自由に選択して含有させることもできる。他の成分としては、例えば、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤等の成分を用いることができる。更に、公知の又は将来的に見出される機能を有する成分を、適宜目的に応じて併用することも可能である。
　＜２．冷凍パン生地の製造方法、パンの製造方法＞
　本技術に係る冷凍パン生地の製造方法は、生地調製工程と、冷凍工程と、を少なくとも行う方法である。また、本技術に係るパンの製造方法は、解凍工程と、発酵工程と、加熱工程と、を少なくとも行う方法である。その他、パンの種類等に応じて、各工程の前後や各工程と同時に、本技術の効果を損なわない範囲において、一般的なパンの製造工程を行うことも可能である。以下、各工程について時系列に沿って詳細に説明する。
　（１）生地調製工程
　生地調製工程は、パン生地材料に糖質酸化酵素を添加して、パン生地を調製する工程である。具体的には、糖質酸化酵素を添加したパン生地材料を混捏して生地を調製する工程である。生地調製工程における具体的な混捏方法は、本技術の効果を損なわない限り特に限定されず、パン類の製造方法で通常行われる混捏方法を自由に選択して用いることができる。例えば、ゴムべら等の調理器具を用いて生地材料を混合した後、手で捏ねる方法や、混捏可能な機械を用いて混捏する方法などが挙げられる。
　生地調製工程では、パン生地に用いる材料を全て同時に混捏することも可能であるが、パン生地に含有させる材料の種類に応じて、一部を混合した後に残りの材料を混ぜて混捏する方法や、何種類かの材料を別々の混合し、混合した材料同士をあわせて混捏する方法など、用いる材料や目的に合わせて、自由な方法で混捏することができる。
　生地調製工程では、発酵が過度に進まないことが好ましい。発酵が冷凍前に過度に進んでしまうと、酵母に冷凍障害が起こり、解凍後の発酵力が低下する場合がある。そこで、生地調製工程は、パン生地の調製を、パン生地材料の温度が２２℃以下となる条件下で行うことが好ましい。パン生地材料の温度を下げる具体的な方法としては、氷を用いたり、冷蔵保存された材料を用いたり、混捏に用いる調理器具を冷やす等、本技術の効果を損なわない限り、一般的な生地の冷却方法を１種または２種以上自由に選択して用いることができる。
　なお、本技術では、発酵種法を用いたパンの製造も包含する。発酵種法の一般的な製造方法としては、生地材料の一部と酵母および水をミキシングした後に、発酵を行って発酵種を作製し、作製した発酵種に残りの生地材料をミキシングした後に、本生地の発酵を行い、その後、分割・成形、最終発酵を行った後に焼成するという方法である。本技術における生地調製工程では、発酵種と、残りの生地材料と、糖質酸化酵素と、をミキシングして本生地を調製することも可能である。この際、最終発酵が過度に進まないことが好ましい。
　生地調製工程における糖質酸化酵素の添加量は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。添加量の下限は、パン生地の原料１ｇ当たり、例えば、０．０１ｍＵ以上、好ましくは０．１ｍＵ以上、より好ましくは０．５ｍＵ以上、更に好ましくは１ｍＵ以上とすることができる。また、添加量の上限は、パン生地の原料１ｇ当たり、例えば、１Ｕ以下、好ましくは１００ｍＵ以下、より好ましくは１０ｍＵ以下とすることができる。
　生地調製工程で用いるパン生地の材料は、本技術の効果を損なわない限り、一般的なパン生地に用いる材料を自由に組み合わせて用いることができる。例えば、薄力粉、中力粉、準強力粉、強力粉などの小麦粉、デュラム小麦由来の小麦粉、米粉、ライ麦粉、大麦粉、オーツ粉、そば粉、ヒエ粉、アワ粉、コーンフラワー、各種穀物から取った澱粉等の穀粉；ドライイースト、生イースト等の酵母；イーストフード等の酵母を活性化させるための添加物；食塩、マヨネーズ、ソース、しょうゆ、アミノ酸等の各種調味料；脱脂粉乳、ホエイパウダー、バターパウダーなどの乳などを主原料とする各種材料；油脂；卵（全卵、卵黄、卵白、粉末卵などを含む）；香料、乳化剤、製パン改良剤、増粘剤、安定剤、静菌剤、糖質酸化酵素以外の酵素等の各種添加剤等が挙げられる。
　（２）冷凍工程
　冷凍工程は、前記生地調製工程で調製された生地を冷凍する工程である。冷凍工程における冷凍方法は、本技術の効果を損なわない限り限定されず、一般的な冷凍方法を自由に選択して用いることができる。
　冷凍工程における冷凍条件も、本技術の効果を損なわない限り限定されない。例えば、冷凍するための温度条件は、好ましくは－２５℃以下であり、より好ましくは－３０℃以下であり、急速凍結とすることが好ましい。また、冷凍パン生地の冷凍保管条件も、本技術の効果を損なわない限り限定されない。生地の種類や大きさなどによって適宜調整することができるが、例えば、冷凍保管時の温度条件は、好ましくは－８～－２２℃であり、より好ましくは－１２～－２０℃である。
　（３）解凍工程
　解凍工程は、糖質酸化酵素を含有する冷凍パン生地を解凍する工程である。解凍工程における解凍方法は、本技術の効果を損なわない限り限定されず、一般的な解凍方法を自由に選択して用いることができる。例えば、室温解凍（１～３０℃）、常温解凍（１５～２５℃）、冷蔵解凍（１～１０℃）、マイクロ波解凍等が挙げられる。
　（４）発酵工程
　発酵工程は、前記解凍工程にて解凍したパン生地を発酵させる工程である。発酵工程における発酵方法は、本技術の効果を損なわない限り限定されず、一般的な発酵方法を自由に選択して用いることができる。なお、ここでいう発酵工程は、本生地の発酵（一次発酵（フロアタイム）、ベンチタイム、二次発酵（最終発酵、ホイロ））に該当する工程である。即ち、液種法などの発酵種を作製する際の発酵ではない。
　発酵工程における発酵温度は、本技術の効果を損なわない限り、用いる酵母の種類や生地の状態に応じて、自由に設定することができる。例えば、発酵工程における発酵温度は、２３～４０℃に設定することが好ましく、２６～３５℃に設定することがより好ましい。
　発酵工程における発酵時間も、本技術の効果を損なわない限り、用いる酵母の種類や量、生地の状態に応じて、自由に設定することができる。例えば、発酵工程における発酵時間は、３０分～２４時間に設定することが好ましく、１～１６時間に設定することがより好ましい。
　発酵工程は、複数回に分けて行うことができる。例えば、一次発酵（フロアタイム）→後述する分割工程→ベンチタイム→後述する成形工程→二次発酵（最終発酵、ホイロ）の順に各工程を行う方法が挙げられる。
　発酵工程では、発酵条件と同様の条件下において、糖質酸化酵素による酵素反応も進行させることもできるが、発酵工程とは別に、酵素処理工程を設けることも可能である。その場合の酵素処理の条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いる糖質酸化酵素の至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。ｐＨは例えば、ｐＨ５．０～１０．５、好ましくはｐＨ５．０～７．５に設定することができる。温度は例えば、２０℃～５５℃、好ましくは３０℃～５０℃、より好ましくは３５℃～４５℃に設定することができる。作用時間は例えば、１～１２時間、好ましくは４～１０時間に設定することができる。なお、発酵工程と酵素処理工程とは、同時に進行させることが好ましい。
　（５）分割工程
　分割工程は、調製されたパン生地を分割する工程である。本技術において、分割工程は必須ではなく、製造するパンの形態等に応じて、適宜行うことができる。
　なお、分割工程は、生地調製工程の後であれば、いつでも行うことが可能である。例えば、生地調製工程後、生地が落ち着くまで適宜休ませた後に、所望の大きさに生地を分割し、分割した状態の生地を冷凍することも可能である。また、冷凍された生地を解凍した後に、所望の大きさに生地を分割し、適宜成形、発酵を行った後に、後述する加熱工程を行うこともできる。
　（６）成形工程
　成形工程は、調製されたパン生地を成形する工程である。本技術において、成形工程は必須ではなく、製造するパンの形態等に応じて、適宜行うことができる。
　なお、成形工程は、生地調製工程の後であれば、いつでも行うことが可能である。例えば、生地調製工程後、生地が落ち着くまで適宜休ませた後に、所望の形態に生地を成形し、成形した状態の生地を冷凍することも可能である。また、冷凍された生地を解凍した後に、所望の形態に生地を成形し、適宜発酵を行った後に、後述する加熱工程を行うこともできる。
　（７）加熱工程
　加熱工程は、発酵後のパン生地を加熱する工程である。加熱工程における加熱方法は、本技術の効果を損なわない限り限定されず、一般的な加熱方法を自由に選択して用いることができる。例えば、焼成、油ちょう、蒸し、マイクロ波加熱等が挙げられる。
　加熱工程における加熱温度は、本技術の効果を損なわない限り、製造するパンの種類や形態、加熱方法等に応じて、自由に設定することができる。例えば、加熱工程における加熱温度は、１４０～２８０℃に設定することが好ましく、１６０～２４０℃に設定することがより好ましい。
　加熱工程における加熱時間も、本技術の効果を損なわない限り、製造するパンの種類や形態、加熱方法等に応じて、自由に設定することができる。例えば、加熱工程における加熱時間は、１０分～２時間に設定することが好ましく、１５分～１時間に設定することがより好ましい。
　以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
　なお、本技術では、糖質酸化酵素の活性測定法として、以下の測定方法を用いた。
　［グルコースオキシダーゼ活性測定法］
　適当量の酵素を量り、冷却したｐＨ７．０のリン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加えて溶解又は均一に分散して５０ｍＬとしたものを試料液とした。Ｄ（＋）－グルコース２．５０ｇを量り、水を加えて溶かし、２５ｍＬとしたものを基質溶液とした。基質溶液０．５ｍＬ、リン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０、フェノール含有）２ｍＬ、パーオキシダーゼ試液（２５単位／ｍＬ）０．５ｍＬ及び４－アミノアンチピリン溶液（１→２５０）０．１ｍＬを石英セルに入れ、３７℃で１０分間加温した。この液に試料液０．１ｍＬを加えてよく混ぜて３７℃で加温し、検液とした。別に試料液の代わりにｐＨ７．０のリン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）又は水を用いて検液の調製と同様に操作し、比較液とした。検液及び比較液につき、試料液添加２分後及び５分後の波長５００ｎｍにおける吸光度を測定した。生成したキノンイミン色素のモル吸光係数から酸化されたグルコース量を定量した。条件下、１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化するのに必要な酵素量を１単位とした。
　本実施例では、糖質酸化酵素の一例として、ＷＯ２０１４/０４２２３７に記載の方法で精製された酵素を用いた。
　＜実験例１＞
　実験例１では、冷凍工程を経ないパンの製造方法において、酵素なし、グルコースオキシダーゼを用いた場合、および糖質酸化酵素を用いた場合に、製造されたパンのボリューム、外観（表面の切れ目の広がり）、および食感（サクサク感）への影響を調べた。
　（１）パンの製造
　ミキサーに、下記の表１に示すイースト以外の材料を入れ、氷が溶けるまで低速で約５分間混合した。高速で約２分間混合した後、イーストを加え、生地がまとまるまで、高速で混合し続けパン生地を調製した。調製したパン生地を２．１ｋｇ量り取り、ボール状にして５分間休ませた。休ませたパン生地を７０ｇに分割して丸め、長さ８～１０ｃｍの円筒形になるように成形した後、型に入れて、長さが６ｃｍ程度になるように、縦に並べた。２８℃で１５時間、発酵を行った後、縦に１本ずつ切り込みを入れ、１７０℃のオーブンで１７～２０分間、８～１０秒スチームを加えながら焼成し、パンを製造した。
　（２）評価
　製造したパンのボリューム（比容積（ｍＬ／ｇ））を測定した。また、外観（表面の切れ目の広がり）、および食感（サクサク感）について、下記の評価基準に従って評価を行った。
　＜外観（表面の切れ目の広がり）＞
　＋：クープに広がりがなく、不良
　＋＋：クープに広がりがあり、概ね良好な外観を有する
　＋＋＋：クープに良好な広がりがあり、優れた外観を有する
　＜食感（サクサク感）＞
　＋：サクサク感がなく、不良
　＋＋：サクサク感があり、概ね良好な食感を有する
　＋＋＋：良好なサクサク感があり、優れた食感を有する
　（３）結果
　結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（４）考察
　表１に示す通り、冷凍工程を経ないパンの製造方法においては、酵素添加の有無や、酵素の種類に関わらず、各評価は同等であった。
　＜実験例２＞
　実験例２では、パン生地を冷凍する工程を経てパンを製造する場合において、酵素なし、グルコースオキシダーゼを用いた場合、および糖質酸化酵素を用いた場合に、製造されたパンのボリューム、外観（表面の切れ目の広がり）、および食感（サクサク感）への影響を調べた。
　（１）パン生地の製造
　ミキサーに、下記の表２に示すイースト以外の材料を入れ、氷が溶けるまで低速で約５分間混合した。高速で約２分間混合した後、イーストを加え、生地がまとまるまで、高速で混合し続けパン生地を調製した。なお、この際、パン生地の温度が２２℃を超えないように、適宜、水を氷の状態で使用したり、冷蔵状態の材料を用いたり、ジャケット付きのミキサーを使用したりして、温度調節を行った。
　調製したパン生地を２．１ｋｇ量り取り、ボール状にして５分間休ませた。休ませたパン生地を７０ｇに分割して丸め、長さ８～１０ｃｍの円筒形になるように成形した後、型に入れて、長さが６ｃｍ程度になるように、縦に並べた。この状態で、－３５℃にて約３０分間、パン生地の中心温度が－１０℃になるまで冷凍した後、ビニール袋に入れて密封し、－１８℃の保存用冷凍庫にて１～６週間保存した。
　（２）パンの製造
　前記で製造した冷凍パン生地を、ビニール袋から取り出し、平らな穴あきトレイに、お互いが触れ合わないように、約１０ｃｍ間隔で並べた。この状態で、室温にて約１時間かけて解凍し、２８℃で１４時間、発酵を行った。発酵後、縦に１本ずつ切り込みを入れ、１７０℃のオーブンで１７～２０分間、８～１０秒スチームを加えながら焼成し、パンを製造した。
　（３）評価
　製造したパンのボリューム（比容積（ｍＬ／ｇ））を測定した。また、外観（表面の切れ目の広がり）、および食感（サクサク感）について、前記実験例１と同様の評価基準に従って評価を行った。
　（４）結果
　結果を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（５）考察
　表２に示す通り、パン生地を冷凍する工程を経てパンを製造する場合、グルコースオキシダーゼを用いた比較例２のパンは、ボリュームが減少してしまうところ、糖質酸化酵素を用いた実施例４～６のパンは、冷凍期間１週間では、コントロールと同等かそれ以上のボリュームを有していた。また、冷凍期間６週間では、コントロールに比べてボリュームは減少してしまうが、比較例２に比べて、実施例４～６は、ボリュームの減少を抑制していた。
　外観（切り口の広がり）については、グルコースオキシダーゼを用いた比較例２のパンはコントロールの結果と同等であるところ糖質酸化酵素を用いた実施例４～６のパンは、明らかにその評価が良好であった。
　食感（サクサク感）については、冷凍期間が長くなるにつれて、酵素を用いなかったコントロールおよびグルコースオキシダーゼを用いた比較例２のパンは、評価が低下してしまった。一方、冷凍期間５週間および６週間の結果が示す通り、糖質酸化酵素を用いた実施例４～６のパンは、冷凍期間が長くなっても、良好な食感（サクサク感）を有していた。
　本技術は、以下のような構成をとることもできる。
［１］
　糖質酸化酵素を含む、冷凍パン生地用改質剤。
［２］
　体積増大作用を有する［１］に記載の冷凍パン生地用改質剤。
［３］
　食感向上作用を有する［１］又は［２］に記載の冷凍パン生地用改質剤。
［４］
　外観向上作用を有する［１］から［３］のいずれかに記載の冷凍パン生地用改質剤。
［５］
　前記糖質酸化酵素が、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に作用する性質を有する、［１］から［４］のいずれかに記載の冷凍パン生地用改質剤。
［６］
　前記糖質酸化酵素が、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、［１］から［５］のいずれかに記載の冷凍パン生地用改質剤。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド。
［７］
　パン生地材料に糖質酸化酵素を添加して、パン生地を調製する生地調製工程と、
　調製された生地を冷凍する冷凍工程と、
　を行う冷凍パン生地の製造方法。
［８］
　糖質酸化酵素を含有する冷凍パン生地を解凍する解凍工程と、
　解凍後のパン生地を発酵させる発酵工程と、
　発酵後のパン生地を加熱する加熱工程と、
　を行うパンの製造方法。
［９］
　前記糖質酸化酵素が、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に作用する性質を有する、［７］に記載の冷凍パン生地の製造方法。
［１０］
　前記糖質酸化酵素が、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、［７］又は［９］に記載の冷凍パン生地の製造方法。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％２以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド。
［１１］
　前記糖質酸化酵素が、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に作用する性質を有する、［８］に記載のパンの製造方法。
［１２］
　前記糖質酸化酵素が、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、［８］又は［１１］に記載のパンの製造方法。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド。

Claims (8)

  1. 　糖質酸化酵素を含む、冷凍パン生地用改質剤。
  2. 　体積増大作用を有する請求項１に記載の冷凍パン生地用改質剤。
  3. 　食感向上作用を有する請求項１に記載の冷凍パン生地用改質剤。
  4. 　外観向上作用を有する請求項１に記載の冷凍パン生地用改質剤。
  5. 　前記糖質酸化酵素が、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に作用する性質を有する、請求項１に記載の冷凍パン生地用改質剤。
  6. 　前記糖質酸化酵素が、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１に記載の冷凍パン生地用改質剤。
    （１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド、及び
    （３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド。
  7. 　パン生地材料に糖質酸化酵素を添加して、パン生地を調製する生地調製工程と、
    　調製された生地を冷凍する冷凍工程と、
    　を行う冷凍パン生地の製造方法。
  8. 　糖質酸化酵素を含有する冷凍パン生地を解凍する解凍工程と、
    　解凍後のパン生地を発酵させる発酵工程と、
    　発酵後のパン生地を加熱する加熱工程と、
    　を行うパンの製造方法。
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WO2014042237A1 (ja) * 2012-09-14 2014-03-20 天野エンザイム株式会社 糖質酸化酵素とその製造方法並びに用途
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