JP2016123339A - 多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物 - Google Patents
多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016123339A JP2016123339A JP2014266696A JP2014266696A JP2016123339A JP 2016123339 A JP2016123339 A JP 2016123339A JP 2014266696 A JP2014266696 A JP 2014266696A JP 2014266696 A JP2014266696 A JP 2014266696A JP 2016123339 A JP2016123339 A JP 2016123339A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mir369
- pluripotent stem
- stem cell
- mature
- quality
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title claims description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 2
- 108091057188 miR-369 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 5
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 4
- QHPQWRBYOIRBIT-UHFFFAOYSA-N 4-tert-butylphenol Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 QHPQWRBYOIRBIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 3
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 2
- 101150061264 FXR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 2
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 229940127084 other anti-cancer agent Drugs 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 241000288950 Callithrix jacchus Species 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101001091538 Homo sapiens Pyruvate kinase PKM Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100034911 Pyruvate kinase PKM Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000006682 Warburg effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 229940000425 combination drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- -1 corrigents Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 101150042537 dld1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001368 germline stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000441 neoplastic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037423 splicing regulation Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Abstract
【課題】多能性幹細胞の品質を簡易に検証する方法を提供する。【解決手段】多能性幹細胞の品質を評価する方法であって、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法。【選択図】なし
Description
本発明は、多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物に関する。
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ 細胞）その他の多能性幹細胞の、医薬や創薬モデルとしての応用が期待されている。
しかしながら、その作製プロセスは複雑であり、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で満足な細胞が高効率で得られるとは限らない。
したがって、これらの多能性幹細胞を利用するにあたっては、品質を検証することが不可欠となるが、簡易に検証する方法は未だ確立されていない。
本発明は、多能性幹細胞の品質を簡易に検証する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ｍｉＲ３６９が、胎生期において発現上昇して、スプライシング因子であるＨＮＲＮＰＡ２／Ｂ１（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２／Ｂ１）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲに結合し、そのタンパク質発現を亢進する役割を果たしていることを初めて見出した。ＨＮＲＮＰＡ２／Ｂ１が発現上昇すると、オルタナティブスプライシング調節によりピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）アイソフォームのうちＰＫＭ２のタンパク質発現量が相対的に上昇する。これにより、正常酸素分圧下におけるにもかかわらず、細胞内の代謝形態が、好気的解糖経路から嫌気的解糖経路に変換する（いわゆるＷａｒｂｕｒｇ効果）。
また、本発明者らは、ｍｉＲ３６９をノックアウトした非ヒト動物が、組織の変性疾患を呈することを見出した。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ３６９を投与することにより、腫瘍の転移を抑制できることを見出した。
本発明者らは、かかる知見に基づきさらなる試行錯誤を重ねることにより本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
項１．
多能性幹細胞の品質を評価する方法であって、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法。
項２．
成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む、多能性幹細胞の品質評価キット。
項３．
前記手段が、成熟ｍｉＲ３６９に対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、項２記載のキット。
項４．
前記ポリヌクレオチドが、支持体に固定されたものである、項３記載のキット。
項５．
ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する、非ヒトノックアウト動物。
項６．
ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する、抗がん剤。
項１．
多能性幹細胞の品質を評価する方法であって、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法。
項２．
成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む、多能性幹細胞の品質評価キット。
項３．
前記手段が、成熟ｍｉＲ３６９に対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、項２記載のキット。
項４．
前記ポリヌクレオチドが、支持体に固定されたものである、項３記載のキット。
項５．
ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する、非ヒトノックアウト動物。
項６．
ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する、抗がん剤。
本発明によれば、多能性幹細胞の品質を簡易に検証できる。また、組織の変性疾患を呈する非ヒトノックアウト動物を提供できる。さらに、本発明によれば、腫瘍を抑制する手段を提供できる。
１． 多能性幹細胞の品質を評価する方法
本発明の、多能性幹細胞の品質を評価する方法は、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法である。
本発明の、多能性幹細胞の品質を評価する方法は、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法である。
被検多能性幹細胞は、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、人工多能性幹細胞様細胞（ｉＰＳ様細胞）、
胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖系列幹細胞（ｍＧＳ細胞）、単為発生幹細胞、核移植幹細胞及びがん幹細胞等が含まれる。
胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖系列幹細胞（ｍＧＳ細胞）、単為発生幹細胞、核移植幹細胞及びがん幹細胞等が含まれる。
また、さらに、被検多能性幹細胞には、体性幹細胞も含まれる。
被検多能性幹細胞としては、特に、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞が好ましい。
発現量の測定方法は、特に限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ及びノーザンハイブリダイゼーション等が挙げられる。検出時間が短い点、及び類似配列を識別できる点において、リアルタイムＰＣＲが特に好ましい。
本発明者らは、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が少ないと、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で不十分であることを見出した。したがって、特に限定されないが、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で満足な細胞を基準として設定して、その発現量を基準発現量とすることができる。このときの基準発現量を、高品質基準量と呼ぶ。
また、それとは反対に、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で不十分な細胞を基準として設定して、その発現量を基準発現量とすることもできる。このときの基準発現量を、低品質基準量と呼ぶ。
さらに、上記の高品質基準量と低品質基準量の間の値を基準発現量とすることができる。このときの基準発現量を、中間基準量と呼ぶ。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量と基準発現量との比較による品質の評価としては、特に限定されないが、以下の態様が挙げられる。
（１）高品質基準量との比較
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、高品質基準量以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、高品質基準量以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、高品質基準量の９０％以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、高品質基準量の８０％以上であるときに高品質であると評価する。
（２）低品質基準量との比較
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、低品質基準量の２００％以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、低品質基準量の２００％以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、低品質基準量の１９０％以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、低品質基準量の１８０％以上であるときに高品質であると評価する。
（３）中間基準量との比較
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、中間基準量の２０％以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、中間基準量の２０％以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、中間基準量の３０％以上であるときに高品質であると評価する。
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、中間基準量の４０％以上であるときに高品質であると評価する。
特に限定されないが、本発明の評価方法は、以下の工程（１）及び（２）を含む。
（１）被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を測定する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた測定値を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する工程。
（２）前記工程（１）で得られた測定値を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する工程。
２． 多能性幹細胞の品質評価キット
本発明の、多能性幹細胞の品質評価キットは、成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む。
本発明の、多能性幹細胞の品質評価キットは、成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む。
特に限定されないが、リアルタイムＰＣＲにより成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定する場合、以下のポリヌクレオチドを使用する。
ループＲＴプライマー
フォワード・プライマー
リバース・プライマー
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ
ループＲＴプライマー
フォワード・プライマー
リバース・プライマー
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ
また、成熟ｍｉＲ３６９と相補的な捕捉用核酸を固定化した基板を用い、成熟ｍｉＲ３６９をその捕捉用核酸に結合させた上で、定量解析を行ってもよい。このとき、多能性幹細胞の品質評価キットは、成熟ｍｉＲ３６９と相補的な捕捉用核酸を固定化した基板を含む。定量解析の方法は、特に限定されないが、例えば、質量分析、定量的ＰＣＲ法、及びＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。
３．非ヒトノックアウト動物
本発明の非ヒトノックアウト動物は、ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する。
本発明の非ヒトノックアウト動物は、ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する。
組織の変性疾患は、特に限定されず、神経変性疾患及び筋変性疾患が含まれる。特に限定されないが、筋ジストロフィー等が含まれる。
本発明の非ヒトノックアウト動物は、非ヒト動物の生体内に存在するｍｉＲ３６９の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように破壊されているか、又は組み換えがなされている非ヒト動物である。
本発明の非ヒトノックアウト動物は、特に限定されないが、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム、ＴＥＴ−ＯＦＦシステム及びＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９システム等を使用することにより作出することができる。
非ヒト動物は、特に限定されないが、マウス、ラット、カニクイザル及びコモンマーモセット等が挙げられる。
４．抗がん剤
本発明の抗がん剤は、ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する。
本発明の抗がん剤は、ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する。
上記遺伝子治療ベクターは、適当なベクターにアンチｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、得ることができる。
ベクターは、非ウイルスベクターであってもよいし、ウイルスベクターであってもよい。
本発明の抗がん剤には、抗がん剤の増強剤も含まれる。ｍｉＲ３６９を別の抗がん剤と併用投与することにより、その抗がん剤の薬理作用が増強される。
具体的には、特に限定されないが、併用する抗がん剤としては、ＤＮＡ合成阻害、細胞分裂阻害、ＤＮＡ損傷、代謝拮抗及び栄養阻害からなる群より選択される少なくとも一種の作用を有する抗がん剤を用いることができる。特に、ＤＮＡ損傷作用又は代謝拮抗作用を有する抗がん剤が好ましい。
特に限定されないが、ＤＮＡ損傷作用を有する抗がん剤としては、例えば、シスプラチン等の白金製剤等が挙げられる。
代謝拮抗剤としては、特に限定されないが、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等が挙げられる。
併用する抗がん剤との投与量の割合は、抗がん剤の種類に応じて適宜設定することができる。
本発明の抗がん剤の増強剤は、他の抗がん剤と併用投与するために用いられるものであってもよいし、他の抗がん剤と一体として製剤化された配合剤の中の有効成分であってもよい。
本発明の抗がん剤は、治療有効量のｍｉＲ３６９又は遺伝子治療ベクターを含有し、さらに必要に応じて賦形剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、矯味剤、懸濁化剤、乳化剤、着香剤、溶解補助剤、着色剤及び粘稠剤等を含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
１．ｍｉＲ３６９のリプログラミングへの影響
正常細胞へ山中４因子（Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃ）を導入し、さらにｍｉＲ３６９を導入することで細胞のリプログラミング実験を行いリプログラミング効率の検討を行った。
正常細胞へ山中４因子（Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃ）を導入し、さらにｍｉＲ３６９を導入することで細胞のリプログラミング実験を行いリプログラミング効率の検討を行った。
その結果、ｍｉＲ３６９導入群では対照群（山中４因子のみを導入）に比べリプログラミング効率が２倍程度上昇した（図１）。また、山中４因子にａｎｔｉ−ｍｉＲ３６９を導入するとリプログラミング効率が半分程度まで減少した。
２．ｍｉＲ３６９のターゲット探索
山中４因子（Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃ）を導入しさらにｍｉＲ３６９を導入した細胞からタンパク質を抽出し２次元電気泳動を行った。対象群(山中４因子のみを導入)に比べタンパク質量に変化のあるスポットを刳り貫き、質量分析系を用いてタンパク質の同定を行った。
山中４因子（Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃ）を導入しさらにｍｉＲ３６９を導入した細胞からタンパク質を抽出し２次元電気泳動を行った。対象群(山中４因子のみを導入)に比べタンパク質量に変化のあるスポットを刳り貫き、質量分析系を用いてタンパク質の同定を行った。
その結果、スプライシングファクターとして知られるＨｎＲＮＰＡ２、ＰＴＢＰ及び解糖系の酵素として知られるＰＫＭのタンパク質量がｍｉＲ３６９導入によって増加することが明らかとなった。
これらのタンパク質量制御がｍｉＲ３６９による直接効果であることを確認するためＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の３’ＵＴＲ領域をこれらＨｎＲＮＰＡ２、ＰＴＢＰ及びＰＫＭの３’ＵＴＲ領域に組み替えたベクターを作成し、細胞に導入しルシフェラーゼアッセイを行った。
その結果、ＨｎＲＮＰＡ２及びＰＴＢＰの３’ＵＴＲを持つベクター導入群においてｍｉＲ３６９強制発現によりルシフェラーゼ発光量が上昇した（図１）。以上のことからＨｎＲＮＰＡ２及びＰＴＢＰがｍｉＲ３６９の直接のターゲットであると考えられる。
３．ｍｉＲ３６９の機能検討
ｍｉＲ３６９と結合し複合体を形成するタンパク質を同定するため、免疫沈降実験を行った。
ｍｉＲ３６９と結合し複合体を形成するタンパク質を同定するため、免疫沈降実験を行った。
Ｄｉｃｅｒノックアウト細胞へｍｉＲ３６９を導入し抗Ｄｉｃｅｒ抗体を用いて免疫沈降実験を行った。Ｄｉｃｅｒタンパク質と共沈してきたタンパク質を質量分析系又はウエスタンブロッティング法を用いて同定した結果Ｆｘｒ１及びＨｎＲＮＰＡ２タンパク質が複合体形成に関与していることが明らかとなった（図３）。
以上のことからｍｉＲ３６９はＤｉｃｅｒ及びＦｘｒ１、ＨｎＲＮＰＡ２と複合体を形成しターゲットのｍＲＮＡに結合していることが示唆された。
４．ｍｉＲ３６９ノックアウトマウスの表現型解析
図４に示したようにＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いてｍｉＲ３６９ノックアウトマウスを作成しその表現型解析を行った。
図４に示したようにＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いてｍｉＲ３６９ノックアウトマウスを作成しその表現型解析を行った。
ｍｉＲ３６９ＫＯマウスの血漿を用いて血液検査を行ったところクレアチンキナーゼの量が野生型に比べ１００倍以上上昇しており（図５）、ｍｉＲ３６９ノックアウトマウスが筋ジストロフィーに似た病態をとることが明らかとなった。
５．ｍｉＲ３６９の癌細胞への効果
ｍｉＲ３６９の癌細胞への効果を検討するために大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ＤＬＤ１）への導入実験を行った。
ｍｉＲ３６９の癌細胞への効果を検討するために大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ＤＬＤ１）への導入実験を行った。
ＭＴＴアッセイを行った結果、ｍｉＲ３６９を導入した細胞は導入していない細胞に比べて既存の抗癌剤（５−ＦＵおよびＣＤＤＰ）への感受性が増し、またＰｒｏｌｉｆｅａｔｉｏｎアッセイにより細胞の増殖能も低下することが明らかとなった。
治療効果の検討のために免疫不全マウスの皮下に大腸癌細胞株を移植し尾静脈からｍｉＲ３６９の投与を行った。その結果非治療群に比べ癌の増殖が遅くなり、治療に一定の効果が見られた。
Claims (6)
- 多能性幹細胞の品質を評価する方法であって、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法。
- 成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む、多能性幹細胞の品質評価キット。
- 前記手段が、成熟ｍｉＲ３６９に対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項２記載のキット。
- 前記ポリヌクレオチドが、支持体に固定されたものである、請求項３記載のキット。
- ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する、非ヒトノックアウト動物。
- ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する、抗がん剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014266696A JP2016123339A (ja) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | 多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014266696A JP2016123339A (ja) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | 多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016123339A true JP2016123339A (ja) | 2016-07-11 |
Family
ID=56356632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014266696A Pending JP2016123339A (ja) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | 多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2016123339A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016213854A (ja) * | 2010-08-17 | 2016-12-15 | エム アンド ケー ホールディングス インコーポレイテッド | イントラ予測モード符号化方法 |
| JP2018117582A (ja) * | 2017-01-26 | 2018-08-02 | 日本メナード化粧品株式会社 | 幹細胞の品質を評価する方法及び幹細胞の品質評価用キット |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011102444A1 (ja) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | 国立大学法人大阪大学 | 誘導多能性幹細胞の製造方法 |
| WO2013188679A1 (en) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | Stemgent, Inc. | Methods of preparing pluripotent stem cells |
-
2014
- 2014-12-26 JP JP2014266696A patent/JP2016123339A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011102444A1 (ja) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | 国立大学法人大阪大学 | 誘導多能性幹細胞の製造方法 |
| WO2013188679A1 (en) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | Stemgent, Inc. | Methods of preparing pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CELL STEM CELL, vol. Vol.8, JPN6018044868, 3 June 2011 (2011-06-03), pages 633 - 638 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016213854A (ja) * | 2010-08-17 | 2016-12-15 | エム アンド ケー ホールディングス インコーポレイテッド | イントラ予測モード符号化方法 |
| JP2018117582A (ja) * | 2017-01-26 | 2018-08-02 | 日本メナード化粧品株式会社 | 幹細胞の品質を評価する方法及び幹細胞の品質評価用キット |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lange et al. | AMPA receptor antagonist perampanel affects glioblastoma cell growth and glutamate release in vitro | |
| Dodd et al. | mTORC1 drives HIF-1α and VEGF-A signalling via multiple mechanisms involving 4E-BP1, S6K1 and STAT3 | |
| Chudnovsky et al. | ZFHX4 interacts with the NuRD core member CHD4 and regulates the glioblastoma tumor-initiating cell state | |
| US11912994B2 (en) | Methods for reactivating genes on the inactive X chromosome | |
| Marqués-Torrejón et al. | LRIG1 is a gatekeeper to exit from quiescence in adult neural stem cells | |
| Rousseaux et al. | Depleting Trim28 in adult mice is well tolerated and reduces levels of α-synuclein and tau | |
| Alrfaei et al. | microRNA-100 targets SMRT/NCOR2, reduces proliferation, and improves survival in glioblastoma animal models | |
| Li et al. | Allosteric inhibition of ubiquitin-like modifications by a class of inhibitor of SUMO-activating enzyme | |
| Zhang et al. | The renewed battle against RAS-mutant cancers | |
| Salguero-Aranda et al. | STAT6 knockdown using multiple siRNA sequences inhibits proliferation and induces apoptosis of human colorectal and breast cancer cell lines | |
| WO2015120197A1 (en) | Rna editing biomarkers for diagnosis, pharmacological screening and prognostication in cancer | |
| Lv et al. | Neuropeptide Y1 receptor inhibits cell growth through inactivating mitogen-activated protein kinase signal pathway in human hepatocellular carcinoma | |
| Doldi et al. | MicroRNAs as epigenetic determinants of treatment response and potential therapeutic targets in prostate cancer | |
| Tsubaki et al. | Contributions of MET activation to BCR-ABL1 tyrosine kinase inhibitor resistance in chronic myeloid leukemia cells | |
| Li et al. | BCL6 is regulated by the MAPK/ELK1 axis and promotes KRAS-driven lung cancer | |
| Braoudaki et al. | MicroRNAs in pediatric central nervous system embryonal neoplasms: the known unknown | |
| JP2016123339A (ja) | 多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物 | |
| Liu et al. | Silencing KIF18B enhances radiosensitivity: identification of a promising therapeutic target in sarcoma | |
| Rossi et al. | Lactate is a potential promoter of tamoxifen resistance in MCF7 cells | |
| Li et al. | MiR-145 mediates zebrafish hepatic outgrowth through progranulin a signaling | |
| Hu et al. | Advances in the research of the mechanism of secondary resistance to imatinib in gastrointestinal stromal tumors | |
| Mika et al. | Epigenetic changes at the Birc5 promoter induced by YM155 in synovial sarcoma | |
| Rogava et al. | Loss of Pip4k2c confers liver-metastatic organotropism through insulin-dependent PI3K-AKT pathway activation | |
| Yan et al. | Combined in vitro/in vivo genome-wide CRISPR screens in triple negative breast cancer identify cancer stemness regulators in paclitaxel resistance | |
| Rialdi et al. | WNTinib is a multi-kinase inhibitor with specificity against β-catenin mutant hepatocellular carcinoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171222 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171222 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181113 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20190521 |