JPWO2011067983A1 - 脂肪細胞シート、その三次元構造体、及びそれらの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.脂肪細胞を含有する細胞シートを含む、心臓疾患治療用移植材料。
項2.前記細胞シートの厚さが50μm以上である、項1記載の心臓疾患治療用移植材料。
項3.前記脂肪細胞シートのアディポネクチン分泌能が1日当たり3×10−14g/cell以上である、項1または2のいずれか1項記載の心臓疾患治療用移植材料。
項4.前記細胞シートが線維化抑制機能、血管新生機能、アトポーシス抑制機能、および抗炎症機能からなる群より選択される少なくとも1種の機能を有する、項1〜3のいずれか1項記載の心臓疾患治療用移植材料。
項5.前記細胞が脂肪組織由来線維芽細胞を分化誘導したものである、項1〜4のいずれか1項記載の心臓疾患治療用移植材料。
項6.細胞シートを三次元構造体の状態で含む、項1〜5のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項7.複数層の細胞シートを積層した状態で含む、項1〜6のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項8.前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を50%以上含むものである、項1〜7のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項9.前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を60%以上含むものである、項1〜7のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項10.前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を70%以上含むものである、項1〜7のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項11.前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を80%以上含むものである、項1〜7のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項12.前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を90%以上含むものである、項1〜7のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項13.前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を95%以上含むものである、項1〜7のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項14.前記細胞シートのうち少なくとも一層が筋芽細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される少なくとも1種の細胞をさらに含むものである、項1〜13のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項15.前記筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、項14記載の心臓疾患治療用移植材料。
項16.前記間葉系幹細胞が脂肪組織由来のものである、項14または15のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項17.スキャフォルドを含まない、項1〜16のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項18.脂肪細胞が由来する個体に対して適用される、項1〜17のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項19.さらにサイトカインまたは増殖因子を含む、項1〜18のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項20.前記心臓疾患が、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害である、項1〜19のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項21.前記細胞シートが、細胞培養支持体から単離されたものである、項1〜20のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項22.脂肪細胞を含有する細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料を製造する方法であって、スキャフォルドを用いず、かつ
a)水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体上で、脂肪細胞を含有する細胞群を培養液中で培養する工程;
b)培養液の温度を、該上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程;および
c)細胞群を、細胞培養支持体から細胞シートとして剥離する工程
を含む方法。
項23.工程c)の前に、
d)培養液にアスコルビン酸またはその誘導体を加える工程
をさらに含む、項22記載の方法。
項24.タンパク質分解酵素で処理する工程を含まない、項22または23のいずれか1項に記載の方法。
項25.前記温度応答性高分子が、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、項22〜24のいずれか1項に記載の方法。
3週令雄性LEW/Seaラットの両鼡径部から皮下脂肪組織を採取した。脂肪組織を鋏で細かく刻み、0.1%のタイプIIコラゲナーゼ溶液中に懸濁し、37度温浴槽で1時間震盪した。250μmのメッシュフィルターで濾過し、毎分1800回転5分間遠心分離した。沈渣を培養培地(10%ウシ胎児血清、200μMアスコルビン酸、および抗生物質含有D−MEM)に懸濁し、25μmのメッシュフィルターで濾過し、毎分1800回転5分間遠心分離した。沈渣を培養培地で懸濁し、これを培養皿に移して5%二酸化炭素、37度の湿潤環境で培養した。培養開始後24時間で培養皿に接着したものを脂肪由来線維芽細胞(Stromal−Vascular Fraction cell: SVF cell)とした。
培養開始後3日で細胞をトリプシン処理により細胞浮遊液とし、直径35mmの温度応答性培養皿に密度7000個/cm2になるように播種した。培養開始10日後、温度応答性培養皿上でコンフルエントとなった脂肪由来線維芽細胞に、分化誘導培地(10%ウシ胎児血清、200μMアスコルビン酸、0.87μMインスリン、0.25μMデキサメタゾン、500μMイソブチルメチルキサンチン、5μMピオグリタゾン、抗生物質含有D−MEM)を48時間添加し、脂肪細胞へ分化誘導を行った。分化誘導終了後はメンテナンス培地(10%ウシ胎児血清、200μMアスコルビン酸、0.87μMインスリン、抗生物質含有D−MEM)で培養し、細胞質内に油滴が蓄積され、脂肪細胞に分化したことを確認した。培養開始19〜25日後、温度応答性培養皿を20度で培養した。40分以内に脂肪細胞は自然にはがれ、脂肪細胞シートとして培養液中に浮遊した。
脂肪細胞シートを24時間培養した培養培地を採取し、酵素免疫抗体法(ELISA法)により培養液中のアディポネクチンを測定した。
脂肪細胞シートの凍結切片を作製し、4%パラホルムアルデヒドで固定後、オイルレッドO染色およびアディポネクチン免疫染色を施行した。
8週令雌性LEW/Seaラットを用いた。心筋梗塞モデルは左冠動脈前下降枝結紮術により作製した。イソフルランの吸入麻酔人工呼吸下(1.5%イソフルラン、換気量4ml、100サイクル/分)に全身麻酔をした後、左開胸を行い、心臓を露出した。左冠動脈起始部から2−3mmの部位を8−0プロリン糸で結紮した。
冠動脈結紮術15分後、ラットを2群に分けて以下の処置を行った。すなわち、脂肪細胞シート2枚を左室前壁に移植した群(A群;n=15)、および移植を行わない未治療の群(C群;n=15)である。手術後3日に組織学的評価、分子学的評価を行った。手術後4週間後に心臓超音波検査、心臓カテーテル検査、および組織学的評価を行った。
イソフルランの吸入麻酔により抑制状態を得たのち、収縮末期血圧および心拍数のモニタリング下で、14MHzトランスデューサーを備えた心臓超音波システムを用いて、乳頭筋レベルの左室短軸像を得た。左室の拡張末期断面積(LVEDA)および収縮末期断面積(LVESA)を測定した。測定は3回以上繰り返し、平均値を求めた。左室断面積変化率(FAC)は以下の式から算出した。
FAC(%)=(LVEDA―LVESA)/LVEDA×100
イソフルランの吸入麻酔人工呼吸下(1.5%イソフルラン、換気量4ml、100サイクル/分)に全身麻酔をした後、正中開胸を行い、心臓を露出した。下大静脈に1−0絹糸をかけた。左室心尖部からコンダクタンスカテーテル、左室前壁から圧カテーテルをそれぞれ左室内腔に挿入した。PV−loopを描出した後、下大静脈を絞って負荷をかけた。データはIntegral3ソフトウェア(ユニークメディカル)を用いて解析した。
手術後3日および28日において、カリウム投与により心臓を拡張期で停止させた後摘出した。左室を短軸方向にスライスしてコンパウンドに包埋後、液体窒素中で凍結し、組織切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色、マッソン・トリクロム染色、オイルレッドO染色、アディポネクチン免疫染色、CD11b免疫染色、TUNEL染色を施行した。線維化率をマッソン・トリクロム染色像の画像解析により求めた。梗塞サイズはヘマトキシリン・エオジン染色のマクロ像の画像解析により求めた。CD11bおよびTUNEL染色は、1視野あたりの陽性細胞数を計測し、検体あたり5視野の平均値を算出した。
手術後3日において、摘出した心臓サンプルを梗塞部(scar)、梗塞と正常の境界部(border)、非梗塞部(normal)に分けて、それぞれRNA抽出をした。RNAから逆転写反応によりcDNAを合成した。定量PCR法により腫瘍壊死因子(TNF−α)および単球走化活性因子(MCP−1)転写量を定量し、内在性コントロールであるリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)転写量で除算した値を、各検体のnormalの値との比であらわした。
データは平均値±標準誤差であらわした。群間の比較はt検定にて行い、P値が0.05未満を有意差ありとした。生存率解析は、カプラン・マイヤー法により生存率を算出し、各実験群について、ログランク検定で有意差を求めた。
ラット脂肪由来線維芽細胞に対して脂肪細胞へ分化誘導をしたところ、分化誘導後7日でオイルレッドO陽性の脂肪細胞が多数出現した(図1.A)。直径35mmの温度応答性培養皿で培養した脂肪細胞は、20℃でインキュベートすることにより10mm程度のシート状に回収された(図1.B)。1枚のシートを構成する細胞数は2×106個程度であった。脂肪細胞シートは100μm程度の厚さで、オイルレッドO陽性脂肪細胞を多数含み、細胞質にアディポネクチンの発現を認めた(図1.C,D)。脂肪細胞シートを24時間培養した培養液に、0.98±0.20μg/mlのアディポネクチン分泌を認めた。一方、細胞培養液自体や分化誘導処理をしていない脂肪由来線維芽細胞シートの培養液においてアディポネクチンは検出限界以下の濃度であった。
心筋梗塞急性期に左室前壁に移植された脂肪細胞シートは、移植後28日の左室前壁瘢痕領域に良好に生着していた(図1.E)。脂肪細胞シートは移植部位でもオイルレッドO陽性、アディポネクチン陽性であった(図1.F−H)。
心筋梗塞急性期に対するシート移植後28日の心機能評価を図2.A−Gに示す。心臓超音波検査より、A群におけるLVEDAおよびLVESAの値がC群と比して小さかったことから、左室拡大が抑制されていると考えられる(図2.A,B)。またFACはC群と比して有意に大きく、シート移植により心機能の増悪が抑制されていると考えられる(図2.C)。心臓カテーテル検査においても、収縮能の指標である左室最大陽性dP/dt(dP/dtmax)および左室収縮期末エラスタンス(Ees)の上昇、拡張能 の指標である左室最大陰性dP/dt(dP/dtmin)および左室等容弛緩時間(τ)の低下を認めたことから、脂肪細胞シート移植が心筋梗塞急性期において治療効果を有することが示唆された。
心筋梗塞急性期に対するシート移植28日後、組織学的解析を施行した。無治療であるC群は強度の左室前壁菲薄化を認めたが、A群はC群と比して左室前壁が厚く、左室前壁組織が維持されていることが示唆された(図3.A−C)。さらにマッソン・トリクロム染色により、梗塞部周縁の線維化を評価したところ、A群はC群と比して有意に線維化が抑制されていた(図3.D−F)。
心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植3日後、組織学的解析を施行した。梗塞サイズを定量したところ、A群における梗塞サイズはC群と比して有意に小さかった(図4.A−C)。さらに心筋梗塞部周縁におけるアポトーシス細胞をTUNNEL染色により検出したところ、A群におけるTUNEL陽性細胞数はC群と比して有意に少なかった(図4.D−F)。以上より、脂肪細胞シート移植によりアポトーシスの抑制を介して梗塞サイズが限局されている可能性が示唆された。
脂肪細胞シート移植後3日の心筋組織における抗炎症効果に関する検討を図5に示す。心筋梗塞周縁における炎症細胞の浸潤を炎症細胞マーカーであるCD11bの免疫染色により評価した。A群における梗塞部周縁のCD11b陽性細胞はC群と比して有意に少なかった(図5.A−C)。さらに、梗塞部および梗塞部周縁の炎症性サイトカイン転写程度を評価したところ、A群はC群と比して梗塞部、梗塞部周縁ともに、TNF−αおよびMCP−1の転写量が有意に低かった(図5.D,E)。以上より、脂肪細胞シート移植により、心筋梗塞後の炎症細胞の浸潤を含む炎症反応が緩和されている可能性が示唆された。
20週令雄性C57BL/6J(野生型マウス)およびアディポネクチンノックアウト遺伝子改変マウスの両鼡径部から皮下脂肪組織を採取した。脂肪組織を鋏で細かく刻み、0.1%のタイプIIコラゲナーゼ溶液中に懸濁し、37度温浴槽で1時間震盪した。100μmのメッシュフィルターで濾過し、毎分1800回転5分間遠心分離した。沈渣を培養培地(10%ウシ胎児血清、200μMアスコルビン酸、および抗生物質含有D−MEM)に懸濁し、70μmのメッシュフィルターで濾過し、毎分1800回転5分間遠心分離した。沈渣を培養培地で懸濁し、これを培養皿に移して5%二酸化炭素、37度の湿潤環境で培養した。培養開始後24時間で培養皿に接着したものを脂肪由来線維芽細胞(Stromal−Vascular Fraction cell: SVF cell)とした。
培養開始後3日で細胞をトリプシン処理により細胞浮遊液とし、24穴(直径15.5mm)の温度応答性培養皿に密度7000個/cm2になるように播種した。培養開始10日後、温度応答性培養皿上でコンフルエントとなった脂肪由来線維芽細胞に、分化誘導培地(10%ウシ胎児血清、200μMアスコルビン酸、0.87μMインスリン、0.25μMデキサメタゾン、500μMイソブチルメチルキサンチン、5μMピオグリタゾン、抗生物質含有D−MEM)を48時間添加し、脂肪細胞へ分化誘導を行った。分化誘導終了後はメンテナンス培地(10%ウシ胎児血清、200μMアスコルビン酸、0.87μMインスリン、抗生物質含有D−MEM)で培養し、細胞質内に油滴が蓄積され、脂肪細胞に分化したことを確認した。培養開始19〜25日後、温度応答性培養皿を20度で培養した。40分以内に脂肪細胞は自然にはがれ、脂肪細胞シートとして培養液中に浮遊した。
脂肪細胞シートを24時間培養した培養培地を採取し、酵素免疫抗体法(ELISA法)により培養液中のアディポネクチンを測定した。
脂肪細胞シートの凍結切片を作製し、4%パラホルムアルデヒドで固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色およびアディポネクチン免疫染色を施行した。
雌性C57BL/6J(野生型マウス)およびアディポネクチンノックアウト遺伝子改変マウスを用いた。心筋梗塞モデルは左冠動脈前下降枝結紮術により作製した。イソフルランの吸入麻酔人工呼吸下(1.0%イソフルラン、換気量1ml、100サイクル/分)に全身麻酔をした後、左開胸を行い、心臓を露出した。左冠動脈起始部から約1mmの部位を8−0プロリン糸で結紮した。
冠動脈結紮術15分後、ラットを2群に分けて以下の処置を行った。すなわち、野生型マウス由来脂肪細胞シート2枚を左室前壁に移植した群(W群)、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シート2枚を左室前壁に移植した群(K群)、および移植を行わない未治療の群(C群)である。手術後2日に組織学的評価、分子学的評価を行った。手術後4週間後に心臓超音波検査および組織学的評価を行った。
イソフルランの吸入麻酔により抑制状態を得たのち、14MHzトランスデューサーを備えた心臓超音波システムを用いて、乳頭筋レベルの左室短軸像を得た。左室の拡張末期径(LVDd)および収縮末期径(LVDs)を測定した。測定は3回以上繰り返し、平均値を求めた。左室駆出率(EF)は以下の式から算出した。
EF(%)=(LVDd3―LVDs3)/LVDd3×100
手術後2日および28日において、カリウム投与により心臓を拡張期で停止させた後摘出し、左室を短軸方向にスライスした。移植後2日の検体について、常法によりTTC染色を施行した。また、コンパウンドに包埋後、液体窒素中で凍結し、組織切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色、マッソン・トリクロム染色、PAS染色、オイルレッドO染色、アディポネクチン免疫染色、CD11b免疫染色を施行した。線維化率はマッソン・トリクロム染色像の画像解析により求めた。心筋細胞径はPAS染色像の心筋細胞径を画像解析により計測した。梗塞範囲はTTC染色像の画像解析により求めた。CD11bは1視野あたりの陽性細胞数を計測した。以上の定量評価について、検体あたり5視野の平均値を算出し、各群で平均値を求めた。
手術後2日において、摘出した心臓サンプルの梗塞部よりRNA抽出をした。RNAから逆転写反応によりcDNAを合成した。定量PCR法により腫瘍壊死因子(TNF−α)転写量を定量し、内在性コントロールであるリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)転写量で除算した。
ラット脂肪由来線維芽細胞に対して脂肪細胞へ分化誘導をしたところ、分化誘導後7日で細胞質に油滴を蓄積した脂肪細胞が多数出現した(図6.A)。直径15.5mmの温度応答性培養皿で培養した脂肪細胞は、20℃でインキュベートすることにより7mm程度のシート状に回収された(図6.B)。脂肪細胞シートは、主に細胞質に油滴を蓄積した脂肪細胞から成り、約100μm程度の厚さであった(図6.C)。野生型マウス由来の脂肪細胞シートは細胞質にアディポネクチンの発現を認めた。分化誘導処理をしていない野生型マウス由来脂肪由来線維芽細胞シート、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートおよび脂肪由来線維芽細胞シートにおいて、アディポネクチンの発現を認めなかった(図6.D)。脂肪細胞シートを24時間培養した培養液においてアディポネクチン分泌を認めた。一方、細胞培養液自体や野生型マウス由来脂肪由来線維芽細胞シートやアディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートの培養液においてアディポネクチンは検出限界以下の濃度であった。
心筋梗塞急性期に対するシート移植後28日の心機能評価を図7.A、Bに示す。心臓超音波検査より、W群におけるLVDsの値が、C群と比して有意に小さかったことから、左室拡大が抑制されていると考えられる。K群はC群と比して、LVDd、LVDsともに縮小傾向にあるものの、有意な差ではなかった。また、EFは、W群においてC群と比して有意に高く、K群はC群と比して有意な差はなかった。(図7.A)このことから脂肪細胞シート移植により心機能の増悪が抑制されており、その機序において、脂肪細胞シート由来のアディポネクチンが重要であると考えられる。また、各群の生存率について評価したところ、W群はC群と比して有意に生存率が高かった(p=0.0428)。W群はK群と比して有意ではないものの生存率改善傾向を認めた(p=0.0614)。以上より、心筋梗塞において、脂肪細胞シート移植による外来アディポネクチンを介して予後が改善することが示唆された。
心筋梗塞急性期に対するシート移植28日後、組織学的解析を施行した。W群はK群およびC群と比して心筋細胞径が小さく、心筋梗塞後の心筋肥大が抑制されていることが示唆された(図8.A、B)。マッソン・トリクロム染色により、梗塞部周縁の線維化を評価したところ、W群はK群およびC群と比して有意に線維化が抑制されていた(図8.C、D)。
心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植2日後、組織学的解析を施行した。TTC染色により梗塞サイズを定量したところ、W群における梗塞サイズはK群およびC群と比して有意に小さかった(図9.A、B)。梗塞部における炎症性サイトカインTNF−α転写程度を評価したところ、W群はK群およびC群と比して転写量が有意に低かった(図9.C)。また、心筋梗塞周縁における炎症細胞の浸潤を炎症細胞マーカーであるCD11bの免疫染色により評価した。W群およびK群における梗塞部周縁のCD11b陽性細胞はC群と比して有意に少なかった(図9.D)。以上より、脂肪細胞シート移植により、アディポネクチンを介して心筋梗塞後の細胞死が抑制され、炎症細胞の浸潤を含む炎症反応が緩和されている可能性が示唆された。
脂肪細胞シート由来アディポネクチンの持続産生および移植部位の心筋組織対する浸潤を評価するため、アディポネクチンノックアウトマウスをレシピエントとして脂肪細胞シート移植を施行した。野生型マウス由来脂肪細胞シートは移植後1か月間、心筋組織に生着し、アディポネクチンを分泌していた。脂肪細胞シートと接した心筋細胞のECMにおいてアディポネクチンの発現を認めたことから、脂肪細胞シート由来アディポネクチンは近傍の心筋細胞に浸透していることが示唆された(図10.B)。このような近傍の心筋細胞におけるアディポネクチン陽性免疫染色像は、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートでは認めなかったことから、図10.Bの染色像が非特異的なものである可能性は除外される(図10.C)。さらに、脂肪細胞シート移植後1か月の血漿から、脂肪細胞シート由来アディポネクチンが検出された。アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シート移植マウスの血漿からはアディポネクチンは検出限界以下であった(図10.G)。
Claims (17)
- 細胞培養支持体から単離された脂肪細胞含有細胞シートを含む、心臓疾患治療用移植材料。
- 前記細胞シートの厚さが50μm以上である、請求項1に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 前記細胞シートのアディポネクチン分泌能が1日当たり3×10−14g/cell以上である、請求項1または2のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 前記細胞シートが線維化抑制機能、血管新生機能、アトポーシス抑制機能、および抗炎症機能からなる群より選択される少なくとも1種の機能を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 前記脂肪細胞が脂肪組織由来線維芽細胞を分化誘導したものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 複数層の細胞シートを積層した状態で含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 前記細胞シートのうち少なくとも一層が筋芽細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される少なくとも1種の細胞をさらに含むものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 前記筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項7に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 前記間葉系幹細胞が脂肪組織由来のものである、請求項7または8のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- スキャフォルドを含まない、請求項1〜9のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 脂肪細胞が由来する個体に対して適用される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- さらにサイトカインまたは増殖因子を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 前記心臓疾患が、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
- 脂肪細胞を含有する細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料を製造する方法であって、スキャフォルドを用いず、かつ
a)水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体上で、脂肪細胞を含有する細胞群を培養液中で培養する工程;
b)培養液の温度を、該上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程;および
c)細胞群を、細胞培養支持体から細胞シートとして剥離する工程
を含む方法。 - 工程c)の前に、
d)培養液にアスコルビン酸またはその誘導体を加える工程
をさらに含む、請求項14に記載の方法。 - タンパク質分解酵素で処理する工程を含まない、請求項14または15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記温度応答性高分子が、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
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