JPWO2011102444A1 - 誘導多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
項1、体細胞に核初期化因子を導入する工程を含む誘導多能性幹細胞の製造方法であって、前記核初期化因子がNANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を亢進させる核酸である、誘導多能性幹細胞の製造方法。
項2、前記核酸が、マイクロRNAである、項1に記載の製造方法。
項3、前記マイクロRNAが、分化を抑制させるマイクロRNA、未分化誘導を促進させるマイクロRNA、細胞間接着を制御するマイクロRNA、およびアポトーシスを抑制するマイクロRNAからなる群より選択される少なくとも1種である、項2に記載の製造方法。
項4、前記マイクロRNAが、miR-200、miR-302、およびmiR-369である項2又は3に記載の製造方法。
項5、項1〜4のいずれか1つに記載の方法によって製造される、誘導多能性幹細胞。
項6、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を亢進させる核酸を含む、誘導多能性幹細胞の誘導剤。
項7、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を亢進させる核酸を含む、誘導多能性幹細胞作製キット。
項8、下記の工程を含む、誘導多能性幹細胞を製造できる核酸のスクリーニング方法:
(1)体細胞に被験核酸を導入する工程、
(2)工程(1)の被験核酸が導入された細胞を培養する工程、および
(3)工程(2)の培養された細胞において誘導多能性幹細胞が誘導される場合は、該被験核酸を、誘導多能性幹細胞を製造できるとして核酸選択する工程。
項9、誘導多能性幹細胞が誘導されることを、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の、発現の亢進により検出する項8のスクリーニング方法。
項10、前記核酸が、マイクロRNAである、項8又は9に記載のスクリーニング方法。
本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法は、体細胞に核初期化因子を導入する工程を含む誘導多能性幹細胞の製造方法であって、前記核初期化因子がNANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を亢進させる核酸であることを特徴とするものである。以下、本発明の製造方法について詳述する。
A群:分化を抑制させるマイクロRNA、
B群:未分化誘導を促進させるマイクロRNA、
C群:細胞間接着を制御するマイクロRNA、および
D群:アポトーシスを抑制するマイクロRNA
から選択される少なくとも1種、好ましくは上記A群、B群、およびC群、又は、A群、B群、およびD群、から選択される少なくとも1種、さらに好ましくは上記A群、B群およびC群、又は、A群、B群、およびD群の組み合わせからなるマイクロRNAであるが、これに限定されるものではない。上記A群のマイクロRNAを体細胞で導入することで、分化の促進の抑制などによって、当該マイクロRNAを導入した体細胞の分化多能性をより活性化すると考えられる。上記B群のマイクロRNAを体細胞で導入することで、未分化状態の促進によって、当該マイクロRNAを導入した体細胞が体細胞の分化多能性をより活性化すると考えられる。上記C群のマイクロRNAを体細胞へ導入することで、接触阻止(contact inhibition)の解除などによって、当該マイクロRNAを導入した体細胞の自己増殖能をより活性化すると考えられる。上記D群のマイクロRNAを体細胞へ導入することで、当該マイクロRNAを導入した体細胞はアポトーシスにより細胞死が抑制され、相対的に細胞の生存活性が高まり、体細胞の自己増殖能をより活性化すると考えられる。すなわち、上記A群、B群、C群およびD群のマイクロRNAが有する体細胞の分化多能性および/又は自己増殖能をより活性化する機能によって、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子、好ましくはNANOG遺伝子および/又はOCT3/4遺伝子、より好ましくはNANOG遺伝子の発現の亢進が実現されると考えられる。
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B群:miR-17、miR-369、など;
C群:miR-200など;および
D群:miR-17、miR-21など。
A群、B群、D群を含むマイクロRNAとして、miR-302、miR-367、miR-369、miR-370、miR-17、miR-21およびmiR-154の組み合わせ、並びに
A群、B群およびC群の組み合わせからなるマイクロRNAとして、miR-302、miR-369、およびmiR-200の組合せ、またはmiR-294、miR-302、miR-369およびmiR-200の組み合わせなどが例示されるが、これらに限定されるものではない。
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miR-374、has-miR-374a(ヒト、miRBase accession number MIMAT0000727)、mmu-374b(ヒト、miRBase accession number MIMAT0004955)、mmu-miR-374, (マウス、miRBase accession number MIMAT0003727);
miR-376(別名miR-368):hsa-miR-376c(ヒト、miRBase accession number MIMAT0000720)、mmu-miR-376c(マウス、miRBase accession number MIMAT0003183);
miR-424:has-miR-424(ヒト、miRBase accession number MIMAT0001341)。
前述するように、核初期化因子を導入する工程を含む誘導多能性幹細胞の製造方法において、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子、好ましくはNANOG遺伝子および/又はOCT3/4遺伝子、より好ましくはNANOG遺伝子の発現を亢進させる核酸を、核初期化因子として体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞を調製することができる。従って、本発明は、さらに、上記核酸を含む誘導多能性幹細胞の誘導剤および該誘導剤を製造するための上記核酸の使用をも提供する。
さらに、本発明は、下記の工程を含む、誘導多能性幹細胞を製造できる低分子量RNAのスクリーニング方法をも提供する:
(1)体細胞に被験核酸を導入する工程、
(2)工程(1)の被験核酸が導入された細胞を培養する工程、および
(3)工程(2)の培養された細胞において誘導多能性幹細胞が誘導される場合は、該被験低分子量RNAを誘導多能性幹細胞を製造できる核酸として選択する工程。
マウス脂肪幹細胞(ABSC)を初期化して、誘導多能性幹細胞を作製する実験を行った。
Nanog-GFPマウスからマウス脂肪幹細胞(ABSC)株を非特許文献4に記載の方法に従い樹立し、これを培養した。Lipofectamine2000を5μl/ml、並びに下記の組み合わせの化学合成したマイクロRNAを無血清培地で希釈した溶液に、前記ABSCを2×105細胞/mlとなるよう混合し、マクロRNAのトランスフェクションを行った:
実施例1:mmu-miR-17(配列番号1)、mmu-miR-21(配列番号2)、mmu-miR-154(配列番号3)、mmu-miR-302a(配列番号5)、mmu-miR-302b(配列番号6)、mmu-miR-302c(配列番号7)、mmu-miR-302d(配列番号8)、mmu-miR-367(配列番号10)、mmu-miR-369-5p(配列番号12)およびmmu-miR-370(配列番号13);
実施例2:mmu-miR-200c(配列番号4)、mmu-miR-294(配列番号5)、mmu-miR-302a(配列番号5)、mmu-miR-302b(配列番号6)、mmu-miR-302c(配列番号7)、mmu-miR-302d(配列番号8)、mmu-miR-369-3p(配列番号11)およびmmu-miR-369-5p(配列番号12);
実施例3:mmu-miR-200c(配列番号4)、mmu-miR-302a(配列番号6)、mmu-miR-302b(配列番号7)、mmu-miR-302c(配列番号8)、mmu-miR-302d(配列番号9)、mmu-miR-369-3p(配列番号11)およびmmu-miR-369-5p(配列番号12)。
実施例1および2において、マイクロRNA導入後10日目において、Nanog-GFPの発現が検出される細胞が観察された。また、Nanog-GFPの発現が検出される細胞は、多能性幹細胞特有の形態である、球状の細胞塊(胚様体)を形成する細胞が観察された(図1および2)。
実施例3の誘導多能性幹細胞がES細胞と同等の性質を有することを、マーカータンパク質の免疫染色実験により検証した。検出対象のマーカータンパク質として、ES細胞などの多能性を有する細胞が特異的に発現することが知られている、SSEA1抗原およびOct3/4タンパク質を用いた。
実施例3の細胞を、免疫染色法により固定した。次に、固定試料を、抗SSEA1抗体(MAB4301, Millpore社)を10μg/ml又は抗マウスOct3/4抗体(MAB4305, Millpore社)を20μg/mlに希釈したリン酸緩衝液中で、4℃にて24時間インキュベートし、さらに洗浄後、二次抗体としてヤギ由来Alexa546標識抗マウスIgG抗体(Invitrogen社)をリン酸緩衝液で500ng/mlに希釈したリン酸緩衝液中で、37℃にて30分間インキュベートし抗体染色試料を作製した。抗体染色試料をKeyence社All-in oneタイプ蛍光顕微鏡システムを用いて観察した。
図3に示すとおり、図3下図中央部のコロニーにおいてマウスSSEA1抗原の発現が確認された。また、図4に示すとおり、図4下図中央部のコロニーにおいてマウスOct3/4タンパク質の発現が確認された。従って、本発明の方法によって、ES細胞と同様の性質を示す細胞が作製できることが明らかとなった。
実施例3の誘導多能性幹細胞がES細胞と同等の性質を有することを、マーカー遺伝子の発現量の測定により検証した。測定対象のマーカー遺伝子として、ES細胞などの多能性を有する細胞が特異的に発現することが知られている、Nanog遺伝子およびOct3/4遺伝子を用いた。
実施例3の細胞、10%のFBSを加えたD-MEM培地で培養したマイクロRNAを導入しない対照のマウス脂肪幹細胞、および実施例3の細胞と同様にES細胞培養環境で培養したマウスES細胞(R-CMTI-1A, Millpore社)について、マイクロRNAを導入後25日目の実施例3の体細胞、またはこれに相当する期間培養を行った対照のマウス脂肪幹細胞およびマウスES細胞を回収した。それぞれの細胞より、mirVana miRNA Isolation Kit(AM1560, Ambion社)を用いて同キットに添付の手順書に従ってtotal RNAの抽出を行い、それぞれの細胞より約2μgのtotal RNAを抽出した。
(1)マウスNanog遺伝子:
Nanog-S(配列番号21):5’- TTCTTGCTTACAAGGGTCTGC -3’
Nanog-AS(配列番号22):5’- CAGGGCTGCCTTGAAGAG -3’
(2)マウスOct3/4遺伝子
Oct3/4-S(配列番号23):5’- CACGAGTGGAAAGCAACTCA -3’
Oct3/4-AS(配列番号24):5’- GCTTTCATGTCCTGGGACTC -3’
(3)マウスGADPH遺伝子:
Gapdh-S(配列番号25):5’- TGTCCGTCGTGGATCTGAC -3’
Gapdh-AS(配列番号26):5’- CCTGCTTCACCACCTTCTTG -3’
図5に示すとおり、実施例3の誘導多能性幹細胞は、ES細胞と同様にマウスNanog遺伝子およびマウスOct3/4遺伝子を発現していることが確認された。従って、本発明の方法によって、ES細胞と同様の性質を示す細胞が作製できることが明らかとなった。
実施例3の誘導多能性幹細胞の腫瘍形成率を評価した。
実施例3の誘導多能性幹細胞についてマイクロRNA導入後30日目のもの、およびマイクロRNAを導入する以外は同様の培養を行った対照細胞それぞれ1×106細胞を、10%FBSを含むD-MEM100μlに希釈し、これをNOD/SCIDマウスの側腹部の皮下に注入し、マウスを4週間飼育した後に、腫瘍形成能を評価した。
非特許文献3において腫瘍形成が報告される皮下注入後4週間においても、実施例1で作製した誘導多能性幹細胞および対照細胞腫瘍を注入したマウスにおいて、腫瘍の形成が認められなかった(マイクロRNA導入細胞は6例中0例、対照細胞は6例中0例)。
ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を初期化して、誘導多能性幹細胞を作製する実験を行った。
ヒト皮膚線維芽細胞(Human dermal fibroblasts(HDF)(CA106K05a, 東洋紡社))をD-MEM +10%FBS培地で培養した。上記実施例1〜3と同様の手順で、化学合成したマイクロRNAのhsa-miR-200c(配列番号13)、hsa-miR-302a(配列番号14)、hsa-miR-302b(配列番号15)、hsa-miR-302c(配列番号16)、hsa-miR-302d(配列番号17)、hsa-miR-369-3p(配列番号18)、hsa-miR-369-5p(配列番号19)およびhsa-miR-369-3p(配列番号20)をトランスフェクトした。
図6下図に示す通り、対照のHDF細胞(図5上図)の形状とは明確に異なる、多能性幹細胞特有の形態である、球状の細胞塊(胚様体)を形成する細胞が観察された。従って、本発明の方法によって、ヒト線維芽細胞を初期化して、誘導多能性幹細胞を作製できることが明らかとなった。
配列番号14〜20は、hsa-miR-200c、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pの成熟したマイクロRNAの塩基配列を示す。
配列番号21および22は、マウスNanog遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号23および24は、マウスOct3/4遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号25および26は、マウスGADPH遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
Claims (10)
- 体細胞に核初期化因子を導入する工程を含む誘導多能性幹細胞の製造方法であって、
前記核初期化因子がNANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を亢進させる核酸である、誘導多能性幹細胞の製造方法。 - 前記核酸が、マイクロRNAである、請求項1に記載の製造方法。
- 前記マイクロRNAが、分化を抑制させるマイクロRNA、未分化誘導を促進させるマイクロRNA、細胞間接着を制御するマイクロRNA、およびアポトーシスを抑制するマイクロRNAからなる群より選択される少なくとも1種のマイクロRNAを含むマイクロRNAである、請求項2に記載の製造方法。
- 前記マイクロRNAが、miR-200、miR-302、およびmiR-369である請求項2又は3に記載の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法によって製造される、誘導多能性幹細胞。
- NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を亢進させる核酸を含む、誘導多能性幹細胞の誘導剤。
- NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を亢進させる核酸を含む、誘導多能性幹細胞作製キット。
- 下記の工程を含む、誘導多能性幹細胞を製造できる核酸のスクリーニング方法:
(1)体細胞に被験核酸を導入する工程、
(2)工程(1)の被験核酸が導入された細胞を培養する工程、および
(3)工程(2)の培養された細胞において誘導多能性幹細胞が誘導される場合は、該被験核酸を、誘導多能性幹細胞を製造できる核酸として選択する工程。 - 誘導多能性幹細胞が誘導されることを、NANOG遺伝子、SOX2遺伝子、OCT3/4遺伝子、KLF4遺伝子、LIN28遺伝子、およびc-MYC遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の、発現の亢進により検出する請求項8のスクリーニング方法。
- 前記核酸が、マイクロRNAである、請求項8又は9に記載のスクリーニング方法。
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