JPWO2013038739A1 - 肺癌マーカー補体C3dg分子及び肺癌マーカーの分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)
補体C3dg分子を含む肺癌マーカー。
(2)
肺癌マーカーとしての補体C3dg分子の生体試料中におけるレベルを測定し、補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程と、前記補体C3dg分子の基準レベルに基づき、前記測定レベルの高低に関する評価を行う工程とを含む、肺癌マーカーの分析方法。
(3)
前記補体C3dg分子の測定レベルが、前記生体試料中の補体C3全長分子の測定レベルに対する相対値であり、
前記補体C3dg分子の基準レベルが、補体C3全長分子の基準レベルに対する相対値である、(2)に記載の方法。
前記生体試料を分離工程に供することによって、分離された前記補体C3dgを得る工程をさらに含み、
前記補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程において、少なくとも補体C3dg配列の全部又は一部をエピトープとする抗体を用いて前記補体C3dg分子の測定を行う、(2)又は(3)に記載の方法。
(5)
前記補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって補体C3全長分子及び前記補体C3dg分子を同時に検出し、前記補体C3全長分子の検出量に対する前記補体C3dg分子の検出量を求める、(3)に記載の方法。
前記補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって前記補体C3dg分子の検出を行う、(2)に記載の方法。
上記(6)の方法においては、上記(5)におけるような補体C3全長分子の検出を行う必要がない。
抗補体C3dg抗体を含む、肺癌検出キット。
本発明は、肺癌のマーカーを提供する。
本発明において肺癌のマーカーとして提供する補体C3dg分子は、肺癌患者及び健常者それぞれの血清サンプルから見出されたものである。具体的には、肺癌患者及び健常者の血清サンプルを、免疫除去、脱グリコシル化、トリプシン消化、及びLC−MALDI MS測定に供し、測定結果について二次元マッピングを行い、ピークの定量、統計解析を行った後、レトロスペクティブMS/MSによるペプチド同定及びMRM(Multiple Reaction Monitoring)ならびにウェスタンブロッティング法による検証を行うことで見出された。
本発明は、補体C3dg分子を肺癌マーカーとして使用することにより生体試料を分析する方法を提供する。本発明の方法においては、補体C3dg分子が、肺癌患者体内で基準レベルに比べて発現量が抑制されるマーカーとして用いられる。基準レベルは、肺癌患者由来の生体試料における補体C3dg分子のレベルの対照たりうるレベルである。本発明の方法を用いて肺癌のスクリーニングや早期診断を行う場合においては、通常、基準レベルとして、健常者由来の生体試料における補体C3dg分子のレベルが採用される。
生体試料は、補体C3dg分子の測定レベルの取得前に、当業者によって適宜前処理が行われてよい。前処理の具体例としては、脱塩、カートリッジ精製、抗C3抗体を用いた精製、及び酵素消化(特にトリプシン消化)などが挙げられる。
しかしながら、より正確な分析を行う観点からは、補体C3dg分子の測定レベルを、補体C3全長分子の測定レベルに対する相対値として取得することが好ましい。このことによって、補体C3及びその断片の総量の、個体間のわずかな変動に影響されることなく、肺癌患者と健常者との間の差異をより正確に見分けることができる。この場合、比較すべき基準レベルとしても、補体C3全長分子の基準レベルに対する相対値が採用される。
補体C3dg分子の測定レベルを取得するには、測定レベルを測定すべき補体C3dg分子を、C3全長分子や他のC3断片分子等と区別することができる方法であればよい。
生体特異的親和性に基づく検査は当業者に良く知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、分離後の生体試料における補体C3dg分子に結合する抗体の存在を検出する。用いられる抗体としては、補体C3dgと免疫複合体を形成可能な物質であればよく、従って少なくとも補体C3dg配列の全部又は一部をエピトープとする抗体であればよい。具体的には、抗補体C3dg抗体(すなわち補体C3dg配列の全部又は一部のみをエピトープとする抗体)であってもよいし、抗補体C3ポリクローナル抗体(すなわち補体C3全長分子に対するポリクローナル抗体で、補体C3dg分子と結合しうるもの)であってもよい。
その他、質量分析に供すべき生体試料に既知濃度の標準試料を含ませておくことによって、補体C3dg分子の測定レベルを、内部標準法により測定することもできる。
本発明の肺癌検出キットは、抗補体C3dg抗体(すなわち補体C3dg配列の全部又は一部のみをエピトープとする抗体)を含む。
さらに、本発明の肺癌検出キットには、生体試料から補体C3dg分子を分離するためのアイテムをさらに含んでいてもよい。そのようなアイテムは、例えば上記の分子ふるい効果に基づく分離法を行う観点から当業者によって適宜決定されうるものであり、例えば、分離用担体、バッファー、染色液などが挙げられる。
30症例の検体から採取された血清0.5μLをポリアクリルアミドゲル電気泳動用のサンプルバッファー(50mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glycerol, 50mM dithiothreitol, 1.6% SDS, 0.04% Coomassiebrilliant blue G-250)で100倍に希釈し、20μLをNuPAGE Bis-Tris 4-12%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。ゲル中で分離されたタンパク質をそのままPVDF(PolyVinylidene Difluoride)メンブレンへ転写し、抗補体C3ポリクローナル抗体(Sigma GW20073F)を用いたウェスタンブロッティングに供し、C3由来のタンパク質断片を可視化した。ウェスタンブロッティングによるC3dg断片の検出結果を図1に示す。図1において、Mは分子量サイズマーカーを表す。また、図1において検出されたC3dgの相対発現量(C3dg relative expression level)をプロットしたグラフを図2に示す。図2に示されるように、補体C3dgの血中濃度は、健常者(Normal)に比べ、肺癌(特に早期肺癌)症例において顕著に減少していることが示された(進行(Advanced)肺癌ではP<0.005、早期(Early)肺癌ではP<0.0006)。
Claims (7)
- 補体C3dg分子を含む肺癌マーカー。
- 肺癌マーカーとしての補体C3dg分子の生体試料中におけるレベルを測定し、補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程と、前記補体C3dg分子の基準レベルに基づき、前記測定レベルの高低に関する評価を行う工程とを含む、肺癌マーカーの分析方法。
- 前記補体C3dg分子の測定レベルが、前記生体試料中の補体C3全長分子の測定レベルに対する相対値であり、
前記補体C3dg分子の基準レベルが、補体C3全長分子の基準レベルに対する相対値である、請求項2に記載の方法。 - 前記生体試料を分離工程に供することによって、分離された前記補体C3dgを得る工程をさらに含み、
前記補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程において、少なくとも補体C3dg配列の全部又は一部をエピトープとする抗体を用いて前記補体C3dg分子の測定を行う、請求項2又は3に記載の方法。 - 前記補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって補体C3全長分子及び前記補体C3dg分子を同時に検出し、前記補体C3全長分子の検出量に対する前記補体C3dg分子の検出量を求める、請求項3に記載の方法。
- 前記補体C3dg分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって前記補体C3dg分子の検出を行う、請求項2に記載の方法。
- 抗補体C3dg抗体を含む、肺癌検出キット。
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