JPWO2013038767A1 - 膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法 - Google Patents

Abstract

この膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法は、膵液成分を含有する生体試料に、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、当該生体試料中のプロテアーゼの酵素活性を阻害する。また、この膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤は、フッ化スルホニル基を有する化合物であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、かつ膵液成分を含有する生体試料に、当該生体試料中のプロテアーゼを阻害するために添加される。さらに、この膵液成分を含有する生体試料の保存用キットは、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含み、膵液成分を含有する生体試料を保存するために用いられる。

Description

本発明は、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの酵素活性を阻害するための方法、膵液又は十二指腸液中の膵液由来成分の分解抑制に有効なプロテアーゼ阻害剤、及び当該プロテアーゼ阻害剤を含む膵液等の生体試料保存用キットに関する。
本願は、２０１１年９月１３日に日本国に出願された特願２０１１−１９９３５７号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。

体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。膵液も膵臓の状態を知るための重要な生体試料であり、細胞診、重炭酸塩測定、細菌検査、タンパク質や核酸等からなるマーカーの検査等に用いられている。研究においても、膵臓癌等の膵臓関連疾患についての新たなマーカーの探索が広く行われている。

膵液は消化液であるため、様々な消化酵素を含む。これらの消化酵素は、膵臓内においては不活性の状態で存在しているが、十二指腸に排出された後に活性化することが知られている。膵液中の消化酵素は、十二指腸上皮細胞から分泌される小腸エンテロキナーゼによって分解のカスケード反応が進む。小腸エンテロキナーゼによって膵液中に含まれるトリプシノーゲンが活性化されてトリプシンになり、さらにこのトリプシンが引き金となってキモトリプシノーゲン、プロエステラーゼなど種々の消化酵素（プロテアーゼ）が活性化されることが知られている。なお、トリプシノーゲンは膵液総タンパク量のほぼ１２％前後を占めると言われている（例えば、非特許文献２参照。）。これら種々のプロテアーゼの活性化により、膵液中に含まれるタンパク質、核酸、脂質、細胞等の生体分子は、十二指腸に排出後に分解、変性される。このため、十二指腸へ排出された膵液を、細胞診や生体分子の測定等の検査や研究に役立てる場合、膵液中の目的とする細胞やタンパク質などがプロテアーゼの影響を受ける結果、正確に測定できないことが懸念される。このため、十二指腸に排出された膵液中におけるプロテアーゼの活性をいかに阻害するかが重要となる。

膵液や十二指腸液中の各種分解酵素の活性を低減させるための従来法の１つとして、採取した膵液を冷やした状態で保存し、酵素活性の至適温度を外すことによって活性を抑える方法がある。一般的には、採取した膵液等を直ちに氷中に置く必要があり、かつ当該膵液等の検査も迅速に行う必要がある（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、当該方法では、膵液等の温度が上昇すると、再度酵素反応が進行する可能性がある。そのため、採取された膵液を常に低温に保つ必要があり、取り扱いが煩雑である。また、タンパク質の種類によっては、低温であっても分解が進むことがあるため、単に低温で保存するだけでは、膵液由来の成分の分解・変性等を抑制するためには不十分である。

膵液中のタンパク質を測定するために、内視鏡で採取した膵液０．５ｍＬにアプロチニン０．２ｍＬを添加して凍結保存する方法が開示されている（例えば、非特許文献２参照。）。凍結保存により、保存期間中には、膵液中のほぼ全てのプロテアーゼの活性を抑制することができ、当該膵液中の細胞やタンパク質等を安定して保存することができる。しかしながら、凍結保存した膵液は、測定前に融解する必要があり、融解後に再び細胞やタンパク質等の分解が進行する場合もある。さらに、凍結保存中に解析対象の分子自身が損なわれるおそれもある。

その他、生体試料、特に血液を保存する方法として、少なくとも２種類以上のプロテアーゼ阻害剤を含む容器に血液を直接採取する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。採取された血液を直ちにプロテアーゼ阻害剤と接触させることにより、血液中のタンパク質の分解等を防止し得る。当該方法では、セリンプロテアーゼ阻害剤とその他のプロテアーゼ阻害剤とを使用しており、例えばＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン等のセリンプロテアーゼ阻害剤と、Ｅ−６４等のシステインプロテアーゼ等とを含む容器に、血液を採取している。

特許第４４９６４０７号公報

勝沼、他１名、「ぶんせき」、１９７８年、第１０巻、第６８２〜６８９ページ。 ヨコヤマ、他８名、パンクリース（Pancreas）、２００２年、第２４巻、第４号、第３４４〜３４７ページ。

採取した膵液や十二指腸液等を、安定的かつ容易に取り扱うためには、特許文献１に記載の方法と同様に、採取された体液にプロテアーゼ阻害剤を添加する方法が有用であると考えられる。
しかし、血液中と膵液中では、含まれているプロテアーゼの種類は大きく異なる。このため、特許文献１に記載されている血液中のプロテアーゼの活性低下に有効なプロテアーゼ阻害剤を、膵液、十二指腸液等の膵液成分を含む体液に添加したとしても、当該体液中のプロテアーゼの活性を抑制し得るわけではない。

本発明は、膵液や十二指腸液等の膵液成分を含む生体試料中のプロテアーゼの活性を効果的に抑制し得るプロテアーゼ阻害剤、当該阻害剤を使用した膵液成分を含む生体試料中のプロテアーゼの阻害方法、及び当該プロテアーゼ阻害剤を含む膵液等の生体試料保存用キットを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、膵液中に含まれているプロテアーゼに対して最も活性阻害効果が高いことを見出し、本発明を完成させた。

（１） 本発明の第一の態様は、膵液成分を含有する生体試料に、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、当該生体試料中のプロテアーゼの酵素活性を阻害する、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法である。
（２） 前記（１）の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、ｐ−ＡＰＭＳＦ、４−(フルオロスルホニル)安息香酸、３−(フルオロスルホニル)安息香酸、２−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、３−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、４−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、２−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、３−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、及び４−ニトロベンゼンスルホニルフルオリドからなる群より選択される１種以上の化合物であることが好ましい。
（３） 前記（１）の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される１種以上の化合物であることが好ましい。
（４） 前記（１）の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される２種以上であることが好ましい。
（５） 前記（１）〜（４）のいずれかの膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、最終濃度が１ｍＭ以上のＰＭＳＦ、４ｍＭ以上のＡＥＢＳＦ、又は２ｍＭ以上のｐ−ＡＰＭＳＦとなるように、前記生体試料にＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、又はｐ−ＡＰＭＳＦを添加することが好ましい。
（６） 前記（１）〜（５）のいずれかの膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記生体試料に、さらに、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を添加することが好ましい。
（７） 前記（６）の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、アミノ酸クロロメチルケトン類であることが好ましい。
（８） 前記（６）の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫ及びＴＰＣＫからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
（９） 前記（６）の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫであることが好ましい。
（１０） 前記（１）〜（９）のいずれかの膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法において、前記生体試料は、膵液又は十二指腸液であることが好ましい。
（１１） 本発明の第二の態様は、フッ化スルホニル基を有する化合物であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、かつ膵液成分を含有する生体試料に、当該生体試料中のプロテアーゼを阻害するために添加される、膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤である。
（１２） 前記（１１）の膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、ｐ−ＡＰＭＳＦ、４−(フルオロスルホニル)安息香酸、３−(フルオロスルホニル)安息香酸、２−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、３−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、４−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、２−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、３−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、及び４−ニトロベンゼンスルホニルフルオリドからなる群より選択される化合物であることが好ましい。
（１３） 前記（１１）の膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される化合物であることが好ましい。
（１４） 本発明の第三の態様は、前記（１１）〜（１３）のいずれかの生体試料用プロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種以上含む、プロテアーゼ阻害剤混合物である。
（１５） 前記（１４）のプロテアーゼ阻害剤混合物は、さらに、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含むことが好ましい。
（１６） 本発明の第四の態様は、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含み、膵液成分を含有する生体試料を保存するために用いられる、膵液成分を含有する生体試料の保存用キットである。
（１７） 前記（１６）の膵液成分を含有する生体試料の保存用キットは、さらに、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含むことが好ましい。
（１８） 前記（１６）又は（１７）の膵液成分を含有する生体試料の保存用キットは、さらに、採取された体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を含み、前記貯留部に、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が予め含まれていることが好ましい。

本発明の第二の態様に係る膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤、及び本発明の第三の態様に係るプロテアーゼ阻害剤混合物は、膵液や十二指腸等の膵液成分を含有する生体試料中に含まれているプロテアーゼを非常に効果的に抑制し得る。このため、当該プロテアーゼ阻害剤を用いる本発明の第一の態様に係る膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法は、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの活性を効果的に抑制することができる。よって、当該阻害方法により、膵液由来成分の分解等が抑制され、膵液成分を含有する生体試料を安定して保存することができる。

ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦの化学式を示した図である。 実施例１において、各パンクレアチン溶液から測定された蛍光量を示した図である。 実施例２において、各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を示した図である。 実施例３において、各試料溶液から測定された蛍光量を示した図である。 実施例４において、各試料溶液から測定された蛍光量を示した図である。 実施例５において、各試料溶液から測定された蛍光量を示した図である。 実施例５において、各試料溶液から測定された蛍光量を示した図である。 実施例６において、各試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を示した図である。 実施例７において、ＰＭＳＦを添加した各試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を示した図である。 実施例７において、ＡＥＢＳＦを添加した各試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を示した図である。 実施例７において、ｐ−ＡＰＭＳＦを添加した各試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を示した図である。 実施例８において、１種類のプロテアーゼ阻害剤を添加した各試料溶液から測定された蛍光量を示した図である。 実施例８において、２種類のプロテアーゼ阻害剤を添加した各試料溶液から測定された蛍光量を示した図である。 実施例９において、各種プロテアーゼ阻害剤を添加した各試料溶液から測定された蛍光量を示した図である。

膵液とは、膵管から排出される体液である。本発明及び本願明細書において、膵液成分を含有する生体試料とは、膵液由来の成分が含まれている体液を含む試料を意味する。膵液由来成分が含まれている体液としては、膵臓から直接カテーテルから採取された膵液、十二指腸で採取した液（十二指腸液）等が挙げられる。十二指腸液には、膵液に加えて、同じく乳頭部より排出された胆汁や元々十二指腸に存在している液、血液等も含まれている。膵液や十二指腸液は、常法により採取することができる。

＜膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤＞
本発明の第二の態様に係る膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤（以下、「本発明のプロテアーゼ阻害剤」ということがある。）は、フッ化スルホニル基を有する化合物であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、かつ膵液成分を含有する生体試料に、当該生体試料中のプロテアーゼを阻害するために添加されることを特徴とする。

本発明のプロテアーゼ阻害剤は、フッ化スルホニル基を有し、かつプロテアーゼ阻害活性を有する化合物であれば、特に限定されるものではないが、ベンゼン環に直接又は炭素数１〜６の炭化水素基を介してフッ化スルホニル基が結合する構造を有する化合物であることが好ましく、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）、ＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライド））、ｐ−ＡＰＭＳＦ（ｐ−アミジノフェニルメタンスルフォニルフオライド塩酸塩）、４−(フルオロスルホニル)安息香酸（ＣＡＳ番号：４５５−２６−５）、３−(フルオロスルホニル)安息香酸（ＣＡＳ番号：４５４−９５−５）、２−アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３９２−８６−９）、３−アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３６８−５０−３）、４−アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：９８−６２−４）、２−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：４３３−９８−７）、３−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３４９−７８−０）、又は４−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３４９−９６−２）であることが好ましく、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、又はｐ−ＡＰＭＳＦであることがより好ましい。図１に、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦの化学式を示す。図１中、点線で囲われた官能基が、フッ化スルホニル基である。

本発明のプロテアーゼ阻害剤は、複数種類のプロテアーゼ阻害剤からなる混合物の一有効成分としてもよい。プロテアーゼ阻害剤混合物としては、本発明のプロテアーゼ阻害剤のみからなるものであってもよく、１種類又は２種類以上の本発明のプロテアーゼ阻害剤とその他のプロテアーゼ阻害剤との混合物であってもよい。その他のプロテアーゼ阻害剤としては、本発明のプロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ阻害活性を損なわないものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、エラスタチナール、抗トロンビン等のペプチド系プロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、Ｅｌａｓｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、トリプシンインヒビター、Ｅｃｏｔｉｎ,Ｅ．ｃｏｌｉ等が挙げられる。また、メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）、メシル酸カモスタット（フォイパン）、メシル酸ナファモスタット（Ｆｕｔｈａｎ）、ウリナスタチン等の膵炎治療薬を用いることもできる。

本発明のプロテアーゼ阻害剤と併用するその他のプロテアーゼ阻害剤としては、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が好ましく、アミノ酸クロロメチルケトン類であることがより好ましい。当該アミノ酸クロロメチルケトン類としては、プロテアーゼ阻害活性を有するものであれば特に限定されるものではなく、ＴＬＣＫ（Ｎ−ａ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン）、ＴＰＣＫ（Ｎ−ａ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン）等が挙げられる。本発明においては、特に、ＴＬＣＫ及びＴＰＣＫからなる群より選択される１種以上が好ましく、ＴＬＣＫがより好ましい。

本発明のプロテアーゼ阻害剤をはじめとする複数種類のプロテアーゼ阻害剤からなる混合物としては、本発明のプロテアーゼ阻害剤を２種類以上含むものが好ましく、２種類以上の本発明のプロテアーゼ阻害剤と少なくとも１種類のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含むものがより好ましく、２種類以上の本発明のプロテアーゼ阻害剤と少なくとも１種類のプロテアーゼ阻害活性を有するアミノ酸クロロメチルケトン類を含むものがさらに好ましく、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される２種類以上とＴＬＣＫ及びＴＰＣＫからなる群より選択される１種以上とを含むものが特に好ましい。

＜膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法＞
本発明の第一の態様に係る膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法（以下、「本発明のプロテアーゼ阻害方法」ということがある。）は、膵液成分を含有する生体試料に、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤（すなわち、本発明のプロテアーゼ阻害剤）を添加することにより、当該生体試料中のプロテアーゼの酵素活性を阻害することを特徴とする。本発明のプロテアーゼ阻害剤は、他のプロテアーゼ阻害剤と比べて、膵液や十二指腸液中に含まれているプロテアーゼに対する阻害活性が非常に高い。このため、膵液成分を含有する生体試料に本発明のプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、当該生体試料中の膵液や十二指腸液由来のプロテアーゼによる膵液成分の分解を簡便かつ効果的に抑制できる。

本発明のプロテアーゼ阻害方法に供される膵液成分を含有する生体試料は、膵液由来の成分が含まれている体液を含む試料であればよい。例えば、膵液由来成分が含まれている体液のみからなるものであってもよく、当該体液を適当なバッファー等で希釈した液であってもよく、当該体液又はその希釈液に、各種添加剤を添加したものであってもよい。添加剤としては、界面活性剤、核酸分解酵素阻害剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等が挙げられる。本発明のプロテアーゼ阻害方法に供される膵液成分を含有する生体試料としては、膵液又は十二指腸液を含む試料であることが好ましい。具体的には、膵液、十二指腸液、膵液又は十二指腸液の希釈液、若しくはこれらに前述の各種添加剤を添加した液等が挙げられる。

本発明のプロテアーゼ阻害方法においては、生体から採取された後に保存等された膵液成分を含有する生体試料に、本発明のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよいが、生体から膵液成分を含有する体液を採取した時点から本発明のプロテアーゼ阻害剤を添加する時点までの間隔は短いほうが好ましく、生体から採取直後の膵液又は十二指腸液に本発明のプロテアーゼ阻害剤を添加することが特に好ましい。

膵液中に含まれるプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、カルボキシペプチターゼなど多種多様である。このため、従来から膵液等に用いられてきたプロテアーゼ阻害剤では、１種類のみを添加した場合に得られるプロテアーゼ阻害効果は非常に限定的なものであり、数種類のプロテアーゼ阻害剤を組み合わせた場合でも、十分なプロテアーゼ阻害効果を得られたという報告はない。これに対して、本発明のプロテアーゼ阻害剤は、１種類のみを用いた場合であっても、添加量を適宜調整することにより、十分なプロテアーゼ阻害効果を得ることができる。

本発明のプロテアーゼ阻害方法において用いられる本発明のプロテアーゼ阻害剤は、１種類のみであっても充分にプロテアーゼ阻害活性が発揮されるが、２種類以上を組み合わせて用いることも好ましい。また、本発明のプロテアーゼ阻害剤とともに、その他のプロテアーゼ阻害剤を１種類又は２種類以上用いてもよい。本発明のプロテアーゼ阻害方法において用いられる本発明のプロテアーゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される１種以上を少なくとも含むことが好ましく、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される２種以上を組み合わせて含むことがより好ましい。膵液には活性の異なる様々なプロテアーゼが含まれているため、複数のプロテアーゼ阻害剤を混合して用いることにより、より確実に生体試料中のプロテアーゼ活性を抑えることが期待できる。さらに単独で使用する場合よりも、低い濃度で組み合わせることによってプロテアーゼ活性を抑えることが期待できる。

膵液成分を含有する生体試料に添加されるプロテアーゼ阻害剤の量は、当該プロテアーゼ阻害剤によるプロテアーゼ阻害効果が発揮される量であれば特に限定されるものではなく、膵液成分を含有する生体試料の種類、用いるプロテアーゼ阻害剤の種類等を考慮して、適宜調整することができる。例えば、膵液成分を含有する生体試料にプロテアーゼ阻害剤としてＰＭＳＦのみを添加する場合、最終濃度が１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上となるように添加することができる。また、プロテアーゼ阻害剤としてＡＥＢＳＦのみを用いる場合、最終濃度が４ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上となるように、膵液成分を含有する生体試料にＡＥＢＳＦを添加することができる。プロテアーゼ阻害剤としてｐ−ＡＰＭＳＦのみを用いる場合、最終濃度が２ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上となるように、膵液成分を含有する生体試料にＡＥＢＳＦを添加することができる。

また、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤（本発明のプロテアーゼ阻害剤）と共に用いられるその他のプロテアーゼ阻害剤としてＴＬＣＫのみを添加する場合、最終濃度が０．１ｍＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上となるように添加することができる。また、当該その他のプロテアーゼ阻害剤としてＴＰＣＫのみを添加する場合、最終濃度が０．１ｍＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上となるように添加することができる。

本発明のプロテアーゼ阻害方法においては、膵液成分を含有する生体試料に添加される本発明のプロテアーゼ阻害剤及びその他のプロテアーゼ阻害剤は、粉末状、顆粒状等の固形状であってもよく、適当なバッファー等に溶解させたプロテアーゼ阻害剤溶液であってもよい。また、本発明のプロテアーゼ阻害剤とその他のプロテアーゼ阻害剤は、膵液成分を含有する生体試料に同時に添加してもよく、どちらか一方を先に添加した後、他方を添加してもよい。生体試料中のプロテアーゼに対する阻害効果を充分に発揮させ得る点からは、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と前記その他のプロテアーゼ阻害剤は同時に添加されることが好ましい。

膵液成分を含有する生体試料に本発明のプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、当該生体試料中に含まれているプロテアーゼの活性が効果的に阻害されるため、当該生体試料中に含まれている膵液成分の分解・変性等が顕著に抑制される。このため、本発明のプロテアーゼ阻害方法によりプロテアーゼが阻害された膵液成分を含有する生体試料は、膵液由来の生体成分をより安定して保存することが可能である。また、本発明のプロテアーゼ阻害方法によりプロテアーゼが阻害された膵液成分を含有する生体試料に対して、膵液成分の解析を行うことにより、解析精度が向上し、信頼性の高い結果を得ることができる。

本発明のプロテアーゼ阻害方法によりプロテアーゼが阻害された膵液成分を含有する生体試料は、その他の生体試料と同様に、各種検査のための測定試料として用いることができる。検査対象となる物質は、膵液又は十二指腸液に含まれていることが期待される生体成分であれば特に限定されるものではなく、タンパク質であってもよく、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸であってもよく、細胞であってもよい。例えば、当該生体試料は、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、二次元電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法などを用いた種々のタンパク質解析や、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、プローブを用いたハイブリダイゼーションなどを用いた種々の核酸解析、細胞数カウントや細胞診のような細胞解析等に用いることができる。

＜膵液成分を含有する生体試料の保存用キット＞
本発明の第四の態様に係る膵液成分を含有する生体試料の保存用キット（以下、「本発明の保存用キット」ということがある。）は、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤（すなわち、本発明のプロテアーゼ阻害剤）を含み、膵液成分を含有する生体試料を保存するために用いられる。当該キットを用いることにより、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼをより簡便に阻害することができる。本発明の保存用キットに含まれる本発明のプロテアーゼ阻害剤は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせていてもよい。また、当該キットは、さらに、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含むことが好ましく、少なくとも１種以上の、プロテアーゼ阻害活性を有するアミノ酸クロロメチルケトン類を含むことがより好ましい。

また、本発明の保存用キットに含まれる本発明のプロテアーゼ阻害剤は、凍結乾燥粉末であってもよく、凍結乾燥粉末を適当な賦形剤等とともに成型された錠剤又は顆粒剤等であってもよく、適当なバッファーに溶解させたプロテアーゼ阻害剤溶液であってもよい。

本発明の保存用キットは、さらに、採取された体液を希釈するためのバッファー、その他のプロテアーゼ阻害剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等を含んでいてもよい。界面活性剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等の各種添加剤は、予め希釈用のバッファーに溶解させていてもよい。

その他、本発明の保存用キットは、調製された膵液成分含有試料（膵液成分を含有する生体試料に、本発明の保存用キットが含む各種プロテアーゼ阻害剤を添加し、必要に応じてその他の成分を添加したもの。）を、当該膵液成分含有試料が充填されている容器から一定量を滴下することを可能とする、当該容器の開口部に結合可能なキャップを含んでいてもよい。

本発明の保存用キットは、さらに、生体から採取された膵液又は十二指腸液等の体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を含んでいてもよい。この場合、本発明のプロテアーゼ阻害剤及びその他のプロテアーゼ阻害剤は、当該貯留部に予め含まれていることが好ましい。当該保存用容器に目盛りが刻まれていた場合には、当該保存用容器に添加された生体試料の量（当該保存容器内に予めプロテアーゼ阻害剤が充填されていた場合には、生体試料とプロテアーゼ阻害剤の合計量）が視覚的に確認することができ、ひいてはプロテアーゼ阻害剤の終濃度を一目で理解することができる。

また、膵液成分を含む生体試料は、経内視鏡的に採取することが一般的である。そこで、本発明の保存用キットの構成品として、膵液成分を含む生体試料を経内視鏡的に採取する採取具を含めてもよい。当該採取具としては、例えば、内視鏡装置に挿入可能なカテーテルにシリンジを組合せたものや、内視鏡装置に挿入可能な吸収体を先端に備えたプローブ等がある。内視鏡装置に挿入可能なカテーテルとしては、例えば、特開２０１１−５００９号公報に記載されている標本採取キューブ等が挙げられる。これらの採取具としては、前記プロテアーゼ阻害剤を予め分注した貯留部を有していることが好ましい。

次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
膵液に対して最も効果が高いプロテアーゼ阻害剤を調べるため、市販されているプロテアーゼ阻害剤カクテル８種類の中から、膵液に対して阻害効果の高いプロテアーゼ阻害剤カクテルを探索した。用いたプロテアーゼ阻害剤カクテルは、ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）（阻害剤カクテル１）、Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）（阻害剤カクテル２）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）（阻害剤カクテル３）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ（ＧＥ社製）（阻害剤カクテル４）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ I（ＭＥＲＣＫ社製）（阻害剤カクテル５）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ ＩＩ（ＭＥＲＣＫ社製）（阻害剤カクテル６）、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｅｔ ＩＩＩ（ＭＥＲＣＫ社製）（阻害剤カクテル７）、及びＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）（阻害剤カクテル８）である。

膵酵素が活性化した状態で存在するブタの膵臓から製した消化酵素剤である“パンクレアチン”を擬似人工膵液として用い、各プロテアーゼ阻害剤カクテルを最終濃度が、製造元による推奨濃度（１×）又は推奨濃度の５倍濃度（５×）になるよう添加した後、プロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性は、ＥｎｚＣｈｅｃｋ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて測定した。具体的には、各プロテアーゼ阻害剤カクテルが添加されたパンクレアチン溶液に、キット添付の蛍光標識されたカゼインを添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５３５ｎｍの蛍光波長で蛍光量を測定した。また、対照として、パンクレアチンに直接蛍光標識されたカゼインを添加した試料溶液（阻害剤なし、ＤＭＳＯなし）、パンクレアチンにＤＭＳＯを、各プロテアーゼ阻害剤カクテルを製造元による推奨濃度（１×）となるように添加した場合と同様のＤＭＳＯ添加量となるように添加した試料溶液（阻害剤なし、ＤＭＳＯ１×）、及びパンクレアチンにＤＭＳＯを、各プロテアーゼ阻害剤カクテルを製造元による推奨濃度（５×）となるように添加した場合と同様のＤＭＳＯ添加量となるように添加した試料溶液（阻害剤なし、ＤＭＳＯ５×）についても、同様にプロテアーゼ活性を測定した。

各パンクレアチン溶液の蛍光量の測定結果を図２に示す。縦軸の蛍光量はカゼインを分解した量を表し、その値をプロテアーゼ活性の値として概算した。これらの結果より、阻害剤カクテル４（ＧＥ社のＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ）が最も阻害効果が高いことが分かった。

［実施例２］
プロテアーゼ活性を阻害することによって、膵液中のタンパク質の保存安定性がどのように影響を受けるかについて検討した。一般的に膵液に含まれているＳ１００Ｐ（カルシウム結合タンパク質）とパンクレアチン（擬似膵液）を混合した溶液中に、プロテアーゼ阻害剤を添加した場合としなかった場合において、Ｓ１００Ｐがどの程度保存されるかを調べた。
具体的には、まず、２５ｎｇ／ｍＬのＳ１００Ｐ（標品）溶液（試料溶液１）２５ｎｇ／ｍＬのＳ１００Ｐ（標品）及び１ｍｇ／ｍＬのパンクレアチンを含む溶液（試料溶液２）、２５ｎｇ／ｍＬのＳ１００Ｐ（標品）及び１ｍｇ／ｍＬのパンクレアチンを含み、さらに推奨濃度の２倍濃度（２×）のＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ（ＧＥ社製）を含む溶液（試料溶液３）、２５ｎｇ／ｍＬのＳ１００Ｐ（標品）及び１ｍｇ／ｍＬのパンクレアチンを含み、さらに推奨濃度の５倍濃度（５×）のｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む溶液（試料溶液４）を調製した。各試料溶液は、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ−８０６０）に付属のバッファーを用いて調製した。これらの試料溶液を２５℃、１６時間インキュベートすることにより反応させた。その後、各試料溶液をＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ−８０６０）に付属のバッファーを用いて１０倍希釈した希釈液に対して、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用い、Ｓ１００Ｐの検出を行った。

各試料溶液中のＳ１００Ｐの測定結果を図３に示す。この結果、プロテアーゼ阻害カクテルを添加した試料溶液３及び４は、プロテアーゼ阻害カクテルを添加しなかった試料溶液２よりも、残存するＳ１００Ｐ量が多かった。また、試料溶液３に添加したプロテアーゼ阻害カクテルよりもよりプロテアーゼ阻害活性が高いプロテアーゼ阻害カクテル（実施例１参照。）を添加した試料溶液４は、試料溶液３よりも残存するＳ１００Ｐ量が多かった。これらの結果から、膵液にプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、膵液中のタンパク質の分解を抑制し、より安定して保存し得ることが明らかである。また、プロテアーゼ活性とＳ１００Ｐの検出濃度は相関があることも示唆された。

［実施例３］
実施例１において最もプロテアーゼ阻害活性が高かった阻害剤カクテルに含まれる各種プロテアーゼ阻害剤の中で、膵液のプロテアーゼに対し、どのプロテアーゼ阻害剤が最も阻害活性が高いのかについて検討した。
Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ（ＧＥ社製）に含まれるセリンプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦの４種類である（濃度については非公開）。そこで、最終濃度が各プロテアーゼ阻害剤単剤における推奨最大濃度となるように調製し、４種類の阻害剤の組合せ全１５通りについて、パンクレアチン及び２種類の膵液検体を用いてプロテアーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した。各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤を表１に示す。なお、推奨最大濃度は、アプロチニン（Ｒｏｃｈｅ社製）は０．３μＭ、ロイペプチン（Ｒｏｃｈｅ社製）は５０μＭ、ＰＭＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）は１ｍＭ、ＡＥＢＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）は４ｍＭであった。また、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液（対照試料溶液１）、推奨濃度の阻害剤カクテル１（Ｒｏｃｈｅ社のｃｏｍｐｌｅｔｅ）を含む試料溶液（対照試料溶液２）、推奨濃度の５倍濃度（５×）の阻害剤カクテル１を含む試料溶液（対照試料溶液３）、推奨濃度の阻害剤カクテル４（ＧＥ社のＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ）を含む試料溶液（対照試料溶液４）、及び推奨濃度の５倍濃度（５×）の阻害剤カクテル４を含む試料溶液（対照試料溶液５）のプロテアーゼ活性も同様に測定した。

各試料溶液の蛍光量の測定結果を図４に示す。縦軸の蛍光量はカゼインを分解した量を表し、その値をプロテアーゼ活性の値として概算した。試料溶液１は、阻害剤カクテル４を模擬し、４種類のセリンプロテアーゼ阻害剤を全て添加したものであり、カゼインはほとんど分解されていなかった。試料溶液４、５、及び１１は、試料溶液１とほぼ同等のプロテアーゼ活性阻害効果が示された。これら３種の試料溶液に共通して添加されたプロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ及びＡＥＢＳＦであった。これらの結果から、ＰＭＳＦ及びＡＥＢＳＦの組み合わせが、膵液に対して高いプロテアーゼ阻害効果を持つことが明らかとなった。一方、血液検査用のプロテアーゼ阻害剤として採血管などに用いられているペプチド系プロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン及びロイペプチンは、いずれもプロテアーゼ活性にはほとんど影響を与えなかった。

［実施例４］
ＰＭＳＦ及びＡＥＢＳＦは、いずれもフッ化スルホニル基を有する有機化合物である。そこで、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、フッ化スルホニル基を有さないプロテアーゼ阻害剤について、その阻害効果を検討した。プロテアーゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＡＥＢＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ｐ−ＡＰＭＳＦ（ＳＩＧＭＡ社製）、ＴＬＣＫ（ＳＩＧＭＡ社製）、及びＴＰＣＫ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
具体的には、パンクレアチン及び２種類の膵液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、１ｍＭのＰＭＳＦと４ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した試料溶液、１ｍＭのＰＭＳＦを添加した試料溶液、４ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した試料溶液、５ｍＭのｐ−ＡＰＭＳＦを添加した試料溶液、１００μＭのＴＬＣＫを添加した試料溶液、及び１００μＭのＴＰＣＫを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した。また、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液（阻害剤なし）、推奨濃度の阻害剤カクテル１（Ｒｏｃｈｅ社のｃｏｍｐｌｅｔｅ）を含む試料溶液、推奨濃度の５倍濃度（５×）の阻害剤カクテル１を含む試料溶液、推奨濃度の阻害剤カクテル４（ＧＥ社のＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ）を含む試料溶液、及び推奨濃度の５倍濃度（５×）の阻害剤カクテル４を含む試料溶液のプロテアーゼ活性も同様に測定した。

各試料溶液の蛍光量の測定結果を図５に示す。縦軸の蛍光量はカゼインを分解した量を表し、その値をプロテアーゼ活性の値として概算した。横軸は、各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤を示す。この結果、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦは、プロテアーゼ活性阻害効果が高く、ＴＬＣＫ及びＴＰＣＫは膵液中に含まれるプロテアーゼに対するプロテアーゼ活性阻害効果が低いことが明らかとなった。
図１に示すように、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦは、いずれも非常に類似した化学構造を持つ。特に、これらの化合物は共通してフッ化スルホニル基を有していた。そのため、フッ化スルホニル基が膵液中のプロテアーゼの阻害に大きく影響を与えている可能性が示唆された。フッ化スルホニル基を有する構造が、膵液の中でも分解カスケードのトリガーとして知られているセリンプロテアーゼの阻害に有効に働いていると考えられる。

［実施例５］
フッ化スルホニル基を有していないプロテアーゼ阻害剤について、そのプロテアーゼ阻害効果を検討した。フッ化スルホニル基を有していないプロテアーゼ阻害剤としては、Ｅｌａｓｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ（ＭＥＲＣＫ社製）、ＥＤＴＡ（和光純薬社製）、アプロチニン（Ｒｏｃｈｅ社製）、ロイペプチン（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＴＬＣＫ（ＳＩＧＭＡ社製）、及びＴＰＣＫ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
具体的には、パンクレアチン及び２種類の膵液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、１０〜５０μＭのＥｌａｓｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉを添加した試料溶液、１〜１０ｍＭのＥＤＴＡを添加した試料溶液、０．０００３〜０．３ｍＭのアプロチニンを添加した試料溶液、０．００５〜５ｍＭのロイペプチンを添加した試料溶液、０．０１〜１ｍＭのＴＬＣＫを添加した試料溶液、又は０．０１〜１ｍＭのＴＰＣＫを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した。また、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液（阻害剤なし）、推奨濃度の阻害剤カクテル１（Ｒｏｃｈｅ社のｃｏｍｐｌｅｔｅ）を含む試料溶液、推奨濃度の５倍濃度（５×）の阻害剤カクテル１を含む試料溶液、推奨濃度の阻害剤カクテル４（ＧＥ社のＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ）を含む試料溶液、及び推奨濃度の５倍濃度（５×）の阻害剤カクテル４を含む試料溶液のプロテアーゼ活性も同様に測定した。

各試料溶液の蛍光量の測定結果を図６及び７に示す。縦軸の蛍光量はカゼインを分解した量を表し、その値をプロテアーゼ活性の値として概算した。横軸は、各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤を示す。この結果、Ｅｌａｓｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ、ＥＤＴＡ、ロイペプチン、及びＴＬＣＫは、膵液中のプロテアーゼに対する阻害効果はほとんど見られなかった。一方、アプロチニンは、パンクレアチン（擬似膵液）に対しては弱いながらもプロテアーゼ阻害効果が見られたが、膵液検体に対しては、ほとんどプロテアーゼ阻害効果は観察されなかった。また、ＴＰＣＫは、プロテアーゼ阻害効果が若干見られたものの、濃度を上げても阻害効果が高くなかったことから、膵液中のプロテアーゼに対する阻害効果は低いと判断した。

［実施例６］
膵炎治療薬であるメシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）（和光純薬社製）、メシル酸カモスタット（フォイパン）（和光純薬社製）、メシル酸ナファモスタット（Ｆｕｔｈａｎ）（ＢＤ社製）について、そのプロテアーゼ阻害効果を検討した。
具体的には、パンクレアチン及び２種類の膵液検体を用いて、ＦＯＹ及びフォイパンについては最終濃度が０．５〜５０ｍＭとなるように、Ｆｕｔｈａｎについては最終濃度が０．５〜５ｍＭとなるようにそれぞれ添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した。また、プロテアーゼ阻害剤として、１ｍＭのＰＭＳＦを添加した試料溶液、４ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した試料溶液、及び５ｍＭのｐ−ＡＰＭＳＦを添加した試料溶液のプロテアーゼ活性も同様に測定した。

各試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を図８に示す。縦軸は、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液の蛍光輝度を１００％とし、各試料溶液の蛍光輝度からプロテアーゼ活性の相対値（％）として換算した値を示す。横軸は、各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤及び最終濃度を示す。これらの結果から、膵炎治療薬のプロテアーゼ阻害効果は、フッ化スルホニル基を有する化合物よりも低いことが明らかとなった。

［実施例７］
ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦに対し、膵液のプロテアーゼを阻害するための最適濃度の検討を行った。
具体的には、パンクレアチン及び２種類の膵液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、様々な濃度でＰＭＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＡＥＢＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、又はｐ−ＡＰＭＳＦ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した。対照として、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液（阻害剤なし）のプロテアーゼ活性も同様に測定した。

ＰＭＳＦを添加した試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を図９に、ＡＥＢＳＦを添加した試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を図１０に、ｐ−ＡＰＭＳＦを添加した試料溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を図１１に、それぞれ示す。縦軸は、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液の蛍光輝度を１００％とし、各試料溶液の蛍光輝度からプロテアーゼ活性の相対値（％）として換算した値を示す。横軸は、各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤の最終濃度を示す。これらの結果から、ＰＭＳＦは約１ｍＭ以上、ＡＥＢＳＦは約４ｍＭ以上、ｐ−ＡＰＭＳＦは約２ｍＭ以上である場合に、膵液に対し高いプロテアーゼ阻害効果が得られることが明らかとなった。

［実施例８］
ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦについて、これらを組み合わせることによってプロテアーゼ阻害活性にどのような効果が見られるかについて検討した。プロテアーゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＡＥＢＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、及びｐ−ＡＰＭＳＦ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
具体的には、３種類の膵液検体及び２種類の十二指腸液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、１ｍＭのＰＭＳＦを添加した試料溶液、４ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した試料溶液、２ｍＭのｐ−ＡＰＭＳＦを添加した試料溶液、１ｍＭのＰＭＳＦと４ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した試料溶液、４ｍＭのＡＥＢＳＦと２ｍＭのｐ−ＡＰＭＳＦを添加した試料溶液、並びに１ｍＭのＰＭＳＦと２ｍＭのｐ−ＡＰＭＳＦを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した。対照として、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液（阻害剤なし）のプロテアーゼ活性も同様に測定した。

１種類のプロテアーゼ阻害剤を添加した試料溶液の蛍光量の測定結果を図１２に、２種類のプロテアーゼ阻害剤を組み合わせて添加した試料溶液の蛍光量の測定結果を図１３に、それぞれ示す。縦軸の蛍光量はカゼインを分解した量を表し、その値をプロテアーゼ活性の値として概算した。横軸は、各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤を示す。この結果、１種類のプロテアーゼ阻害剤を添加した場合よりも、２種類以上のプロテアーゼ阻害剤を組み合わせて添加した場合のほうが、プロテアーゼ阻害効果が高まることが明らかとなった。また、組み合わせについては、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦの中からいずれの２種類を組み合わせた場合であっても、ほぼ同程度に高いプロテアーゼ阻害効果が得られた。

［実施例９］
前記実施例８の結果より、膵液を含む生体試料に対して、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦの中から２種類以上のプロテアーゼ阻害剤を組み合わせて添加すると、プロテアーゼ阻害効果が高まることが明らかとなった。そこで、これら２種類の阻害剤と他の阻害剤の組合せにより、さらにプロテアーゼ阻害効果が高まるかどうかについて検討を行った。プロテアーゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＡＥＢＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、アプロチニン（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＴＬＣＫ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
具体的には、４種類の十二指腸液検体を用いて、プロテアーゼ阻害剤として、１ｍＭのＰＭＳＦと４ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した試料溶液、１ｍＭのＰＭＳＦと４ｍＭのＡＥＢＳＦと０．３ｍＭのアプロチニンを添加した試料溶液、並びに１ｍＭのＰＭＳＦと４ｍＭのＡＥＢＳＦと１ｍＭのＴＬＣＫを添加した試料溶液を調製し、各試料溶液のプロテアーゼ活性を、実施例１と同様にして測定した。対照として、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液（阻害剤なし）のプロテアーゼ活性も同様に測定した。

ＰＭＳＦとＡＥＢＳＦに、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤以外のその他のプロテアーゼ阻害剤を１種類添加した試料溶液の蛍光量の測定結果を図１４に示す。縦軸の蛍光量はカゼインを分解した量を表し、その値をプロテアーゼ活性の値として概算した。横軸は、各試料溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤を示す。この結果、２種類以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤にペプチド系の阻害剤であるアプロチニンを添加した場合には、ＰＭＳＦとＡＥＢＳＦのみを添加した場合と比べてさらなる阻害効果は見られなかった。これに対して、ＰＭＳＦとＡＥＢＳＦに、スルホニル基を持つスルホン系のプロテアーゼ阻害剤であるＴＬＣＫを添加した場合は、ＰＭＳＦとＡＥＢＳＦのみを添加した場合と比べてさらなる阻害効果が見られた。

本発明のプロテアーゼ阻害剤及びこれを用いる本発明のプロテアーゼ阻害方法は、膵液や十二指腸液等の生体試料中のプロテアーゼ活性を効果的に阻害し、当該生体試料中の生体成分をより安定して保存することが可能なであるため、膵液等の生体試料を解析する分野、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。

Claims (18)

1. 膵液成分を含有する生体試料に、少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、当該生体試料中のプロテアーゼの酵素活性を阻害する、膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
2. 前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、ｐ−ＡＰＭＳＦ、４−(フルオロスルホニル)安息香酸、３−(フルオロスルホニル)安息香酸、２−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、３−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、４−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、２−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、３−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、及び４−ニトロベンゼンスルホニルフルオリドからなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
3. 前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
4. 前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される２種以上である、請求項１に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
5. 最終濃度が１ｍＭ以上のＰＭＳＦ、４ｍＭ以上のＡＥＢＳＦ、又は２ｍＭ以上のｐ−ＡＰＭＳＦとなるように、前記生体試料にＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、又はｐ−ＡＰＭＳＦを添加する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
6. 前記生体試料に、さらに、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を添加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
7. 前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸クロロメチルケトン類である、請求項６に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
8. 前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫ及びＴＰＣＫからなる群より選択される１種以上である、請求項６に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
9. 前記スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫである、請求項６に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
10. 前記生体試料が、膵液又は十二指腸液である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の膵液成分を含有する生体試料中のプロテアーゼの阻害方法。
11. フッ化スルホニル基を有する化合物であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、かつ膵液成分を含有する生体試料に、当該生体試料中のプロテアーゼを阻害するために添加される、膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤。
12. ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、ｐ−ＡＰＭＳＦ、４−(フルオロスルホニル)安息香酸、３−(フルオロスルホニル)安息香酸、２−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、３−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、４−アミノベンゼンスルホニルフルオリド、２−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、３−ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、及び４−ニトロベンゼンスルホニルフルオリドからなる群より選択される化合物である、請求項１１に記載の膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤。
13. ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ−ＡＰＭＳＦからなる群より選択される化合物である、請求項１１に記載の膵液成分を含有する生体試料用プロテアーゼ阻害剤。
14. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の生体試料用プロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種以上含む、プロテアーゼ阻害剤混合物。
15. さらに、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１４に記載のプロテアーゼ阻害剤混合物。
16. 少なくとも１種以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含み、
    膵液成分を含有する生体試料を保存するために用いられる、
    膵液成分を含有する生体試料の保存用キット。
17. さらに、少なくとも１種以上のスルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１６に記載の膵液成分を含有する生体試料の保存用キット。
18. さらに、採取された体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を含み、
    前記貯留部に、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が予め含まれている、請求項１６又は１７に記載の膵液成分を含有する生体試料の保存用キット。

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