JPWO2013122188A1 - 血管内皮機能低下の予防または改善剤 - Google Patents

Abstract

より高いＮＯ産生増強作用を有する血管内皮機能の低下および、血管内皮機能の低下から進展して生じる動脈硬化に関連する症状（心筋梗塞、狭心症、末梢動脈閉塞などの虚血性疾患など）または血流低下に関連する症状（肩凝り、冷え症、むくみ、勃起不全、肌荒れ、骨格筋活動低下による運動パフォーマンス低下など）の予防または改善剤を提供する。シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有するＮＯ産生増強剤。シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有する血管内皮機能低下の予防または改善剤。シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有する血管内皮機能低下から生じる症状の予防または改善剤。

Description

本発明は、シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有し、より高い一酸化窒素（ＮＯ）産生増強作用を有する血管内皮機能低下の予防または改善剤に関する。

シトルリンは、生体内でタンパク質の合成原料としては使われず、遊離の状態で存在するアミノ酸の一種である。体内ではアルギニン前駆体としてアルギニン生合成や、ＮＯの供給に関わるＮＯサイクルの構成因子として重要な役割を果たしている。

血管内皮細胞から産生されるＮＯは、血管弛緩作用、酸化ＬＤＬ抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗平滑筋細胞増殖作用、抗酸化作用など、正常な血管機能を維持するための多様な生理活性を発揮する。動脈硬化は血管内膜における炎症反応の亢進や、コレステロールの蓄積により、血管壁の弾力性が低下した状態である。それにより円滑な血流の維持が困難になり、血栓が形成され易くなる。この要因の１つとして、血管内皮細胞から産生されるＮＯの低下が多くの研究により指摘されている。すなわち、血管内皮細胞からのＮＯ産生を増強することにより、動脈硬化をはじめとした血管内皮機能の低下に起因する虚血性血管疾患を予防または改善し、血流を促進することが期待できる。

シトルリンの摂取により、血管拡張因子であるＮＯ産生を介した抗動脈硬化作用および血流改善効果が報告されており（非特許文献１）、シトルリンは、ＮＯを産生させ血流を改善する食品素材として米国を中心に用いられている。また、シトルリンは欧州では、抗疲労用の医薬品として、シトルリン-リンゴ酸塩の形態で用いられている。

グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンから成るトリペプチドであり、生体内における活性酸素種の除去機構において中心的役割を果たしている。さらに生体内異物を体外に除去する解毒機構にも関与する。

グルタチオンの摂取により肝保護作用（非特許文献２）、美白作用（非特許文献３）などが報告されている。このような機能性から、グルタチオンは中毒時の解毒剤や肝機能改善用途の医薬品、または抗酸化用途の食品素材として使われている。

しかしながら、グルタチオンによるＮＯ産生促進作用は知られておらず、シトルリンまたはその塩にグルタチオンおよびその塩を組み合わせることにより、相乗的なＮＯ産生増強効果が得られることは知られていない。

「ピー エヌ エー エス（PNAS）」２００５年、第１０２巻、ｐ.１３６８１−１３６８６ 「ジャーナル オブ ニュートリッショナル サイエンス アンド バイタミノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ）」１９９８年、第４４巻、ｐ．６１３−６２４ 「ジャーナル オブ ダーマトロジカル トリートメント（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」２０１０年、Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ

本発明の目的は、より高いＮＯ産生増強作用を有する血管内皮機能の低下および、血管内皮機能の低下から進展して生じる動脈硬化に関連する症状（心筋梗塞、狭心症、末梢動脈閉塞などの虚血性疾患など）または血流低下に関連する症状（肩凝り、冷え症、むくみ、勃起不全、肌荒れ、骨格筋活動低下による運動パフォーマンス低下など）の予防または改善剤を提供することにある。

本発明は、下記の（１）〜（７）に関する
（１）シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有するＮＯ産生増強剤。
（２）シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有する血管内皮機能低下の予防または改善剤。
（３）シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有する血管内皮機能低下から生じる症状の予防または改善剤。
（４）血管内皮機能低下から生じる症状が、動脈硬化に関連する症状、血流低下に関連する症状より選ばれる少なくとも一つの症状である、（３）に記載の予防または改善剤。
（５）動脈硬化に関連する症状が虚血性疾患である、（４）に記載の予防または改善剤。
（６）虚血性疾患が、心筋梗塞、狭心症、末梢動脈閉塞より選ばれる少なくとも一つの症状である、（５）に記載の予防または改善剤。
（７）血流低下に関連する症状が、肩凝り、冷え症、むくみ、勃起不全、肌荒れ、骨格筋活動低下による運動パフォーマンス低下より選ばれる少なくとも一つの症状である、（４）に記載の予防または改善剤。

本発明により、シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有する、安全で効果的な、より高いＮＯ産生増強作用を有する血管内皮機能低下の予防または改善剤を提供することができる。

図１は、ＨＵＶＥＣに各濃度のサンプルを添加した後の培地中の安定ＮＯ代謝産物である亜硝酸イオンＮｉｔｒｉｔｅ（ＮＯ_２）濃度を示したものである。平均＋−ＳＥＭ、Ｎ＝４、＊はＰ＜０．０５の有意差を示す。

本発明で用いられるシトルリンとしては、Ｌ−シトルリンおよびＤ−シトルリンがあげられるが、Ｌ−シトルリンが好ましい。シトルリンは、化学的に合成する方法、発酵生産する方法等により取得することができる。また、シトルリンは、市販品を購入することにより取得することもできる。シトルリンを化学的に合成する方法としては、例えば、J. Biol. Chem., 122, 477(1938)、J.Org.Chem., 6, 410(1941)に記載の方法があげられる。Ｌ-シトルリンを発酵生産する方法としては、例えば、特開昭５３−０７５３８７号公報、特開昭６３−０６８０９１号公報に記載の方法があげられる。また、Ｌ-シトルリンおよびＤ-シトルリンは、シグマ−アルドリッチ社等より購入することもできる。

シトルリンの塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等があげられる。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α−ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩があげられる。

金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。
アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。

有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩があげられる。

アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩があげられる。上記のシトルリンの塩のうち、リンゴ酸塩が好ましく用いられるが、他の塩、または２以上の塩を適宜組み合わせて用いてもよい。

本発明において用いられるグルタチオンとしては、還元型グルタチオンまたは酸化型グルタチオンがあげられる。

還元型グルタチオンとはγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙの構造を有するトリペプチドを表し、酸化型グルタチオンとは還元型グルタチオン２分子がＳＳ結合により結合した分子を表す。

本発明で用いられる還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンは、どのような製造法によって得られたものであってもよい。還元型グルタチオンの製造法としては、酵母等の微生物からの抽出法［Methods in Enzymology, 3, 603 (1957）］、化学合成法［Bull.Chem. Soc. Jpn., 53, 2529 (1980）］、酵素法（特開昭61-74595）等の方法が、酸化型グルタチオンの製造法としては、Acta Biochim. Pol., 17, 175 (1970)に記載の方法があげられる。また、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンは、シグマ−アルドリッチ社等より購入することもできる。

本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤は、還元型グルタチオンまたは酸化型グルタチオンのいずれかを単独で含有してもよいし、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンを同時に含有してもよい。

また、本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤に含まれる還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンは、それらの塩として該剤中に存在してもよい。還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの塩としては、上記のシトルリンの塩と同様のものがあげられる。

また、本発明では、生体内で還元型グルタチオンに代謝される物質、例えば、N-アセチルシステイン等をグルタチオンの代りに使用することもできる。

本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤中の、シトルリンまたはその塩とグルタチオンまたはその塩との組成比は、重量比で１：１００〜１００：１、好ましくは１：５０〜５０：１、とりわけ好ましくは１０：１〜１：１０である。

本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤としては、シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩をそのまま投与することも可能であるが、通常各種の製剤として提供するのが望ましい。

製剤は、有効成分としてシトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を含有するが、更に任意の有効成分を含有していてもよい。また、それら製剤は、有効成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。

製剤の投与形態は、血管内皮機能低下の予防または改善に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または、例えば静脈内、腹膜内もしくは皮下投与等の非経口投与をあげることができるが、経口投与が好ましい。

投与する剤形としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよいが、経口剤として好適に用いられる。

経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類などを添加して製剤化することができる。

また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して製剤化することができる。

また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。

非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張であるシトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。

また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した防腐剤、保存剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することができる。

本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤中のシトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩の濃度は、製剤の種類、該製剤の投与により期待する効果等に応じて適宜選択されるが、シトルリンまたはその塩として、通常は０．１〜１００重量％、好ましくは０．５〜８０重量％、特に好ましくは１〜７０重量％である。

本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤中の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、成人一日当り、シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩として、通常は５０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ、特に好ましくは２００ｍｇ〜３ｇとなるように、一日一回ないし数回投与する。

投与期間は、特に限定されないが、通常は１日間〜１年間、好ましくは１週間〜３ヶ月間である。

本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤は、ＮＯ産生を介して血管内皮機能低下を予防または改善するために使用することがきる。本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤は、血管内皮機能の低下から進展して生じる動脈硬化に関連する症状の予防または改善、または血流低下に関連する症状の予防または改善に使用することができる。血管内皮機能の低下から進展する動脈硬化に関連する症状の予防または改善から期待される効果として、例えば心筋梗塞、狭心症、末梢動脈閉塞などの虚血性疾患の予防または改善があげられ、または血流低下に関連する症状の予防または改善から期待される効果として、例えば肩凝り、冷え症、むくみ、勃起不全、肌荒れ、骨格筋活動低下による運動パフォーマンス低下の予防または改善をあげることができる。

よって、それらの症状を呈する者に本発明の血管内皮機能低下の予防または改善剤を投与することにより、該症状を改善することができる。

さらに本発明においては、血管内皮機能低下の予防または改善剤を製造するために、シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を使用され得る。

さらにまた本発明は、ＮＯを上昇させるための方法を包含する。本発明の方法は、ＮＯを上昇させる必要のある被験体に、該被験体のＮＯを上昇させるのに十分な量のシトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を投与する工程を含む。

以下に、シトルリン、およびグルタチオンのＮＯ産生に及ぼす影響に関する試験例を示す。

試験例 正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ社（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）由来株を用い、培地は２％ＦＢＳを含むＥＧＭ−２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いた。細胞の培養は３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で行い、４〜６世代経代し細胞を実験に供した。シトルリンおよび還元型グルタチオンは協和発酵バイオ株式会社製を用いた。

初発細胞濃度を５×１０^５ｃｅｌｌｓ/ｍＬに調整した細胞浮遊液を２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に０．４５ｍＬ播種した。４０時間培養後、シトルリン（終濃度０．３ｍＭ：シトルリン群）、還元型グルタチオン（終濃度１ｍＭ：高用量グルタチオン群）、シトルリンと還元型グルタチオンとの混合物（シトルリン終濃度０．３ｍＭ、およびグルタチオン終濃度０．３ｍＭ：シトルリン＋低用量グルタチオン群）を含む培地に置換した。尚、対照群には溶媒（ＰＢＳ）のみを添加した培地を用いた。２４時間培養後、培養液１００μＬを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、培養液上清中の安定ＮＯ代謝産物であるＮｉｔｒｉｔｅ（ＮＯ_２）濃度をＨＰＬＣ法（ＥＮＯ−２０，ＥＩＣＯＭ）により定量した。

また、ＭＴＴアッセイ法により、本試験ではいずれの添加群においても細胞のｖｉａｂｉｌｉｔｙに影響が無いことを確認した。

シトルリンのＮＯ産生作用は既知であるが、図１に示すように本試験で用いた添加濃度においては、シトルリン群および高用量グルタチオン群は、各単独でＮＯ産生に影響を及ぼさない範囲であった。しかしながら、シトルリンおよび単独群よりも低い濃度のグルタチオンを併用添加した、シトルリン＋低用量グルタチオン群においては、ＮＯレベルが対照群に比較して約３１％高値を示し、有意なＮＯ産生活性の促進効果が認められた。このことから、シトルリンとグルタチオンを併用することにより、血管内皮細胞の生存率や増殖能には影響を与えることなく、相乗的にＮＯ産生活性が促進することが明らかとなり、本発明である優れた血管内皮機能低下の予防または改善剤となることが示された。

以下に、本発明の実施例を示す。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する錠剤の製造
L-シトルリン120kg、還元型グルタチオン120kg、環状オリゴ糖19kg、セルロース57kgおよびプルラン1kgを流動層造粒乾燥機で造粒した。得られた造粒物とステアリン酸カルシウム3kgとをコニカルブレンダーで混合した後、ロータリー圧縮成形機で圧縮成形して錠剤を製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する腸溶錠剤の製造
実施例１で製造する錠剤の表面をシェラック溶液でコーティングして腸溶錠剤を製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する腸溶カプセルの製造
L-シトルリン120kg、還元型グルタチオン120kg、環状オリゴ糖19kg、セルロース57kg、ステアリン酸カルシウム3kgおよびプルラン1kgを、コニカルブレンダーで混合する。得られる混合物20ｋｇと0.2ｋｇの二酸化ケイ素とを混合攪拌して得られた混合物をカプセル充填機に投入、ハードカプセルに充填してハードカプセルを得る。得られるハードカプセルの表面をツェイン溶液でコーティングして腸溶カプセルを製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する飲料の製造（１）
L-シトルリン1.28ｋｇ、酸化型グルタチオン1.28ｋｇ、エリスリトール3ｋｇ、クエン酸0.05ｋｇ、人工甘味料3ｇ、香料0.06ｋｇを液温70℃で水50Ｌに攪拌溶解し、クエン酸でｐＨを3.3に調整後、プレート殺菌を用いて滅菌して瓶に充填後、パストライザー殺菌し、飲料を製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する飲料の製造（２）
シトルリン20ｍｇ、酸化型グルタチオン20ｍｇ、アルギニン20ｍｇと適当量の果糖ぶどう糖液糖、食塩、クエン酸、香料、クエン酸Na、乳酸Ca、ピロリン酸鉄、グルコン酸Ca、塩化Ｋ、塩化Mg、甘味料とを配合し555ｍｌの飲料を製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する飲料の製造（３）
シトルリン100ｍｇ、酸化型グルタチオン100ｍｇ、アルギニン100ｍｇ、アラニン2.5mg、グリシン2.5mg、ロイシン 2.5mg、イソロイシン 1.3mg、バリン 1.3mgと適当量の香料、甘味料を配合し300ｍｌの飲料を製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する化粧水の作製
エタノール10.0重量%、Ｌ-シトルリン2.0重量%、還元型グルタチオン2.0重量%、1,3-ブチレングリコール5.0重量%、精製水83.0重量%を配合し化粧水を製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有するクリームの作製
ポリエチレングリコール（PGE55）、モノステアレート2.00重量%、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン5.00重量%、セチルアルコール4.00重量%、スクワラン 6.00重量%、2-エチルヘキサン酸トリグリセリル6.00重量%、1,3-ブチレングリコール7.00重量%、Ｌ-ヒスチジン3.00重量%、Ｌ-シトルリン1.00重量%、還元型グルタチオン1.00重量%、精製水66.00重量%を配合しクリームを製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有するローションの作製
Ｌ-シトルリン3.00重量%、酸化型グルタチオン3.00重量%、Ｌ-セリン1.00重量%、水溶性コラーゲン（1％水溶液）1.00重量%、クエン酸ナトリウム0.10重量%、クエン酸0.05重量%、甘草エキス0.20重量%、1,3-ブチレングリコール3.00重量%、精製水91.65重量%を配合しローションを製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有するパックの作製
ポリビニールアルコール13.00重量%、Ｌ-アスパラギン酸1.00重量%、Ｌ-シトルリン5.00重量%、還元型グルタチオン5.00重量%、ラウロイルヒドロキシプロリン1.00重量%、水溶性コラーゲン （１％水溶液）2.00重量%、1,3-ブチレングリコール3.00重量%、エタノール5.00重量%、精製水70.00重量%を配合しパックを製造する。

シトルリンおよびグルタチオンを含有する美溶液の作製
ヒドロキシエチルセルロース（2％水溶液）12.0重量%、キサンタンガム（2％水溶液） 2.0重量%、Ｌ-シトルリン2.0重量%、還元型グルタチオン2.0重量%、1,3-ブチレングリコール6.0重量%、濃グリセリン4.0重量%、ヒアルロン酸ナトリウム（1％水溶液）5.0重量%、精製水69.0重量%を配合し美溶液を製造する。

Claims (7)

1. シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有するＮＯ産生増強剤。
2. シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有する血管内皮機能低下の予防または改善剤。
3. シトルリンまたはその塩、およびグルタチオンまたはその塩を有効成分として含有する血管内皮機能低下から生じる症状の予防または改善剤。
4. 血管内皮機能低下から生じる症状が、動脈硬化に関連する症状、血流低下に関連する症状より選ばれる少なくとも一つの症状である、請求項３に記載の予防または改善剤。
5. 動脈硬化に関連する症状が虚血性疾患である、請求項４に記載の予防または改善剤。
6. 虚血性疾患が、心筋梗塞、狭心症、末梢動脈閉塞より選ばれる少なくとも一つの症状である、請求項５に記載の予防または改善剤。
7. 血流低下に関連する症状が、肩凝り、冷え症、むくみ、勃起不全、肌荒れ、骨格筋活動低下による運動パフォーマンス低下より選ばれる少なくとも一つの症状である、請求項４に記載の予防または改善剤。

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