JPWO2009063970A1 - 抗ｇｐｒ４９抗体を用いる癌の診断および治療 - Google Patents

Abstract

GPR49タンパク質に結合し、かつGPR49タンパク質を発現する細胞に対して細胞増殖阻害活性を有する抗体が開示される。細胞増殖阻害活性は、抗体依存性細胞傷害および補体依存性細胞傷害などの細胞傷害活性である。本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物、細胞増殖抑制剤および抗癌剤も開示される。癌は、例えば、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマである。さらに、GPR49タンパク質またはGPR49タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出することにより癌を診断する方法、ならびにこの方法に用いるための診断薬およびキットも開示される。

Description

本発明は、癌の診断方法、治療方法および抗癌剤に関する。

GPR49分子はヒト染色体12q12のENSG00000139292遺伝子によってコードされるタンパク質であって、G蛋白共役７回膜結合タンパク質のホルモンレセプターファミリーのLGRファミリー（Leucine-rich GPCRファミリー、以下LGRファミリーと指称する）のメンバーであることが、そのアミノ酸配列の特徴から明らかにされている分子である（非特許文献1）。LGRファミリーのメンバーには、LHR, TSHR, FSHなどのホルモンレセプターやリラキシン、インシュリン様ペプチド3（INSL3）などをリガンドとするLGR7, LGR8などがある（非特許文献2）。いずれのリガンドもヘテロなペプチドからなり、主にcAMPを介したシグナルを伝達することが知られている。LGRファミリーは７回膜貫通蛋白の領域とN末端の長い細胞外領域からなる構造を有し、細胞外領域に２５アミノ酸程からなるロイシンに富んだ領域の繰り返し（leucine-rich repeat: LRR）が９−１７個存在する。GPR49は１７回のLRRを有している（非特許文献１）。TSHRなどの解析からこの細胞外のLRRにリガンドが高い親和性をもって結合し、さらに２番目の細胞外ループ領域に結合することでG蛋白質に共役したシグナル伝達がおこる（非特許文献3；Pharmacology & Therapeutics 103, 21 (2004)）。GPR49のリガンドについてはまだ同定されていないが、ショウジョウバエの近縁のLGRであるDLGR2のリガンドがBMP antagonistのファミリー分子であるBurs, Pburs (Partner of Bur) からなるBursiconであったことから、いまだリガンドが明らかとなっていないLGR4、LGR5 (GPR49)、LGR6のリガンドもBMP antagonistではないかとの報告がされている（非特許文献4、非特許文献2）。この分子の機能については、ノックアウトマウスの解析から舌癒合症(ankylogenesis) との関わりが示唆されている（非特許文献5）。また、Hair follicule stem cellの遺伝子発現解析からstem cellの増殖に関与しているのではないかとの推測もされている(非特許文献6)。

癌との関わりについては山本らが、肝細胞癌患者においてGPR49が高発現していることを報告しており（非特許文献7）、特にベータカテニンの変異がある患者でGPR49のmRNAのレベルでの発現が亢進することを報告している。また、伊藤らはAffymetrix社のGenechipデータ解析から胃癌患者で高発現している分子の一つとしてGPR49を挙げている（特許文献1）。

大腸癌、卵巣癌においてGPR49が発現亢進しており、大腸癌で64%(25/39)、卵巣癌で53%(18/33)の患者においてmRNAレベルの発現亢進が見られることが報告されている(非特許文献8)。PoAbを用いた免疫染色では正常組織でPlacenta, skeletal muscleに発現していることが報告されている(非特許文献8)。癌化との関わりについてはFocus formation assayで遺伝子導入しただけのNIH3T3では4週間でfocus formationなく、SW620を培養した培養上清(conditioned medium) を添加した細胞では3週間以内にFocus formationが見られた。このことから、Ligandに依存した癌化を引き起こすことを想定している。siRNA実験ではsubG1の細胞の蓄積が見られアポトーシスが引き起こされた。GPR49は大腸癌細胞ではアポトーシス誘導を阻害する機能を有しているのではないかと示唆されている。

しかしながら、GPR49は癌細胞株の発現から大腸癌、卵巣癌、グリオーマ、メラノーマの癌で発現亢進しているが、乳癌、肺癌では発現亢進が見られないことも報告されている(非特許文献8)。

WO2000071710 Mol. Endocrinology 12, 1830 (1998) Journal of Endocrinology 187, 333 (2005) Pharmacology & Therapeutics 103, 21 (2004) PNAS 102, 2820 (2005) Molecular and Cellular Biology, 24, 9736 (2004) Nature Biotechnology 22, 411 (2004) Hepatology 37, 528 (2003) Cancer Biology & Therapy 5, 419 (2006)

本発明は、癌を診断する新規方法、癌を治療する新規方法、新規な細胞増殖抑制剤および抗癌剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、GPR49が胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマなどの癌細胞でその遺伝子のみならずそのタンパク質も高発現していることを見出した。また、本発明者らはGPR49タンパク質に対するモノクローナル抗体を作成し、100 kDaの分子量をもつGPR49タンパク質が切断されて60 kDaと40 kDaの断片に分かれることを初めて見出した。N末端側の60 kDaの断片は切断されて細胞外に分泌されることから癌の診断用マーカーとして有用である。また、C末端側の40 kDaの断片は治療用抗体のターゲットとして有用であると考えられる。

さらに本発明者らは、抗GPR49抗体の補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity; CDC）活性、更に抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC）活性を測定したところ、抗GPR49抗体はGPR49発現細胞に対してCDC活性およびADCC活性を有することを見出した。さらに、毒素を結合させた抗体によりGPR49発現細胞に細胞傷害を与える活性も見出した。以上の知見により、本発明者らは、抗GPR49抗体が、原発性の、あるいは転移性の各種の癌の診断、予防および治療に有効であることを見出して、本発明を完成させた。より具体的には、本発明者らは、GPR49が、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマをはじめとする、GPR49が発現亢進している癌の、治療あるいは診断のためのツールとして有用であることを見出して本発明を完成した。

すなわち、本発明はGPR49タンパク質に結合する抗体を提供する。さらに本発明はGPR49タンパク質に結合し、かつ、GPR49タンパク質を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有する抗体を提供する。好ましくは、当該細胞傷害活性はADCC活性である。好ましくは、当該細胞傷害活性はCDC活性である。本発明はまた、細胞傷害性物質を結合した抗体を提供する。

さらに本発明は、GPR49タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、GPR49タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤を提供する。本発明はまた、GPR49タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。

あるいは本発明は、GPR49タンパク質に結合する抗体と、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。より具体的には、
〔１〕 GPR49タンパク質に結合し、かつGPR49タンパク質を発現する細胞に対して細胞増殖阻害活性を有する抗体、
〔２〕 細胞増殖阻害活性が細胞傷害活性である〔１〕に記載の抗体、
〔３〕 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性である〔２〕に記載の抗体、
〔４〕 細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性である〔２〕に記載の抗体、
〔５〕 細胞傷害性物質が結合した抗体である〔１〕〜〔４〕いずれかに記載の抗体、
〔６〕 インターナライズ活性を有する抗体である〔５〕に記載の抗体、
〔７〕 癌細胞の増殖を抑制する抗体である〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の抗体、
〔８〕 癌細胞が胃癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞およびグリオーマ細胞のいずれかである〔７〕に記載の抗体、
〔９〕 以下（１）から（２０）のいずれかに記載の抗体；
（１）CDR1として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2J18-1N）
（２）CDR1として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2J18-1N)
（３）（１）に記載のH鎖、および（２）に記載のL鎖を含む抗体、
（４）CDR1として配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2U1E-1）
（５）CDR1として配列番号：２０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2U1E-1)
（６）（４）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
（７）CDR1として配列番号：２５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2U2E-2）
（８）CDR1として配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：３１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：３２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2U2E-2)
（９）（７）に記載のH鎖、および（８）に記載のL鎖を含む抗体、
（１０）CDR1として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2L13-3）
（１１）CDR1として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2L13-3)
（１２）（１０）に記載のH鎖、および（１１）に記載のL鎖を含む抗体、
（１３）CDR1として配列番号：４５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2L36-12）
（１４）CDR1として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：５２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2L36-12)
（１５）（１３）に記載のH鎖、および（１４）に記載のL鎖を含む抗体、
（１６）CDR1として配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：６７に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：６８に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2T15E-2）
（１７）CDR1として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2T15E-2)
（１８）（１６）に記載のH鎖、および（１７）に記載のL鎖を含む抗体、
（１９）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（２０）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体が結合するGPR49タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
〔１０〕 ヒト定常領域を有する抗体である〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の抗体、
〔１１〕 キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔１０〕に記載の抗体、
〔１２〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物、
〔１３〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、
〔１４〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する抗癌剤、
〔１５〕 癌が、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマからなる群から選択されるいずれかの癌である、〔１４〕に記載の抗癌剤、
〔１６〕 GPR49タンパク質またはGPR49タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法、
〔１７〕 GPR49タンパク質を検出することを特徴とする〔１６〕に記載の診断方法、
〔１８〕 GPR49タンパク質の検出がGPR49タンパク質に結合する抗体を用いて行なわれる〔１７〕に記載の診断方法、
〔１９〕 以下の工程を含む癌の診断方法；
（ａ） 被検者から採取された試料を提供する工程；
（ｂ） （ａ）の試料に含まれるGPR49タンパク質を、GPR49タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程、
〔２０〕 以下の工程を含む癌の診断方法；
（ａ） GPR49タンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体を被検者に投与する工程、
（ｂ） 前記放射性同位元素の集積を検出する工程、
〔２１〕 癌が、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマからなる群から選択されるいずれかの癌である〔１６〕から〔２０〕いずれかに記載の診断方法、
を提供するものである。
また本発明は、以下を提供する。
〔２２〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体を用いた細胞増殖を抑制する方法。
〔２３〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体を投与する工程を含む、癌の治療もしくは予防方法。
〔２４〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の抗体の細胞増殖抑制剤もしくは抗癌剤の製造における使用。

本発明の抗GPR49抗体は、GPR49発現細胞に対して補体依存性細胞傷害活性、並びに、抗体依存性細胞傷害活性を有し、さらに、毒素を結合させた抗体によりGPR49発現細胞に細胞傷害を与える活性も有することから、原発性あるいは転移性の各種の癌の診断、予防および治療に有効である。

正常組織でのヒトGPR49の発現プロファイルを示す。下の値はExon Arrayで解析した値を示し、高い値ほどmRNAの発現量が高いことを示す。 胃癌細胞株と胃癌摘出組織の腫瘍部でのヒトGPR49の発現プロファイルを示す。下の値はExon Arrayで解析した値を示し、高い値ほどmRNAの発現量が高いことを示す。 ユーイング肉腫、小細胞肺癌、肺線癌摘出組織の腫瘍部でのヒトGPR49の発現プロファイルを示す。下の値はExon Arrayで解析した値を示し、高い値ほどmRNAの発現量が高いことを示す。 卵巣癌細胞株と卵巣癌摘出組織の腫瘍部でのヒトGPR49の発現プロファイルを示す。下の値はExon Arrayで解析した値を示し、高い値ほどmRNAの発現量が高いことを示す。 誘導発現されたGPR49をモノクローナル抗体2U2E-2で検出した写真である。Dox（ドキソサイクリン） 1μL、10μL添加により誘導されたGPR49を抗体は特異的に認識し、N末端に付加されたHAタグを抗HAタグ抗体で検出されるバンドと同じものを認識することを示す。 GPR49強制発現DG44細胞及びに大腸癌細胞株LoVoにGPR49 siRNAをトランスフェクションした細胞破砕液中に存在するGPR49タンパク質をモノクローナル抗体2U1E-1、2U2E-2で検出した写真である。siRNA 507、508、509を導入した細胞ではGPR49の発現が抑えられた。（−）はsiRNAを導入していない細胞、「con」はcontrol siRNAを導入した細胞を示す。100 kDaのバンドに加えて2U1E-1では矢印で示した40 kDaのバンドが消失し、2U2E-2では矢印で示した60 kDaのバンドが消失していることからこれらのバンドはGPR49由来のバンドである。 2B10(HA-GPR49発現DG44細胞)の細胞破砕液を免疫沈降してモノクローナル抗体でGPR49を検出した写真である。2U1E-1では100 kDaと40 kDaのバンドが検出され、2U2E-2では100 kDaと60 kDaのGPR49のバンドが検出された。二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社製)を使用した。 2B10(HA-GPR49発現DG44細胞)の細胞破砕液を免疫沈降してモノクローナル抗体でGPR49を検出した写真である。2Lシリーズの抗体すべてにおいて60 kDaのGPR49のバンドが検出された。免疫沈降に使用した抗体のH鎖に由来するバンドと60 kDaのGPR49のバンドを区別するために二次抗体としてHRP標識抗マウスkappa抗体(Southern Biotech社製)を使用した。 各種の癌細胞株の細胞破砕液をモノクローナル抗体を用いたWBで検出した写真である。写真の中のレーンはサンプル名を示し、それぞれ大腸癌細胞株LoVo、胃癌細胞株NUGC-4、肝細胞癌株Alexander、肝細胞癌株HepG2、肝細胞癌株Huh6、卵巣癌細胞株KURAMOCHI、卵巣癌細胞株OVSAHO、グリオーマU251、チャイニーズハムスター卵巣細胞DG44、HA-GPR49発現DG44細胞株2B10を示す。 GPR49抗体によるCDC活性を示したグラフである。 GPR49抗体によるHA-GPR49発現DG44細胞に対するADCC活性を示したグラフである。 Mab-Zapを用いた抗体のインターナリゼーションによる殺細胞活性を示したグラフである。3本の棒グラフはGPR49誘導発現293細胞株B4の非誘導細胞に抗体とMab-Zapを加えたもの（左）、GPR49発現誘導細胞に抗体とMab-Zapを加えたもの（中）、GPR49発現誘導細胞に抗体のみを加えたもの（右）での生細胞の割合をWST8 assayにより測定した結果を示す。 GPR49の構造とdeletion mutant、GST融合蛋白に含まれている領域を示す図である。 2U1E-1、2T15E-2のGST融合蛋白とのWBでの反応性を示した写真である。 マウスGPR49に対するモノクローナル抗体2U1E-1、2U2E-2のWBでの反応性を示した写真である。ともにヒト(H)およびマウス(M)のGPR49と反応する。 FACS(フローサイトメトリー)による結合活性の評価結果を示す図である。実線で示したピークが癌細胞株との反応性を示し、影をつけた部分は抗体なしで反応させたときのピークを表す。横軸はFITCを結合した抗体の結合度によるシグナルの強さを示し、縦軸は細胞数を示す。

［発明を実施するための最良の形態］
GPR49
GPR49は、7回膜貫通型のLGRファミリーメンバーであるタンパク質である。ヒトGPR49のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれNCBI登録番号NP_003658.1（配列番号：１）及びNM_003667.2（配列番号：２）に開示されている。本発明において、GPR49タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、GPR49タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のGPR49タンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例として、GPR49タンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。GPR49タンパク質の細胞外領域は配列番号：１のアミノ酸配列において1-556番目、615−637番目、704−722番目、および792−800番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号：１のアミノ酸配列において557−579番目、592−614番目、638−660番目、681-703番目、723−745番目、769−791番目、および801−823番目が相当する。

抗GPR49抗体の作製
本発明で用いられる抗GPR49抗体は、GPR49タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のGPR49タンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。

本発明で使用される抗GPR49抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗GPR49抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。まず、GPR49タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。更にこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗GPR49抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。

具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、GPR49遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるGPR49タンパク質が取得できる。GPR49遺伝子の塩基配列は、NCBI登録番号NM＿003667.2（配列番号：２）などに開示されている。すなわち、GPR49をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から、目的のヒトGPR49タンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のGPR49タンパク質もまた同様に使用できる。また、本発明で用いられるように、GPR49タンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed.（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）に記載されている。

このようにして精製されたGPR49タンパク質を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。GPR49の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる。
ヒトGPR49のアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド
GPR49遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド
GPR49タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド

部分ペプチドとして用いるGPR49の領域および大きさは限定されない。好ましい領域はGPR49の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号：１のアミノ酸配列において1-556番目、615-637番目、704-722番目、および792-800番目）から選択することができる。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８〜５０、好ましくは１０〜３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。

該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。

公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。更に、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。

一方、モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA Immunization）によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
−GPR49のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
−免疫抗原を精製する必要が無い

しかし一方で、DNA免疫においては、アジュバントなどの免疫刺激手段と組み合わせることが困難である。GPR49は７回膜貫通型立体構造という構造的特徴を有するため、生体内で天然に存在する構造を保持したまま免疫反応を惹起することが困難であることが予想されていた。このような構造的特徴から、抗体取得が困難であったLGRファミリーに属するタンパク質であるGPR49に結合するモノクローナル抗体がDNA免疫によって現実に得られたことは、予想外の成果である。

DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、GPR49タンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。GPR49をコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene gun）で細胞内に打ち込むことによってDNA免疫を行うことができる。

本発明者らの知見によれば、GPR49強制発現細胞を腹腔内に投与することによって免疫したマウスからは、GPR49結合性抗体を産生するハイブリドーマを効率よく得ることができないのに対して、DNA免疫を利用して免疫したマウスからはGPR49結合性の抗体を産生するハイブリドーマを効率よく取得することができた。特に、DNA免疫の後に、更にGPR49強制発現細胞を投与したマウスにおいて、目的とするハイブリドーマを容易に取得することができた。すなわち、DNA免疫後に、GPR49発現細胞による追加免疫（boost）を行うことは、本発明のモノクローナル抗体を得る好ましい方法である。

このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。

上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。

HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用することができる。

P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123, 1548-1550）
P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）
NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）
MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）
SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）
FO（de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）
S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、
R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等

基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。

より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。

細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。

このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、GPR49を認識する抗体を国際公開WO03/104453に記載された方法によって作成することもできる。

目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実質的に同質なGPR49タンパク質が好適に使用できる。たとえばGPR49を発現する細胞株、GPR49の細胞外ドメイン、あるいは当該領域を構成する部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、抗原として利用することができる。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をGPR49タンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。この方法によって得られる抗GPR49抗体は、GPR49タンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。

さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるGPR49タンパク質を投与するか、又はGPR49を当該動物中において発現するように構築されたDNAによって免疫することによって、抗GPR49ヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、GPR49タンパク質に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602参照）。更に不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトGPR49を異物と認識する。したがって、ヒトGPR49に対するヒト抗体を容易に得ることができる。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。

当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。

本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775参照）。

たとえば、抗GPR49抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗GPR49抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）
AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）

抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。マウスの抗体遺伝子に共通な配列より選び出した任意の15-30塩基の配列をプライマーとして用いることができる。具体的には、配列番号：６１〜６３に示されたDNA配列を有するプライマーを用いることで抗体V領域をコードするcDNAが得られる。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）を利用することができる。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。

得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、cDNAの塩基配列を、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認することができる。

また、抗体の可変領域をコードする遺伝子を得るために、cDNAライブラリーを利用することもできる。まず抗体産生細胞から抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。

得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文（J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597）などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法を行う。

具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。

重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、GPR49に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。

たとえばGPR49に対する抗体の取得を目的とするとき、抗体のGPR49への結合は、特異的であることがさらに好ましい。GPR49に結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングすることができる。
(１) 得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をGPR49に接触させる工程、
(２) GPR49と抗体との結合を検出する工程、および
(３) GPR49に結合する抗体を選択する工程

抗体とGPR49との結合を検出する方法は公知である。具体的には、担体に固定したGPR49に対して被験抗体を反応させ、次に抗体を認識する標識抗体を反応させる。洗浄後に担体上の標識抗体が検出されたときには、当該被験抗体のGPR49への結合を証明できる。標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性蛋白質、あるいはFITC等の蛍光物質を利用することができる。抗体の結合活性を評価するためにGPR49を発現する細胞の固定標本を利用することもできる。

結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv(scFv)とすることができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、scFvを表面に発現するファージを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するscFvを濃縮することができる。

本発明において抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の全長をコードしていてもよいし、あるいは抗体の一部をコードしていてもよい。抗体の一部とは、抗体分子の任意の部分を言う。以下、抗体の一部を示す用語として、抗体断片を用いる場合がある。本発明における好ましい抗体断片は、抗体の相補鎖決定領域（complementarity determination region;CDR）を含む。更に好ましくは、本発明の抗体断片は、可変領域を構成する３つのCDRの全てを含む。

目的とする抗GPR49抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって当該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する可能性が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素が好ましい。上記のように消化された抗GPR49抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターを得ることができる。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、上記のV領域をコードする遺伝子とをインフレームで融合させることによって、キメラ抗体を得ることができる。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なることを言う。したがって、マウス−ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト−ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域をコードするDNAが組み込まれている発現ベクターに、V領域遺伝子を挿入して、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。

具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5'側に、V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列を配置しておくことができる。両者を同じ組み合わせの制限酵素で消化し、インフレームで融合させることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。

本発明で使用される抗GPR49抗体を製造するために、抗体遺伝子を発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込むことができる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗GPR49抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。

抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO 94/11523参照）。

単離した抗体遺伝子を適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
（１）哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など

あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。

更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces ）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属

あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。

哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。

また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。

SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。

大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。

抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素のグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。

動物細胞を用いて抗体を産生させる場合に、細胞外への分泌のために必要とされるシグナル配列としては抗体の重鎖遺伝子または軽鎖遺伝子のシグナル配列を用いることが望ましい。又、IL-3やIL-6などの分泌タンパク質が有するシグナル配列を用いることも可能である。

発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカーを挿入することができる。具体的には、次のような選択マーカーを利用することができる。
アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子
チミジンキナーゼ（TK）遺伝子
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子
ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等

これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。

上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。

また、組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。

本発明の組み換え抗体のC領域として、ヒト以外の動物の抗体由来のC領域を使用できる。例えばマウス抗体のH鎖C領域としては、Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cεが、L鎖C領域としてはCκ、Cλが使用できる。また、マウス以外の動物の抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の抗体が使用できる。これらの配列は公知である。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、C領域を修飾することができる。

本発明において、抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。

キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体およびヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。

例えばH鎖においては、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、およびCεをC領域として利用することができる。またL鎖においてはCκ、およびCλをC領域として使用できる。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾することができる。

一般にキメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成される。これに対してヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity determining region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework region）およびヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。

抗体の可変領域は、通常、４つのフレーム(FR)にはさまれた３つの相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。

ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるといわれている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。

また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。

最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5'末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。このベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、ヒト化抗体が培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400、国際公開WO 96/02576参照）。

上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。

また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作する。次いで、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞と融合させることによって、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体が取得できる（特公平1-59878参照）。融合パートナーであるヒトミエローマ細胞には、例えばU266などを利用することができる。

また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することにより、所望のヒト抗体が取得できる（国際公開WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製できる。該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより該ヒト抗体が取得できる。これらの方法は既に公知である（国際公開WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388）。

従って、本発明で用いられる抗体の好ましい態様の一つとして、ヒト定常領域を有する抗体を挙げることができる。

本発明の抗体には、GPR49タンパク質に結合する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、GPR49タンパク質に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。

低分子化抗体は、全長抗体（whole antibody、例えばwhole IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。GPR49抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。また、本発明における抗体断片はCDRを含んでいることが好ましい。VHまたはVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにGPR49抗原への結合能を有する限り、VHおよびVLのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）、scFv-Fcなどを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。

抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。

消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
パパイン消化：F(ab)2またはFab
ペプシン消化：F(ab')2またはFab'
プラスミン消化：Facb

したがって、本発明における低分子化抗体は、GPR49に対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片であることができる。更に、特に、本発明による癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい低分子化抗体は、GPR49に対する結合親和性とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、ADCC活性およびCDC活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性およびCDC活性のいずれか、または両方をエフェクター機能として備える。

ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。

scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883.）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば3から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。

両鎖のV領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列

増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。

アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。

scFv-Fcは抗体のH鎖V領域とL鎖V領域からなるscFvにFc領域を融合させた低分子化抗体である（Cellular & Molecular Immunology 2006； 3： 439-443）。scFv-Fcに用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvを用いることができる。又、Fcの由来は特に限定されないが、例えばマウスIgG2(マウスIgG2aなど)、ヒトIgG（ヒトIgG1など）を用いることができる。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、マウスIgG2aのCH2(たとえば、Cγ2)とCH3（たとえば、Cγ3)をマウスIgG2aのヒンジ領域（Hγ)で連結させたscFv-Fcや、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2とCH3をヒトIgG1のヒンジ領域で連結させたscFv-Fcを挙げることができる。

sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。

また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。

2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］

抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、更に好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。

ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５３）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：５４）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５５）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：５６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号：５７)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：５８）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５９）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：６０）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：５３）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：５４）)n
［nは１以上の整数である］

ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１または２である。

よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる。
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］

あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してV領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。
N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、および
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など

4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明において好ましい低分子化抗体はダイアボディー又はsc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。

また、本発明の抗体には、一価抗体だけでなく、多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。

抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。また、抗体に化学療法剤、毒性ペプチドあるいは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。また後に述べるように、GPR49タンパク質のみならず、化学療法剤、毒性ペプチド、放射性化学物質などの細胞傷害性物質を認識するように遺伝子組換え技術を用いて設計した二重特異性抗体（bispecific antibody）のような分子型として取得することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。

抗GPR49抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる：アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。

本発明において、好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100〜2000、好ましくは200〜1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。

また、抗体を毒性ペプチドで修飾することもできる。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖(Diphtheria toxin A Chain)(Langone J.J.,et al.,Methods in Enzymology,93,307-308,1983)、シュードモナスエンドトキシン(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine,2,350-353,1996)、リシン鎖(Ricin A Chain)(Fulton R.J.,et al.,J.Biol.Chem.,261,5314-5319,1986;Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169-3173,1987;Cumber A.J.et al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Gheeite V.,et al.,J.Immunol.Methods,142,223-230,1991)、無糖鎖リシンＡ鎖(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924-5931,1987)、アブリンＡ鎖(Abrin A Chain)(Wawrzynczak E.J.,et al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169-3173,1987;Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924-5931,1987)、ゲロニン(Gelonin)(Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169-3173,1987;Cumber A.J.et al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;WawrzynczakE.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)、ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s;Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)、ブリオジン(Briodin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)、サポリン(Saporin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)、モモルジン(Momordin)(Cumber A.J.,et al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)、モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)、ジアンシン３２(Dianthin 32)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)、ジアンシン３０(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986)、モデッシン(Modeccin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986)、ビスカミン(Viscumin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986)、ボルケシン(Volkesin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986)、ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986)、トリチン(Tritin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986)、ルフィン(Luffin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986)、トリコキリン(Trichokirin)(Casellas P.,et al.,Eur.J.Biochem.176,581-588,1988;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)。

本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Reなどを用いることが可能である。また別の態様では、一または二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。抗GPR49抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合または非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。

更に、タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと抗GPR49抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗GPR49抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素を配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。

さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はGPR49分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のGPR49に対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。

あるいは、一方の抗原結合部位がGPR49を認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、GPR49を発現している細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質をGPR49発現細胞に直接作用させることができる。すなわち細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体によって、腫瘍細胞を特異的に傷害し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。

また本発明においては、GPR49以外の抗原を認識する二重特異性抗体を組み合わせることもできる。たとえば、GPR49と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、GPR49とは異なる抗原を認識するような二重特異性抗体を組み合わせることができる。

二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。

抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。

本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、次のような抗体が公知である；
グリコシル化が修飾された抗体（WO99/54342など）、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など））、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）など。

抗体がGPR49タンパク質を発現する細胞に対して細胞増殖阻害活性を有するか否かは当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、GRP49タンパク質を発現する細胞を対象抗体の存在下および非存在下（若しくは陰性コントロール抗体存在下）で培養し、その生細胞数をカウントすることにより測定することが可能である。細胞の増殖を阻害する限り阻害の割合は特に限定されないが、好ましい例として、対象抗体存在下の生細胞数が非存在下での生細胞数と比較して90%以下、70%以下、50%以下などを挙げることができる。GPR49タンパク質を発現する細胞は特に限定されないが、GPR49タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌およびグリオーマ等を挙げることができる。

本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。

本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。

抗GPR49抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。

具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。

（１）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×10⁶/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。

（２）補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement（CEDARLANE社製）を10％ FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。

（３）標的細胞の調製
GPR49タンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの⁵¹Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％ FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。GPR49タンパク質を発現する細胞としては、GPR49タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌およびグリオーマ等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％ FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×10⁵/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。

ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗GPR49抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C) / (B-C) x 100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％ NP-40（nacalai tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。

一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗GPR49抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。

一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗GPR49抗体コンジュゲートを50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。炭酸ガスインキュベーター内で1から4時間培養する。抗体の終濃度は0または3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。また、本発明で用いられる抗体の他の態様の一つとしてインターナライズ活性を有する抗体を挙げることができる。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、細胞表面上のGPR49に結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。

抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗GPR49抗体をGPR49を発現する細胞に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞傷害性物質を結合した抗GPR49抗体をGPR49を発現する細胞に接触させ該GPR49発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。より具体的には下記の実施例に記載の方法などにより抗体がインターナライズ活性を有するか否かを確認することが可能である。

インターナライズ活性を有する抗体は例えば上述の細胞傷害性物質を結合することにより抗癌剤などの医薬組成物として用いることができる。

本発明の抗体としては、GPR49を認識する任意の抗体を利用することができる。たとえば以下（１）から（２０）に記載の抗体が好ましい抗体として例示できる。これらの抗体は、例えば、全長抗体、低分子化抗体、動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体であってよい。

（１）CDR1として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2J18-1N）
（２）CDR1として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2J18-1N)
（３）（１）に記載のH鎖、および（２）に記載のL鎖を含む抗体、
（４）CDR1として配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2U1E-1）
（５）CDR1として配列番号：２０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2U1E-1)
（６）（４）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
（７）CDR1として配列番号：２５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2U2E-2）
（８）CDR1として配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：３１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：３２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2U2E-2)
（９）（７）に記載のH鎖、および（８）に記載のL鎖を含む抗体、
（１０）CDR1として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2L13-3）
（１１）CDR1として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2L13-3)
（１２）（１０）に記載のH鎖、および（１１）に記載のL鎖を含む抗体、
（１３）CDR1として配列番号：４５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2L36-12）
（１４）CDR1として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：５２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2L36-12)
（１５）（１３）に記載のH鎖、および（１４）に記載のL鎖を含む抗体、
（１６）CDR1として配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：６７に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：６８に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、（2T15E-2）
（１７）CDR1として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、(2T15E-2)
（１８）（１６）に記載のH鎖、および（１７）に記載のL鎖を含む抗体、
（１９）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
（２０）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体が結合するGPR49タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。

本発明において、本発明の抗体と同等の活性を有するとは、GPR49への結合活性および／またはGPR49を発現する細胞への細胞傷害活性が同等であることをいう。

ポリペプチドに変異を導入する方法は、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。

このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）

あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、その生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いといわれている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。

また本発明は、本発明で開示された抗GPR49抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。すなわち本発明は、2J18, 2L13, 2L36, 2U1E, 2U2Eが認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体と、その用途に関する。このような抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。

被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。

具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたGPR49タンパク質を、候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗GPR49抗体が添加される。ウェル中のGPR49タンパク質に結合した本発明の抗GPR49抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗GPR49抗体のGPR49タンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、一方、被験抗体のGPR49タンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。

ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。

更に被験抗体が本発明の抗GPR49抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合したいずれかの抗体を、いずれかの定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。

候補の競合抗体の非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも50％、抗GPR49抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗GPR49抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。

上述の(4)〜(6)いずれかの抗体が認識するエピトープの例として、ヒトGPR49タンパク質（配列番号：１）の517番目のアミノ酸から537番目のアミノ酸までの領域を挙げることができる。又、上述の(16)〜(18)いずれかの抗体が認識するエピトープの例として、ヒトGPR49タンパク質（配列番号：１）の510番目のアミノ酸から529番目のアミノ酸までの領域を挙げることができる。

医薬組成物
別の観点においては、本発明は、GPR49タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明はGPR49タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤に関する。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。GPR49の発現レベルは、脳以外の正常細胞で非常に低い一方、癌細胞では亢進していることから、抗GPR49抗体の投与によって、癌細胞特異的な細胞傷害作用が得られると考えられる。

本発明の医薬組成物（例えば、抗癌剤）において用いられる抗GPR49抗体は特に限定されず、如何なる抗GPR49抗体であってもよく、例えば上述の抗GPR49抗体を用いることができる。

GPR49タンパク質は切断されて60 kDaと40 kDaの断片に分かれ、N末端側の60 kDaの断片は切断されて細胞外に分泌されることが見出されている。従って、本発明の医薬組成物に用いられる抗GPR49抗体は、特に限定されないが、C末端側の40 kDaの断片を認識することが好ましい。C末端側の40 kDaの断片の例としては、配列番号：１の510番目のアミノ酸から907番目のアミノ酸配列からなる断片などを挙げることができる。

配列番号：１の510番目のアミノ酸から907番目のアミノ酸配列のうち、細胞外領域は510番目のアミノ酸から556番目のアミノ酸までの領域、615番目のアミノ酸から637番目のアミノ酸までの領域、704番目のアミノ酸から722番目のアミノ酸までの領域、792番目のアミノ酸から800番目のアミノ酸までの領域となる。従って、特に限定されないが、これらの領域を認識する抗体は医薬組成物として特に有用である。

本発明において、「GPR49に結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗GPR49抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗GPR49抗体の含有率を制限するものではない。

本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、対象となる癌は特に限定されないが、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫またはグリオーマ（例えば、グリオブラストーマ）であることが好ましく、胃癌が特に好ましい。癌は原発病巣および転移病巣のいずれであってもよい。

本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。

また、本発明は、GPR49発現細胞とGPR49タンパク質に結合する抗体とを接触させることによりGPR49発現細胞に傷害を引き起こす方法又は細胞の増殖を抑制する方法を提供する。

本発明の方法において用いられる抗体は、特に限定されないが、例えば上述の抗体を用いることが可能である。抗GPR49抗体が結合する細胞はGPR49が発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいGPR49発現細胞は癌細胞である。より好ましくは、胃癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、ユーイング肉腫またはグリオーマ細胞（例えば、グリオブラストーマ細胞）である。本発明の方法は、これらの癌の、原発病巣および転移病巣のいずれに対しても適用することができる。さらに好ましい癌細胞は、原発性胃癌、および転移性胃癌である。

本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているGPR49発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。また本発明において「接触」は更に、GPR49発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にGPR49を発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。

抗GPR49抗体の接触によってGPR49発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などの測定法を挙げることができる。抗GPR49抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗GPR49抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞傷害活性を有しない結合抗体を、抗GPR49抗体と同様に使用して、抗GPR49抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示すことにより活性を判定することができる。

抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列のH鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。

また、生体内で細胞傷害活性を評価、あるいは測定するために、例えばGPR49発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞傷害活性を判定することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗GPR49抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことにより細胞傷害活性を有すると判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被検動物中のTリンパ球の関与を除くことができる。

また、本発明はGPR49タンパク質またはGPR49タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。GPR49は種々の癌組織あるいは癌細胞株において顕著な発現亢進が確認されるのに対して、正常細胞におけるGPR49の発現は脳以外の臓器では非常に低い。したがって、GPR49は、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。

本発明の方法の1つの態様においては、試料中のGPR49タンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。好ましくは、GPR49タンパク質の細胞外領域が検出される。GPR49タンパク質の検出はGPR49タンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。

本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
（ａ） 被検者から採取された試料を提供する工程；
（ｂ） 採取された試料に含まれるGPR49タンパク質を、GPR49タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。

本発明において検出とは、定量的または定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
単にGPR49タンパク質が存在するか否かの測定
GPR49タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
GPR49タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など

一方、定量的な検出とは、GPR49タンパク質の濃度の測定、GPR49タンパク質の量の測定などを挙げることができる。

本発明における被検試料は、GPR49タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織、腹水、腹腔内洗浄液などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被検試料から得られる試料である。

GPR49タンパク質は切断されて約60 kDaのN末端ペプチドと約40 kDaのC末端ペプチドに分けられ、N末端ペプチドが血中に分泌される。従って、本発明の診断方法においては、切断後のN末端ペプチドまたはC末端ペプチドが検出されてもよい。例えば、血液や血清などの試料中に含まれる分泌されたN末端ペプチドが検出されてもよい。

本発明によって診断される癌は、特に制限されることはなく如何なる癌でもよい。具体的には、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫、又はグリオーマ（例えば、グリオブラストーマ）などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、および転移病巣のいずれをも診断することができる。本発明において特に好ましい癌は、原発性胃癌、および転移性胃癌である。

本発明においては、被検試料中にタンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として癌が診断される。具体的には、陰性コントロールまたは健常者と比較して被検試料中に検出されるGPR49タンパク質の量が多い場合に、被検者が癌である、または将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。すなわち本発明は、次の工程を含む癌の診断方法に関する。
(1) 被検者から採取された生体試料中のGPR49発現レベルを検出する工程、および
(2) (1)で検出されたGPR49の発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有することが示される工程。

本発明において、対照とは、比較の基準となる試料をいい、陰性コントロールや健常者の生体試料が含まれる。陰性コントロールは、健常者の生体試料を採取し、必要に応じて混合することによって得ることができる。対照のGPR49の発現レベルは、被検者の生体試料におけるGPR49の発現レベルと平行して検出することができる。あるいは、予め、多数の健常者の生体試料におけるGPR49の発現レベルを検出し、健常者における標準的な発現レベルを統計学的に決定することができる。具体的には、たとえば、平均値±２×標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±３×標準偏差(S.D.)を標準値として用いることもできる。統計学的に、平均値±２×標準偏差(S.D.)は80％の、また平均値±３×標準偏差(S.D.)は90％の健常者の値を含む。

あるいは、対照におけるGPR49の発現レベルを、ROC曲線を利用して設定することができる。ROC曲線(receiver operating characteristic curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１−特異度"）を示すグラフである。本発明においては、生体試料中のGPR49の発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。

なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析のために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のGPR49の測定値の最小値と最大値の間で、基準値を変化させることができる。

得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法においては、上記工程(2)において、(1)で検出されたGPR49の発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたGPR49の発現レベルが高いときに、被検者の癌が検出される。

本発明において、GPR49の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、GPR49のmRNAの量、GPR49タンパク質の量、そしてGPR49タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、GPR49の発現レベルを知ることができる。GPR49のmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。

本発明においては、GPR49タンパク質を発現する任意の動物種を被検者とすることができる。例えば、チンパンジー(Pan troglodytes)（ENSPTRG00000005223 (XR_021586.1)）、アカゲザル（Macaca mulatta）（ENSMMUG00000020942）、マウス(Mus musculus)(ENSMUSG00000020140)、ラット(Rattus norvegicus）(ENSRNOG00000004221 (LOC687868))、モルモット（Cavia porcellus）（ENSCPOG00000009492）、イヌ（Canis familiaris）（ENSCAFG00000000451）、ネコ（Felis catus）（ENSFCAG00000008064）、ニワトリ(Gallus gallus)(ENSGALG00000010163) 等、ヒト以外の多くの哺乳類がGPR49タンパク質を発現していることが知られている。したがってこれらの動物は、本発明における被検者に含まれる。特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物を被検者とするときは、当該動物種のGPR49タンパク質が検出されることは言うまでもない。

被検試料に含まれるGPR49タンパク質の検出方法は、特に限定されないが、抗GPR49抗体を用いた、以下に例示されるような免疫学的方法により検出することが好ましい；
ラジオイムノアッセイ（RIA）、
エンザイムイムノアッセイ（EIA）、
蛍光イムノアッセイ（FIA）、
発光イムノアッセイ（LIA）、
免疫沈降法（IP）、
免疫比濁法（TIA）、
ウエスタンブロット（WB）、
免疫組織化学（IHC）法、
免疫拡散法（SRID）。

これらの手法の中で、免疫組織化学（IHC）法は、癌に羅患した患者から取得した組織若しくは細胞を固定化した切片上でGPR49タンパク質を検出する工程を含み、癌の診断方法として好ましい免疫学的アッセイ法の一つである。免疫組織化学（IHC）法などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法である。

すなわち、GPR49は、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗GPR49抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織を検出することができる。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出される。

別の好ましい態様では、生体内の癌組織を抗GPR49抗体によって検出することもできる。すなわち本発明は、(1)放射性同位元素等の標識物質で標識されたGPR49タンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程と、(2)該標識物質の集積を検出する工程を含む癌の検出方法に関する。生体内に投与した抗体を追跡するために、抗体は、検出可能に標識することができる。たとえば蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素で標識された抗体の生体における挙動を追跡することができる。蛍光物質や発光物質で標識された抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察することができる。放射性同位元素は、その放射活性を追跡することによって、抗体の局在を画像化することができる。本発明において、生体内における抗GPR49抗体の局在は、癌細胞の存在を表している。

生体内の癌を検出するために抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。たとえば¹⁸F、⁵⁵Co、⁶⁴Cu、⁶⁶Ga、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸⁹Zr、および¹²⁴Iのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種による抗GPR49抗体の標識には、公知の方法（Acta Oncol. 32, 825-830, 1993）を利用することができる。

陽電子放出核種で標識された抗GPR49抗体がヒトや動物に投与された後に、PET（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種が放射する放射線が体外から計測され、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。PETは、薬物の体内挙動などに関するデータを非侵襲的に得るための装置である。PETによって、放射強度をシグナル強度として定量的に画像化することができる。上記のようにPETを使用することによって、患者から試料を採取することなく特定の癌で高発現する抗原分子が検出できる。抗GPR49抗体は、上記の核種の他に¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、⁴⁵Ti等の陽電子放出核種を用いた短寿命核種によって放射標識することもできる。

医療用サイクロトロンによる上記核種を用いた短寿命核種の生産、短寿命放射標識化合物の製造技術等に関する研究開発が進められている。これらの技術により抗GPR49抗体が種々の放射性同位元素によって標識することができる。患者に投与された抗GPR49抗体は、各部位の病理組織に対する抗GPR49抗体の特異性に従って原発病巣及び転移病巣に集積する。抗GPR49抗体が陽電子放出核種で標識されていれば、その放射活性を検出することにより該原発病巣および転移病巣の存在が放射活性の局在によって検出される。該診断用途に用いる場合には25-4000 keVのガンマ粒子又は陽電子放射量の活性値が適切に使用できる。また、適切な核種を選択して、さらに大量に投与すれば治療効果も期待できる。放射線による抗癌作用を得るためには、70-700 keVのガンマ粒子または陽電子放射量値を与える核種を使用できる。

本発明の方法の別の態様においては、GPR49の遺伝子の発現を検出する。本発明において検出される遺伝子は特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的または定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
単にGPR49のmRNAが存在するか否かの測定、
GPR49のmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
GPR49のmRNAの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など

一方、定量的な検出とは、GPR49のmRNAの濃度の測定、GPR49のmRNAの量の測定などを挙げることができる。

本発明における被検試料としては、GPR49のmRNAが含まれる可能性のある任意の試料を利用することができる。哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織、腹水、腹腔内洗浄液などが例示できる。好ましい試料は生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。

生物の体から採取された組織、若しくは細胞が固定化された標本、又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料を用いる場合にはインシトゥーハイブリダイゼーション法が好適に用いられる。インシトゥーハイブリダイゼーション法は、細胞や組織内の特定のDNAやRNAの有無若しくは分布およびその発現の強弱を確認する手法として発展してきた。原理としては細胞内の特定の核酸配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が特異的に複合体を形成する性質を利用したものである。当該プローブに予め放射性同位元素（RI）や抗原物質（ハプテン）等を標識しておくことにより、当該標識の検出を通じてハイブリダイゼーションした箇所が識別可能となることから、インシトゥーハイブリダイゼーション法は細胞内DNAやRNAなどの検出等に用いられている。プローブの標識としては好適にはRIによる標識を用いることができる。更に好適な例としては、非放射性物質のビオチンやジゴキシゲニン等のハプテン等を利用した蛍光標識を用いることができる。特に好適な例としてはFISHと呼ばれる蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hibridization）による検出法が用いられる。

診断される癌は、特に制限されない。具体的には、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌およびグリオーマ（例えば、グリオブラストーマ）などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、および転移病巣のいずれをも診断することができる。

本発明においてはGPR49タンパク質を発現する任意の動物種を被検者とすることができる。たとえば、マウス、ラット、アカゲザル、チンパンジー等、ヒト以外の多くの哺乳類がGPR49を発現していることが知られている。特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物種を被検者とするときには、当該動物種のGPR49のmRNAが検出される。

以下に検出方法の具体的な態様を記載する。まず、被検者から試料を調製する。次いで、該試料に含まれるGPR49のmRNAを検出する。本発明においては、mRNAから合成したcDNAを検出することもできる。本発明においては、被検試料中にGPR49のmRNAやGPR49をコードするcDNAが検出された場合、癌の可能性があると判定される。たとえば、陰性コントロールまたは健常者と比較して、被検試料中に検出されるGPR49のmRNAやGPR49をコードするcDNAの量が多い場合に、被検者が癌である、または将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。

mRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を本発明に利用することができる。

上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、短時間に多数の試料を検査することができる。

本発明は、被検試料中のGPR49タンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬またはキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗GPR49抗体を含む。

本発明の癌の診断用試薬と、GPR49の検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとすることができる。すなわち本発明は、GPR49に結合する抗体と、該抗体とGPR49との結合を検出する試薬を含み、さらにGPR49を含む生体試料からなる対照試料を含んでいてもよい、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、更に測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

[実施例１] Human Exon 1.0 ST Arrayによるhuman GPR49 mRNA発現解析
human GPR49 mRNAの臨床癌、癌細胞株、各種正常臓器における発現分布について明らかにするために、元来はスプライスバリアント解析を行うために開発されたHuman Exon 1.0 ST Array (Affymetrix社) を用いた発現解析を実施した。Human Exon 1.0 ST Arrayによって発現解析を実施する利点は、基本的に一遺伝子につき3’側に一つのprobe setしかなかったこれまでのAffymetrix社の発現アレイと比較して、Human Exon 1.0 ST Arrayでは遺伝子のエクソン毎に少なくとも一つのprobe setが設定されているので、本アレイを用いて遺伝子毎の発現解析を行った場合、一遺伝子について複数のprobe setの発現データを得ることができることになり、遺伝子毎の発現データの信頼性が上がると言える。

今回の発現解析においては、22例の肺腺癌摘出組織の腫瘍部、13例の胃癌摘出組織の腫瘍部、5例のユーイング肉腫組織の腫瘍部、20例の卵巣癌摘出組織の腫瘍部、19種類の肺腺癌細胞株、4種類の小細胞肺癌細胞株、16種類の胃癌細胞株、20種類の卵巣癌細胞株、及び71種類の正常組織（Clontech社、Ambion社、STRATAGENE社、Cell APPLICATIONS社、Panomics社、CHEMICON社、BioChain Institute社から購入）由来のtotal RNAを使用した。

全ての臨床癌摘出組織（インフォームドコンセント取得済み）の腫瘍部、正常部、及び癌細胞株（ATCC、JCRB、理研 BIOSOURCE CENTER CELL BANKから購入）については、Trizol (Invitrogen)を用いて製品添付の方法に従ってtotal RNA抽出を実施した。

上述のtotal RNA 1μgを用い、GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix)に準じて遺伝子発現解析実験を実施、Human Exon 1.0 ST Array Dataの数値化は、Affymetrix社提供のExACT (Exon Array Computational Tool)ソフトウェアを用いて実施した。

Human Exon 1.0 ST ArrayのHuman GPR49に対するCore Probe Setは21個存在し、そのprobe set IDは3422146,3422162,3422166,3422167,3422175,3422177,3422179,3422180,3422181,3422182,3422189,3422191,3422194,3422195,3422197,3422198,3422199,3422200,3422201である。

probe set ID 3422201の正常組織の発現データを図１に、胃癌細胞株、胃癌摘出組織の腫瘍部の発現データを図２に、ユーイング肉腫、小細胞肺癌、肺線癌摘出組織腫瘍部の発現データを図３に、卵巣癌細胞株、卵巣癌摘出組織の腫瘍部の発現データを図４にそれぞれ示す。

図１〜４から分かる通り、human GPR49トランスクリプトの正常組織での発現は、間脳(diencephalon)、延髄(medulla oblongata)、末梢神経(peripheral nerve)、骨格筋(skeletal muscle)、子宮(uterus)、胎盤(placenta)、胎児大腸(fetal colon)などに限られている。一方、薬物毒性が懸念される臓器である肺、腎臓、肝臓、骨髄、末梢血での発現は低く、副作用を低く抑えられる可能性が期待される。癌の組織では胃癌、ユーイング肉腫、小細胞肺癌、肺線癌、卵巣癌での高発現が観察され、これらの癌種に対するhuman GPR49を標的とした抗腫瘍剤が有効であることが期待される。

[実施例２] 全長ヒトGPR49発現細胞の樹立
全長ヒトGPR49 cDNAはそれぞれNCBI登録番号NP_003658.1（配列番号：１（アミノ酸配列））及びNM_003667.2（配列番号：２（塩基配列））を基礎にしてPCR法によって単離され、哺乳細胞発現用ベクター（pcDNA5/FRT/TO）(Invitrogen社)にクローニングされた。pcDNA5/FRT/TOは、ハイブリッドヒトCMV/TetO₂プロモーター下で挿入遺伝子が誘導発現可能であり、かつ薬剤耐性マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。さらにテトラサイクリンあるいはドキソサイクリン存在下においてのみ発現誘導することが可能な発現系FlpInシステム（Invitrogen社）を用いて全長ヒトGPR49 cDNAが293FlpIn T-Rex細胞に遺伝子導入された。DMEM（high glucose） / 10% FBS / 100μg/mL Zeocin^TM （Invitrogen社）/ 15μg/ml blasticidin（Invitrogen社）で培養された 293FlpIn T-Rex細胞への発現ベクターの導入にはFugene6（Roche社）が用いられた。マニュアルに従いFlp recombinaseを発現するpOG44ベクターとともにpcDNA5/FRT/GPR49ベクターの遺伝子導入が実施され、50μg/mL hygromycin B（Invitrogen社）による選抜により、全長ヒトGPR49が遺伝子導入されたヒトGPR49誘導発現細胞株、B2、B4が樹立された。発現ベクターに挿入されたGPR49遺伝子のN末端にはHAタグが導入されているので選抜細胞は抗HA抗体（Sigma社）により検出される。

チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞であるDG44細胞株にはBioRad GenePulserを用いて遺伝子導入し、HA-GPR49発現細胞株2B10を得た。

さらにDNA免疫用にGPR49遺伝子を導入したベクターが構築された。発現ベクターpMCNは、マウスCMVプロモーター（ACCESSION No. U68299）下で挿入遺伝子が誘導発現可能であり、かつ薬剤耐性マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。GPR49遺伝子を常法によりpMCNにクローニングすることによりGPR49発現ベクターであるpMCN-GPR49が作製された。

[実施例３] DNA免疫による抗GPR49モノクローナル抗体の作製
GeneGun Particle法によるマウスへの遺伝子導入によるDNA免疫が行われた。方法はBioRad社のマニュアルに従って実施された。1 mm Gold particle（BioRad社）とpMCN-GPR49 DNAを混合してチューブの内部にコーティングすることによりDNA免疫用の弾が作製された。６週令のMRL/lprマウスのメスに対して200-300 psiの圧力でHelios GeneGun（BioRad社）を用いてpMCN-GPR49 DNAがコーティングされた弾を腹部の皮膚に打ち込むことにより遺伝子導入した。皮膚に存在するケラチノサイト(keratinocyte)、ランゲルハンス細胞(Langerhans cell)、デンドリティック細胞(dermal dendritic cell)に導入された遺伝子はGPR49タンパク質を発現することによりこれらの細胞が抗原提示細胞（APC）となり免疫を惹起すると考えられる（Methods 31, 232-242（2003）；Immunization with DNA through the skin）。DNA免疫は1週間間隔で6回行われた。最終免疫としてはGPR49を発現するDG44細胞株2B10、100万個の細胞がPBSに希釈された後に尾静脈内に投与された。抗体価の測定は2B10細胞を用いたFACS解析により実施された。免疫したマウスの血清について、2B10細胞の細胞膜表面上に発現しているGPR49タンパク質との反応が比較された。反応性が一番高かったマウスに最終免疫して細胞融合に供された。最終免疫の3日後、当該脾臓細胞が摘出され、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1（P3U1、ATCCより購入）と2:1になるように混合された。細胞融合はPEG1500（ロシュ・ダイアグノスティック社）を徐々に加える事により行われ、ハイブリドーマ細胞が作製された。慎重にRPMI1640培地（GIBCO BRL社）を加えることによってPEG1500濃度が希釈された後、遠心操作によりPEG1500を除去した。次に、ハイブリドーマ細胞は10％FBS、1 x HAT media supplement（SIGMA社）、0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement（ロシュ・ダイアグノスティック社）を含むRPMI1640培地（以降、HAT培地）に懸濁され、200μL/ウェルとなるように96穴培養プレートに播種された。播種の際の細胞濃度は使用したP3U1細胞数に応じて希釈され、ハイブリドーマ細胞は96ウェル培養プレート中で37℃、5% CO₂にてHAT培地中で約一週間培養された。培養上清中に抗体を分泌しているハイブリドーマのスクリーニングはフローサイトメトリーにより実施された。

[実施例４] sGPR49Fcの調製
GPR49タンパク質の1-555番目のアミノ酸を含む断片をPCRにより増幅してマウスIgG2aのFc蛋白と融合蛋白として発現するようにベクターを構築した。できたベクターをDG44細胞に導入してsGPR49Fcの融合蛋白が発現できる細胞をネオマイシン耐性株として選抜した。得られた細胞株2D3を大量に培養して培養上清を回収してsGPR49Fc蛋白を精製した。ProteinAカラムによりFc融合蛋白としてアフィニティー精製されたsGPR49Fc蛋白は蛋白免疫の抗原やハイブリドーマのスクリーニング抗原に供された。

[実施例５] sGPR49Fc蛋白免疫による抗GPR49抗体の作製
アフィニティー精製sGPR49Fc蛋白は50μgをフロイント・コンプリートアジュバントと混合して免疫し、さらに2回アフィニティー精製sGPR49Fc蛋白は50μgをフロイント・インコンプリートアジュバントと混合したものを皮下にマウスの免疫することで抗体を誘導し、GPR49タンパク質との反応性が一番高かったマウスに25μgのsGPR49Fc蛋白を尾静脈より注射して3日後に細胞融合に供して前述のようにしてハイブリドーマを調製した。

[実施例６] FACS(フローサイトメトリー)による結合活性の評価
得られたハイブリドーマを用い、ヒトGPR49/DG44細胞(2B10)に対する結合がフローサイトメトリーにより評価された。FACSバッファー（2% FBS/PBS/0.05% NaN₃）に懸濁したヒトGPR49発現細胞株はFACSバッファーを用いて1x10⁶個/mLに希釈された後Falcon353910丸底96ウェルプレートに50μL/ウェルで分注された。細胞の入ったウェルに適当な濃度に希釈したハイブリドーマの培養上清を加えて、氷上にて60分間反応させた。次に細胞はFACSバッファーにて1回洗浄された。細胞の入ったウェルに2次抗体としてGoat F(ab')₂ フラグメント抗マウスIgG (H+L)-FITC（Beckman Coulter社）を添加した後、氷上にて30分間反応させた。反応後、遠心分離により上清が除かれた後に、FACS バッファー100μLに懸濁された細胞はフローサイトメトリーに供された。フローサイトメトリーにはFACS Calibur（ベクトンディッキンソン社）が用いられた。前方散乱光（forward scatter）及び側方散乱光（side scatter）のドットブロットにて生細胞集団にゲートが設定され、当該集団に含まれる細胞についてFL1のヒストグラムをとって結合活性が評価された。

ハイブリドーマの上清を、GPR49を誘導発現させたDG44細胞である2B10、その親株であるDG44にそれぞれ反応させたところ、GPR49発現細胞に特異的に反応するハイブリドーマが得られた。これらのウェルのハイブリドーマは限界希釈法により単一クローン化した。それぞれの抗体はIsoStrip（登録商標）mouse monoclonal antibody isotyping kit (ロシュ・ダイアグノスティクス）を用いてアイソタイプを解析した。その結果、2J18-1N、2J18-3はIgMで、2L7-8、2L9-3、2L10-19、2L13-3、2L15-12、2L16-15、2L18-15、2L33-6、2L34-5、2L36-12、2T4E-6、2T9E1#14、2T15E-2、2T42E-4、2T54-2、2T65-3、2T37-16、2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11はIgG1であった。単一クローン化されたハイブリドーマは拡大培養した後、培養上清からプロテインGカラムを用いてマニュアルに従って抗体を精製した。IgM抗体はプロテインLカラムを用いてマニュアルに従って抗体を精製した。精製した抗体はDC Protein Assay等にて蛋白定量した。

[実施例７] 抗原遺伝子のクローニング
ADCC活性及びCDC活性を示した2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2の6種類のハイブリドーマについて抗体可変領域遺伝子の配列が決定された。抗体の遺伝子は、抗GPR49抗体2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2それぞれを産生するハイブリドーマより抽出したTotal RNAを用いてRT-PCR法によって増幅された。各抗体2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2の遺伝子の名称は以下2J18、2U1E、2U2E、2L13、2L36、2T15E遺伝子と略して記載する。Total RNAが、RNeasy Plant Mini Kits（QIAGEN社）を用いて1×10^７細胞のハイブリドーマより抽出された。1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit（CLONTECH社）を用いることによってRACEライブラリーが構築された。IgM抗体である2J18-1NはマウスIgM定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgM（配列番号：６１; CCACCAGATTCTTATCAGACAGG）を用いて、他の抗体遺伝子はマウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1（配列番号：６２; GGGCCAGTGGATAGACAGATG）、またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドkappa（配列番号：６３; GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG）を用いることによって、当該ハイブリドーマが産生する抗体をコードする遺伝子の5’末端側遺伝子断片が増幅された。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応した。PCR溶液50μLは、5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、5μLの10×Universal Primer A Mix、0.2 mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix（以上、CLONTECH社製）、2.5μLの逆転写反応産物、10 pmolの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgM、MHC-IgG1またはkappaを含有していた。PCR反応は、94℃の初期温度にて30秒間反応後、94℃にて5秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、次に94℃にて5秒間、70℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、さらに94℃にて5秒間、68℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを25回反復することによって行われた。最後に反応産物は72℃で7分間加熱された。各PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、アガロースゲルから精製された。その後、当該PCR産物はpGEM-T Easyベクター（Promega社製）へクローニングされ、その塩基配列が決定された。

2J18のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号：３、アミノ酸配列を配列番号：４、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号：８、アミノ酸配列を配列番号：９に示す。又、2J18の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：５、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：６、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：７、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：１０、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：１１、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。

2U1EのH鎖可変領域の塩基配列を配列番号：１３、アミノ酸配列を配列番号：１４、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号：１８、アミノ酸配列を配列番号：１９に示す。又、2U1Eの重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：１５、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：１６、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：１７、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：２０、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：２１、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：２２に示す。

2U2EのH鎖可変領域の塩基配列を配列番号：２３、アミノ酸配列を配列番号：２４、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号：２８、アミノ酸配列を配列番号：２９に示す。又、2U2Eの重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：２５、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：２６、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：２７、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：３０、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：３１、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：３２に示す。

2L13のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号：３３、アミノ酸配列を配列番号：３４、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号：３８、アミノ酸配列を配列番号：３９に示す。又、2L13の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：３５、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：３６、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：３７、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：４０、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：４１、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：４２に示す。

2L36のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号：４３、アミノ酸配列を配列番号：４４、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号：４８、アミノ酸配列を配列番号：４９に示す。又、2L36の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：４５、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：４６、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：４７、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：５０、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：５１、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：５２に示す。

2T15EのH鎖可変領域の塩基配列を配列番号：６４、アミノ酸配列を配列番号：６５、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号：６９、アミノ酸配列を配列番号：７０に示す。又、2T54Eの重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：６６、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：６７、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：６８、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号：７１、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号：７２、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号：７３に示す。

[実施例８] 強制発現細胞株の細胞破砕液を用いたWestern Blotting
HA-GPR49発現DG44細胞株2B10の細胞破砕液を用いてウエスタンブロッティングできる抗体をスクリーニングしたところ2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11、2T15E-2、2T65-3などがウエスタンブロッティングによりGPR49タンパク質として予想される分子量100 kDaのバンドを検出することができた。検出された100 kDaのバンドがヒトGPR49に由来するものであることを確認するためにドキソサイクリンで誘導発現できるHA-GPR49を発現する293細胞B2の非誘導時、誘導時の細胞破砕液との反応性をウエスタンブロッティングにより解析した。結果を図５に示す。293、B2の0は非誘導時の、1および10は発現誘導時の細胞破砕液を意味する。モノクローナル抗体2U2E-2での検出で誘導発現したレーンに特異的に100 kDaのバンドが確認された。このバンドはHAのタグで検出されるHA-GPR49のバンドである100 kDaのバンドと同じサイズであることからモノクローナル抗体2U2E-2はGPR49を認識する抗体であると結論できた。

[実施例９] siRNA による抗体認識抗原の確認
さらに100 kDaのバンドがGPR49由来のバンドであることを確認するためにsiRNAをトランスフェクションすることによりGPR49の発現をノックダウンして抗体が認識しているバンドが消失することを確認した。Invitrogen社から購入したGPR49に対するsiRNA（Cat.No. 1299003）LGR5-HSS112507、LGR5-HSS112508、LGR5-HSS112509(以下、siRNA507、508、509と省略)をマニュアルに従って2B10細胞株またはGPR49高発現大腸癌細胞株であるLoVo細胞に導入し、その細胞破砕液をウエスタンブロッティングで解析した。その結果、図６に示すようにGPR49の予想分子量100 kDa蛋白に相当するバンドがsiRNA507、508、509の3種類のsiRNAのうち508、509において顕著に消失が見られたことから、100 kDaのバンドはGPR49を認識していると考えられた。

さらに図６に示すように2U1E-1、2U2E-2によるウエスタンブロッティングの結果、siRNAの導入によって消失する100 kDa蛋白のバンドとともに消失する新たなバンドを見出した。抗体2U1E-1による検出では100 kDa蛋白のバンドに加えて約40 kDa蛋白のバンドがsiRNAにより消失することが見出された。また、抗体2U2E-2による検出では100 kDa蛋白のバンドに加えて約60 kDa蛋白のバンドがsiRNAにより消失することが明らかとなった。これらの二つのバンドのサイズを合計するとちょうど全長の100 kDaとなることからGPR49タンパク質はどこかで切断されて60 kDa、40 kDaの蛋白質を生じるものと考えられた。また、60kDa, 40kDaのバンドは大腸癌細胞株であるLoVo細胞でも検出された。

[実施例１０] 免疫沈降法による切断断片の検出
ウエスタンブロッティングで検出された40 kDa蛋白、60 kDa蛋白のバンドの存在を確認するためにGPR49モノクローナル抗体を用いて免疫沈降実験を実施した。免疫沈降するサンプルとしてHA-GPR49を発現するDG44細胞株2B10をNP40 lysis buffer (0.5% NP40, 50 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, Roche社 protease inhibitor complete mini) にて可溶化して調製した細胞破砕液を使用した。細胞破砕液に含まれる蛋白量はDC Protein AssayにてBSAをスタンダードとして蛋白定量した。100μgの蛋白を含む細胞破砕液500μLに対して2μgの抗体溶液を加えて4℃で1時間反応させた。さらに20μL Proetein A/G Plus agarose(Santa Cruz社)を加えて一晩反応させた。1000 x g 1分遠心してアガロースビーズを沈降させ、1 mL PBSにて二回洗浄した後、50μL 2x SDS-sample bufferを加えて60℃、30分保温することで抗体と結合している抗原を溶出した。1000 x gで1分間遠心して得られた上清のうち15μLをSDS-PAGEに供した。ミリポア社のイモビロンPにサブマリン法で転写し、モノクローナル抗体2U1E-1、2U2E-2により検出した。その結果を図７、８に示す。2L13-3、2L36-12で免疫沈降したサンプルを流したレーンで見られるように確かに100 kDaのバンドに加えて40 kDaのバンドが2U1E-1で検出でき、60 kDaのバンドが2U2E-2で検出されたことからGPR49は100 kDaに加えて約60 kDa、約40 kDaのサイズで示される分子量をもつ分子として存在していることが明らかとなった。図７は二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社製)を使用して、図８は免疫沈降に使用した抗体のH鎖に由来するバンドと60 kDaのGPR49のバンドを区別するために二次抗体としてHRP標識抗マウスkappa抗体(Southern Biotech社製)を使用した。

[実施例１１] 各種癌細胞株の細胞破砕液を用いたWestern Blotting
各種の癌細胞株の細胞破砕液をモノクローナル抗体2U2E-2で検出した。図９に示すように大腸癌細胞株であるLoVo、肝細胞癌株Alexander、HepG2、卵巣癌細胞株KURAMOCHI、OVSAHO、グリオーマU251で特に顕著にGPR49タンパク質の発現が亢進している。矢印は100 kDa、60 kDaのGPR49タンパク質のバンドを示す。写真の中のレーンはサンプル名を示し、それぞれ大腸癌細胞株LoVo、胃癌細胞株NUGC-4、肝細胞癌株Alexander、肝細胞癌株HepG2、肝細胞癌株Huh6、卵巣癌細胞株KURAMOCHI、卵巣癌細胞株OVSAHO、グリオーマU251、チャイニーズハムスター卵巣細胞DG44、HA-GPR49発現DG44細胞株2B10を示す。

[実施例１２] 抗GPR49モノクローナル抗体のCDC活性の測定
CDC活性は細胞傷害が生じた細胞への7-AADの取り込みの度合いを指標にすることによって測定された。
GPR49発現DG44細胞またはDG44細胞とモノクローナル抗体を10μg/mLの濃度で4℃にて30分間反応させた。次に、Baby Rabbit Complement（CEDARLANE LABORATORIES 社）が最終濃度1%または5%となるように添加され、37℃で90分反応が継続された。7-AAD（Beckman Coulter社）が最終濃度1μg/mLで加えられた後に室温で10分静置された。その後、細胞はFACSバッファーで洗浄された後、細胞傷害が起きている細胞の割合がFACSCaliburにて解析された。%FL3の値は7-AADで染色された細胞傷害を受けている細胞の割合を示し、HA-GPR49を発現しているDG44細胞において抗GPR49抗体2J18-1Nにより特異的に補体依存的細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity（CDC））活性が認められた(図１０)。

[実施例１３] 2J18 scFv-Fc発現ベクターの構築
抗ヒトGPR49モノクローナル抗体2J18はIgMであるためADCC活性を評価できない。そこで抗体遺伝子をscFv-Fcの形で発現させた。実施例７のようにしてクローニングした2J18抗体遺伝子はH鎖、L鎖の可変領域をPCRで増幅してリンカーとしてGGGGSのアミノ酸を介して結合させた後に、マウスのIgG2aのH鎖のhinge領域、CH2領域、CH3領域を連結してscFv-Fcの形で発現される抗体分子を作成した。具体的には以下のプライマーを用いてPCRを実施した。

KozakATG-2J18VH
GCGAATTCCACCATGGGATG（配列番号：７４）
2J18VH-GS1
TGAGCCACCGCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAG（配列番号：７５）
GS1-2J18VL
GGTGGCGGTGGCTCACAGATTGTTCTCACCCAGTC（配列番号：７６）
2J18VH-GS2
ACTCCCACCACCGCCTTTTATTTCCAATTTTGTCCCCG（配列番号：７７）
GS2-mIgG2a-hinge
GGCGGTGGTGGGAGTGAGCCCAGAGGGCCCAC（配列番号：７８）
NX-mG2a-3
CTCTAGAGCGGCCGCTTATC（配列番号：７９）
これを発現ベクターに挿入して2J18scFv-Fc発現ベクターが完成した。

[実施例１４] 2J18 scFv-Fc蛋白の調製
2J18scFv-Fc発現ベクターは293T細胞に一過性に発現させ、その培養上清よりProteinGカラムにてアフィニティー精製した。T75フラスコに培養した293T細胞（ATCCより購入）200万細胞に対して18μgのプラスミドDNAをFugeneHD(Roche社製)54μLとともに900μLのOpti-MEM(Invitorogen社製)の中で混合して15分間静置したのちに細胞の上からかけて遺伝子を細胞に導入した。5% CO₂インキュベーター中で37℃にて3日間培養したのちに培養上清を回収し、ProteinGカラムを使用してマニュアルに従って2J18scFV-Fcを精製した。

[実施例１５] ヒトIgG1キメラ2L13抗体の作成
実施例７のようにしてクローニングした抗ヒトGPR49モノクローナル抗体2L13の抗体遺伝子はH鎖、L鎖の可変領域をPCRで増幅してヒトIgG1のH鎖定常領域、L鎖定常領域と連結してヒトIgG1キメラ分子として発現できるように発現ベクターに挿入した。得られたベクターはラットミエローマ細胞YB2/0(ATCCより購入) に遺伝子導入してネオマイシン耐性株を樹立した。RPMI-1640/10% FBS/500μg/mL Geneticine/ペニシリン・ストレプトマイシン存在下で培養し、培養上清からヒトIgG1キメラ抗体をProteinAカラムにてマニュアルに従って精製した。精製できた抗体2L13/YBはADCC活性の測定に供された。

[実施例１６] 抗GPR49モノクローナル抗体のADCC活性の測定
抗ヒトGPR49モノクローナル抗体におけるGPR49強制発現DG44細胞2B10に対するADCC活性をクロム放出法で調べた。ターゲット細胞となる2B10はChromium-51を添加した培養液(CHO-S SFM II(Invitrogen社製))にて培養を数時間行った後、培養液を除去、培養液で細胞を洗浄したのちに新しい培養液に懸濁された細胞が1ウェルあたり1×10^４個の細胞となるように96ウェル丸底プレートに添加された。続いて抗体を最終濃度1μg/mL、0.1μg/mLとなるように添加し、各ウェルにターゲット細胞に比べて約5倍量のエフェクター細胞(NK-92 (ATCC, CRL-2407)にマウスFc-gamma受容体3(NM_010188)の細胞外領域およびヒトgamma鎖(NM_004106)の膜貫通領域と細胞内領域を含むキメラタンパク質を強制発現させた組換え細胞(特願2007-20155))を添加し、プレートを5% CO₂インキュベーター中で37℃にて4時間静置した。静置後プレートを遠心し、各ウェルより一定量の上清を回収してガンマカウンターWallac 1480を用いて放射活性を測定し以下の式を用いて特異的クロム遊離率(%)を求めた。

特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)

ここで、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1% Nonidet P-40で細胞溶解して培地へ放出される放射活性平均値、Cは培地のみ添加した場合における放射活性平均値である。

その結果、図１１に示したように、試験に用いた抗ヒトGPR49モノクローナル抗体のうち特に2T54-2、2T15E-2、2L13-3、2L36-12及び2J18scFv-Fcは、ヒトGPR49発現細胞2B10に対して非常に強いADCC活性を誘導した。本結果は、ヒトGPR49を標的とした腫瘍に対する抗体治療が非常に有用であることを示す結果である。

ヒトIgG1キメラ抗体2L13/YBのADCC活性の測定は、ターゲット細胞として前述と同じ2B10細胞を用いてターゲット細胞に比べて約5倍量のエフェクター細胞(NK-92 (ATCC, CRL-2407)にヒトFc-gamma受容体3(NM_000569)を強制発現させた組換え細胞(特願2007-20155))を添加し、プレートを5% CO₂インキュベーター中で37℃にて4時間静置した。静置後プレートを遠心し、各ウェルより一定量の上清を回収してガンマカウンターWallac 1480を用いて放射活性を測定し以下の式を用いて特異的クロム遊離率(%)を求めた。その結果、図１１に示すように2L13/YBにおいてヒトGPR49発現細胞に対して非常に高いADCC活性が確認された。

[実施例１７] Mab-Zapを用いたinternaization による殺細胞効果
抗体に毒素等を結合させて細胞内に抗体が標的細胞に結合したのちに細胞内に取り込まれ、コンジュゲートした毒素の作用により標的の細胞を殺すことを作用機序とした抗体医薬の開発のモデルとしてサポリンという毒素の結合された二次抗体、Mab-Zap(Advanced Targeting Systems社製)を用いてGPR49発現細胞に対する殺傷能を評価した。細胞はHA-GPR49を誘導発現させたB4、非誘導発現したB4細胞を用いた。抗体はウェルあたり100 ng、Mab-Zapもウェルあたり100 ngを加えて3日間37℃ 5% CO₂インキュベーターにて保温した後に生細胞数を生細胞測定試薬SF(ナカライテスク社製)を使用したWST8アッセイにて解析した。結果を図１２に示す。2T42E-4、2U2E-2、2U4E-11を除く解析した抗体のいずれにおいても細胞傷害活性が確認できた。

[実施例１８] GST融合蛋白の発現とエピトープの解析
40 kDaのバンドを認識する2U1E-1をdeletion mutantのGPR49発現ベクターを構築してWBにより解析した結果、495-537番目のアミノ酸の中にエピトープが存在することが判明した。そこで範囲を狭めるためにGST融合蛋白として495-537、495-516、510-529、517-537番目のアミノ酸をGST蛋白と融合させて発現させた。各GST融合蛋白が含むGPR49のアミノ酸配列を図１３に示す。図１４に結果を示す発現産物を使ったウエスタンブロット解析の結果、2U1E-1は517-537のアミノ酸の領域をエピトープとすることが判明した。また、同じく40 kDaを認識する2T15E-2抗体のエピトープの解析を行ったところ510-529のアミノ酸の領域にエピトープが存在した。この結果より、切断により生じる40 kDaの蛋白は少なくとも510番目のアミノ酸までの配列を含む分子であるということがいえる。

[実施例１９] 抗GPR49モノクローナル抗体のマウスGPR49との反応性
マウスGPR49を発現ベクターに組み込み、一過性に293T細胞に発現させてその細胞破砕液をWBにて解析したところ図１５に示されるようにマウスのGPR49に対しても反応することが明らかとなった。

[実施例２０] FACS(フローサイトメトリー)による結合活性の評価
抗体2T15E-2とヒト癌細胞株との反応性をフローサイトメトリーで解析した。FACSバッファー（2% FBS/PBS/0.05% NaN₃）に懸濁したヒト癌細胞株はFACSバッファーを用いて1x10⁶個/mLに希釈された後Falcon353910丸底96ウェルプレートに50μL/ウェルで分注された。10μg/mLの濃度に希釈した抗体2T15E-2を加えて、氷上にて60分間反応させた。次に細胞はFACSバッファーにて1回洗浄された。細胞の入ったウェルに2次抗体としてGoat F(ab')₂ フラグメント抗マウスIgG (Fcγ)-FITC（Beckman Coulter社）を添加した後、氷上にて30分間反応させた。反応後、遠心分離により上清が除かれた後に、PI(プロピジウム・イオジド)を含むFACS バッファー100μLに懸濁された細胞はフローサイトメトリーに供された。フローサイトメトリーにはFACS Calibur（ベクトンディッキンソン社）が用いられた。前方散乱光（forward scatter）及び側方散乱光（side scatter）のドットブロットにて生細胞集団にゲートが設定され、当該集団に含まれる細胞についてFL1のヒストグラムをとって結合活性が評価された。

卵巣癌細胞株OVSAHO, 肝癌細胞株Alexander, 胃癌細胞株 NUGC-4を用いたフローサイトメトリー解析で一次抗体を含まないピークに比較して明らかなピークの移動が観察されたことからこれらの細胞株においてGPR49分子が細胞膜上に存在することが明らかとなった（図１６）。実線で示したピークが癌細胞株との反応性をしめしており、影をつけた部分は抗体なしで反応させたときのピークである。横軸はFITCを結合した抗体の結合度によるシグナルの強さを示し、縦軸は細胞数を示す。

本発明に係るGPR49タンパク質に特異的な抗体は、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマなどの診断薬として使用することができる。本発明による診断薬は、原発性、あるいは転移性の癌の診断に有用である。具体的には、患者から採取された生体試料中に含まれるGPR49タンパク質を検出することにより、癌の可能性を判定することができる。あるいは、生体内におけるGPR49発現細胞の局在を検出することによって、生体内において胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマの存在を検出することができる。

また、本発明に係る細胞傷害活性を有する抗GPR49抗体は、GPR49タンパク質を発現する癌の治療あるいは予防に有用である。具体的には、本発明に基づいて、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマなどの各種の癌細胞の細胞傷害剤あるいは細胞増殖抑制剤が提供される。本発明による癌細胞の細胞傷害剤あるいは細胞増殖抑制剤は、原発性、および転移性のいずれの癌に対しても適用することができる。

更に、本発明に係る細胞傷害活性を有する抗GPR49抗体は、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマなどの各種の癌に対する治療薬として使用することができる。本発明において、抗GPR49抗体は、原発性、および転移性のいずれの癌に対する治療薬としても有用である。

加えて、本発明に係る抗体をコードする遺伝子及び当該遺伝子により形質転換された組換え細胞は上記記載の効果、あるいはより好適な効果を奏する組換え抗体を作製するために使用することができる。

Claims (21)

1. GPR49タンパク質に結合し、かつGPR49タンパク質を発現する細胞に対して細胞増殖阻害活性を有する抗体。
2. 細胞増殖阻害活性が細胞傷害活性である請求項１に記載の抗体。
3. 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性である請求項２に記載の抗体。
4. 細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性である請求項２に記載の抗体。
5. 細胞傷害性物質が結合した抗体である請求項１〜４いずれかに記載の抗体。
6. インターナライズ活性を有する抗体である請求項５に記載の抗体。
7. 癌細胞の増殖を抑制する抗体である請求項１から６のいずれかに記載の抗体。
8. 癌細胞が胃癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、ユーイング肉腫細胞およびグリオーマ細胞のいずれかである請求項７に記載の抗体。
9. 以下（１）から（２０）のいずれかに記載の抗体；
   （１）CDR1として配列番号：５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
   （２）CDR1として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
   （３）（１）に記載のH鎖、および（２）に記載のL鎖を含む抗体、
   （４）CDR1として配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
   （５）CDR1として配列番号：２０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
   （６）（４）に記載のH鎖、および（５）に記載のL鎖を含む抗体、
   （７）CDR1として配列番号：２５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：２６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
   （８）CDR1として配列番号：３０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：３１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：３２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
   （９）（７）に記載のH鎖、および（８）に記載のL鎖を含む抗体、
   （１０）CDR1として配列番号：３５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：３６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
   （１１）CDR1として配列番号：４０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：４２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
   （１２）（１０）に記載のH鎖、および（１１）に記載のL鎖を含む抗体、
   （１３）CDR1として配列番号：４５に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：４６に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：４７に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
   （１４）CDR1として配列番号：５０に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：５１に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：５２に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
   （１５）（１３）に記載のH鎖、および（１４）に記載のL鎖を含む抗体、
   （１６）CDR1として配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：６７に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：６８に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
   （１７）CDR1として配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
   （１８）（１６）に記載のH鎖、および（１７）に記載のL鎖を含む抗体、
   （１９）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
   （２０）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体が結合するGPR49タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
10. ヒト定常領域を有する抗体である請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
11. キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項１０に記載の抗体。
12. 請求項１から１１のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
13. 請求項１から１１のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
14. 請求項１から１１のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
15. 癌が、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマからなる群から選択されるいずれかの癌である、請求項１４に記載の抗癌剤。
16. GPR49タンパク質またはGPR49タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法。
17. GPR49タンパク質を検出することを特徴とする請求項１６に記載の診断方法。
18. GPR49タンパク質の検出がGPR49タンパク質に結合する抗体を用いて行なわれる請求項１７に記載の診断方法。
19. 以下の工程を含む癌の診断方法；
    （ａ） 被検者から採取された試料を提供する工程；
    （ｂ） （ａ）の試料に含まれるGPR49タンパク質を、GPR49タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。
20. 以下の工程を含む癌の診断方法；
    （ａ） GPR49タンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体を被検者に投与する工程、
    （ｂ） 前記放射性同位元素の集積を検出する工程。
21. 癌が、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巣癌、ユーイング肉腫およびグリオーマからなる群から選択されるいずれかの癌である請求項１６から２１いずれかに記載の診断方法。

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