JPWO2013038739A1 - 肺癌マーカー補体Ｃ３ｄｇ分子及び肺癌マーカーの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】被検体に対する負担が軽く且つ特異性及び感度に優れた、早期肺癌を検出する方法を提供する。【解決手段】補体Ｃ３ｄｇ分子を含む肺癌マーカー。肺癌マーカーとしての補体Ｃ３ｄｇ分子の生体試料中におけるレベルを測定し、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程と、前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルに基づき、前記測定レベルの高低に関する評価を行う工程とを含む、肺癌マーカーの分析方法。好ましくは、前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルが、前記生体試料中の補体Ｃ３全長分子の測定レベルに対する相対値であり、前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルが、補体Ｃ３全長分子の基準レベルに対する相対値である。
Description
本発明は、肺癌のスクリーニング、特に早期診断のために利用可能な肺癌マーカーに関する。
肺癌は、日本及び欧米で最も死亡者数の多い癌であり、難治性である。肺癌は、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌に分けることができ、肺癌患者全体の１５％が小細胞肺癌であり、残りの８５％が非小細胞肺癌である。さらに非小細胞肺癌は、病理組織学的に、腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌の３つのタイプに分けることができる。
喫煙は依然として癌の主要な危険因子である。しかしながら、近年、非喫煙者における肺癌（主に腺癌）が増加してきている。肺癌患者における５年後の生存率はわずか１５％程度である。これは、初期の段階で肺癌を検出できる方法がないことに大きく起因する。肺癌患者のうち初期ステージの疾患と診断されるケースはわずか１６％である。胸部Ｘ線、喀痰細胞診、及びヘリカルＣＴなどは肺癌検出のスクリーニングツールとして用いられてきているが、肺癌の死亡率の改善に関しては、ほとんど効果をもたらしていない。
一方、疾患の早期発見を達成し、臨床管理を向上させるために、肺癌用血清バイオマーカーが開発されてきている（非特許文献１）。それにもかかわらず、その臨床有用性は限られている（非特許文献２）。ＣＥＡ（carcinoembryonicantigen）及びＣＹＦＲＡ（cytokeratin 19 fragment）は、一部の小細胞癌患者の血清において存在量が増加している。そのため、これらは、疾患の状態をモニターしたり、治療に対する反応を評価したりと、臨床上有効である（非特許文献３）。
近年、プロテオミクス技術を用いて臨床検体におけるタンパク質の発現パターンをモニタリングすることによって、癌の診断に用いられる可能性のある新規バイオマーカーの発見が可能である。癌の病原の分子基盤及び癌関連タンパク質の特性の理解を深めるために、２Ｄ−ＤＩＧＥ（2 Dimensional Fluorescence Difference Gel Electrophoresis）、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）、タンパク質アレイ、ＩＣＡＴ（Isotope-coded affinitiy tags）、ｉＴＲＡＱ（Isobaric tags for relative and absolute quantification）及びＭｕｄＰＩＴ（Multidimensional Protein Identification Technology）などの種々のプロテオミクスツールが、種々の生体試料の差分解析に用いられてきている（非特許文献４）。生体試料としては、細胞可溶化物、血清及び血漿などが含まれている。同様に、疾患に特徴的に起こるタンパク質のプロセシング又は分解によって生じた断片もまた、バイオマーカーとなりうる有力な候補である（非特許文献５）。
他方、補体系成分として補体第３成分（Ｃ３）が知られている。ヒト補体Ｃ３は、α及びβ鎖がＳ−Ｓ結合で架橋された構造を持つ分子量約１８０ｋＤａの糖タンパク質で、補体系成分のうち血中含有量が最も高く、補体系の活性化に関与する。ヒト補体Ｃ３は、いくつかの癌種において、癌の進行に伴い血中存在量が増加することが知られている。例えば特開２００７−５１８８０号公報（特許文献１）においては、補体Ｃ３前駆体が膵臓癌のバイオマーカー候補として挙げられている。
ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Journal of the National Cancer Institute）、１９８８年、第８０巻、ｐ．９７−１０１
チェスト（Chest）、２００２年、第１２２巻、ｐ．１０３７−１０５７
ビー・エム・ビー・レポーツ（BMB Reports）、２００８年、第４１巻、ｐ．６１５−６２５
アンチキャンサー・リサーチ（Anticancer Research）、２００７年、第２７巻、ｐ．１２４７−１２５５
プロス・ワン（Plos One）、第４巻、ｅ番号７７３１、[online]、２００９年１１月５日、［平成２３年９月１５日検索］、インターネット＜URL: http://www.plosone.org/article/fetchArticle.action?articleURI=info:doi/10.1371/journal.pone.0007731＞
ＣＥＡ及びＣＹＦＲＡは、臨床上有効とされていても、肺癌の診断としての使用には適していない。なぜなら、ＣＥＡ及びＣＹＦＲＡは、喫煙や肺炎などの他の疾患及び他の種類の癌にも関連していることが知られており、さらには、初期ステージの肺癌を検出することができないからである。
また、プロテオミクス技術を用いて発見されたこれまでのバイオマーカー候補のうち、実際に肺癌のバイオマーカーとして実用された例は皆無である。特異性又は感度の不足が主要因であると考えられる。
さらに、補体Ｃ３前駆体が膵臓癌のバイオマーカー候補として知られていても、補体Ｃ３の血中量は免疫応答や肝機能障害など他の要因によって変動することも知られている。つまり、補体Ｃ３単独では癌の疾患を判定するためのバイオマーカーとして機能しないことが想定される。
既存の血中腫瘍マーカーは、感度及び特異性に乏しいため、精度良く肺癌を検出する効果が期待できない。一方、画像診断や各種精密検査はいずれも直接的ではあるが、信頼性が高いものほど侵襲性が高く、被検体に対する負担が大きい。そこで、本発明の目的は、被検体に対する負担が軽く且つ特異性及び感度に優れた、早期肺癌を検出する方法、及び肺癌診断キットを提供することにある。
本発明者らは、正常被検体の生体試料において一定量存在する補体Ｃ３ｄｇ断片が、早期肺癌被検体の生体試料においては著しく減少するという新規知見を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
補体Ｃ３ｄｇ分子を含む肺癌マーカー。
（２）
肺癌マーカーとしての補体Ｃ３ｄｇ分子の生体試料中におけるレベルを測定し、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程と、前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルに基づき、前記測定レベルの高低に関する評価を行う工程とを含む、肺癌マーカーの分析方法。
（３）
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルが、前記生体試料中の補体Ｃ３全長分子の測定レベルに対する相対値であり、
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルが、補体Ｃ３全長分子の基準レベルに対する相対値である、（２）に記載の方法。
（１）
補体Ｃ３ｄｇ分子を含む肺癌マーカー。
（２）
肺癌マーカーとしての補体Ｃ３ｄｇ分子の生体試料中におけるレベルを測定し、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程と、前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルに基づき、前記測定レベルの高低に関する評価を行う工程とを含む、肺癌マーカーの分析方法。
（３）
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルが、前記生体試料中の補体Ｃ３全長分子の測定レベルに対する相対値であり、
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルが、補体Ｃ３全長分子の基準レベルに対する相対値である、（２）に記載の方法。
（４）
前記生体試料を分離工程に供することによって、分離された前記補体Ｃ３ｄｇを得る工程をさらに含み、
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、少なくとも補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部をエピトープとする抗体を用いて前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定を行う、（２）又は（３）に記載の方法。
（５）
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって補体Ｃ３全長分子及び前記補体Ｃ３ｄｇ分子を同時に検出し、前記補体Ｃ３全長分子の検出量に対する前記補体Ｃ３ｄｇ分子の検出量を求める、（３）に記載の方法。
前記生体試料を分離工程に供することによって、分離された前記補体Ｃ３ｄｇを得る工程をさらに含み、
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、少なくとも補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部をエピトープとする抗体を用いて前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定を行う、（２）又は（３）に記載の方法。
（５）
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって補体Ｃ３全長分子及び前記補体Ｃ３ｄｇ分子を同時に検出し、前記補体Ｃ３全長分子の検出量に対する前記補体Ｃ３ｄｇ分子の検出量を求める、（３）に記載の方法。
（６）
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって前記補体Ｃ３ｄｇ分子の検出を行う、（２）に記載の方法。
上記（６）の方法においては、上記（５）におけるような補体Ｃ３全長分子の検出を行う必要がない。
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって前記補体Ｃ３ｄｇ分子の検出を行う、（２）に記載の方法。
上記（６）の方法においては、上記（５）におけるような補体Ｃ３全長分子の検出を行う必要がない。
（７）
抗補体Ｃ３ｄｇ抗体を含む、肺癌検出キット。
抗補体Ｃ３ｄｇ抗体を含む、肺癌検出キット。
本発明により、被検体に対する負担が軽く且つ特異性及び感度に優れた、早期肺癌を検出する方法、及び肺癌診断キットを提供することができる。
［１．肺癌マーカー］
本発明は、肺癌のマーカーを提供する。
本発明において肺癌のマーカーとして提供する補体Ｃ３ｄｇ分子は、肺癌患者及び健常者それぞれの血清サンプルから見出されたものである。具体的には、肺癌患者及び健常者の血清サンプルを、免疫除去、脱グリコシル化、トリプシン消化、及びＬＣ−ＭＡＬＤＩ ＭＳ測定に供し、測定結果について二次元マッピングを行い、ピークの定量、統計解析を行った後、レトロスペクティブＭＳ／ＭＳによるペプチド同定及びＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring）ならびにウェスタンブロッティング法による検証を行うことで見出された。
本発明は、肺癌のマーカーを提供する。
本発明において肺癌のマーカーとして提供する補体Ｃ３ｄｇ分子は、肺癌患者及び健常者それぞれの血清サンプルから見出されたものである。具体的には、肺癌患者及び健常者の血清サンプルを、免疫除去、脱グリコシル化、トリプシン消化、及びＬＣ−ＭＡＬＤＩ ＭＳ測定に供し、測定結果について二次元マッピングを行い、ピークの定量、統計解析を行った後、レトロスペクティブＭＳ／ＭＳによるペプチド同定及びＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring）ならびにウェスタンブロッティング法による検証を行うことで見出された。
本発明の肺癌マーカーである補体Ｃ３ｄｇ分子は、補体系成分である補体第３成分（Ｃ３）が、生体内で段階的に分解されて断片化することによって生じるものであり、具体的には、補体Ｃ３の９５５位から１３０３位までのアミノ酸配列からなる断片分子である。より具体的には、補体Ｃ３ｄｇ分子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるものである。さらに、補体Ｃ３ｄｇ分子の検出が行われるべき生体試料の由来元となる個体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加又はそれらの組合せを含む多型若しくはアレル変異を有するものである場合、補体Ｃ３ｄｇ分子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において当該多型又はアレル変異を有するアミノ酸配列である。
補体Ｃ３ｄｇ分子は、分子量が約３９ＫＤａである。より具体的には、配列番号１からの理論値としての分子量が３８，９０５Ｄａである。しかしながら、用いられる測定方法や測定機器によって、実測値は若干変動してもよい。例えば、質量分析法を用いる場合、補体Ｃ３ｄｇ分子の実測値は、前記理論値±０．５％（好ましくは±０．３％、より好ましくは±０．１％）であってよい。
補体Ｃ３ｄｇ分子は、肺癌患者、特に早期肺癌患者の生体試料において、健常者の生体試料に比べて含有量が有意に減少するものである。
従って、本発明の肺癌マーカー補体Ｃ３ｄｇ分子は、肺癌患者と健常者とを区別することを可能にする。特に、本発明の肺癌マーカーは、早期肺癌患者と健常者とを区別することを可能にする。本発明の肺癌マーカーは、肺癌のスクリーニング、特に肺癌の早期診断のために用いられることができる。
［２．肺癌マーカーの分析方法］
本発明は、補体Ｃ３ｄｇ分子を肺癌マーカーとして使用することにより生体試料を分析する方法を提供する。本発明の方法においては、補体Ｃ３ｄｇ分子が、肺癌患者体内で基準レベルに比べて発現量が抑制されるマーカーとして用いられる。基準レベルは、肺癌患者由来の生体試料における補体Ｃ３ｄｇ分子のレベルの対照たりうるレベルである。本発明の方法を用いて肺癌のスクリーニングや早期診断を行う場合においては、通常、基準レベルとして、健常者由来の生体試料における補体Ｃ３ｄｇ分子のレベルが採用される。
本発明は、補体Ｃ３ｄｇ分子を肺癌マーカーとして使用することにより生体試料を分析する方法を提供する。本発明の方法においては、補体Ｃ３ｄｇ分子が、肺癌患者体内で基準レベルに比べて発現量が抑制されるマーカーとして用いられる。基準レベルは、肺癌患者由来の生体試料における補体Ｃ３ｄｇ分子のレベルの対照たりうるレベルである。本発明の方法を用いて肺癌のスクリーニングや早期診断を行う場合においては、通常、基準レベルとして、健常者由来の生体試料における補体Ｃ３ｄｇ分子のレベルが採用される。
本発明の方法においては、分析に供されるべき生体試料を用意し、生体試料から、肺癌マーカーである補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する。肺癌マーカーの基準レベルに基づいて、測定レベルの高低に関する評価を行う。測定レベルが基準レベルより有意に低いとの評価をもって、生体試料の由来元である個体が肺癌に罹患している可能性が高いことの指標とすることができる。
分析に供されるべき生体試料としては、肺癌の罹患を識別すべき対象となる個人に由来する生体試料であればよい。例えば、組織試料及びその抽出物であってもよいし、血液、血清などの体液や、喀痰、尿などの排泄物であってもよい。
生体試料は、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルの取得前に、当業者によって適宜前処理が行われてよい。前処理の具体例としては、脱塩、カートリッジ精製、抗Ｃ３抗体を用いた精製、及び酵素消化（特にトリプシン消化）などが挙げられる。
生体試料は、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルの取得前に、当業者によって適宜前処理が行われてよい。前処理の具体例としては、脱塩、カートリッジ精製、抗Ｃ３抗体を用いた精製、及び酵素消化（特にトリプシン消化）などが挙げられる。
補体Ｃ３及びその断片の総量は、基本的に、健常者と肺癌患者との間で大きく変わるものではない。従って、本発明の方法においては、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを、絶対値として取得してよい。
しかしながら、より正確な分析を行う観点からは、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを、補体Ｃ３全長分子の測定レベルに対する相対値として取得することが好ましい。このことによって、補体Ｃ３及びその断片の総量の、個体間のわずかな変動に影響されることなく、肺癌患者と健常者との間の差異をより正確に見分けることができる。この場合、比較すべき基準レベルとしても、補体Ｃ３全長分子の基準レベルに対する相対値が採用される。
補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得するには、測定レベルを測定すべき補体Ｃ３ｄｇ分子を、Ｃ３全長分子や他のＣ３断片分子等と区別することができる方法であればよい。
しかしながら、より正確な分析を行う観点からは、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを、補体Ｃ３全長分子の測定レベルに対する相対値として取得することが好ましい。このことによって、補体Ｃ３及びその断片の総量の、個体間のわずかな変動に影響されることなく、肺癌患者と健常者との間の差異をより正確に見分けることができる。この場合、比較すべき基準レベルとしても、補体Ｃ３全長分子の基準レベルに対する相対値が採用される。
補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得するには、測定レベルを測定すべき補体Ｃ３ｄｇ分子を、Ｃ３全長分子や他のＣ３断片分子等と区別することができる方法であればよい。
補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する方法の一例としては、生体試料を分離工程に供して補体Ｃ３ｄｇを分離し、分離された補体Ｃ３ｄｇ分子を測定することが挙げられる。
補体Ｃ３ｄｇ分子の分離の方法としては、例えば分子ふるい効果に基づく方法が用いられうる。分子ふるい効果に基づく分離法は当業者に良く知られた方法であり、特に限定されないが、電気泳動法、限外濾過法やクロマトグラフィー法などを用いることができる。具体的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や、遠心力により低分子量タンパク質を濾過する方法や、高速液体クロマトグラフィー法を用いることが好ましい。
分離された補体Ｃ３ｄｇ分子の測定方法としては、生体特異的親和性に基づく検査や質量分析による定量法が挙げられる。
生体特異的親和性に基づく検査は当業者に良く知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、分離後の生体試料における補体Ｃ３ｄｇ分子に結合する抗体の存在を検出する。用いられる抗体としては、補体Ｃ３ｄｇと免疫複合体を形成可能な物質であればよく、従って少なくとも補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部をエピトープとする抗体であればよい。具体的には、抗補体Ｃ３ｄｇ抗体（すなわち補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部のみをエピトープとする抗体）であってもよいし、抗補体Ｃ３ポリクローナル抗体（すなわち補体Ｃ３全長分子に対するポリクローナル抗体で、補体Ｃ３ｄｇ分子と結合しうるもの）であってもよい。
生体特異的親和性に基づく検査は当業者に良く知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、分離後の生体試料における補体Ｃ３ｄｇ分子に結合する抗体の存在を検出する。用いられる抗体としては、補体Ｃ３ｄｇと免疫複合体を形成可能な物質であればよく、従って少なくとも補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部をエピトープとする抗体であればよい。具体的には、抗補体Ｃ３ｄｇ抗体（すなわち補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部のみをエピトープとする抗体）であってもよいし、抗補体Ｃ３ポリクローナル抗体（すなわち補体Ｃ３全長分子に対するポリクローナル抗体で、補体Ｃ３ｄｇ分子と結合しうるもの）であってもよい。
質量分析法も当業者に良く知られた方法であり、特に限定されるものではない。例えば、試料を機器に導入するための方式としては、高速液体クロマトグラフィーなどの分離装置への接続、ステンレスプレートへの試料の滴下、プローブを試料に浸漬させる方法などが挙げられる。導入された試料をイオン化させる方式としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法などが挙げられる。イオンの質量を測定する機器の種類としては、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）型などが単独または組み合わせて用いられる。当業者は、これら多様な選択肢の中から最適な組み合わせを任意に選択して質量分析を行ってよい。
上記の方法において、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを、補体Ｃ３全長分子の測定レベルに対する相対量として得る場合は、分離後の生体試料における補体Ｃ３全長分子も同様に測定する。補体Ｃ３全長分子の測定に用いる抗体は、補体Ｃ３全長分子と免疫複合体を形成可能な物質であればよく、補体Ｃ３ｄｇ分子の検出に用いられる抗体と同じものを用いることもできる。
補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する方法の他の一つとしては、例えば質量分析法を用いた方法が挙げられる。この方法は、上述の方法のような補体Ｃ３ｄｇの分離工程を必ずしも要しない点で好ましい。この方法において用いられる質量分析法としては特に限定されるものではないが、例えばMALDIイオン源と組み合わされたものが挙げられる。具体的には、MALDI-TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、MALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などが挙げられる。
この方法においては、生体試料を質量分析に供することによって、補体Ｃ３全長分子と補体Ｃ３ｄｇ分子とを同時に検出することができるため、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルは、補体Ｃ３全長分子の検出量（質量ピーク強度）に対する補体Ｃ３ｄｇ分子の検出量（質量ピーク強度）として取得することができる。但し、この方法においては、必ずしも補体Ｃ３全長分子が補体Ｃ３ｄｇ分子と同時に検出されていなければならないわけではなく、補体Ｃ３ｄｇ分子のみが検出される態様も許容される。
その他、質量分析に供すべき生体試料に既知濃度の標準試料を含ませておくことによって、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを、内部標準法により測定することもできる。
その他、質量分析に供すべき生体試料に既知濃度の標準試料を含ませておくことによって、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを、内部標準法により測定することもできる。
［３．肺癌検出キット］
本発明の肺癌検出キットは、抗補体Ｃ３ｄｇ抗体（すなわち補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部のみをエピトープとする抗体）を含む。
さらに、本発明の肺癌検出キットには、生体試料から補体Ｃ３ｄｇ分子を分離するためのアイテムをさらに含んでいてもよい。そのようなアイテムは、例えば上記の分子ふるい効果に基づく分離法を行う観点から当業者によって適宜決定されうるものであり、例えば、分離用担体、バッファー、染色液などが挙げられる。
本発明の肺癌検出キットは、抗補体Ｃ３ｄｇ抗体（すなわち補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部のみをエピトープとする抗体）を含む。
さらに、本発明の肺癌検出キットには、生体試料から補体Ｃ３ｄｇ分子を分離するためのアイテムをさらに含んでいてもよい。そのようなアイテムは、例えば上記の分子ふるい効果に基づく分離法を行う観点から当業者によって適宜決定されうるものであり、例えば、分離用担体、バッファー、染色液などが挙げられる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
健常者（Normal）１０症例、早期肺癌患者（Lung cancer stage I-II）１０症例、及び進行肺癌患者（Lung cancer stage IIIb-IV）１０症例の計３０症例を用い、以下の試験を行った。
３０症例の検体から採取された血清0.5μLをポリアクリルアミドゲル電気泳動用のサンプルバッファー（50mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glycerol, 50mM dithiothreitol, 1.6% SDS, 0.04% Coomassiebrilliant blue G-250）で100倍に希釈し、20μLをNuPAGE Bis-Tris 4-12%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。ゲル中で分離されたタンパク質をそのままPVDF（PolyVinylidene Difluoride）メンブレンへ転写し、抗補体C3ポリクローナル抗体（Sigma GW20073F）を用いたウェスタンブロッティングに供し、C3由来のタンパク質断片を可視化した。ウェスタンブロッティングによるC3dg断片の検出結果を図１に示す。図１において、Ｍは分子量サイズマーカーを表す。また、図１において検出されたC3dgの相対発現量（C3dg relative expression level）をプロットしたグラフを図２に示す。図２に示されるように、補体C3dgの血中濃度は、健常者（Normal）に比べ、肺癌（特に早期肺癌）症例において顕著に減少していることが示された（進行(Advanced)肺癌ではP<0.005、早期(Early)肺癌ではP<0.0006）。
３０症例の検体から採取された血清0.5μLをポリアクリルアミドゲル電気泳動用のサンプルバッファー（50mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glycerol, 50mM dithiothreitol, 1.6% SDS, 0.04% Coomassiebrilliant blue G-250）で100倍に希釈し、20μLをNuPAGE Bis-Tris 4-12%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。ゲル中で分離されたタンパク質をそのままPVDF（PolyVinylidene Difluoride）メンブレンへ転写し、抗補体C3ポリクローナル抗体（Sigma GW20073F）を用いたウェスタンブロッティングに供し、C3由来のタンパク質断片を可視化した。ウェスタンブロッティングによるC3dg断片の検出結果を図１に示す。図１において、Ｍは分子量サイズマーカーを表す。また、図１において検出されたC3dgの相対発現量（C3dg relative expression level）をプロットしたグラフを図２に示す。図２に示されるように、補体C3dgの血中濃度は、健常者（Normal）に比べ、肺癌（特に早期肺癌）症例において顕著に減少していることが示された（進行(Advanced)肺癌ではP<0.005、早期(Early)肺癌ではP<0.0006）。
Claims (7)
- 補体Ｃ３ｄｇ分子を含む肺癌マーカー。
- 肺癌マーカーとしての補体Ｃ３ｄｇ分子の生体試料中におけるレベルを測定し、補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程と、前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルに基づき、前記測定レベルの高低に関する評価を行う工程とを含む、肺癌マーカーの分析方法。
- 前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルが、前記生体試料中の補体Ｃ３全長分子の測定レベルに対する相対値であり、
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の基準レベルが、補体Ｃ３全長分子の基準レベルに対する相対値である、請求項２に記載の方法。 - 前記生体試料を分離工程に供することによって、分離された前記補体Ｃ３ｄｇを得る工程をさらに含み、
前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、少なくとも補体Ｃ３ｄｇ配列の全部又は一部をエピトープとする抗体を用いて前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定を行う、請求項２又は３に記載の方法。 - 前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって補体Ｃ３全長分子及び前記補体Ｃ３ｄｇ分子を同時に検出し、前記補体Ｃ３全長分子の検出量に対する前記補体Ｃ３ｄｇ分子の検出量を求める、請求項３に記載の方法。
- 前記補体Ｃ３ｄｇ分子の測定レベルを取得する工程において、質量分析法によって前記補体Ｃ３ｄｇ分子の検出を行う、請求項２に記載の方法。
- 抗補体Ｃ３ｄｇ抗体を含む、肺癌検出キット。
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