CN117126873A - 非天然氨基酸编码系统及其应用 - Google Patents

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CN117126873A CN202210557275.XA CN202210557275A CN117126873A CN 117126873 A CN117126873 A CN 117126873A CN 202210557275 A CN202210557275 A CN 202210557275A CN 117126873 A CN117126873 A CN 117126873A
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Abstract

提供了一种非天然氨基酸编码系统及其应用，其中非天然氨基酸编码系统包括：第一核酸，所述第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；和第二核酸，所述第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，其中所述第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。

Description

非天然氨基酸编码系统及其应用
技术领域
本申请涉及生物工程技术领域，具体涉及一种非天然氨基酸编码系统及其应用。
背景技术
工程生物和合成生物学的飞速发展极大地促进了生物技术的发展和应用。目前，人工遗传改造的生物体已经在工业生产、临床医疗和环境修复等方面展现出重要的应用前景。例如，作为人工合成生物体的里程碑事件，科学家获得了含有从头设计合成的多条染色体的酿酒酵母，可用于开发外源代谢途径与底盘菌株相互优化适配的高产菌株。然而，在这些工程生物给科研和产业的发展注入活力的同时，也带来了人工遗传改造生物体遗传信息的泄露等问题，这些潜在的安全问题有可能对自然环境生态及人类健康等产生负面影响。
为阻止工程生物逃逸至外界环境中，相关技术中的遏制策略包括营养缺陷型生物遏制策略、诱导型生物遏制策略和基因流屏障策略等，其中营养缺陷型生物遏制策略通常采用敲除工程生物中合成必须物质所需的基因，使工程生物的生长依赖于外源提供的营养物，一旦工程生物发生逃逸，将因为环境中缺乏对应的营养物而无法生长。然而，由于自然环境中广泛存在各种代谢必需分子，从而使该营养缺陷型菌株能够继续存活，使得生物遏制策略失效。
由此，亟待开发安全、有效的生物遏制技术，用于提高人类对于基因改造生物的可控性。
发明内容
本申请至少从以下方面解决了现有技术的问题之一。
为此，本申请的实施例提供了一种非天然氨基酸编码系统及其应用。
本申请第一方面实施例提出了一种非天然氨基酸编码系统，包含：
第一核酸，所述第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；和
第二核酸，所述第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，
其中所述第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述第一终止密码子编码非天然氨基酸。
在一些实施例中，所述一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列位于所述第一核酸中编码形成必需基因所表达的必须蛋白序列的N端的前18个氨基酸和/或所述必须蛋白二级结构之间的连接环(Loop)区域。
在一些实施例中，所述必需基因包括表达量处于中低水平的基因，可选地，所述必需基因包括以下的至少一个：CDC27和CDC4。
在一些实施例中，所述编码第一终止密码子的核苷酸序列取代编码所述必需基因CDC27第520位氨基酸的核苷酸序列，和/或所述编码第一终止密码子的核苷酸序列取代编码所述必需基因CDC4第325位氨基酸的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述非天然氨基酸编码工具包括甲氧基酪氨酰-tRNA合成酶/亮氨酸tRNA正交配对(LeuOmeRS/tRNACUA)工具；
所述第一终止密码子编码的所述非天然氨基酸包括O-甲基-L-酪氨酸(OmeY)。
在一些实施例中，所述非天然氨基酸编码系统还包含载体，所述载体选自由真核细胞表达载体和原核细胞表达载体组成的组，任选地，所述真核细胞表达载体包括：pDR196、pHISi、pESP-3、pESP-2、pESP-1、pHiSi-1、pGAG424、p53his、pRS426gal、pRS41H、pRS413、pRS416、pGBT9和pAUR123；任选地，所述原核细胞表达载体包括：pET28a-TagRFP-N、pTrc-CKS、pET-DsbA、pET-Trx、pET-28a(+)-GFP、pET-28a(+)-sumo、pET-3c-sumo、pET-35b(+)、pTXB1和pCWori。
在一些实施例中，所述载体包括第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含第一核酸；所述第二载体包含第二核酸。
在一些实施例中，所述载体还包含复制起点、筛选标记和酶切位点，
任选地，所述复制起点是以下至少之一：ARS和Ori；
任选地，所述筛选标记是编码以下蛋白的至少之一的核苷酸序列：His、Ura、Leu、Amp和Kan；
任选地，所述酶切位点是以下至少之一：ApaI、BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、SacI、SalI、SphI、XbaI和XhoI。
本申请第二方面实施例提出了一种基于非天然氨基酸的生物遏制方法，包括：
向待改造生物体提供如本申请第一方面实施例中任一实施例所述的非天然氨基酸编码系统，其中所述非天然氨基酸编码系统包括：
第一核酸，所述第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；和
第二核酸，所述第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，
其中所述第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
本申请第三方面实施例提出了一种通过本申请第二方面实施例所述的生物遏制方法获得的工程生物，所述工程生物包含第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；所述第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，其中所述第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述工程生物包括酵母或大肠杆菌，优选地，所述工程生物为酵母。
本申请第四方面实施例提出了一种如本申请第三方面实施例所述的工程生物在产生可持续生物质的用途，所述可持续生物质包括食品、饲料、药物、生物燃料和材料。
本申请的实施例实现了如下有益效果：
本申请所提出的非天然氨基酸编码系统及采用该系统的基于非天然氨基酸的生物遏制方法，通过对生物体必需基因中终止密码子位置的选择、和利用(LeuOmeRS/tRNACUA)编码工具将非天然氨基酸引入到生物体必须蛋白中，实现了工程生物体的生物遏制。本申请通过对“中心法则”中翻译过程的深度改造，能够解决基因突变、自然环境对代谢物的补充以及水平基因转移等方式使得生物遏制策略失效的问题，具有安全有效、易于操作、和广泛的适用性。且本申请在消除潜在的生物安全问题的同时，也为工程菌株在开放环境中的应用铺平了道路。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据本申请实施例的Cdc27蛋白H520位点结构示意图；
图2为根据本申请实施例的Cdc4蛋白F325位点结构示意图；
图3为根据本申请实施例的yXF082和yXF083回补验证图；
图4为根据本申请实施例的yXF082在37℃条件下的梯度点板图；
图5为根据本申请实施例的yXF083在37℃条件下的梯度点板图；
图6为根据本申请实施例的酵母同源重组引入琥珀密码子示意图；
图7为根据本申请实施例的yXF098和yXF097及对照菌株BY4741的点板结果图；
图8为根据本申请实施例的yXF098、yXF097及对照菌株BY4741生长倍增时间；
图9为根据本申请实施例的yXF099及对照菌株BY4741的点板结果图；
图10为根据本申请实施例的酵母生物遏制方法的原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，并非限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
本申请是基于发明人的以下认识做出的：
相关技术中生物遏制策略存在基因突变、自然环境对代谢物的补充以及水平基因转移等方式使得生物遏制策略失效的突出问题。对此，本申请提出了一种基于非天然氨基酸的生物遏制方法，即通过在必需基因中的合适位置引入终止密码子，随后利用密码子拓展技术，借助于非氨基酸编码工具将非天然氨基酸引入到必须蛋白的特定位点，从而实现生物体中必须蛋白的全合成，并使其的生长依赖于外源添加的非天然氨基酸，以此达到生物遏制的目的，最终实现对“生命”的高度可控。本申请所提出的非天然氨基酸编码系统及对应的生物遏制策略安全有效、易于操作，且具有广泛的适用性。
由此，本申请提供了一种基于非天然氨基酸的生物遏制策略及方法。利用非天然氨基酸编码工具，实现在生物体的必需基因中定点引入非天然氨基酸，利用非天然氨基酸可及性来调控必须蛋白的全长表达，进而达到生物遏制的目的。该策略选择的非天然氨基酸引入位点主要包括：(1)蛋白序列的N端(前18个氨基酸)；(2)蛋白二级结构之间的连接环区域。上述位置的选择不需要对目标必须蛋白的结构和功能有深入了解，因此，本方法具有良好的普适性。此外，2个非天然氨基酸引入位点的联合使用有益于进一步提升该系统和遏制策略的有效性。
本申请的核心内容：首先是必需基因中终止密码子位置的选择，即选择对蛋白结构影响较小的氨基酸位点。通过大量实验筛选验证，发明人发现必须蛋白一级结构的N端的前18个氨基酸和必须蛋白二级结构域之间的连接环(Loop)区域能够作为非天然氨基酸的替换位点。其次，本申请选择了甲氧基酪氨酰-tRNA合成酶/亮氨酸tRNA正交配对(LeuOmeRS/tRNACUA)作为非天然氨基酸编码工具，该编码工具中的LeuOmeRS能够特异性识别非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸(OmeY)和tRNACUA，并催化OmeY加载到tRNACUA的3’-CCA上，实现tRNACUA的活化，活化后的tRNACUA通过读通终止密码子，产生全长的必须蛋白，生物体得以存活。在自然环境中不存在非天然氨基酸，逃逸菌株无法产生全长的必须蛋白，其只能依赖于人工提供的非天然氨基酸才可存活，由此降低了工程生物逃逸的可能性。同时，本申请实施例提出的基于非天然氨基酸的生物遏制策略利用了不同于野生生命体的遗传编码机制(即引入了非天然氨基酸)，有效地阻断了工程菌株自身遗传信息的转移。本申请的实施例通过对“中心法则”中翻译过程的深度改造，将基于非天然氨基酸的翻译水平调控用于生物遏制。具体地，在本申请的实施例中，通过对目标必须蛋白的设计和改造，在必需基因中引入琥珀密码子(TAG)，利用正交的非天然氨基酸编码工具将非天然氨基酸引入到生物体中，使得必须蛋白的全合成和生物体的生长依赖于外源添加的非天然氨基酸，从而达到生物遏制的目的，最终实现对“人造生命”的高度控制。
在本申请的实施例中，“必需基因”(essential genes)是指在缺失时会引起致死表型的基因。必需基因在某些条件下对一个物种的生存和发展起决定性作用的基因。可以理解的是，虽然在不同的物种之间具有不同的基因组大小和基因组成，但是这些差别很大的基因组中都包含各自一套的必需基因用以维持关键的细胞功能。必需基因揭示了一个物种最基础的生物机制，是该物种得以生存的必要条件。不同物种之间的必需基因不同，例如在酵母中，必需基因包括CDC27、CDC4、MET30等。
在本申请的实施例中，“第一核酸”包含必需基因的至少一部分片段。可以理解的是，所述“至少一部分片段”为必需基因的任意一部分片段。在一些实施例中，第一核酸为必需基因的全长片段。在一些实施例中，第一核酸为必需基因编码区片段。
在本申请的实施例中，“第二终止密码子”所编码的是天然存在的终止密码子，其位于必需基因编码区序列所转录的mRNA的3’末端。“第一终止密码子”是指除位于mRNA的3’末端的自然状态下的“第二终止密码子”之外的、位于该必需基因其它位置上的终止密码子。在一些实施例中，第一终止密码子和第二终止密码子包括：UAG、UAA、UGA。编码第一终止密码子和第二终止密码子的核苷酸序列包括：TAG、TAA、TGA。在一些实施例中，第一终止密码子是UGA，编码第一终止密码子的核苷酸序列为TAG。
“非天然氨基酸”是指不由现有的64种遗传密码子编码的氨基酸。在本申请的实施例中，非天然氨基酸包括O-甲基-L-酪氨酸(OmeY)。
在本申请的实施例中，“第二核酸”编码上述非天然氨基酸编码工具。“非天然氨基酸编码工具”包含某类非天然氨基酸的tRNA合成酶(RS)和tRNA，该工具中的tRNA合成酶能够特异性识别某类非天然氨基酸，并催化该非天然氨基酸加载到tRNA上，以此实现tRNA的活化，活化后的tRNA能够特异性识别编码该非天然氨基酸的密码子。在本申请的实施例中，非天然氨基酸编码工具包括：甲氧基酪氨酰-tRNA合成酶/亮氨酸tRNA正交配对(LeuOmeRS/tRNACUA)工具。在一些实施例中，使用甲氧基酪氨酰-tRNA合成酶/亮氨酸tRNA正交配对(LeuOmeRS/tRNACUA)作为非天然氨基酸编码工具，该编码工具中的LeuOmeRS能够特异性识别非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸(OmeY)和tRNACUA，并催化OmeY加载到tRNACUA的3’-CCA上，实现tRNACUA的活化，活化后的tRNACUA通过读通终止密码子，产生全长的必须蛋白，生物体得以存活。
在本申请实施例中，通过在必需基因中引入一个或多个第一终止密码子来进行生物阻遏。可以理解的是，该一个或多个第一终止密码子的编码序列可以位于必需基因的编码区。在一些实施例中，该一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列位于第一核酸中编码形成必需基因所表达的必须蛋白序列的N端的前18个氨基酸和/或所述必须蛋白二级结构之间的连接环(Loop)区域。
在一些实施例中，必需基因包括微生物中表达量处于中低水平的基因。在一些实施例中，必需基因包括以下的至少一个：CDC27和CDC4。
在本申请实施例中，使用编码第一终止密码子的核苷酸序列对必需基因所编码的必须蛋白的某些氨基酸位点进行替换(取代)以实现非天然氨基酸的引入。可以理解的是，编码第一终止密码子的核苷酸序列可以替换(取代)必需基因的编码区的任意核苷酸序列，只要保证替换后该序列无法表达出全长的和/或有效力的必须蛋白即可，本申请对该替换位点不做限制。在一些实施例中，编码第一终止密码子的核苷酸序列取代编码必需基因CDC27第520位氨基酸的核苷酸序列，和/或编码第一终止密码子的核苷酸序列取代编码必需基因CDC4第325位氨基酸的核苷酸序列。
在本申请实施例中，“载体”是指核酸分子，优选指人工核酸分子。本申请实施例上下文中的载体适用于并入或携带所需的核酸序列，例如包含开放阅读框的核酸序列。这样的载体可以是储存载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。储存载体是允许方便地储存核酸分子(例如mRNA分子)的载体。因此，载体可以包含对应于例如所需的mRNA序列或其部分的序列，例如对应于mRNA的开放阅读框和3'-UTR的序列。表达载体可以用于产生表达产物如RNA，例如mRNA，或肽、多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包含转录载体序列片段所需的序列，例如启动子序列，例如RNA聚合酶启动子序列。克隆载体通常是含有克隆位点的载体，克隆位点可以用于将核酸序列并入载体中。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合于将核酸分子转移到细胞或生物体中的载体，例如病毒载体。本申请实施例上下文中的载体可以是例如真核细胞表达载体或原核细胞表达载体。在一些实施例中，真核细胞表达载体包括：pDR196、pHISi、pESP-3、pESP-2、pESP-1、pHiSi-1、pGAG424、p53his、pRS426gal、pRS41H、pRS413、pRS416、pGBT9、pAUR123；原核细胞表达载体包括：pET28a-TagRFP-N、pTrc-CKS、pET-DsbA、pET-Trx、pET-28a(+)-GFP、pET-28a(+)-sumo、pET-3c-sumo、pET-35b(+)、pTXB1、pCWori。优选地，载体是真核生物载体，例如pRS413、pRS416。优选地，本申请意义上的载体包含酶切位点、筛选标记和适合于载体增殖的序列，例如复制起点。优选地，本申请实施例上下文中的载体是质粒载体。任选地，所述复制起点是以下至少之一：ARS和Ori；任选地，所述筛选标记是编码以下蛋白的至少之一的核苷酸序列：His、Ura、Leu、Amp和Kan；任选地，所述酶切位点是以下至少之一：ApaI、BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、SacI、SalI、SphI、XbaI、XhoI。
本申请实施例所提出的非天然氨基酸编码系统，通过对“中心法则”中翻译过程的深度改造，将基于非天然氨基酸的翻译水平调控用于生物遏制。具体地，通过对目标必须蛋白的设计和改造，在必需基因中引入终止密码子，利用正交的非天然氨基酸编码工具将非天然氨基酸引入到生物体中，使得必须蛋白的全合成和生物体的生长依赖于外源添加的非天然氨基酸，从而达到生物遏制的目的，最终实现对“人造生命”的高度控制。本申请所提出的非天然氨基酸编码系统安全有效、易于操作，且具有广泛的适用性。
本申请实施例还提出了一种基于非天然氨基酸的生物遏制方法，包括：向待改造生物体提供如上方任一实施例所述的非天然氨基酸编码系统，该非天然氨基酸编码系统包括：
第一核酸，该第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；和
第二核酸，该第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，
其中该第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
可以理解的是，在本申请实施例中，该基于非天然氨基酸的生物遏制方法通过向待改造生物体提供如上方任一实施例所述的非天然氨基酸编码系统，即，使待改造生物体中包含上方任一实施例所述的非天然氨基酸编码系统，通过对“中心法则”中翻译过程的深度改造，将基于非天然氨基酸的翻译水平调控用于生物遏制。具体地，通过对目标必须蛋白的设计和改造，在必需基因中引入终止密码子，利用正交的非天然氨基酸编码工具将非天然氨基酸引入到待改造生物体中，使得必须蛋白的全合成和生物体的生长依赖于外源添加的非天然氨基酸，从而达到生物遏制的目的，最终实现对“人造生命”的高度控制。本申请所提出的基于非天然氨基酸的生物遏制方法安全有效、易于操作，且具有广泛的适用性。
本申请实施例还提出了一种通过上述实施例中任一实施例提出的生物遏制方法获得的工程生物，其中该工程生物包含第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，其中第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
在本申请实施例中，“工程生物”是指通过定向改造和大规模培养以生产大量有用代谢产物或发挥其独特生理功能的工程菌或工程细胞株。可以理解的是，本申请中所提出的非天然氨基酸编码系统及生物遏制策略具有普适性，因此生产中所使用的底盘菌株均可以应用该系统和该策略进行改造以避免菌株的生物逃逸，本申请无意对具体的工程生物类别进行限制。在一些实施例中，工程生物包括酵母或大肠杆菌，优选为酵母。
本申请实施例所提出的工程生物，是通过基于非天然氨基酸的生物遏制方法、通过向待改造生物体提供如上方任一实施例所述的非天然氨基酸编码系统，即，使待改造生物体中包含上方任一实施例所述的非天然氨基酸编码系统获得的。通过对“中心法则”中翻译过程的深度改造，将基于非天然氨基酸的翻译水平调控用于生物遏制。具体地，通过对该工程生物的目标必须蛋白的设计和改造，在必需基因中引入终止密码子，利用正交的非天然氨基酸编码工具将非天然氨基酸引入到该工程生物中，使得必须蛋白的全合成和工程生物的生长依赖于外源添加的非天然氨基酸，从而达到生物遏制的目的，最终实现对“人造生命”的高度控制。
本申请实施例还提出了一种根据上方任一实施例中所述的工程生物在产生可持续生物质的用途，其中可持续生物质包括食品、饲料、药物、生物燃料和材料。
根据本申请实施例所提出的工程生物，由于其被改造为包含上述实施例中所述的非天然氨基酸编码系统，因而该工程生物具有高度可控性，由此通过控制该工程生物，即通过对该工程生物进行生物遏制以防止其逃逸，实现了对利用该工程生物在产生可持续生物质的用途的高度控制，以此有效保证了安全绿色的可持续生物质的生产。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
本实施例基于温度敏感性菌株的单个必须蛋白进行了生物遏制效果测试。
本实施例所采用的非天然氨基酸编码工具为甲氧基酪氨酰-tRNA合成酶/亮氨酸tRNA正交配对(LeuOmeRS pair，LeuOmeRS/tRNACUA，ACS Synth.Biol.2018,7,9,2256–2269)，即提供包含上述LeuOmeRS/tRNACUA的pXF231载体，并分别将酵母必需基因CDC27和CDC4编码的蛋白中Loop区域中的H520的F325作为非天然氨基酸的引入位点，其具体位点示意图分别如图1和2所示。
1.1质粒构建
利用Gibson组装将野生型CDC27基因(SEQ ID NO：1)组装在pRS416质粒中，即构建出pXF412质粒(即pRS416-CDC27)；同理，将野生型CDC4基因(SEQ ID NO：2)组装在pRS413质粒中，构建出pXF413质粒(即pRS413-CDC4)。
利用带有突变位点的引物，分别以pXF412和pXF413为模板进行PCR扩增，其中引物的具体信息如表1所示，PCR反应体系和反应条件分为如表2、表3所示。所得PCR扩增产物即为引入了TAG的突变型CDC27和CDC4基因，其具体突变形式分别为H520amb和F325amb。将PCR反应产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒参照其说明书指示进行纯化回收，随后再利用Gibson组装，将带有TAG的CDC27(H520amb)(SEQ ID NO：3)组装在pRS416质粒中，构建出质粒pXF414，即pRS416-CDC27(H520amb)；同理，将带有TAG的CDC4(F325amb)(SEQ ID NO：4)组装在pRS413质粒中，构建出的质粒pXF415，即pRS413-CDC4(F325amb)。
表1引物信息
注：带有下划线的碱基为引入TAG位置
表2 PCR反应体系
组分 用量
ddH2O 19μl
10μM DNA模板 1μl
10μM引物 2.5μl
CloneAmp HiFi PCR Premix 2× 25μl
Total 50μl
注：引物：上下游引物各2.5μl。
表3 PCR反应条件
1.2质粒扩增和提取
将pXF412、pXF413、pXF414和pXF415分别转化到大肠杆菌DH5a中进行质粒的扩增和提取，具体步骤如下：
1.2.1转化
冰上融化大肠杆菌感受态DH5a，分别加1μg的pXF412、pXF413、pXF414和pXF415质粒于50μl感受态细胞中，冰上放置30分钟；
随后置于42℃水浴锅中热激90秒，然后迅速转移至冰上3分钟；
于超净台内，向各管含上述质粒的感受态细胞中分别加入200μl LB培养液(无抗性)，然后转移到摇床中，37℃下低速培养1h。
将200μl的细胞涂布于LB+Carb固体培养基上，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养。
挑取单克隆。
1.2.2质粒扩增和提取
将单克隆菌落(即为经筛选转化成功的大肠杆菌DH5a)分别接种于LB+Carb的液体培养基中并在37℃、220rpm的摇床中过夜培养以进行质粒扩增。使用天根质粒提取试剂盒参照其说明书指示进行质粒提取。
将提取的质粒保存在-20℃备用。
1.3温度敏感型菌株回补验证
将pRS416质粒(空载质粒)、pXF412质粒(pRS416-CDC27)分别转化到yXF082温度敏感菌株中，并将pRS413质粒(空载质粒)、pXF413质粒(pRS413-CDC4)分别转化到yXF083温度敏感菌株中，具体转化步骤如下：
1.3.1挑取野生型酵母单克隆(即yXF082和yXF083)，接种于4ml酵母富集培养基YPD中，于30℃、200rpm摇床培养24小时；
1.3.2取1ml上述培养的菌液，使用分光光度计测定初始菌密度，即OD600值：随后根据初始菌密度，取适量菌液接种于含有20ml YPD的三角瓶中，使每毫升菌液OD600为0.1，然后于30℃、200rpm摇床培养至每毫升菌液OD600为0.6-1；
1.3.3将浓度达标的菌液于2000rpm/min，离心5min，去上清收集菌体；
1.3.4加入10ml无菌ddH2O重悬细胞，2000rpm/min，离心5min，去上清收集菌体；
1.3.5加入10ml 0.1M LioAc重悬细胞，2000rpm/min，离心5min，去上清收集菌体；
1.3.6加入1ml 0.1M LioAc重悬细胞，即获得感受态细胞。
1.3.7准备转化反应离心管，每个离心管都包含以下体系：
注：目标DNA即为待转入的质粒DNA
1.3.8将离心管中的上述体系振荡混匀，小心添加100μl感受态细胞于最上层。
1.3.9颠倒混匀，30℃培养30min。
1.3.10加50μl DMSO，迅速颠倒混匀。
1.3.11 42℃热激15min，置于冰上1min。
1.3.12 8000rpm/min离心30s，去上清。
1.3.13用400μl 5mM CaCl2重悬细胞，室温培养10min。
1.3.14取100μl菌液涂布于相应的缺陷型培养基上，培养2-3天，待长出单克隆。
将1.3.13中得到的yXF082的重悬菌液点板于SC-Ura的固体培养基上，分别置于20℃和37℃的条件下培养5天。同理，将1.3.13中得到的yXF083的重悬菌液点板于SC-His的固体培养基上，分别置于20℃和37℃的条件下培养3天，并观察其单克隆生长情况。具体菌株生长结果如图3所示。
可以理解的是，由于yXF082及yXF083菌株在37℃以上的条件下，其自身基因组的CDC27和CDC4基因表达的蛋白折叠错误，因而导致菌株不能正常生长。在本实施例中，如图3所示，在20℃时，含有两种质粒的yXF082和yXF083菌株均能正常生长；而在37℃时，只含有空载质粒的温度敏感菌株不能正常生长，而对应的含有必需CDC27或CDC4野生型基因(即回补基因)的质粒的温度敏感菌株可以正常生长，因此证明了温度敏感菌株回补实验成功，该温度敏感菌株可以用于后续试验，即为后续将琥珀密码子引入到构建在质粒上的必需基因的突变回补提供了可行性基础。
1.4CDC4及CDC27在温度敏感型菌株中的突变回补及生物遏制验证
1.4.1CDC27突变型的质粒转化和回补验证
按照上述实施例中的转化步骤，将带有非天然氨基酸编码工具LeuOmeRS/tRNACUA的pXF231和带有突变型CDC27(H520amb)的pXF414质粒共同转化到yXF082酵母菌株中，并同时设置对照组，分别为：
阴性对照：带有pRS415(空载)和pRS416(空载)的yXF082菌株、带有pXF231和pRS416(空载)的yXF082菌株；
阳性对照：带有pXF231和pXF412(pRS416-CDC27，野生型)的yXF082菌株。
将上述共同转化的菌株于SC-Leu-Ura固体培养基中20℃培养5天，获得正确单克隆后，挑取该单克隆于SC-Leu-Ura液体培养基中，20℃振荡培养2天，然后用无菌ddH2O按照OD600＝10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌液浓度进行梯度点板，其中将菌液分别点板于SC-Leu-Ura+OmeY固体培养基和SC-Leu-Ura固体培养基上，于37℃培养2天，结果如图4所示。
图4为yXF082菌株在37℃条件下的梯度点板图。从图4的梯度点板结果可以看出，在37℃、加减OmeY条件(即是否存在非天然氨基酸OmeY)下，不含有CDC27回补基因质粒(即带有pRS415空载质粒和pRS416空载质粒及带有pXF231和pRS416空载质粒)的菌株均不能生长，而第三行含有pXF412质粒的菌株可以正常生长；在第四行，在加OmeY的培养基中，含有pXF414质粒的菌株可以正常生长，而在不加OmeY的培养基中，含有pXF414质粒的菌株不能生长，由此表明pXF231配对工具可以读通CDC27(H520amb)，且通过CDC27基因H520 amb突变引入OmeY不影响蛋白的结构及功能。在缺少非天然氨基酸OmeY的培养基SC-Leu-Ura上，含有pXF231和pXF414的yXF082菌株无法正常生长的实验结果，有效说明了本申请实施例所提出的关于非天然氨基酸的系统的生物遏制策略可以通过控制培养条件(即是否提供对应的非天然氨基酸)成功控制温度敏感菌的生长，由此实现了优异的生物阻遏的效果。
1.4.2CDC4突变型的质粒转化和回补验证
同理，按照上述1.4.1中的实验方法，对含有CDC4突变型基因的质粒进行转化和回补验证：将pXF231和带有突变型CDC4(F325amb)的pXF415质粒共同转化到yXF083酵母菌株中，并同时设置对照组，分别为：
阴性对照：带有pRS415和pRS413(空载)的yXF083菌株、带有pXF231和pRS413(空载)的yXF083菌株；
阳性对照：带有pXF231和pXF413(pRS413-CDC4，野生型)的yXF083菌株。
将上述共同转化的菌株于SC-Leu-His固体培养基中20℃培养3天，获得正确单克隆后，挑取该单克隆于SC-Leu-His液体培养基中，20℃振荡培养2天，然后进行梯度点板，分别点板于SC-Leu-His固体培养基和SC-Leu-His+OmeY固体培养基上，于37℃培养2天，结果如图5所示。
图5为yXF083菌株在37℃条件下的梯度点板图。从图5的梯度点板结果可以看出，在37℃、加减OmeY条件下，不含有CDC4回补基因质粒(即带有pRS415和pRS413空载质粒及带有pXF231和pRS413空载质粒)的菌株均不能生长，而第三行含有pXF413质粒的菌株可以正常生长；在第四行，在加OmeY的培养基中，含有pXF415质粒的菌株可以正常生长，而在不加OmeY的培养基中，含有pXF415质粒的菌株不能生长，由此表明pXF231配对工具可以读通CDC4(F325amb)，且通过CDC4基因F325amb突变引入OmeY不影响蛋白的结构及功能。在缺少非天然氨基酸OmeY的培养基SC-Leu-His上，含有pXF231和pXF414的yXF082菌株无法正常生长的实验结果，有效说明了本申请实施例所提出的关于非天然氨基酸的生物遏制策略可以通过控制培养条件(即是否提供对应的非天然氨基酸)成功控制温度敏感菌的生长，由此实现了优异的生物阻遏的效果。
实施例2
本实施例针对基因组整合版本的单个必须蛋白(CDC4、CDC27)的生物遏制效果进行了测试。
2.1制备单基因引入TAG生物遏制菌株
根据实施例一中的温度敏感型菌株的回补测试实验，进一步将CDC27(H520amb)和CDC4(F325amb)整合到对应的菌株基因组的CDC27和CDC4基因中。具体步骤如下：
首先通过PCR，以pXF414为模板获得用于基因组整合的突变型CDC27(H520amb)基因片段(SEQ ID NO：3)、以pXF415为模板获得用于基因组整合的突变型CDC4(F325amb)基因片段(SEQ ID NO：4)，以及以pRS416为模板获得Ura3的基因片段(SEQ ID NO：9，此片段用作基因组整合时的筛选基因)，其中各引物信息如下表表4所示，PCR反应条件及反应体系同实施例一。
表4
注：下划线标注的碱基区域是与Ura3同源的区域
将各PCR反应产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒参照其说明书指示进行纯化回收。随后，通过OE-PCR获得CDC27(H520amb)-Ura3和CDC4(F325amb)-Ura3基因片段，其中PCR的引物信息、反应体系和反应条件分为如表5-7所示。
表5 OE-PCR引物信息
注：下划线标注碱基分别是与CDC27或者CDC4的终止子区域同源
表6 OE-PCR反应体系
注：DNA模板分别为CDC27(H520amb)和Ura3 DNA片段各0.5μl，或CDC4(F325amb)和Ura3DNA片段各0.5μl。
引物：上下游引物各2.5μl。
表7 OE-PCR反应条件
将OE-PCR反应产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒参照其说明书指示进行纯化回收。随后，通过酵母转化法(转化方法同实施例一)，利用酵母基因同源重组，将CDC27(H520amb)-Ura3基因片段整合到酵母BY4741的基因组中，测序验证正确后，即得到菌株yXF097。同理，将CDC4(F325amb)-Ura3基因片段整合到酵母BY4741基因组中，测序验证正确后，即得菌株yXF098。基因组整合示意图如图6。
图6为酵母同源重组引入琥珀密码子示意图，其中浅色箭头表示必需基因，浅色箭头中的方形表示TAG，深灰色箭头表示用于同源重组的筛选标记。如图6所示，利用酵母细胞易于接纳外源DNA的特点，通过酵母转化技术，将pXF231转化到酵母中。随后利用酵母基因组较容易发生同源重组的特点，通过酵母转化技术，将带有TAG琥珀密码子的同源片段整合到目标必需基因的合适位置，即在同源重组的过程中，带有TAG的突变型必需基因和筛选标记通过交换重组整合入酵母的基因组序列中。在后续实验中，通过筛选该筛选标记即可初步验证整合结果，随后经测序分析即可确认整合情况，由此得到用于生物遏制的工程酵母。
2.2菌株生长状态测定
将菌株BY4741-A(野生型)、yXF097(BY4741-CDC27(H520amb)-Ura3)、yXF098(BY4741-CDC4(F325amb)-Ura3)分别梯度点板在SC-Ura-Leu和SC-Ura-Leu+OmeY的固体培养基上，培养2天，其生长结果如图7所示。
图7为yXF098和yXF097及对照菌株BY4741-A的点板结果图。由图7可见，在无OmeY的条件下，yXF097和yXF098均不能生长，而在存在OmeY的条件下，yXF097和yXF098可以正常生长，这说明本申请实施例中的生物遏制策略有效。同时，在含有OmeY的培养基上，yXF097和yXF098的克隆大小与BY4741-A基本无差别，这说明本申请实施例中所选择的非天然氨基酸编码工具能够高效读通必须蛋白，且终止密码子引入的非天然氨基酸并未影响该必须蛋白的结构和功能。
在SC-Ura-Leu+OmeY液体培养基中，在30℃下于bioscreen生长曲线测定仪中测定yXF097和yXF098的生长曲线，以此获得菌株的倍增时间。接菌量起始量为OD600＝10-2，设置仪器每隔20分钟测一次OD600，直至菌株生长达到平台期，总测量时间为48小时。菌株倍增时间计算方法参考PRECOG:A tool for automated extraction and visualization offitness components in microbial growth phenomics。经计算得出，BY4741-A的倍增时间为2.06小时，yXF098倍增时间为2.77小时，yXF097倍增时间为2.59小时，结果如图8。
2.3单基因引入TAG菌株生物遏制效果验证
对2.1中获得的yXF097和yXF098菌株(工程酵母)进行逃逸率测试。具体步骤如下：
分别将yXF097和yXF098菌株接种到SC-Leu-Ura+OmeY液体培养基中使其初始浓度为OD600＝0.1，30℃、200rpm振荡培养到对数后期，即培养至OD600约为2-3；
分别将yXF097和yXF098菌液水洗3遍后，将其稀释到OD600＝1；
分别取10-4mL yXF097和yXF098菌液涂在加有SC-Leu-Ura+OmeY固体培养基板子上，于30℃培养箱培养2天，平板计数；
分别取10-2mL、10-1mL、1mL、10mL涂在SC-Leu-Ura固体培养基板子上，于30℃培养箱培养8天，平板计数。
计算菌株逃逸率。逃逸率计算方法为，例如：10-4mL菌液涂在SC-Leu-Ura+OmeY固体培养基板子上培养2天后，长出的单克隆数为x；当培养第八天涂10-2mL、10-1mL菌液的SC-Leu-Ura固体培养基上无单克隆长出，且涂1mL、10mL菌液的减非天然氨基酸的固体培养基上长出单克隆，则以长出克隆数最少涂1mL菌液的固体平板进行计数，单克隆数为y。则该菌株的逃逸率＝(y×10-4)/(x×1)。
按照上述算法，本实施例中yXF097和yXF098的逃逸率如下表表8所示。
表8 yXF097和yXF098逃逸率
菌株 yXF097 yXF098
逃逸率 (3.72±1.38)×10-7 (5.25±3.55)×10-7
由表8可见，yXF097和yXF098菌株的逃逸率低，说明本申请实施例中的生物遏制方法有效，即通过外源引入非天然氨基酸的策略可以有效用于酵母菌株的生物逃逸的防御，此外也证明必需基因的Loop区域是引入外源的非天然氨基酸的有效的可执行位点。
实施例3
本实施例对两个必须蛋白(Cdc4，Cdc27)合并版本的生物遏制效果进行了测试。
3.1制备多基因引入TAG生物遏制菌株
在单基因引入TAG菌株逃逸结果的基础上，进一步将CDC27(H520amb)和CDC4(F325amb)两个突变同时整合到对应的基因组的CDC27和CDC4基因中，即构建了多基因引入TAG的生物遏制菌株。具体步骤如下：
首先以pXF415为模板获得用于基因组整合的CDC4(F325amb)基因片段(SEQ IDNO：18)，以及以pRS413为模板获得His3的基因片段(SEQ ID NO：19，此片段用作基因组整合时的筛选基因)。其中各引物信息如下表表9所示，PCR反应条件及反应体系同实施例一。
表9 PCR引物信息
注：下划线标注的碱基区域是与His3同源区域。
将各PCR反应产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒参照其说明书指示进行纯化回收。随后，通过OE-PCR获得CDC4(F325amb)-His3基因片段，其中OE-PCR的引物信息如下表表10所示，其反应体系和反应条件同实施例二。
表10 OE-PCR引物信息
注：下划线标注的碱基是与CDC4的终止子区域同源
将OE-PCR反应产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒参照其说明书指示进行纯化回收。然后通过酵母转化法(转化方法同实施例一)，利用酵母基因同源重组，将CDC4(F325amb)-His3基因片段整合到实施例2中的工程酵母yXF097基因组中，测序验证正确后，即得同时包含两个引入TAG的基因的菌株yXF099。
3.2菌株生长状态测定
将菌株BY4741-B(野生型)和上述yXF099(BY4741-CDC27(H520amb)-Ura-CDC4(F325amb)-His)梯度点板在SC-3(即SC-Ura-Leu-His三缺)和SC-3+OmeY的固体培养基上，培养2天，其生长结果如图9所示。
图9为yXF099及对照菌株BY4741-B的点板结果图。由图9可见，在无OmeY的条件下，yXF099不能生长，而在OmeY存在的条件下，yXF099可以正常生长，这说明本申请实施例中的多基因引入TAG的生物遏制策略有效。同时，在含有OmeY的培养基上，yXF099的克隆大小与野生型BY4741-B基本无差别，这说明本申请实施例中所选择的非天然氨基酸编码工具能够高效读通必须蛋白，且多个终止密码子引入的非天然氨基酸并未影响对应的必须蛋白的结构和功能。
3.3多基因引入TAG菌株生物遏制效果验证
对3.1中获得的yXF099菌株(工程酵母)进行逃逸率测试。具体步骤如下：
将yXF099菌株接种到SC-3+OmeY液体培养基中使其初始浓度为OD600＝0.1，30℃、200rpm振荡培养到对数后期，即培养至OD600约为2-3；
将yXF099菌液水洗3遍后，稀释到OD600＝1；
取10-4mL yXF099菌液涂在加有SC-3+OmeY固体培养基板子上，于30℃培养箱培养2天，平板计数；
分别取10-2mL、10-1mL、1mL、10mL涂在SC-3固体培养基板子上，于30℃培养箱培养8天，平板计数；
计算菌株逃逸率，计算方法同实施例二中的逃逸率计算方法。按照该算法计算出的yXF099菌株逃逸率如下表表11所示。
表11 yXF099逃逸率
菌株 yXF099
逃逸率 (1.03±0.48)×10-7
由表11可见，yXF099菌株的逃逸率低，并且与实施例二中的单位点引物TAG的yXF097和yXF098菌株相比，多位点引入TAG的yXF099的逃逸率显著更低，具体降低了5倍左右，表明随着TAG引入个数的增加，可以进一步降低菌株逃逸率，由此证明通过增加TAG的引入个数可以有效的降低菌株逃逸率。
可以理解的是，本申请通过在酵母中引入高效、正交的非天然氨基酸编码工具，在必需基因中选择性地引入终止密码子UAG，利用正交的编码系统在终止密码子位置引入非天然氨基酸，使得必须蛋白的全合成(即读通)以及人工酵母的生长依赖于外源添加的非天然氨基酸，以此达到高效的生物遏制目的。
本申请上述实施例中所涉及的菌株和质粒的具体信息分别如下表表12和13所示。
表12菌株信息
表13质粒信息
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 非天然氨基酸编码系统及其应用
<130> FS211179C1
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2304
<212> DNA
<213> 酵母
<400> 1
atggcggtaa atcctgagtt agcaccgttc accctctcga gaggaatccc cagctttgat 60
gatcaagctt tgagcaccat catacagctt caggactgca ttcagcaggc tattcagcag 120
ttgaactaca gtaccgcaga gtttttggcc gaactgctct atgctgaatg ctccattctc 180
gataaatcaa gtgtttactg gtccgatgcg gtatatttat atgcactttc gctgtttctg 240
aataaaagct accacactgc gttccagata tccaaagaat tcaaggagta tcatcttggt 300
atcgcttaca tattcgggcg ttgtgcttta cagctttcgc agggagttaa cgaagctatc 360
ctcactcttc tctcaataat aaatgtattt tcttcgaaca gcagtaatac gcgcataaat 420
atggtgttga attctaatct cgtccatatt cccgatttgg ccactttgaa ttgcctgtta 480
ggcaatcttt atatgaaact ggaccattct aaggagggag cattttatca ttctgaagca 540
ttagccatta atccttacct ttgggaatct tacgaagcga tttgtaaaat gagagctacc 600
gtggatctca agagggtttt tttcgacatt gcagggaaaa aaagtaatag tcataataat 660
aatgcagctt catcgtttcc gtctacatca ctatcgcatt tcgaacctcg ttcacaacct 720
agcttatatt caaaaacaaa caaaaacggc aataataata tcaataataa tgttaataca 780
ctgtttcagt cgtctaattc tcccccttct acatcggcat cttctttttc ttccattcag 840
catttctcaa ggtcacagca gcaacaagcg aacacatcaa taaggacctg ccagaacaaa 900
aatactcaaa ctcctaaaaa ccctgcaatc aacagtaaga cgtcttctgc gctaccaaat 960
aacatttcca tgaacttagt gtctccatcc tccaaacagc ctacaataag ctcgttggcc 1020
aaagtttata acagaaacaa acttttaacg actcctccat cgaaactgtt aaataacgat 1080
aggaaccacc aaaataacaa taataataat aataataata ataataataa taataataat 1140
aataataata ataataataa taacattata aataaaacaa ctttcaaaac tccaagaaac 1200
ctatattcct caacaggaag gttaacaact tccaagaaaa atccaaggtc tttaataatc 1260
agtaactcaa tactaacgag tgattattca attacgctgc ctgaaatcat gtataatttc 1320
gctttaatat taaggtcgtc atcacaatac aattcgttca aggcaataag actgttcgag 1380
tctcaaatcc catctcatat taaagacaca atgccatggt gtctagtgca attaggaaaa 1440
cttcattttg agatcattaa ttatgatatg tccttaaagt atttcaatag attgaaagac 1500
ctacaaccgg caagggtaaa agatatggaa attttttcta ctttgctgtg gcatttgcat 1560
gacaaggtta aatcttcaaa tttggcaaat gggctaatgg atacaatgcc taataagccc 1620
gaaacatggt gttgtatagg taatttgcta tcattgcaaa aggatcatga tgccgcaata 1680
aaagccttcg aaaaagctac tcagttagac ccaaattttg catacgcgta tactttgcaa 1740
ggtcatgaac attcttccaa cgattcttcg gattctgcca agacatgcta tagaaaggcg 1800
ctagcttgtg atcctcagca ttacaatgca tattacggat tgggtacgag cgctatgaaa 1860
ttaggtcaat atgaagaagc gttgttatat tttgaaaagg caaggtcaat taatcccgtc 1920
aatgttgtgt taatctgttg ttgcggtggt tctttagaaa agctgggcta taaggaaaag 1980
gctctacaat attatgaact agcatgtcat ttgcaaccga cttcctcgct atccaaatat 2040
aagatgggcc agttgctcta ttccatgaca agatataatg ttgctttgca aacttttgaa 2100
gaattggtga aactcgttcc tgatgatgcc acagcccatt atttgctggg tcaaacatat 2160
agaatagttg ggaggaaaaa agatgcaatc aaggagctaa ctgttgctat gaatttggat 2220
ccaaagggta accaagttat catcgatgaa ttacaaaaat gtcatatgca agaatcctcc 2280
ggtcatcatc atcatcatca ttaa 2304
<210> 2
<211> 2340
<212> DNA
<213> 酵母
<400> 2
atggggtcgt ttcccttagc tgagtttcca ttacgtgata tccctgttcc ttatagctac 60
cgtgtgtctg gcggtatagc ttcctcaggt agtgttactg cgcttgttac tgccgctggc 120
actcatcgaa actcgtccac ggctaagaca gttgagacag aagacggcga agaagatatc 180
gatgagtatc agaggaaaag agcagctggt tctggcgaat ccactcctga acgcagtgat 240
ttcaaaaggg taaaacatga taatcacaaa accctccatc cagttaactt acagaacacc 300
ggtgcagcgt ctgtggataa tgacggtctg cacaatttaa cagatatatc caacgatgca 360
gaaaaacttt tgatgtctgt ggatgatggt tctgccgcac cttctacatt gagtgtaaac 420
atgggagtgg catctcataa tgttgctgct cccactaccg tcaatgcggc aacaataact 480
ggcagtgatg ttagtaacaa tgttaatagt gctactatta acaatcctat ggaggaagga 540
gcgctgccgt tatcacccac tgcttcctct ccaggtacca caactccttt agctaaaact 600
acgaaaacta tcaacaacaa taataatatc gccgatttga tagaatccaa agattctata 660
atctcccctg aatacctttc tgatgagatt ttcagcgcaa taaacaataa tctccctcac 720
gcatacttca aaaatttatt atttagatta gttgccaaca tggataggag tgaactatcc 780
gacttgggga ctttaatcaa ggataattta aagagggacc taataacgtc tttgcctttt 840
gaaataagtt tgaaaatttt caattatttg caattcgagg atattataaa ttcccttggg 900
gtctcccaaa attggaacaa aataattaga aaatctacat cgttgtggaa aaaacttctg 960
atatcggaaa attttgtgag cccaaagggt tttaattctc tcaatctcaa actctcccaa 1020
aaatacccaa aactctcaca acaagatcgc cttagattat cttttctgga gaatatattc 1080
attttaaaaa attggtacaa tcccaagttt gtaccacaaa ggaccacgtt aagaggccat 1140
atgacgagtg ttattacgtg cttgcaattt gaagataatt atgtcattac gggggctgat 1200
gacaaaatga tcagagttta tgattcgata aacaagaaat ttcttctaca actatcaggt 1260
catgatggtg gggtttgggc attgaagtat gcccatggcg gtattttagt cagcggttct 1320
acagacagaa cggtgcgagt ttgggatatt aagaaaggtt gttgtaccca tgtgtttaaa 1380
ggtcataact ctacggtgag gtgcctagat atagtagaat ataaaaatat caagtacatt 1440
gttactggtt cgagagataa cactttgcac gtttggaaat tgcccaagga gtcctccgtt 1500
cctgatcatg gggaagaaca tgattatcca ttagtctttc atacccctga ggagaaccca 1560
tattttgttg gtgttttaag aggacatatg gcatctgtaa gaactgtctc aggccacggt 1620
aatattgtcg ttagtggctc ctatgataat acactgattg tgtgggatgt tgcgcaaatg 1680
aaatgtttgt atattttaag tggacatacg gatcgtattt attcgacaat ctacgatcat 1740
gaaagaaaaa ggtgcatctc tgccagtatg gataccacta ttagaatttg ggatttggaa 1800
aatatatgga ataatggaga atgttcctac gcaacaaatt cagcatcgcc atgcgccaaa 1860
atacttggtg ctatgtacac tttgcagggt catacagctt tggtcggttt attaagatta 1920
tccgacaaat ttttggtcag tgccgctgca gacggttcaa taaggggttg ggacgcaaac 1980
gactactcta gaaaattttc ctaccatcat accaatttga gtgcaattac cacattttat 2040
gtatcggata atattttggt gagtggatcg gaaaatcagt tcaacatcta taatctacgg 2100
agtgggaaat tggtccacgc aaatattcta aaagatgctg atcagatttg gtcggttaat 2160
tttaagggca aaacacttgt tgcagcagtt gaaaaagatg gacagagctt tttagaaatt 2220
ctggatttca gcaaagcttc aaaaattaac tacgttagca atcccgtaaa ctcctcgtcg 2280
tcgtctttgg aatccatttc tacttctttg ggtctaacga ggacaactat aataccatga 2340
<210> 3
<211> 1535
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcgttggc caaagtttat aacagaaaca aacttttaac gactcctcca tcgaaactgt 60
taaataacga taggaaccac caaaataaca ataataataa taataataat aataataata 120
ataataataa taataataat aataataata ataacattat aaataaaaca actttcaaaa 180
ctccaagaaa cctatattcc tcaacaggaa ggttaacaac ttccaagaaa aatccaaggt 240
ctttaataat cagtaactca atactaacga gtgattattc aattacgctg cctgaaatca 300
tgtataattt cgctttaata ttaaggtcgt catcacaata caattcgttc aaggcaataa 360
gactgttcga gtctcaaatc ccatctcata ttaaagacac aatgccatgg tgtctagtgc 420
aattaggaaa acttcatttt gagatcatta attatgatat gtccttaaag tatttcaata 480
gattgaaaga cctacaaccg gcaagggtaa aagatatgga aattttttct actttgctgt 540
ggcatttgta ggacaaggtt aaatcttcaa atttggcaaa tgggctaatg gatacaatgc 600
ctaataagcc cgaaacatgg tgttgtatag gtaatttgct atcattgcaa aaggatcatg 660
atgccgcaat aaaagccttc gaaaaagcta ctcagttaga cccaaatttt gcatacgcgt 720
atactttgca aggtcatgaa cattcttcca acgattcttc ggattctgcc aagacatgct 780
atagaaaggc gctagcttgt gatcctcagc attacaatgc atattacgga ttgggtacga 840
gcgctatgaa attaggtcaa tatgaagaag cgttgttata ttttgaaaag gcaaggtcaa 900
ttaatcccgt caatgttgtg ttaatctgtt gttgcggtgg ttctttagaa aagctgggct 960
ataaggaaaa ggctctacaa tattatgaac tagcatgtca tttgcaaccg acttcctcgc 1020
tatccaaata taagatgggc cagttgctct attccatgac aagatataat gttgctttgc 1080
aaacttttga agaattggtg aaactcgttc ctgatgatgc cacagcccat tatttgctgg 1140
gtcaaacata tagaatagtt gggaggaaaa aagatgcaat caaggagcta actgttgcta 1200
tgaatttgga tccaaagggt aaccaagtta tcatcgatga attacaaaaa tgtcatatgc 1260
aagaatcctc cggtcatcat catcatcatc attaaacgca ggttggccaa aacataacaa 1320
attgaaacat gttaaatgtt ttcataattc tttttgttct tcgttgtttc atatttattt 1380
ttaagttaat gtaatagtaa tagttaataa taataacgtt aatggtaaca ataataataa 1440
tatatatatc cagtaatttg aaagaagagg acatcatgtc tgcggttcct gcgatgagag 1500
tgcaccatac cacagctttt caattcaatt catca 1535
<210> 4
<211> 1913
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcaataaac aataatctcc ctcacgcata cttcaaaaat ttattattta gattagttgc 60
caacatggat aggagtgaac tatccgactt ggggacttta atcaaggata atttaaagag 120
ggacctaata acgtctttgc cttttgaaat aagtttgaaa attttcaatt atttgcaatt 180
cgaggatatt ataaattccc ttggggtctc ccaaaattgg aacaaaataa ttagaaaatc 240
tacatcgttg tggaaaaaac ttctgatatc ggaaaatttt gtgagcccaa agggttttaa 300
ttctctcaat ctcaaactct cccaaaaata cccaaaactc tcacaacaag atcgccttag 360
attatctttt ctggagaata tattcatttt aaaaaattgg tacaatccca agtttgtacc 420
acaaaggacc acgttaagag gccatatgac gagtgttatt acgtgcttgc aatttgaaga 480
taattatgtc attacggggg ctgatgacaa aatgatcaga gtttatgatt cgataaacaa 540
gaaatttctt ctacaactat caggtcatga tggtggggtt tgggcattga agtatgccca 600
tggcggtatt ttagtcagcg gttctacaga cagaacggtg cgagtttggg atattaagaa 660
aggttgttgt acccatgtgt ttaaaggtca taactctacg gtgaggtgcc tagatatagt 720
agaatataaa aatatcaagt acattgttac tggttcgaga gataacactt tgcacgtttg 780
gaaattgccc aaggagtcct ccgttcctga tcatggggaa gaacatgatt atccattagt 840
ctttcatacc cctgaggaga acccatattt tgttggtgtt ttaagaggac atatggcatc 900
tgtaagaact gtctcaggcc acggtaatat tgtcgttagt ggctcctatg ataatacact 960
gattgtgtgg gatgttgcgc aaatgaaatg tttgtatatt ttaagtggac atacggatcg 1020
tatttattcg acaatctacg atcatgaaag aaaaaggtgc atctctgcca gtatggatac 1080
cactattaga atttgggatt tggaaaatat atggaataat ggagaatgtt cctacgcaac 1140
aaattcagca tcgccatgcg ccaaaatact tggtgctatg tacactttgc agggtcatac 1200
agctttggtc ggtttattaa gattatccga caaatttttg gtcagtgccg ctgcagacgg 1260
ttcaataagg ggttgggacg caaacgacta ctctagaaaa ttttcctacc atcataccaa 1320
tttgagtgca attaccacat tttatgtatc ggataatatt ttggtgagtg gatcggaaaa 1380
tcagttcaac atctataatc tacggagtgg gaaattggtc cacgcaaata ttctaaaaga 1440
tgctgatcag atttggtcgg ttaattttaa gggcaaaaca cttgttgcag cagttgaaaa 1500
agatggacag agctttttag aaattctgga tttcagcaaa gcttcaaaaa ttaactacgt 1560
tagcaatccc gtaaactcct cgtcgtcgtc tttggaatcc atttctactt ctttgggtct 1620
aacgaggaca actataatac catgaccttt cccagagaat aagcattgac tcatacttag 1680
ataatatagc ttaataagta gttatataat cagtaaaaaa gtacaataac aacttcgtac 1740
attttattga atataaactg cagctaaact gcttgtatgt tcaattttaa ttgtgtttac 1800
aaaaagggtg ccgtttatta attaatgttt cttccctgaa aatatggaaa gtacaagttt 1860
ttagttgaga agggagagtg caccatacca cagcttttca attcaattca tca 1913
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctactttgc tgtggcattt gtaggacaag gttaaatctt caaatttggc aaatgg 56
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aagatttaac cttgtcctac aaatgccaca gcaaagtaga aaaaatttcc atatc 55
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgatatcgg aaaattaggt gagcccaaag ggttttaatt ctctcaatc 49
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aattaaaacc ctttgggctc acctaatttt ccgatatcag aagttttttc cacaacgatg 60
tag 63
<210> 9
<211> 1171
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gagagtgcac cataccacag cttttcaatt caattcatca tttttttttt attctttttt 60
ttgatttcgg tttctttgaa atttttttga ttcggtaatc tccgaacaga aggaagaacg 120
aaggaaggag cacagactta gattggtata tatacgcata tgtagtgttg aagaaacatg 180
aaattgccca gtattcttaa cccaactgca cagaacaaaa acctgcagga aacgaagata 240
aatcatgtcg aaagctacat ataaggaacg tgctgctact catcctagtc ctgttgctgc 300
caagctattt aatatcatgc acgaaaagca aacaaacttg tgtgcttcat tggatgttcg 360
taccaccaag gaattactgg agttagttga agcattaggt cccaaaattt gtttactaaa 420
aacacatgtg gatatcttga ctgatttttc catggagggc acagttaagc cgctaaaggc 480
attatccgcc aagtacaatt ttttactctt cgaagacaga aaatttgctg acattggtaa 540
tacagtcaaa ttgcagtact ctgcgggtgt atacagaata gcagaatggg cagacattac 600
gaatgcacac ggtgtggtgg gcccaggtat tgttagcggt ttgaagcagg cggcagaaga 660
agtaacaaag gaacctagag gccttttgat gttagcagaa ttgtcatgca agggctccct 720
atctactgga gaatatacta agggtactgt tgacattgcg aagagcgaca aagattttgt 780
tatcggcttt attgctcaaa gagacatggg tggaagagat gaaggttacg attggttgat 840
tatgacaccc ggtgtgggtt tagatgacaa gggagacgca ttgggtcaac agtatagaac 900
cgtggatgat gtggtctcta caggatctga cattattatt gttggaagag gactatttgc 960
aaagggaagg gatgctaagg tagagggtga acgttacaga aaagcaggct gggaagcata 1020
tttgagaaga tgcggccagc aaaactaaaa aactgtatta taagtaaatg catgtatact 1080
aaactcacaa attagagctt caatttaatt atatcagtta ttaccctatg cggtgtgaaa 1140
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc g 1171
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctcgttggc caaagtttat aacag 25
<210> 11
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgatgaattg aattgaaaag ctgtggtatg gtgcactctc atcgcaggaa ccgcagacat 60
g 61
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgcaataaac aataatctcc ctcacgc 27
<210> 13
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgatgaattg aattgaaaag ctgtggtatg gtgcactctc ccttctcaac taaaaacttg 60
tactttccat attttcaggg 80
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gagagtgcac cataccacag cttttc 26
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cggtattttc tccttacgca tctgtgc 27
<210> 16
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aaataaaaag tttacgaatt aatacaatca aattagacac tgatactatc aagaagtacc 60
ggtattttct ccttacgcat ctgtgc 86
<210> 17
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cttttatatt tttttagatc attttcaaaa ctttcttaaa ccggtatttt ctccttacgc 60
atctgtgc 68
<210> 18
<211> 1940
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgcaataaac aataatctcc ctcacgcata cttcaaaaat ttattattta gattagttgc 60
caacatggat aggagtgaac tatccgactt ggggacttta atcaaggata atttaaagag 120
ggacctaata acgtctttgc cttttgaaat aagtttgaaa attttcaatt atttgcaatt 180
cgaggatatt ataaattccc ttggggtctc ccaaaattgg aacaaaataa ttagaaaatc 240
tacatcgttg tggaaaaaac ttctgatatc ggaaaattag gtgagcccaa agggttttaa 300
ttctctcaat ctcaaactct cccaaaaata cccaaaactc tcacaacaag atcgccttag 360
attatctttt ctggagaata tattcatttt aaaaaattgg tacaatccca agtttgtacc 420
acaaaggacc acgttaagag gccatatgac gagtgttatt acgtgcttgc aatttgaaga 480
taattatgtc attacggggg ctgatgacaa aatgatcaga gtttatgatt cgataaacaa 540
gaaatttctt ctacaactat caggtcatga tggtggggtt tgggcattga agtatgccca 600
tggcggtatt ttagtcagcg gttctacaga cagaacggtg cgagtttggg atattaagaa 660
aggttgttgt acccatgtgt ttaaaggtca taactctacg gtgaggtgcc tagatatagt 720
agaatataaa aatatcaagt acattgttac tggttcgaga gataacactt tgcacgtttg 780
gaaattgccc aaggagtcct ccgttcctga tcatggggaa gaacatgatt atccattagt 840
ctttcatacc cctgaggaga acccatattt tgttggtgtt ttaagaggac atatggcatc 900
tgtaagaact gtctcaggcc acggtaatat tgtcgttagt ggctcctatg ataatacact 960
gattgtgtgg gatgttgcgc aaatgaaatg tttgtatatt ttaagtggac atacggatcg 1020
tatttattcg acaatctacg atcatgaaag aaaaaggtgc atctctgcca gtatggatac 1080
cactattaga atttgggatt tggaaaatat atggaataat ggagaatgtt cctacgcaac 1140
aaattcagca tcgccatgcg ccaaaatact tggtgctatg tacactttgc agggtcatac 1200
agctttggtc ggtttattaa gattatccga caaatttttg gtcagtgccg ctgcagacgg 1260
ttcaataagg ggttgggacg caaacgacta ctctagaaaa ttttcctacc atcataccaa 1320
tttgagtgca attaccacat tttatgtatc ggataatatt ttggtgagtg gatcggaaaa 1380
tcagttcaac atctataatc tacggagtgg gaaattggtc cacgcaaata ttctaaaaga 1440
tgctgatcag atttggtcgg ttaattttaa gggcaaaaca cttgttgcag cagttgaaaa 1500
agatggacag agctttttag aaattctgga tttcagcaaa gcttcaaaaa ttaactacgt 1560
tagcaatccc gtaaactcct cgtcgtcgtc tttggaatcc atttctactt ctttgggtct 1620
aacgaggaca actataatac catcgtcggg tcaccaccac caccaccact gacctttccc 1680
agagaataag cattgactca tacttagata atatagctta ataagtagtt atataatcag 1740
taaaaaagta caataacaac ttcgtacatt ttattgaata taaactgcag ctaaactgct 1800
tgtatgttca attttaattg tgtttacaaa aagggtgccg tttattaatt aatgtttctt 1860
ccctgaaaat atggaaagta caagttttta gttgagaagg gcattagtca gggaagtcat 1920
aacacagtcc tttcccgcaa 1940
<210> 19
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gcattagtca gggaagtcat aacacagtcc tttcccgcaa ttttcttttt ctattactct 60
tggcctcctc tagtacactc tatatttttt tatgcctcgg taatgatttt catttttttt 120
tttcccctag cggatgactc tttttttttc ttagcgattg gcattatcac ataatgaatt 180
atacattata taaagtaatg tgatttcttc gaagaatata ctaaaaaatg agcaggcaag 240
ataaacgaag gcaaagatga cagagcagaa agccctagta aagcgtatta caaatgaaac 300
caagattcag attgcgatct ctttaaaggg tggtccccta gcgatagagc actcgatctt 360
cccagaaaaa gaggcagaag cagtagcaga acaggccaca caatcgcaag tgattaacgt 420
ccacacaggt atagggtttc tggaccatat gatacatgct ctggccaagc attccggctg 480
gtcgctaatc gttgagtgca ttggtgactt acacatagac gaccatcaca ccactgaaga 540
ctgcgggatt gctctcggtc aagcttttaa agaggcccta ctggcgcgtg gagtaaaaag 600
gtttggatca ggatttgcgc ctttggatga ggcactttcc agagcggtgg tagatctttc 660
gaacaggccg tacgcagttg tcgaacttgg tttgcaaagg gagaaagtag gagatctctc 720
ttgcgagatg atcccgcatt ttcttgaaag ctttgcagag gctagcagaa ttaccctcca 780
cgttgattgt ctgcgaggca agaatgatca tcaccgtagt gagagtgcgt tcaaggctct 840
tgcggttgcc ataagagaag ccacctcgcc caatggtacc aacgatgttc cctccaccaa 900
aggtgttctt atgtagtgac accgattatt taaagctgca gcatacgata tatatacatg 960
tgtatatatg tatacctatg aatgtcagta agtatgtata cgaacagtat gatactgaag 1020
atgacaaggt aatgcatcat tctatacgtg tcattctgaa cgaggcgcgc tttccttttt 1080
tctttttgct ttttcttttt ttttctcttg aactcgacgg atctatgcgg tgtg 1134
<210> 20
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttgcgggaaa ggactgtgtt atgacttccc tgactaatgc ccttctcaac taaaaacttg 60
tactttccat attttcaggg 80
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gcattagtca gggaagtcat aacacagtcc 30
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cacaccgcat agatccgtcg agttc 25
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cttttatatt tttttagatc attttcaaaa ctttcttaaa ccacaccgca tagatccgtc 60
gagttc 66

Claims (13)

1.一种非天然氨基酸编码系统，其特征在于，包含：
第一核酸，所述第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；和
第二核酸，所述第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，
其中所述第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，所述第一终止密码子编码非天然氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，所述一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列位于所述第一核酸中编码形成必需基因所表达的必须蛋白序列的N端的前18个氨基酸和/或所述必须蛋白二级结构之间的连接环(Loop)区域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，所述必需基因包括表达量处于中低水平的基因，可选地，所述必需基因包括以下的至少一个：CDC27和CDC4。
5.根据权利要求4所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，所述编码第一终止密码子的核苷酸序列取代编码所述必需基因CDC27第520位氨基酸的核苷酸序列，和/或所述编码第一终止密码子的核苷酸序列取代编码所述必需基因CDC4第325位氨基酸的核苷酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，所述非天然氨基酸编码工具包括甲氧基酪氨酰-tRNA合成酶/亮氨酸tRNA正交配对(LeuOmeRS/tRNACUA)工具；
所述第一终止密码子编码的所述非天然氨基酸包括O-甲基-L-酪氨酸(OmeY)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，还包含载体，所述载体选自由真核细胞表达载体和原核细胞表达载体组成的组，任选地，所述真核细胞表达载体包括：pDR196、pHISi、pESP-3、pESP-2、pESP-1、pHiSi-1、pGAG424、p53his、pRS426gal、pRS41H、pRS413、pRS416、pGBT9和pAUR123；任选地，所述原核细胞表达载体包括：pET28a-TagRFP-N、pTrc-CKS、pET-DsbA、pET-Trx、pET-28a(+)-GFP、pET-28a(+)-sumo、pET-3c-sumo、pET-35b(+)、pTXB1和pCWori。
8.根据权利要求7所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，所述载体包括第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含第一核酸；所述第二载体包含第二核酸。
9.根据权利要求7所述的非天然氨基酸编码系统，其特征在于，所述载体还包含复制起点、筛选标记和酶切位点，
任选地，所述复制起点是以下至少之一：ARS和Ori；
任选地，所述筛选标记是编码以下蛋白的至少之一的核苷酸序列：His、Ura、Leu、Amp和Kan；
任选地，所述酶切位点是以下至少之一：ApaI、BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、SacI、SalI、SphI、XbaI和XhoI。
10.一种基于非天然氨基酸的生物遏制方法，其特征在于，包括：
向待改造生物体提供如权利要求1-9中任一项所述的非天然氨基酸编码系统，其中所述非天然氨基酸编码系统包括：
第一核酸，所述第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；和
第二核酸，所述第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，
其中所述第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
11.一种通过权利要求10所述的生物遏制方法获得的工程生物，所述工程生物包含第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸包含必需基因的至少一部分片段；所述第二核酸编码非天然氨基酸编码工具，其中所述第一核酸包含一个或多个编码第一终止密码子的核苷酸序列和任选的位于所述必需基因编码区结束位置的编码第二终止密码子的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的工程生物，其特征在于，所述工程生物包括酵母或大肠杆菌，优选地，所述工程生物为酵母。
13.如权利要求11或12所述的工程生物在产生可持续生物质的用途，其特征在于，所述可持续生物质包括食品、饲料、药物、生物燃料和材料。
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