JPWO2008018519A1 - ヒアルロン酸の分子量の測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
HA:ヒアルロン酸
BSA:ウシ血清アルブミン
CS−C:コンドロイチン硫酸C
HA−BSA:HA−BSAコンジュゲート
HABP:HA結合性タンパク質
ビオチン−HABP:ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質
HRP−アビジン:ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
OPD錠:O−フェニレンジアミン錠
ABTS錠:2,2'−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−0−スルホン酸)
TMB(+):N,N,N,N−テトラメチルベンチジン(+)
TMB BLUE:N,N,N,N−テトラメチルベンチジンブルー
PBS:食塩添加リン酸ナトリウム緩衝液
GPC:ゲル浸透クロマトグラフィー
SDS:ドデシル硫酸ナトリウム
TCA:トリクロロ酢酸
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA: Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid
TLCK: Nα-p-Tosyl-lysine chloromethyl ketone
TPCK: N-p-Tosyl-phenylalanine chloromethyl ketone
上記HABPのHAに対する反応性は、HAの分子量に依存して一定方向に変化し、従ってHAの分子量によりHAに結合するHABPの量が変化する。従って、HAに結合するHABPの量又はその量を反映する値を測定することにより、HAの分子量を測定することができる。
(1) 試料中のHA濃度を測定する工程、
(2) 試料中のHAをHABPと反応させ、試料中のHAに結合したHABPの量又はその量を反映する値を測定する工程、及び
(3) 濃度及び分子量既知の標準HA試料から得られたHAの分子量とHAに結合するHABPの量又はその量を反映する値との関係に基づいて、上記工程(1)で得られた試料中のヒアルロン酸濃度と、上記工程(2)で得られた試料中のHAに結合したHABPの量又はその量を反映する値から試料中のHAの分子量を求める工程
により行うことができる。
(i) HABPを固相に固定する工程、
(ii) 固相に固定したHABPに試料中のHAを反応させる工程、
(iii) 固相に固定したHABPに結合したHAに、標識したHABPをさらに反応させる工程、及び
(iv) 工程(iii)においてHAに結合した標識HABPの量又はその量を反映する値を測定する工程、から構成される工程が例示できる。
上記添加剤としては、グアニジン塩酸、尿素などのタンパク質変性剤、CS−Cなどの酸性多糖類、SDSなどの界面活性剤などが使用できる。
本発明キットは、HABPの他、上記添加剤、上記添加剤を含むバッファー、分子量既知のHA標準試料などを含むものとしてもよい。
上記工程において、HABPはHAに対する反応性がHAの分子量に依存して一定方向に変化し、従ってHAの分子量によりHAに結合するHABPの量が変化する。これによりHAに結合するHABPの量又はその量を反映する値を測定することによって、HAの分子量を測定することができるものである。
1)HA分子量が低下しない条件下で、プロテアーゼ処理による共存タンパク質を分解する工程。
2)HA分子量が低下しない条件下で、1) の処理液にタンパク質沈殿剤、変性剤、あるいは特異的阻害剤によりプロテアーゼを失活させる工程。
3)HA分子量が低下しない条件下で、2) の各試薬を中和あるいは除去する工程。
4)2) あるいは3) 液に対して、分子量測定工程1および工程2を実施するために必要な特定の成分を加える調整工程。
1.分子量測定の工程1においてHA分子量に影響されず同一の反応性を示すこと。
2.分子量測定の工程2においてHA分子量の増加とともに一定方向の反応性の変化を示すこと。
(1)菌体由来のプロテアーゼ
(例:Pronase E、Proteinase K (SIGMA社)、Actinase E、Actinase AF(科研製薬)、Dispase(ロシュダイアグノスティック社))
(2)菌体由来のコラゲナーゼ
(例:Collagenase A, Collagenase P(ロシュダイアグノスティック社))
(3)脊椎動物由来のCystein Proteinase
(例:Papain)
(4)脊椎動物由来の Serine Proteinase
(例:Chimotrypsin, Trypsin)
a)TCA、過塩素酸などの徐タンパク試薬
b)pH2.0以下の酸性緩衝液
c)グアニジン塩酸、尿素、硫酸アンモニウムなどのタンパク変性剤
本工程においては、必要に応じて、変性・沈殿したプロテアーゼを除去する操作を加えることができる。具体的には、以下に示す操作が利用できる。
a)遠心分離
b)フィルターろ過
a)キレート剤(例:EDTA, EGTA)
b)還元剤(例:ヨード酢酸)
c)Serin Protease阻害剤(例:TPCK、TLCK、大豆トリプシンインヒビター)
d)市販プロテアーゼインヒビターカクテル
1)Tris、Bis-Tris, MOPS等のGoodの緩衝液成分で作成した塩基性溶液
2)ホウ酸Na, リン酸Na糖の無機塩で作成した塩基性溶液
1)脱塩用カラムを用いた脱塩
2)透析膜・透析カセット等を用いた透析
また、必要に応じて試料を濃縮するために、下記方法が使用できる。
1)遠心エバポレータ
2)凍結乾燥
(1) 試料中のHA濃度を測定する工程、
(2) 試料中のHAをHABPと反応させ、試料中のHAに結合したHABPの量又はその量を反映する値を測定する工程、及び
(3) 濃度及び分子量既知の標準HA試料から得られたHAの分子量とHAに結合するHABPの量又はその量を反映する値との関係と、上記工程(1)で得られた試料中のHA濃度と、上記工程(2)で得られた試料中のHAに結合したHABPの量又はその量を反映する値から試料中のHAの分子量を求める工程
により好ましく行うことができる。
HAを固定化した固相とHABPとを利用した競合的阻害法は、例えば以下のような具体的手順により行うことができるが、これに限定されるものではない。
2) BSAを用いて各ウェルをブロッキングする。
3) HA標準試料(特定の分子量1種のみ、濃度ポイントは6点前後)及び適時希釈した被検試料を各ウェルに添加する。
4) 被検試料にビオチン−HABP溶液を添加し、所定時間反応させる。
5) 未反応HA及びビオチン−HABPを除去した後、HRP−アビジン溶液を添加し、所定時間反応させる。
6) 発色基質溶液(例えばオルトフェニレンジアミン)を添加し、所定時間反応させる。
7) 停止液を添加し、マイクロプレート吸光度計を用いて所定の測定波長にて吸光度を測定する。
8) 標準試料について得られた吸光度から標準曲線を作成し、これと被検試料について得られた吸光度から被検試料中のHA濃度を決定する。
(i) HABPを固相に固定する工程、
(ii) 固相に固定したHABPに試料中のHAを反応させる工程、
(iii) 固相に固定したHABPに結合したHAに、さらに標識したHABPを反応させる工程、及び
(iv) 工程(iii)においてHAに結合した標識HABPの量又はその量を反映する値を測定する工程により行うことができる。
上記工程(iii)において使用する標識したHABPの標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、酵素、アイソトープ、蛍光色素、化学発光物質等が使用でき、取り扱いやすさや標識対象物質の量が正確に反映されることなどから、ビオチン及びアビジンが好ましい。また、HABPの抗体を作製し、これを上記のような標識物質で標識し、これをHABPと反応させることによりHABPを検出することもできる。
上記添加剤としては、グアニジン塩酸、尿素などのタンパク質変性剤、CS−Cなどの酸性多糖類、SDSなどの界面活性剤などが使用でき、グアニジン塩酸が特に好ましい。
9) HABPをELISAプレートの各ウェルに固相化する。
10) BSAを用いて各ウェルをブロッキングする。
11) 標準試料(特定の分子量3種以上、濃度ポイントは同一1点のみ)及び被検試料をそれぞれ各ウェルに添加し、所定時間反応させる。
12) ビオチン−HABP溶液を添加し、所定時間反応させる。
13) HRP−アビジン溶液を添加し、所定時間反応させる。
14) 発色基質溶液(例えばオルトフェニレンジアミン)を添加し、所定時間反応させる。
15) 停止液を添加し、マイクロプレート吸光度計を用いて所定の測定波長にて吸光度を測定する。
16) 標準試料について得られた吸光度を使用し、分子量に対して吸光度をプロットすることにより標準曲線を作成し、これと被検試料について得られた吸光度から被検試料中の分子量を決定する。
上記本発明のキットは、HABPの他、HABPのHAに対する反応性を調節するための添加剤、該添加剤を含む又は含まないバッファー、標準曲線作成用の分子量既知のHA標準試料などを含むものとしてもよい。
以下の実施例においては下記の材料を使用した。
ELISA用96ウェルプレート(Maxisorp、ナルジェヌンク社製)
BSA(オリエンタル酵母社製)
HA(アルツアンプル、鶏冠由来、生化学工業社製)
CS−C(サメ軟骨由来、生化学工業社製)
HA−BSA(生化学工業社製)
HABP(「ヒアルロン酸バインディングプロテイン」、生化学工業社製)
ビオチン−HABP(生化学工業社製)
HRP−アビジン(PIERCE社製)
OPD錠(SIGMA社製)
ABTS錠(SIGMA社製)
OPD(o-フェニレンジアミン)用緩衝液(特殊免疫研究所社製)
TMB(+)(DAKO社製)
TMB BLUE(DAKO社製)
PBS(塩化ナトリウム8g、塩化カリウム0.2g、リン酸水素二ナトリウム2.9g、リン酸二水素カリウム0.2gを精製水1Lに溶解して調製した。)
洗浄液(PBS 1LにTween-20(和光純薬社製)0.5mL を添加し、攪拌溶解して調製した。)
ELISA基本緩衝液(洗浄液1LにBSA 10gを添加し、攪拌溶解した後、ポアサイズ0.2μmのろ過フィルターでろ過して調製した。)
上記鶏冠由来HA(試料Aとした)をアルカリ条件下(pH10.5)あるいはヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼで処理して低分子化し、エタノール沈殿処理により精製し下記試料B〜Jを調製した。記載した各分子量は、後述する実施例1のGPC法により測定した値である。これらの試料を実施例2以降の試験に被験試料として使用した。
試料A: 2289 kDa(以下「HA−2289」とも記載する)
試料B: 964 kDa(以下「HA−964」とも記載する)
試料C: 821 kDa(以下「HA−821」とも記載する)
試料D: 606 kDa(以下「HA−606」とも記載する)
試料E: 323 kDa(以下「HA−323」とも記載する)
試料F: 248 kDa(以下「HA−248」とも記載する)
試料G: 182 kDa(以下「HA−182」とも記載する)
試料H: 112 kDa(以下「HA−112」とも記載する)
試料I: 61 kDa(以下「HA−61」とも記載する)
試料J: 22 kDa(以下「HA−22」とも記載する)
GPC用HA標準品として鶏冠由来HAを前述の方法によって低分子化し、エタノール沈殿によって精製し、9種の標準品(HA−MWSTD−1〜9)を得た。これらの分子量を公知の方法である光散乱法によって決定した。
上記9種のGPC用標準品、及び10種の被検試料のそれぞれを、0.2M NaClを用いて約100μg/mLの濃度に調製し、下記条件で分析した。標準品の分子量をX軸に、溶出ピーク位置の溶出時間をY軸に、それぞれプロットして標準曲線を作成し、これを用いて被検試料の溶出ピーク位置からそれらのピーク分子量を算出した。
カラムオーブン:CO-8025(東ソー社製)
ポンプ:PU-920(日本分光社製)
紫外部吸収検出器:UV-1575(日本分光社製)
カラム:TSK-GEL G-6000PWXL(東ソー社製)
・測定条件
溶媒:0.2M NaCl
温度:40℃
流速:0.5mL/min.
検出条件:波長215nmでの紫外吸収
本実施例における測定所要時間は、試験1では47時間、試験2では37時間であった。このように、既存の方法のひとつであるGPC法では1サイクルで1試料しか分析できないため、長時間が必要となる。また、40μg以上(100μg/mL溶液が400μL)のHA量が必要である。
実施例1においてGPC法で分子量を測定した試料A〜Jについて、以下に記載したHPLC法によってHA濃度を定量測定した。
・標準品
HA不飽和2糖標準品(生化学工業社製)を精製水に溶解し、波長232nmでの紫外部吸収を校正された分光光度計(U-530DS;日本分光社製)により測定し、同物質の分子吸光係数5.7に基づき濃度を決定し、校正された電子天秤(AT-250;メトラー社製)を用いて正確に希釈して濃度2μg/mLのHPLC定量用標準液を作成した。
・測定装置
ポンプ:PU-2080(日本分光社製)
グラジエントユニット:(日本分光社製)
オートサンプラー:AS-2050(日本分光社製)
加熱反応槽:DB-5(島村計器社製)
蛍光検出器:FP-2059(日本分光社製)
カラム:YMC-GEL PA120-S05(ワイエムシー社製)
・測定条件
溶媒:0 〜 200mM Na2SO4グラジエント
温度:室温
流速:0.5 mL/min.
標識温度:145℃
検出条件:励起波長346nm、吸収波長410nm
被検試料を採取し、ヒアルロニダーゼSD(生化学工業社製)を終濃度 100mUとなるように加え、酢酸Na緩衝液を終濃度25mUとなるように加え、37℃で2時間反応させ、HA不飽和2糖に完全に分解した。得られた被検試料の消化液及びHA不飽和2糖標準液をHPLCを用いて上記条件で分析した。標準液のピーク面積値と被検試料消化液の面積値との比を元に、被検試料である各種分子量のHA濃度を算出した。
結果を表2に示す。
実施例1でGPC法により分子量を測定し、実施例2でHPLC法によりHA濃度を測定した試料B(HA-964)、E(HA-323)、H(HA-112)及びJ(HA-22)を、濃度0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 ng/mLに調製し、下記の手順による競合ELISA法によりHA定量試験を行った。
HA−BSAを濃度100μg/mLでPBSに溶解し、これを96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ加え、4℃で一晩静置して固相化した。その後、各ウェルをPBS 300μLで3回洗浄し、1%BSAのPBS溶液を200μLずつ加え、室温で2時間静置してブロッキングした後、各ウェルを洗浄液300μLで3回洗浄した。この各ウェルに、前述のELISA基本緩衝液で調製した各試料HAの希釈系列あるいはHA不含液を50μLずつ加え、次いで、ELISA基本緩衝液で調製したビオチン−HABP溶液を50μLずつ加え、37℃で1時間反応させた後、各ウェルを洗浄液300μLで3回洗浄した。この各ウェルに、ELISA基本緩衝液で希釈したHRP−アビジン溶液を100μLずつ加え、37℃で1時間反応させた後、各ウェルを洗浄液300μLで5回洗浄した。この各ウェルに、OPD用緩衝液で濃度0.25mg/mLに調製したOPD溶液を100μLずつ加え、遮光して室温にて30分間反応させた後、1M HCl溶液を100μL加え、ELISAプレート吸光度計(SK-603、生化学工業社製)を用いて吸収波長492nm、対照波長630nmにて吸光度を測定した。測定結果を表3に、結果をプロットしたグラフを図1に示す。
実施例3と同様の方法でHA定量試験を行った。但し、ビオチン−HABPの溶解液を0.4Mおよび1.2Mグアニジン塩酸を含むELISA基本緩衝液とした。測定結果を表4および表5に、結果をプロットしたグラフを図2および図3に、それぞれ示す。
下記のような手順によりHAに結合する標識されたHABPの測定を行った。
本実施例では、固相に固定するHABPの量、反応時の緩衝条件、添加剤の条件を検討するため、固相に固定するHABPの量を変化させ、またHA標準液及びビオチン−HABPを溶解する緩衝液に関して、下記5通りのELISA緩衝液を用いた。
1) ELISA基本緩衝液
2) ELISA基本緩衝液に1M NaClを添加
3) ELISA基本緩衝液に3M NaClを添加
4) ELISA基本緩衝液に0.4M グアニジン塩酸を添加
5) ELISA基本緩衝液に1.2M グアニジン塩酸を添加
ビオチン−HABPの反応性に対する添加剤条件について試験するため、試料B(HA−964)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。結果を表8及び9に示す。
・HABP固相化濃度:300及び3000 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200及び800 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度:0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2及び1.4 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500 ng/mL
・発色液:0.25 mg/mL OPD
発色物質による発色強度の調整について試験するため、試料B(HA−964)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。結果を図4に示す。
・HABP固相化濃度:300 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200及び800 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2及び1.4 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500ng/mL
・発色液:0.25mg/mL OPD、0.5mg/mL
OPD及びTMB(+)(試薬量として100μl)
ビオチン−HABPの反応性に対する添加剤条件について試験するため、試料B(HA−964)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表10に、結果を図5に示す。
・HABP固相化濃度:300及び3000 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0、0.4、0.8、及び 1.2 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500ng/mL
・発色液:0.25mg/mL OPD、0.5mg/mL
OPD及びTMB(+)(試薬量として100μl)
ビオチン−HABPの反応性に対する添加剤条件について試験するため、試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表11に、結果を図6に示す。
・HABP固相化濃度:300 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へ加えた添加剤の種類及び濃度
1) 尿素: 2.67M、5.33M及び8.0M
2) CS−C: 0.2mg/mL、1.0mg/mL及び10mg/mL
3) SDS: 0.025%、0.05%及び0.1%
・HRP−アビジンの使用濃度:500ng/mL
・発色液:0.25mg/mL OPD、0.5mg/mL OPD及びTMB(+)(試薬量として100μl)
ビオチン−HABPの使用濃度の適当な範囲について試験するため、試料B(HA-964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表12に、結果を図7に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表13にそれぞれ示す。
・HABP固相化濃度:300 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200、400、800、1600及び3200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0.4、0.8及び1.2 M
・HRP−アビジンの使用濃度:100及び500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度:
1) ABTS:0.4 mg/mL
2) OPD:0.2、0.25、及び 0.5 mg/mL
3) TMB−BLUE(試薬量として100μl)
HA標準溶液においてグアニジン塩酸を使用した場合の影響について試験するため、試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表14に、結果を図8に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表15にそれぞれ示す。
・HABP固相化濃度:30、300、3000 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0、0.8、1.2、1.6及び2.4 M
・ビオチン−HABPの使用濃度:200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加: なし
・HRP−アビジンの使用濃度:100及び500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度:
1) OPD:0.25、0.32及び0.5 mg/mL
2) TMB(+)(試薬量として100μl)
HABP固相化時の緩衝液条件について試験するため、試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表16に、結果を図9に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表17にそれぞれ示す。
・HABP固相化濃度:300 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS、3M NaCl−PBS及び3.6M NaCl−PBS
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0.4、0.8及び1.2 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500ng/mL
・ 発色液の濃度と使用濃度:
1)OPD:0.25mg/mL
2)OPD:0.5mg/mL及びTMB(+)(試薬量として100μl)
HABP固相化時のHABP濃度について試験するため、試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表18に、結果を図10に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表19にそれぞれ示す。
・HABP固相化濃度:10、30、100、300、1000、3000、10000、30000 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0.4及び1.2 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度:
1) OPD:0.25及び0.5 mg/mL
2) TMB(+)及びTMB BLUE(試薬量として100μl)
HABP固相化時のHABP濃度について試験するため、試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例13と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表20に、結果を図11に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表21にそれぞれ示す。
・HABP固相化濃度:30、60、120、240 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0.4及び0.8 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度:
1)OPD:0.25及び0.5 mg/mL
上記実施例で検討した各種の条件の組合せにより分子量依存性の程度を調整できるかを試験するため、試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用し、下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表22に、結果を図12に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表23にそれぞれ示す。
・HABP固相化濃度:100 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HA標準品溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0、0.8及び1.6 M
・ビオチン−HABPの使用濃度:200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加: 0、0.4及び0.8 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度:
1)OPD:0.25、0.32及び0.5 mg/mL
以下に被検試料の分子量の測定の具体例を示す。
被検試料としては、実施例1において分子量を測定した3種のHA、試料D(HA−606)、G(HA−182)、I(HA−61)を、ダルベッコ改変イーグル培地に添加した試料を用いた。工程(1)の標準試料としては試料J(HA−22)そのものを使用した。工程(2)の標準試料としては試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用した。
これらの試料をそれぞれ適宜希釈し、まず実施例3に記載した方法に従って工程(1)を実施した。吸光度測定の結果を、標準試料については下記表24に、それらを濃度値とともに対数に換算した値を表25に、被検試料については表26に示す。
この結果に基づき、各被検試料を400ng/mLの濃度に希釈し、実施例15の条件Eを適用して、工程(2)を実施した。得られた吸光度の結果を下記表28に示す。また各濃度の標準試料について同様に操作を行った。得られた吸光度の結果を下記表27に示す。これらの値から得られた各標準試料についての反応曲線を図14Aに示す。またこれらの結果のうち400ng/mLの濃度で得られた結果から得られた標準曲線を図14Bに示す。
400ng/mLの濃度の各試料の吸光度値と図14Bの標準曲線から、各被検試料のHAの分子量を求めた(工程(3))。結果を表28に示す。
以下に被検試料の分子量の測定の別の具体例を示す。
被検試料としては、実施例1において分子量を測定した3種のHA、試料D(HA−606)、F(HA−248)、I(HA−61)を、ダルベッコ改変イーグル培地に添加した試料を用いた。工程(1)の標準試料としては試料J(HA−22)そのものを使用した。工程(2)の標準試料としては試料B(HA−964)、E(HA−323)、H(HA−112)及びJ(HA−22)を使用した。
工程(1)について、標準試料の吸光度測定の結果を下記表29に、それらの対数に換算した値を濃度を対数に換算した値とともに表30に、被検試料の吸光度測定の結果を表31に示す。
また、工程(2)で得られた標準試料の吸光度の結果を下記表32に、これら値から得られた各標準試料についてのHA濃度に対する吸光度を示す反応曲線を図16Aに、被検試料の吸光度の結果を表34に示す。
本実施例のように、工程(1)および(2)を、工程(1)の結果に基づいて工程(2)の反応条件等を選択する等の操作を行うことなく独立して実施した場合でも、被験試料について各工程で得られた吸光度値が各々の測定範囲内であれば、被験試料のHA分子量を求めることができる。
アクチナーゼAFを、濃度2%あるいは6% となるように0.135M NaCl−10mM Tris.HCl(pH8.0) に溶解し、被験試料液とした。この溶液の一部を分取し、10分間煮沸して失活させ、対照液Aとした。また、アクチナーゼを含まない緩衝液を対照液Bとした。
各液を氷冷後、予め氷冷しておいた40%、12%、あるいは4%TCA溶液を1/4容量添加して混合して氷上に15分間保持した後、各液を2等分し、一方はそのまま氷上に維持し、もう一方は小型冷却遠心機を用いて4℃で5分間、10000r.p.m.で遠心分離し、上清を採取した。
各液に対して予め氷冷しておいた 2M Tris溶液を添加し、pH8.0に調整した。尚、pH8.0 に調整する為に要する2M Trisの容量は、事前検討により決定した。
中和後の各液を 20μL採取し、試験開始時のアクチナーゼ濃度2%の試料については精製水 180μL を、アクチナーゼ濃度 6%の試料については精製水580μL を、それぞれ添加して希釈して氷上に保持し、残存プロテアーゼ活性測定の被験試料とした。
プロテアーゼ活性測定の標準品として、アクチナーゼAF粉末を精製水に溶解して6%溶液を調整し、これを用いて12.5−500μg/mLの希釈系列を作成し、標準液とした。
上記の被験試料および標準液を50μLずつ採取し、1.25%カゼインナトリウム(和光純薬)溶液を250μL添加し、55℃で30分間反応させた後、110mM TCA250μLを添加してタンパク質を沈殿させ、10000×gで10分間遠心分離して上清60μLを採取した。この溶液に500mM 炭酸Na溶液を 150μL添加し、更に4倍希釈したフェノール試薬(和光純薬)を30μL添加し、攪拌混合後、37℃で30分間反応させた後、波長630nmの吸光度を測定した。
標準液の濃度と吸光度から検量線を作成し、これを用いて被験試料中の残存プロテアーゼ活性を、標準アクチナーゼAFの濃度当量として算出して評価した。
その結果を表36に示した。アクチナーゼ濃度 2%溶液、6%溶液ともに、TCA処理を終濃度8%および2.4%で実施し、沈殿を遠心分離除去後に上清を中和する方法を実施した場合、残存プロテアーゼ活性をほぼ完全に失活できることが確認できた。
試料用緩衝液として0.135M NaCl−10mM Tris.HCl(pH8.0) を調製し、これに、3種の分子量のHA(実施例1、表1のHA−MWSTD−1、2、および3)を終濃度5μg/mLとなるように添加し、これを被験試料とした。
各被験試料を6mLずつ3本に分注し氷冷後、予め氷冷しておいた3種濃度のTCA溶液(A:40%、B:12%、C:4%)を1.5mL添加して混合して氷上に15分間保持した後、冷却遠心機を用いて4℃で5分間、3000r.p.m.で遠心分離し、上清9.6mLを採取した。
上記各液に対して、氷冷した 2M Tris溶液を、Aについては2.50mL、Bについては0.75mL、Cについては0.27mL添加してpH8.0に調整した。続いて氷冷した精製水を、Aについては非添加、Bについては1.75mL、Cについては2.24mL添加して、最終容量を揃えた。これらの液を9.6mL採取し、PD-10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて脱塩後、遠心エバポレーターで加温せずに濃縮乾固し、0.2M NaCl 380μL を加えて再溶解した。
この溶液について、実施例1と同様の方法でGPC分析を実施してHA分子量を測定し、上記の前処理実施後のHA分子量と未処理のHAの分子量とを比較して、前処理工程でのHA分子量保持率を評価した。
その結果を表37に示した。TCAを終濃度8%で処理した場合、HA−MWSTD−1(分子量:2310kDa)、HA−MWSTD−2(分子量:1410kDa)、HA−MWSTD−03(分子量:993kDa)の各試料について、ピーク分子量で評価した保持率はそれぞれ100%、96%、103%であった。TCAを終濃度2.4%で処理した場合、HA分子量 HA−MWSTD−1、同−2、同−3の各試料について、ピーク分子量で評価した保持率はそれぞれ101%、99%、102%であった。TCAを終濃度0.8%で処理した場合、HA−MWSTD−1、同−2、同−3の各試料について、ピーク分子量で評価した保持率はそれぞれ97%、95%、104%であった。
試料用緩衝液として0.135M NaCl−10mM Tris.HCl(pH8.0) を調製し、これにアクチナーゼAFを溶解して、濃度6%溶液(A)および2%溶液(B)を調製した。また、アクチナーゼを含まない試料用緩衝液(C)を用意した。上記各液に、3種の分子量のHA(実施例1、表1のHA−MWSTD−1、2、および3)を終濃度5μg/mLとなるように添加し、これを被験試料とした。
各被験試料を37℃湯浴中で24時間処理した後、6mLを採取して氷冷後、予め氷冷しておいた40%TCA溶液を1.5mL添加して混合し、氷上に15分間保持した後、冷却遠心機を用いて4℃で5分間、3000r.p.m.で遠心分離し、上清9.6mLを採取した。
上記各液に対して、氷冷した 2M Tris溶液を2.65mL添加してpH8.0に調整した。調製後の各液を PD-10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて脱塩後、遠心エバポレーターで加温せずに濃縮乾固し、0.2M NaCl 380μL を加えて再溶解した。
この溶液について、実施例1と同様の方法でGPC分析を実施してHA分子量を測定し、上記の前処理実施後のHA分子量と未処理のHAの分子量とを比較して、前処理工程でのHA分子量保持率を評価した。
その結果を表38に示した。アクチナーゼ濃度2%で37℃・24時間処理した場合の保持率は、ピーク分子量で評価した場合、HA−MWSTD−1(分子量:2310kDa)、HA−MWSTD−2(分子量:1410kDa)、HA−MWSTD−3(分子量:993kDa)の各試料について、それぞれ89%、91%、96%であった。アクチナーゼ濃度6%で42℃・24時間処理した場合の保持率は、ピーク分子量で評価した場合HA−MWSTD−1、同−2、同−3の各試料について、それぞれ74%、80%、89%であった。
3種濃度のTCA溶液、2M Tris溶液、ELISA用補正液、D.W. を、表39の比率で混合し、模擬前処理液A、B、Cを調製した。この処理液を用いて、4種の分子量のHA(実施例1、表1の試料-B、E、H、J)について、濃度800、400、200、100、50、25、12.5ng/mLの希釈列を作成した。これを、実施例3と同様の方法で測定工程(1)を実施した。
測定結果を表40に、結果をプロットしたグラフを図18に、それぞれに示した。模擬処理液A、B、Cいずれを用いた場合も、HAの分子量によらず同一の反応性を示すことが確認された。このことから、被験試料溶液に前処理工程で添加したプロテアーゼ失活用試薬および中和試薬が含まれたままの状態でも、標準品の溶媒を被験試料の溶媒と同一組成に合わせて使用すれば、測定工程(1)が実施可能であることが確認された。
実施例21で調製した模擬前処理液A、B、Cを用いて、4種の分子量のHA(実施例1、表1の試料-B、E、H、J)について、濃度1000、300、100、30ng/mLの希釈列を作成した。これを下記の条件で、その他は実施例5と同様に反応及び測定を行った。
・HABP固相化濃度:30、100 ng/mL
・HABP固相化時の緩衝液:PBS
・HABP固相化プレート:3種ブロッキング試薬を用いて乾燥プレートを作成して使用。
・HA標準品を溶解した緩衝液:ELISA基本緩衝液
・ビオチン−HABPの使用濃度:200 ng/mL
・ビオチン−HABP溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度: 0.4及び0.8 M
・HRP−アビジンの使用濃度:500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度:OPD:0.5 mg/mL
HABP固相化濃度30ng/mLでの反応条件を表41に、結果を図19に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表42にそれぞれ示す。また、HABP固相化濃度100ng/mLでの反応条件を表43に、結果を図20に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表44にそれぞれ示す。
模擬処理液A、B、Cいずれを用いた場合も、HAの分子量に比例した反応強度を示すことが確認された。このことから、被験試料溶液に前処理工程で添加したプロテアーゼ失活用試薬および中和試薬が含まれたままの状態でも、標準品の溶媒を被験試料の溶媒と同一組成に合わせて使用すれば、測定工程(2)が実施可能であることが確認された。
10mM Tris.HCl(pH8.0) にアクチナーゼAFを溶解して、2%溶液を調製し、これをブタ軟骨種組織試料400mgに4mL添加し、これを被験試料1とした。
同様に10mM Tris.HCl(pH8.0) にアクチナーゼAFを溶解して、10%溶液を調製し、これをヒト滑膜細胞株培養上清4mLに1mL添加し、これを被験試料2とした。
各被験試料を37℃湯浴中で24時間処理した後、3mLを採取して氷冷後、予め氷冷しておいた40%TCA溶液を0.75mL添加して混合し、氷上に15分間保持した後、冷却遠心機を用いて4℃で5分間、3000r.p.m.で遠心分離し、上清4.8mLを採取した。
上記各液に対して、氷冷した 2M Tris溶液を1.33mL添加してpH8.0に調整した。調製後の各液を PD-10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて脱塩後、遠心エバポレーターで加温せずに濃縮乾固し、0.2M NaCl を加えて再溶解した。
この溶液について、実施例2と同様の方法でHPLC分析を実施してHA濃度を測定した。
その結果を表45に示した。
実施例23で得た、脱塩濃縮後の再溶解液について、実施例1と同様の方法でGPC分析を実施してHA分子量を測定した。
その結果を表45に示した。
実施例23で得た、各検体の2M Tris中和液を 30μL採取し、これに実施例21に示したELISA用補正液を48.3μL添加し、被験試料溶液を作成した。HA濃度標準品は実施例21と同様の方法で調製した。
上記の標準液および被験試料溶液を、実施例16と同様の方法で測定し、HA濃度を測定した。
その結果を表45に示した。本方法での測定値と、実施例23で得られたHPLC法での値との間で、良好な一致が得られた。
実施例25で作成した各被験試料溶液について、実施例25での結果を元に、実施例21で作成した模擬前処理液Aを用いて希釈し、HA濃度を100ng/mLにあわせ、これを被験試料とした。HA分子量標準品は実施例21と同様の方法で調製した。
上記の標準液および被験試料を、実施例16と同様の方法で測定し、HA分子量を算出した。
その結果を表45に示した。本方法での測定値と、実施例24で得られたGPC法での値との間で、良好な一致が得られた。
Claims (16)
- ヒアルロン酸を含む試料中のヒアルロン酸をヒアルロン酸結合性タンパク質と反応させ、試料中のヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を測定する工程を少なくとも含む、ヒアルロン酸の分子量の測定方法。
- 下記の工程(1)〜(3)を少なくとも含む、請求項1に記載の測定方法。
(1) 試料中のヒアルロン酸濃度を測定する工程、
(2) 試料中のヒアルロン酸をヒアルロン酸結合性タンパク質と反応させ、試料中のヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を測定する工程、及び、
(3) 濃度及び分子量既知の標準ヒアルロン酸試料から得られたヒアルロン酸の分子量とヒアルロン酸に結合するヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値との関係と、上記工程(1)で得られた試料中のヒアルロン酸濃度と、上記工程(2)で得られた試料中のヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値から試料中のヒアルロン酸の分子量を求める工程。 - 上記工程(2)が下記工程(i)〜(iv)により構成される、請求項2に記載の測定方法。
(i) ヒアルロン酸結合性タンパク質を固相に固定する工程、
(ii) 固相に固定したヒアルロン酸結合性タンパク質に試料中のヒアルロン酸を反応させる工程、
(iii) 固相に固定したヒアルロン酸結合性タンパク質に結合したヒアルロン酸に、標識したヒアルロン酸結合性タンパク質をさらに反応させる工程、及び
(iv) 工程(iii)においてヒアルロン酸に結合した標識ヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を測定する工程。 - 工程(iii)において使用する標識したヒアルロン酸結合性タンパク質の標識物質が、ビオチン、アビジン、酵素、アイソトープ、蛍光色素、及び化学発光物質からなる群から選択される、請求項3に記載の測定方法。
- 工程(iii)において使用する標識したヒアルロン酸結合性タンパク質の標識物質が、ビオチン又はアビジンである、請求項3又は4に記載の測定方法。
- 工程(3)において使用する、濃度及び分子量既知の標準ヒアルロン酸試料から得られたヒアルロン酸の分子量とヒアルロン酸に結合するヒアルロン酸結合性タンパク質又はその量を反映する値の量との関係が、濃度及び分子量既知のヒアルロン酸標準液を試料として工程(2)を行うことにより得られた標準曲線で表されることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか1項に記載の測定方法。
- 工程(3)において、工程(1)で得られた試料中のヒアルロン酸濃度は、試料を希釈するための指標として、又は、当該濃度における、標準ヒアルロン酸試料のヒアルロン酸に結合するヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値の算出に用いられることを特徴とする、請求項2〜6のいずれか1項に記載の測定方法。
- ヒアルロン酸にヒアルロン酸結合性タンパク質を反応させる際に、タンパク質変性剤、酸性多糖、及び界面活性剤から選択される添加剤を共存させ、その添加剤の量を調節することによりヒアルロン酸結合性タンパク質とヒアルロン酸とが結合する量を調整することを特徴とする、請求項3〜7のいずれか1項に記載の測定方法。
- 工程(iv)において測定するヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を、工程(i)における固定するヒアルロン酸結合性タンパク質の量、あるいは工程(iii)における反応させるヒアルロン酸結合性タンパク質の量を変化させることにより調整することを特徴とする、請求項3〜8のいずれか1項に記載の測定方法。
- 添加剤が、グアニジン塩酸である、請求項8に記載の測定方法。
- 固相化するヒアルロン酸結合性タンパク質の量が、固相化に使用するヒアルロン酸結合性タンパク質溶液の濃度として、3〜30000 ng/mLである、請求項3〜10のいずれか1項に記載の測定方法。
- 工程(iii)において反応させる標識ヒアルロン酸結合性タンパク質がビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質であり、ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質溶液の濃度が10〜30000 ng/mLである、請求項3〜11のいずれか1項に記載の測定方法。
- ヒアルロン酸標準液及び/又は試料中のグアニジン塩酸の濃度が終濃度で0〜3.6 Mである、請求項10に記載の測定方法。
- ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質溶液中のグアニジン塩酸の濃度が終濃度で0〜1.6 Mである、請求項10に記載の測定方法。
- ヒアルロン酸結合性タンパク質を少なくとも含む、ヒアルロン酸の分子量の測定用のキット。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の測定方法を用いることを特徴とする、請求項15に記載のキット。
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