JPWO2009116286A1

JPWO2009116286A1 - 凝集性酵母、及びその作製法

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Publication number: JPWO2009116286A1
Application number: JP2010503780A
Authority: JP
Inventors: 赤田　倫治; 倫治赤田; サノムノンクラ; 尚司星田; バビカモハメドアーメドアブデル−バナット
Original assignee: Yamaguchi University NUC
Current assignee: Yamaguchi University NUC
Priority date: 2008-03-18
Filing date: 2009-03-18
Publication date: 2011-07-21
Anticipated expiration: 2029-03-18
Also published as: WO2009116286A1; US8198089B2; CN101983240B; US20110020937A1; JP5435657B2; EP2256194A4; CN101983240A; BRPI0908930A2; EP2256194A1

Abstract

【課題】外来の凝集性遺伝子をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入することにより、バイオエタノールの工業生産に適した、耐熱性及び凝集性を有する新規のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体、ならびに、該形質転換体の効率的な作製法を提供すること。【解決手段】本発明者らは、クルイベロマイセス・マルシアヌスに凝集性を付与するための外来遺伝子として、サッカロマイセス・セレビシエの凝集性遺伝子ＦＬＯに着目し、既知の発現プロモーター配列とサッカロマイセス・セレビシエ由来のＦＬＯ遺伝子配列とを含む線状ＤＮＡ断片を作製した。この線状ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入した結果、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体が効率よく得られることを確認するとともに、予想外にも、上記形質転換体の凝集性が顕著に高まることを確認し、本発明を完成するに至った。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオエタノール生産のための凝集性を高めたクルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）に属する凝集性酵母、及びその作製法等に関する。

微生物は、工業製品を生産するために重要な位置を占めている。その中で、より効率よく安価に生産を行うことが課題とされてきた。その解決方法は、より高い生産性を示す菌株を選択すること、微生物培養のための培地組成や培養温度等の培養条件の検討等であった。近年の分子遺伝学の発達のもとでは、菌株の選択肢のひとつとして、従来の菌株から優秀な遺伝子を特定して利用し、菌株を形質転換する手法があげられる。従来、有用な食品類を生産してきた酵母においても、より有効な生産のために形質転換が多く行われている。

有効な生産のための形質転換のひとつとして、菌体の凝集性を高める形質転換があげられる。発酵法によるアルコール生産は、発酵酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の中で特にアルコール生産性の高い株を用いて、回分発酵法あるいは、連続発酵法という手法で実施されている。従来の回分発酵法は、アルコール発酵酵母に糖蜜等を原料として加え、一定の条件下で培養することによりアルコールを生成させる。生成されたアルコールは、培養液を加熱して蒸留回収するが、培養液中に残った酵母は、加熱により死滅する。従って、アルコール生産を続ける際には、酵母液を補充しなければならない。このような工程は、効率が悪く、さらにコスト高になる。凝集性酵母を使用した場合は、静置して上清のアルコールを回収し、沈殿している凝集性酵母に新たな発酵液を加えて、再度アルコール生産を行うことができるため、回分発酵法によるアルコール生産においては、凝集性の酵母が望まれていた。

凝集性を付与する形質転換の手法として、アルコール発酵酵母の染色体上の任意のマーカー遺伝子領域に、外来ＤＮＡである凝集性遺伝子発現カセットを導入して作製した、実用的な凝集性アルコール発酵酵母とその育種方法（特許文献１）、酵母の凝集性遺伝子の凝集性に関与する蛋白領域をコードするＤＮＡを取得し、該ＤＮＡをビール酵母に導入して凝集性が強化された酵母を製造する方法（特許文献２）、燃料用エタノール生産のために凝集性酵母の構築（非特許文献１）等がある。これらの既に報告されている形質転換酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ由来の凝集性遺伝子を、サッカロマイセス・セレビシエに属する酒類製造用酵母に導入して作製されたものである。一方、サッカロマイセス・セレビシエと異なる属に属する酵母に、サッカロマイセス・セレビシエ由来の凝集性遺伝子を導入した形質転換酵母については未だ報告されておらず、サッカロマイセス・セレビシエ由来の凝集性遺伝子が、サッカロマイセス・セレビシエ以外の酵母においても凝集性の調節に関与するかどうかについては全く知られていなかった。

サッカロマイセス・セレビシエでは、全ゲノムの解析がおわり、凝集性遺伝子が特定されている。凝集性に関与するＦＬＯ遺伝子群には、第１番染色体上に存在するＦＬＯ１遺伝子（非特許文献２）、第８番染色体上に存在するＦＬＯ５遺伝子（非特許文献３）、第５番染色体上に存在するＦＬＯ８遺伝子（非特許文献４）、第１番染色体上に存在するＦＬＯ９遺伝子（非特許文献５）、第１１番染色体上に存在するＦＬＯ１０遺伝子（非特許文献６）等がある。これらの遺伝子は、ＦＬＯ１と類似の塩基配列を有するレクチン様タンパク質であるとされている。

現在、石油供給の問題点から、世界レベルで石油に代わって、生物由来資源（バイオマス）によるエネルギー源の探索が試みられている。バイオマスによる新エネルギーのひとつに、バイオマス燃料であるバイオエタノールがある。バイオエタノールは、糖質あるいはデンプン質を多く含む植物資源が利用されている。バイオマスを原料とした微生物によるアルコール生産の方法としては、サゴヤシ原木の粉砕物を糖化し、サッカロマイセス・セレビシエによるエタノールの発酵生産法（特許文献３）、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵母を用いた生ごみなどの廃棄物からの燃料用アルコールの生産法（特許文献４）が開示されている。バイオエタノールの生産に使う酵母は、バイオマスの処理に対応できる耐熱性を有し、アルコール生産酵母と同様に高い凝集性を有する酵母が望まれている。

酵母クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）は耐熱性を有する酵母であり、Lertwattanasakulや山田らによって糖からエタノールへの変換に関与する酵素アルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase; Ａｄｈ）の発現が確認されている（非特許文献７）。クルイベロマイセス・マルシアヌスはエタノールを産生することができるだけでなく、タンパク質生産性が高いことから、工業的な生産において非常に有用であると考えられるが、クルイベロマイセス・マルシアヌスの形質転換方法が一般的に確立されていない等、研究が進んでいないのが現状である。このため、バイオエタノールの工業生産に適したクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換株については、これまで全く報告されていない。

特許第３０４０９５９号公報特許第３６４３４０４号公報特開２００７−１９５４０６号公報特開２００６−３２５５７７号公報 Biotechnol Lett, 30: 97-102, 2008 Yeast, 9: 423-427,1993 Science, 265: 2077-2082, 1994 Nature 387: 78-81, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 92: 3809-3813, 1995 Nature 369: 371-378, 1994 Biosci. Biotechnol. Biochem.71: 1170-82, 2007

本発明の課題は、外来の凝集性遺伝子をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入することにより、バイオエタノールの工業生産に適した、耐熱性及び凝集性を有する新規のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体を提供すること、ならびに、上記形質転換体の効率的な作製法を提供することにある。

本発明者らは、クルイベロマイセス・マルシアヌスに凝集性を付与するための外来遺伝子として、サッカロマイセス・セレビシエの凝集性遺伝子ＦＬＯに着目し、ＦＬＯ遺伝子発現を誘導するためのＦＬＯ遺伝子発現カセットとして、既知の発現プロモーター配列とサッカロマイセス・セレビシエ由来のＦＬＯ遺伝子配列とを含む直鎖状（線状）ＤＮＡ断片を作製した。この線状ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入した結果、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体が効率よく得られることを確認するとともに、予想外にも、上記形質転換体の凝集性が顕著に高まることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、[１]（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の内在性ＦＬＯ遺伝子の上流にマーカー遺伝子配列及び発現プロモーター配列を導入してサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体を作製する工程；（Ｂ）工程（Ａ）で作製されたサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体由来の染色体ＤＮＡから、マーカー遺伝子配列、発現プロモーター配列、及び、ＦＬＯ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を得る工程；（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたＤＮＡ断片を、ＦＬＯ遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入し、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体を作製する工程；の工程（Ａ）〜（Ｃ）を順次含むことを特徴とする凝集性及び耐熱性を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）形質転換体の作製方法や、[２]サッカロマイセス・セレビシエの内在性ＦＬＯ遺伝子が、ＦＬＯ１遺伝子、ＦＬＯ５遺伝子、ＦＬＯ９遺伝子、及び、ＦＬＯ１０遺伝子から選択される１以上のＦＬＯ遺伝子であることを特徴とする上記[１]記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[３]マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子であることを特徴とする上記[１]又は[２]記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[４]栄養要求性マーカー遺伝子がヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも１つの栄養要求性遺伝子であることを特徴とする上記[１]〜[３]のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[５]栄養要求性マーカー遺伝子がＵＲＡ３遺伝子であることを特徴とする上記[４]記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[６]クルイベロマイセス・マルシアヌスが、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも１つの栄養要求性遺伝子に変異を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス変異体であることを特徴とする上記[１]〜[５]のいずれかに記載の作製方法や、[７]発現プロモーターがグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ３（ＴＤＨ３）プロモーターであることを特徴とする上記[１]〜[６]のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[８] 線状のＤＮＡ断片を、ＦＬＯ遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することを特徴とする上記［１］〜［７］のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[９] クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体形質転換体が、ＲＡＫ４２９９株（ＮＩＴＥＢＰ−５１４）、ＲＡＫ４３００株（ＮＩＴＥＢＰ−５１５）、ＲＡＫ４３０１株（ＮＩＴＥＢＰ−５１６）、又は、ＲＡＫ４３０２株（ＮＩＴＥＢＰ−５１７）であることを特徴とする上記[１]〜[８]のいずれか記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法に関する。

また本発明は、[１０]上記[１]〜[８]のいずれかに記載の作製方法により作製された凝集性及び耐熱性を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体や、[１１]ＲＡＫ４２９９株（ＮＩＴＥＢＰ−５１４）、ＲＡＫ４３００株（ＮＩＴＥＢＰ−５１５）、ＲＡＫ４３０１株（ＮＩＴＥＢＰ−５１６）、又は、ＲＡＫ４３０２株（ＮＩＴＥＢＰ−５１７）であることを特徴とする上記[１０]記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体に関する。

本発明により、クルイベロマイセス・マルシアヌスを形質転換して凝集性及び耐熱性に優れた酵母を作製することが可能であり、バイオエタノールの工業生産のために有効な酵母を提供することができる。

ｐＳＴ１０６プラスミド由来のＴＤＨ３プロモーターとＵＲＡ３ＤＮＡ断片をＦＬＯ遺伝子上流に挿入する模式図を示す。形質転換用ＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す図である。（Ｌａｎｅ１，６：ＤＮＡｌａｄｄｅｒ、ｌａｎｅ２：ＦＬＯ３由来、ｌａｎｅ３：ＦＬＯ５由来、ｌａｎｅ４：ＦＬＯ９由来、ｌａｎｅ５：ＦＬＯ１０由来）形質転換用ＤＮＡ断片を導入したサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００の染色体ＤＮＡ（ＴＦ）と、導入していない染色体ＤＮＡ（ＷＴ）の電気泳動結果を示す図である。形質転換用ＤＮＡ断片を導入して得られた４タイプのサッカロマイセス・セレビシエの染色体ＤＮＡにおける組換えＦＬＯ遺伝子の電気泳動結果を示す図である。（Ｌａｎｅ１，６：ＤＮＡｌａｄｄｅｒ、ｌａｎｅ２：ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ１、ｌａｎｅ３：ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ５、ｌａｎｅ４：ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ９、ｌａｎｅ５：ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ１０）クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２と、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００に対する各形質転換体の凝集性を示す図である。クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の２８℃と４０℃での凝集性を示す図である。温度４０〜５０℃におけるヒートショックの時間について、温度に対する反応時間の上限と下限を示した図である。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２の形質転換についての結果の写真を示す図である。直鎖ＤＮＡのＵＲＡ３断片を２５ｎｇ使用してプレート一面の形質転換体数を得ることができる。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２の形質転換効果における酵母細胞の濃度の影響を示す図である。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２の形質転換効果におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量とヒートショック後の希釈液の影響を示す図である。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２の形質転換効果におけるＤＴＴの影響を示す図である。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２の形質転換効果におけるＤＮＡ断片の大きさの影響を示す図である。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２の形質転換効果におけるヒートショック温度と時間の影響を示す図である。クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２が、ＤＮＡ断片を用いた形質転換に最も有効な菌株であることを示す図である。

本発明の凝集性及び耐熱性を有する酵母の作製方法としては、耐熱性酵母クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）にＦＬＯ遺伝子発現カセットを導入する方法を含むものであれば特に制限されるものではなく、上記ＦＬＯ遺伝子としては、クルイベロマイセス・マルシアヌスに凝集性を付与することができるＦＬＯ遺伝子であればどのようなものでもよいが、例えば、全ゲノム配列が解析されているサッカロマイセス・セレビシエのＦＬＯ遺伝子を好適に挙げることができ、より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエのＦＬＯ１遺伝子、ＦＬＯ５遺伝子、ＦＬＯ９遺伝子、ＦＬＯ１０遺伝子等を好適に例示することができる。サッカロマイセス・セレビシエのＦＬＯ遺伝子の情報は、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（European
Molecular Biology Laboratory）、ＧｅｎＢａｎｋ−ＮＣＢＩ（National
Center for Biotechnology Information）、ＳＧＤ（Saccharomyces Genome Database）等のゲノムデータベースから、その塩基配列情報を知ることができる。

上記ＦＬＯ遺伝子発現カセットとしては、クルイベロマイセス・マルシアヌスにＦＬＯ遺伝子の発現を誘導できるものであれば特に制限されるものではないが、形質転換体を効率的に選択するためのマーカー遺伝子配列含み、さらに、ＦＬＯ遺伝子の発現が発現プロモーターにより制御されるよう設計されたＦＬＯ遺伝子発現カセットであることが好ましい。上記選択マーカー遺伝子としては、抗生物質等の薬剤耐性遺伝子や、栄養要求性マーカー遺伝子等のレシピエント（宿主）細胞における欠失産物をコードする遺伝子等を挙げることができ、上記薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン、ブレオマイシン、カナマイシン、オリゴマイシン等の薬剤に対する耐性遺伝子等を、上記栄養要求性マーカー遺伝子としては、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２等を例示することができ、特に栄養要求性マーカー遺伝子を用いることが好ましい。栄養要求性マーカー遺伝子と選択培地を組み合わせることによって、マーカー遺伝子を発現する細胞を選択することができ、例えば、ＵＲＡ３の栄養要求性遺伝子を細胞に導入した場合、形質転換した宿主細胞は、ウラシルを含まない培地で成育することができ、凝集性を付与された菌株の選択が可能になる。また、上記発現プロモーターとしては、特に制限されるものではないが、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ３（ＴＤＨ３、ＧＡＰ）プロモーター、ＴＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ２プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等を具体的に挙げることができ、これらのプロモーター配列は、生体由来のゲノムＤＮＡ配列であっても、化学的な手法等により人工的に得られたＤＮＡ配列であってもよい。

ＦＬＯ遺伝子発現カセットを導入して形質転換を行うためのクルイベロマイセス・マルシアヌ菌体は、マーカーとなる遺伝子が変異された変異体を用いることが望ましい。変異遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いて行うことができる。ＵＶ照射による方法として、例えば、Hashimotoらの方法（Applied and Environmental
Microbiology,71(1):312-319,2005）、がある。この方法では、生育させたプレート上の酵母株に３５ｃｍの距離からＵＶを２０秒照射して、０．０５〜０．２％の変異体が得られている。この方法に準じて、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ウラシル（Ｕｒａ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｉ）の栄養要求性変異株を得ることができる。あるいは、遺伝子破壊カセットベクター等、標的とする遺伝子と相同的な塩基配列を持ち、遺伝子として働き得ないＤＮＡを細胞中に導入して相同的組換えを起こさせ、不活化させる方法もある（特開２００１−４６０５３号公報）。発現を目視できない遺伝子の変異を行う場合は、細胞の薬剤（抗生物質等）感受性試験、細胞の生育速度、酵素活性試験、光学的方法又は栄養要求性試験により観察できるようなマーカー遺伝子を導入する必要がある。

上述のような、栄養要求性マーカー遺伝子配列と、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＦＬＯ遺伝子配列とを含み、前記ＦＬＯ遺伝子の発現が前記発現プロモーターにより制御されるよう設計されたＦＬＯ遺伝子発現カセットを用いた本発明の酵母の作製方法としては、（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエの内在性ＦＬＯ遺伝子の上流に栄養要求性マーカー遺伝子配列及び発現プロモーター配列を導入してサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体を作製する工程；（Ｂ）工程（Ａ）で作製されたサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体由来の染色体ＤＮＡから、栄養要求性マーカー遺伝子配列、発現プロモーター配列、及び、ＦＬＯ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を得る工程；（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたＤＮＡ断片に含まれる栄養要求性マーカー遺伝子に対応する栄養要求性遺伝子に変異を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス変異体に、前記ＤＮＡ断片をＦＬＯ遺伝子発現カセットととして導入し、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体を作製する工程；の工程（Ａ）〜（Ｃ）を順次含む作製方法を挙げることができる。

上記工程（Ａ）において、サッカロマイセス・セレビシエ形質転換体は、栄養要求性遺伝子が変異したサッカロマイセス・セレビシエ菌株に、栄養要求性マーカー遺伝子配列と、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＦＬＯ遺伝子配列とを含む形質転換用ＤＮＡ断片を導入することにより作製することができ、上記栄養要求性遺伝子が変異したサッカロマイセス・セレビシエ菌株としては、市販のウラシル要求性遺伝子が変異したサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００株や、ウラシル、ロイシン、リシンの要求性遺伝子が変異したサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４０株や、ヒスチジン、ロイシン、ウラシルの要求性遺伝子が変異したサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４３株や、Hashimotoらの方法（Applied and Environmental
Microbiology,71(1):312-319,2005）に準じて作製したウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３６０５等を用いることができる。また、上記形質転換用ＤＮＡ断片の作製には、サッカロマイセス・セレビシエＦＬＯ遺伝子の配列情報に基づき、開始コドンＡＴＧからＡＴＧを含んで４０番目の塩基までの配列からなるＤＮＡ断片を用いることができ、例えば、４０塩基からなるＤＮＡ断片の塩基配列としては、ＦＬＯ１遺伝子由来の場合は、ａｔｇａｃａａｔｇｃｃｔｃａｔｃｇｃｔａｔａｔｇｔｔｔｔｔｇｇｃａｇｔｃｔｔｔａ（配列番号１）であり、ＦＬＯ５遺伝子由来の場合は、ａｔｇａｃａａｔｔｇｃａｃａｃｃａｃｔｇｃａｔａｔｔｔｔｔｇｇｔａａｔｃｔｔｇｇ（配列番号２）であり、ＦＬＯ９遺伝子由来の場合は、ａｔｇｔｃｔｃｔｇｇｃａｃａｔｔａｔｔｇｔｔｔａｃｔａｃｔａｇｃｃａｔｃｇｔｃａ（配列番号３）であり、ＦＬＯ１０遺伝子由来の場合は、ａｔｇｃｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｔｃｇａｔａｔａｔａｔｔｔｔｔｇａｃｃｇｇｃｃｔａｔ（配列番号４）等を挙げることができる。これらのＦＬＯ遺伝子の塩基配列情報を基に作製したＤＮＡ断片をアニールして、発現プロモーター配列と栄養要求性マーカー遺伝子配列を有するプラスミドに挿入し、ＰＣＲによって所望の領域を増幅することでＦＬＯ遺伝子発現カセット用のＤＮＡ配列を得ることができる。上記発現プロモーター配列と栄養要求性マーカー遺伝子配列を有するプラスミドとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Turgeonらの方法（Plasmid 51:24-36,2004）にしたがって作製された、発現プロモーターとしてＴＤＨ３ｐを、栄養要求性遺伝子としてウラシル要求性遺伝子を有するプラスミドＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ（「ｐＳＴ１０６」という）を好適に挙げることができる。

遺伝子変異株に、形質転換用ＤＮＡ断片を導入する方法は、ＤＮＡ断片を導入する一般的な形質転換の手法を用いることができる。例えば、接合法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の何れの方法も用いることができる。また、赤田らの方法（特開２００５−２６９９２０号公報）により、アルカリ金属イオンとポリエチレングリコールを含有する培地でヒートショックを行ない、形質転換用ＤＮＡ断片を導入することもできる。

上記工程（Ａ）において、ウラシル要求性遺伝子が変異したサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００株を用いたサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体の例として、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０１を導入したサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９７７株や、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０５を導入したサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９７９株や、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０９を導入したサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９８１株や、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０１０を導入したサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９８３株等の以下の実施例にて作製された形質転換体を挙げることができる。

上記工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で作製されたサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体由来の染色体ＤＮＡから、ＦＬＯ遺伝子発現カセットをコードするＤＮＡ断片を得る方法としては、上記サッカロマイセス・セレビシエ形質転換体の染色体ＤＮＡを、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液等を用いた通常の方法で、溶解・攪拌・抽出・遠心分離の操作を行うことにより精製し、精製された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う方法を挙げることができ、上記ＰＣＲ反応の際に、栄養要求性マーカー遺伝子配列、発現プロモーター配列、及び、ＦＬＯ遺伝子配列を含むＦＬＯ遺伝子発現カセット配列を含むＤＮＡ配列を増幅するよう設計したプライマーを用いることにより、ＦＬＯ遺伝子発現カセットをコードするＤＮＡ断片を得ることができる。

上記（Ｃ）においては、上記ＦＬＯ遺伝子発現カセットに含まれる栄養要求性マーカー遺伝子に対応する染色体遺伝子に変異を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス栄養要求性変異体であれば、どのような栄養要求性遺伝子が変異したクルイベロマイセス・マルシアヌス変異体であっても使用することができ、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニン等の栄養要求性遺伝子が変異したクルイベロマイセス・マルシアヌス変異体を選択することができる。例えば、以下の実施例に示すように、ＦＬＯ遺伝子発現カセットとして、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ遺伝子断片を用いる場合には、ウラシル要求性遺伝子が変異したクルイベロマイセス・マルシアヌス菌株のクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３６０５株を用いて作製することができる。

本発明の作製方法を用いて作製される凝集性及び耐熱性を有する酵母としては、特に制限されるものではないが、例えば、ウラシル要求性遺伝子が変異したクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３６０５株に、サッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９７７株由来のＦＬＯ遺伝子発現カセット（ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ１）を導入した、クルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ４２９９株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−５１４）や、サッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９７９株由来のＦＬＯ遺伝子発現カセット（ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ５）を導入した、クルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ４３００株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−５１５）や、サッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９８１株由来のＦＬＯ遺伝子発現カセット（ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ９）を導入した、クルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ４３０１株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−５１６）や、サッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ３９８３株由来のＦＬＯ遺伝子発現カセット（ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ１０）を導入した、クルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ４３０２株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−５１７）等を具体的に挙げることができる。なお、上記の４種のクルイベロマイセス・マルシアヌス変異株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。

本発明において、形質転換した菌株を選択するための培地としては、通常使用されている酵母培養用の培地でも良く、例えば、実施例にあげたＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）や、ＹＭ培地（０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．５％ペプトン、１％グルコース）を用いることができる。培地の炭素源、窒素源の種類や、アルカリ金属イオン等の培地への添加物については、形質転換体の選択が有効に行えるものであれば何れの培地でも良い。培養は、２５〜３３℃、好ましくは２８〜３０℃で、１〜５日、好ましくは２〜３日行う。

以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。

＜サッカロマイセス・セレビシエのＦＬＯ遺伝子の上流への過剰発現プロモーターＴＤＨ３ｐの挿入＞
Ａ．ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ断片の増幅
マーカー遺伝子であるＵＲＡ３遺伝子配列と、発現プロモーター配列であるＴＤＨ３とを有するｐＳＴ１０６プラスミドをテンプレートに、表１に示すプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、サッカロマイセス・セレビシエ形質転換用のＤＮＡ断片を作製した。上記プライマーはｐＳＴ１０６プラスミドのＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ配列をはさむように設計されており、さらに、サッカロマイセス・セレビシエのＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９又はＦＬＯ１０遺伝子上流配列をそれぞれ４０塩基含むよう設計されている。ＰＣＲ反応液は、１対の０．２μＭのプライマーを各々０．２μｌ、ＫＯＤｐｌｕｓバッファー１．０μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ１．０μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ_４０．８μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、０．４ｎｇ／μｌｐＳＴ１０６プラスミド０．４μｌ、ＫＯＤＰｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．２μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、滅菌水６．２μｌで、トータル１０μｌの液とした。反応は、まず９４℃で１分間加熱し、その後、９４℃で２０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を３０サイクル行った。その結果、ＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９又はＦＬＯ１０遺伝子上流の相同配列をそれぞれ持つＤＮＡ断片ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０１、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０５、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０９、ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０１０（以下、これらのＤＮＡ断片を総称してＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０ｓということがある）を得た（図１、２）。

Ｂ．サッカロマイセス・セレビシエへのＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ配列の導入
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００株を、２ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）の入ったテストチューブに接種し、２８℃、１５０ｒｐｍで一夜培養した。培養液１ｍｌを、ＹＰＤ培地９ｍｌの入ったペトリ皿へ移し、２８℃、１５０ｒｐｍで５時間培養した。培養液は、８５００ｒｐｍで３分間の遠心分離を行い、細胞を集め、滅菌蒸留水で一度洗った。残渣は、滅菌蒸留水１００μｌで溶解した。形質転換用の溶液は、６０％のＰＥＧ３３５０を１１５μｌ、４Ｍのリチウムアセテート５μｌ、蒸留水１５μｌを混合して調製した。細胞溶解液５０μｌは、形質転換用バッファー１３５μｌの入ったマイクロ遠心分離用のチューブへ移し、サーモンＤＮＡ１０μｌと上記Ａで作製した４種類のＤＮＡ断片（ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０ｓ）をそれぞれ５μｌを加え、攪拌機を使って３０秒間よく攪拌した。チューブを４２℃で４０分間熱処理をした。形質転換された細胞溶液２００μｌは、選択培地へ広げ、２８℃で２−３日培養した。ウラシル欠損培地で生育した細胞のコロニーをランダムに採取して形質転換細胞を分離した。形質転換細胞は、ＹＰＤ培地に生育させ、４℃で保存した。

Ｃ．ＰＣＲによるサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体の確認
１．ＰＣＲ用ＤＮＡの調製
上記Ｂで作製した形質転換細胞を、１ｍｌのＹＰＤ培地の入った１２穴プレートのウエルに接種し、２８℃で２０時間培養した。培養後、ＹＰＤ培地１ｍｌを添加し、さらに２８℃で４時間培養した。培養液１．５ｍｌを採取して、マイクロ遠心分離用のチューブへ移し、１２０００ｒｐｍで３分間の遠心分離を行った後、上清を除き、残渣を滅菌蒸留水で一度洗った。蒸留水を除き、７．５μｌの細胞を２．５μｌの１％ＳＤＳを含むマイクロ遠心分離用のチューブへ移し、攪拌機を使って３０秒間よく攪拌した。１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を取った。上清は、コロニーＰＣＲに使用した。

２．コロニーＰＣＲ
コロニーＰＣＲは表２に示すプライマーを用いて行った。ＰＣＲ反応液は、０．４μＭの１対のプライマーを各々０．４μｌ、ＫＯＤＤａｓｈバッファー１．０μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ１．０μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＫＯＤＤａｓｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．２μｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、滅菌水４．０μｌで、上記で作製した形質転換細胞の染色体ＤＮＡ５．０μｌをテンプレートとして、トータル１０μｌの液でＰＣＲを行った。反応は、まず９４℃で１分間加熱し、その後、９４℃で２０秒間の熱変性、６０℃で２秒間のアニーリング、７４℃で４分間の伸長反応を３０サイクル行った。その結果、図３で示すとおりサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００株にＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯ４０ｓが導入された形質転換体が作製されたことを確認した。ここで作製された４種類のサッカロマイセス・セレビシエの形質転換体は、内在性のＦＬＯ１、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９又はＦＬＯ１０遺伝子の上流に、選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子配列と、ＴＤＨ３プロモーター配列とを含むものである。

＜サッカロマイセス・セレビシエ由来ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯｓのクルイベロマイセス・マルシアヌスへの導入＞
Ａ．ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯｓの増幅
実施例１で作製したサッカロマイセス・セレビシエの形質転換体由来の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いてクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換用のＤＮＡ断片（ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯｓ；ＦＬＯ遺伝子発現カセット）を作製した。表３に示すように、各サッカロマイセス・セレビシエの形質転換体のＵＲＡ３配列、ＴＤＨ３ｐ配列及び完全長ＦＬＯ遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯｓを増幅した。ＰＣＲ反応は、実施例１Ａと同様に行った。反応は、まず９４℃で１分間加熱し、その後、９４℃で２０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で５分間の伸長反応を３０サイクル行った。その結果、増幅したＰＣＲ産物をアガロース電気泳動やＵＶ照射の写真で分析した(図４)。

Ｂ．クルイベロマイセス・マルシアヌスのＵＲＡ３欠損株の作製
クルイベロマイセス・マルシアヌスのＵＲＡ３欠損株は、Hashimotoらの方法（Appl Microbiol. Biotechnol., 69:
689-696, 2006）で取得した。すなわち、酵母株をＹＰＤプレートにスプレッドし、ＵＶを６０秒照射後、２８℃で一晩培養し、そのプレートを、Akadaらの方法（Yeast 23, 399-405, 2006）で調製した５−ＦＯＡ培地にレプリカし、さらに３日間培養した。生育したコロニーを単離し、ウラシル要求性を確認後、形質転換が成功した株をＲＡＫ３６０５株とした。

Ｃ．ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ＦＬＯｓのクルイベロマイセス・マルシアヌス染色体への導入
クルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３６０５を、２５ｍｌのＹＰＤ培地の入った２５０ｍｌの三角フラスコに接種し、２８℃で１８時間培養した。培養液２５ｍｌを、５０ｍｌの遠心管に移し、８５００ｒｐｍ５分間の遠心分離を行い、細胞を集め、上清を除去した。形質転換用の溶液は、６０％のＰＥＧ３３５０を４００μｌ、１ＭのＤＴＴ６０μｌ、４Ｍのリチウムアセテート３０μｌ、蒸留水１１０μｌを含む６００μｌとした。細胞を５００μｌの形質転換用溶液で溶解した。細胞溶解液１００μｌをマイクロ遠心分離用のチューブへ移し、上記作製のＤＮＡ断片５μｌをＦＬＯ遺伝子発現カセットとして加え、攪拌機を使って３０秒間よく攪拌した。チューブを４７℃で１５分間熱処理をした。形質転換された細胞溶液に１００ｍｌのＹＰＤ培地を加え、２００μｌをウラシル欠損培地へ広げ、２８℃で２-３日培養した。ウラシル欠損培地で生育した細胞のコロニーを採取して形質転換細胞を分離した。形質転換細胞は、ＹＰＤ培地に１−２日間生育させ、４℃で保存した。

＜ＦＬＯ遺伝子を発現するクルイベロマイセス・マルシアヌスとサッカロマイセス・セレビシエの凝集性＞
ＦＬＯ遺伝子を発現するクルイベロマイセス・マルシアヌスと、サッカロマイセス・セレビシエを、それぞれ５ｍｌのＹＰＤ培地の入ったテストチューブに接種し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。培養後、テストチューブを，攪拌機を使って１５秒間よく攪拌し、テストチューブはラックに１時間立てておき、経時的に凝集速度を観察した。図５に示すように、ＦＬＯ遺伝子過剰発現株では、野生株（ＷＴ：クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２、ＷＴ：サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００）に比較し、高い凝集性を示した。

＜クルイベロマイセス・マルシアヌスのＦＬＯ遺伝子過剰発現株の高温での凝集性＞
ＦＬＯ遺伝子を発現するクルイベロマイセス・マルシアヌスを、２４穴板の各ウエルに５ｍｌのＹＰＤ培地が入っているウエルに接種し、２８℃又は４０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。図６に示すように、クルイベロマイセス・マルシアヌスのＦＬＯ遺伝子過剰発現株では、高温での凝集性が維持されていた。
[参考例]
以下に参考例として、直鎖状ＤＮＡを用いた効率的なクルイベロマイセス・マルシアヌスの形質転換方法の条件検討を行った結果を示す。

＜材料＞
１．培地
ＹＰＤ培地は、蒸留水中、１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコースを溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブを掛けた。ウラシル欠損培地（以下「−Ｕ培地」とする）は、０．１７％酵母由来の窒素源（アミノ酸と硫酸アンモニウムを除く）、０．５％硫酸アンモニウム、２％グルコース、さらに０．０６％のアミノ酸混合物（４％アデノシンサルフェイト、１６％Ｌ−トリプトファン、１６％Ｌ−塩酸ヒスチジン、１６％Ｌ−メチオニン、３２％Ｌ−ロイシンと１６％Ｌ−塩酸リシン）とした。これらの成分は蒸留水に溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブに掛ける前に、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調製した。固体培地にする場合は、２％寒天を加えた。

２．酵母菌株
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７０４（ＡＴＣＣ２００８６８）より、形質転換のためのＵＲＡ３遺伝子断片を得た。宿主としては、クルイベロマイセス・マルシアヌスのＵＲＡ３欠損株であるＤＭＫＵ３−１０４２、ＮＣＹＣ５８７（National Collection of Yeast Cultures,Institute
of Food Research,Norwich Research Park,Colney,Norwich,United
Kingdom，ＮＲ４７ＵＡ．より入手）、ＩＦＯ０２７３とＩＦＯ０２７７（前記２種は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣより入手）を使用した。すべての酵母は、形質転換に使用する前に、新鮮なＹＰＤ培地のプレート上で、２８°Ｃ、１〜２日間培養した。

３．ＤＮＡ断片
サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７０４由来のＵＲＡ３遺伝子断片は、ＫＯＤ−ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲを行い増幅した。プライマーセットは、ＵＲＡ３−４０（５’−ａｔｃａａａｇａａｇｇｔｔａａｔｇｔｇｇｃｔｇｔｇｇ−３’：配列番号２４）とＵＲＡ３−４０ｃ（５’−ｔｔｃｇｔｃａｔｔａｔａｇａａａｔｃａｔｔａｃｇａｃ−３’：配列番号２５）、ＵＲＡ３−３００（５’−ｇａａｇａｇｔａｔｔｇａｇａａｇｇｇｃａａｃ−３’：配列番号２６）とＵＲＡ３−３００ｃ（５’−ｔｇｔｔｇｔｇａａｇｔｃａｔｔｇａｃａｃａｇ−３’：配列番号２７）、またはＵＲＡ３−１０００（５’−ｔａｃｔａｇｇａａａｔｇａｇａａｔｔｔｔｔｇｇａａ−３’：配列番号２８）とＵＲＡ３−１０００ｃ（５’−ｔｇｃｇａｔｔｇｇｃａｇｔｇｇａａｃａｇｔｇｇｔａ−３’：配列番号２９）を適宜用いた。ＰＣＲは、まず９４℃で１分間加熱し、その後、９４℃で２０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を３０サイクル行った。

＜形質転換方法＞
ＵＲＡ３遺伝子欠損株である、クルイベロマイセス・マルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２菌株細胞を、ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース、２％寒天）の入ったシャーレ上で２８℃、一夜培養し、そこから試験用の細胞を採取した。細胞は、ＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）２５ｍｌの入った三角フラスコへ接種し、２８℃で１７時間、通気下１５０ｒｐｍで振とう培養した。培養液５０ｍｌを取り、遠心分離管に移して、８０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。上清を除き、残渣に形質転換用バッファー（６０％ＰＥＧ３３５０
２ｍｌ、４Ｍリチウムアセテート１５０μｌ、１ＭＤＴＴ３００μｌ、滅菌蒸留水５５０μｌ）を１．４ｍｌ加え、１５秒間攪拌混合し、混合溶液をマイクロ遠心分離管に移した。１２０００ｒｐｍで１５秒間超遠心分離を行い、上清を除いた。残渣に、前記形質転換用バッファー５００μｌを加え、良く攪拌した。混合液１００μｌをマイクロ遠心分離管に移し、試験用には、ＤＮＡ断片（ＵＲＡ３）２５ｎｇ（０．５μｌ）を添加し、対照には添加しなかった。ミクサーでよく混合し、４７℃で１５分間ヒートショックを行って培養した。次いで、反応液に滅菌水及び-Ｕ培地１５０μｌを加えて懸濁し、混合液をスプリーダーで−Ｕ固体培地のプレートに伸ばし、２８℃で２〜３日培養した。

ＵＲＡ３−４０（配列番号２４）とＵＲＡ３−４０ｃ（配列番号２５）で増幅したＤＮＡ断片を用いて行った結果を図１４に示した。対照のＵＲＡ３遺伝子欠損株では、菌体の生育は見られず、試験用では、多くのコロニーが見られ、細胞にＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡが取り込まれたことが証明された。

＜酵母細胞濃度の影響＞
ＹＰＤ液体培地中で生育させた酵母細胞の濃度は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の吸光度で測定した。４２°Ｃで２時間のヒートショック処理を行うことを除いては、実施例１と同じ条件下で形質転換を行った。その結果、図９に示すように、酵母細胞の濃度は濃い程反応性が高いことが明らかになった。

＜形質転換用反応液組成の影響＞
１．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量と希釈溶媒
実施例１と同じ条件下で、形質転換用バッファー中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量を変えて形質転換を行った。ＰＥＧは、ＰＥＧ３３５０（平均分子量３３５０）とＰＥＧ６００（平均分子量６００）を用い、形質転換用バッファー中、最終濃度４０％となるようにした。また、対照としてＰＥＧを加えない場合も同様に行った。図１０に示すように、ＰＥＧ３３５０を添加する方が効果的な結果であった。

２．ＤＴＴ
上述の条件と同じ条件下で、形質転換用バッファー中のＤＴＴの最終濃度を０から１００ｍＭまで変えて形質転換を行った。その結果、図１１に示すように濃度依存的に、ＤＴＴの効果が明らかになった。

＜サッカロマイセスセレビシエ染色体由来のＤＮＡ断片の大きさの影響＞
上述の条件と同じ条件下で、サッカロマイセスセレビシエの染色体ＵＲＡ３ＤＮＡ断片を、増幅プライマーのみを変えて形質転換を行った。用いたプライマーは、ＤＮＡサイズが１．７０２ｋｂとなるＵＲＡ３−３００（配列番号２６）とＵＲＡ３−３００ｃ（配列番号２７）のセット、またはサイズが２．８０４ｋｂとなるＵＲＡ３−１０００（配列番号２８）とＵＲＡ３−１０００ｃ（配列番号２９）のセットを用いＰＣＲで増幅した。その結果、図１２に示すようにＰＣＲでは、いずれの場合にも高い形質転換効率を示した。なお、反応液の懸濁は−Ｕ培地を用いる方が高い形質転換効率を示した。

＜ヒートショックの時間と温度の影響＞
上述の条件と同じ条件下で、ＤＮＡ断片を加えた後の反応液のヒートショックについて、温度と時間のみを変えて形質転換を行った。ヒートショックは、４２℃、４７℃または４９℃の温度で、１分間、５分間、１５分間または４５分間行った。その結果、図１３に示すように、温度により効果的な時間が異なることが明らかになった。

＜宿主クルイベロマイセスマルシアヌスの菌株の選択＞
上述の条件と同じ条件下で、クルイベロマイセスマルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２と同じＵＲＡ３遺伝子欠損株である、ＮＣＹＣ５８７、ＩＦＯ０２７３およびＩＦＯ０２７７を用いて形質転換を行った。その結果、図１４に示すように、宿主としては、クルイベロマイセスマルシアヌスＤＭＫＵ３−１０４２を用いることが最も効果的であることが分かった。なお、反応液の懸濁は−Ｕ培地を用いる方が高い形質転換効率を示した。

本発明の酵母の形質転換方法は、従来の人為的形質転換法と比べて、操作が簡便であり、形質転換に要する時間が短く、且つ１μｇのＤＮＡあたり１０の６乗個以上という高い形質転換率を有し、さらに形質転換細胞の保存が良好で、継代が充分に行える利点がある。

本発明により、バイオエタノールの工業生産に有利な、凝集性と耐熱性に優れたエタノール産生酵母を提供することができる。

Claims

以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を順次含むことを特徴とする凝集性及び耐熱性を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）形質転換体の作製方法。
（Ａ）サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の内在性ＦＬＯ遺伝子の上流にマーカー遺伝子配列及び発現プロモーター配列を導入してサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体を作製する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で作製されたサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体由来の染色体ＤＮＡから、マーカー遺伝子配列、発現プロモーター配列、及び、ＦＬＯ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を得る工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたＤＮＡ断片を、ＦＬＯ遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入し、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体を作製する工程；
サッカロマイセス・セレビシエの内在性ＦＬＯ遺伝子が、ＦＬＯ１遺伝子、ＦＬＯ５遺伝子、ＦＬＯ９遺伝子、及び、ＦＬＯ１０遺伝子から選択される１以上のＦＬＯ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
栄養要求性マーカー遺伝子がヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも１つの栄養要求性遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
栄養要求性マーカー遺伝子がＵＲＡ３遺伝子であることを特徴とする請求項４記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
クルイベロマイセス・マルシアヌスが、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも１つの栄養要求性遺伝子に変異を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス変異体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
発現プロモーターがグリセルアルデヒド-３-リン酸
デヒドロゲナーゼ３（ＴＤＨ３）プロモーターであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
線状のＤＮＡ断片を、ＦＬＯ遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体が、ＲＡＫ４２９９株（ＮＩＴＥＢＰ−５１４）、ＲＡＫ４３００株（ＮＩＴＥＢＰ−５１５）、ＲＡＫ４３０１株（ＮＩＴＥＢＰ−５１６）、又は、ＲＡＫ４３０２株（ＮＩＴＥＢＰ−５１７）であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
請求項１〜８のいずれかに記載の作製方法により作製された凝集性及び耐熱性を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体。
ＲＡＫ４２９９株（ＮＩＴＥＢＰ−５１４）、ＲＡＫ４３００株（ＮＩＴＥＢＰ−５１５）、ＲＡＫ４３０１株（ＮＩＴＥＢＰ−５１６）、又は、ＲＡＫ４３０２株（ＮＩＴＥＢＰ−５１７）であることを特徴とする請求項１０記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体。