JPH0641952B2 - 高分子ヒアルロン酸の測定方法および測定キット - Google Patents
高分子ヒアルロン酸の測定方法および測定キットInfo
- Publication number
- JPH0641952B2 JPH0641952B2 JP63049227A JP4922788A JPH0641952B2 JP H0641952 B2 JPH0641952 B2 JP H0641952B2 JP 63049227 A JP63049227 A JP 63049227A JP 4922788 A JP4922788 A JP 4922788A JP H0641952 B2 JPH0641952 B2 JP H0641952B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- binding protein
- solid phase
- labeling substance
- sample
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は関節膣の滑液等に含まれるヒアルロン酸の測定
方法および測定キットに関するものである。特に、高分
子状のヒアルロン酸を対象とする高感度なヒアルロン酸
の測定方法に関するものである。
方法および測定キットに関するものである。特に、高分
子状のヒアルロン酸を対象とする高感度なヒアルロン酸
の測定方法に関するものである。
従来の技術 ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロ
ン酸が交互にβ−1,4結合により重合した酸性ムコ多糖
類であり、皮下組織を接合させる作用を有し、臍帯、関
節膣の滑液および眼の硝子体等に含まれている。
ン酸が交互にβ−1,4結合により重合した酸性ムコ多糖
類であり、皮下組織を接合させる作用を有し、臍帯、関
節膣の滑液および眼の硝子体等に含まれている。
ところで、リウマチ等の炎症あるいは癌等の疾患によ
り、血液中のヒアルロン酸の濃度が上昇することが知ら
れている。このため血液中のヒアルロン酸を定量するこ
とは炎症の進行や手術後の回復の診断あるいは癌の診断
等において有用であるとされている。
り、血液中のヒアルロン酸の濃度が上昇することが知ら
れている。このため血液中のヒアルロン酸を定量するこ
とは炎症の進行や手術後の回復の診断あるいは癌の診断
等において有用であるとされている。
従来、このようなヒアルロン酸の測定方法として、放射
性ヨウ素を付加したヒアルロン酸結合性蛋白を用いる放
射線分析法、あるいはヒアルロネクチンを利用した酵素
分析法が知られている。
性ヨウ素を付加したヒアルロン酸結合性蛋白を用いる放
射線分析法、あるいはヒアルロネクチンを利用した酵素
分析法が知られている。
放射線分析法の場合には、まず、ヒアルロン酸を結合し
たセファロースと測定対象物であるヒアルロン酸を含む
試料とを混合し、次いで放射性ヨウ素で標識したヒアル
ロン酸結合性蛋白を加えて放置する。この場合、固相で
あるセファロースに結合したヒアルロン酸と放射性ヨウ
素により標識されたヒアルロン酸結合性蛋白との結合は
試料中のヒアルロン酸の濃度に依存して阻害されるの
で、阻害された結合中の標識されたヒアルロン酸結合性
蛋白を測定することで、試料中のヒアルロン酸の濃度を
間接的に測定することができる。
たセファロースと測定対象物であるヒアルロン酸を含む
試料とを混合し、次いで放射性ヨウ素で標識したヒアル
ロン酸結合性蛋白を加えて放置する。この場合、固相で
あるセファロースに結合したヒアルロン酸と放射性ヨウ
素により標識されたヒアルロン酸結合性蛋白との結合は
試料中のヒアルロン酸の濃度に依存して阻害されるの
で、阻害された結合中の標識されたヒアルロン酸結合性
蛋白を測定することで、試料中のヒアルロン酸の濃度を
間接的に測定することができる。
発明が解決しようとする課題 しかし、上記の放射線分析法および酵素分析法は、いず
れも競合反応を利用した方法であり、ヒアルロン酸の測
定感度がせいぜい40ngとあまり高くないという欠点があ
った。
れも競合反応を利用した方法であり、ヒアルロン酸の測
定感度がせいぜい40ngとあまり高くないという欠点があ
った。
また、上記方法では、結合性蛋白やヒアルロネクチンと
の結合部位を１箇所でも有している低分子のヒアルロン
酸も上記競合反応に関与する可能性がある。そのため、
整理的に意味のない低分子のヒアルロン酸も測定されて
しまという欠点があった。特に、リウマチ等の炎症の診
断において比較的高分子量のヒアルロン酸が観測の対象
となるため上記欠点は深刻である。
の結合部位を１箇所でも有している低分子のヒアルロン
酸も上記競合反応に関与する可能性がある。そのため、
整理的に意味のない低分子のヒアルロン酸も測定されて
しまという欠点があった。特に、リウマチ等の炎症の診
断において比較的高分子量のヒアルロン酸が観測の対象
となるため上記欠点は深刻である。
このため、上記のような低分子のヒアルロン酸を被測定
物に含めず、しかも従来よりも高感度なヒアルロン酸の
測定方法が要望されている。
物に含めず、しかも従来よりも高感度なヒアルロン酸の
測定方法が要望されている。
そこで本発明は、競合反応を用いず、しかも測定対象外
の低分子のヒアルロン酸を除いて高分子のヒアルロン酸
を選択的に測定でき且つ高感度なヒアルロン酸の測定方
法を提供することにある。
の低分子のヒアルロン酸を除いて高分子のヒアルロン酸
を選択的に測定でき且つ高感度なヒアルロン酸の測定方
法を提供することにある。
本発明はさらに、上記測定方法に使用されるヒアルロン
酸の測定用キットを提供する。
酸の測定用キットを提供する。
課題を解決するための手段 本発明者は上記問題点を解決するために鋭意検討・研究
した結果、生理的に意味のある高分子量のヒアルロン酸
にはヒアルロン酸結合性蛋白との結合サイトが２以上存
在することに着目し、２以上のヒアルロン酸結合性蛋白
が立体障害なく結合し得るような高分子量のヒアルロン
酸（本明細書においては、このようなヒアルロン酸を
「高分子ヒアルロン酸」と称する）に２以上のヒアルロ
ン酸結合性蛋白を結合したサンドイッチ状結合体を形成
せしめ、該結合体の濃度を測定することにより検体中の
高分子ヒアルロン酸の濃度を高感度に定量する方法を開
発することに成功した。
した結果、生理的に意味のある高分子量のヒアルロン酸
にはヒアルロン酸結合性蛋白との結合サイトが２以上存
在することに着目し、２以上のヒアルロン酸結合性蛋白
が立体障害なく結合し得るような高分子量のヒアルロン
酸（本明細書においては、このようなヒアルロン酸を
「高分子ヒアルロン酸」と称する）に２以上のヒアルロ
ン酸結合性蛋白を結合したサンドイッチ状結合体を形成
せしめ、該結合体の濃度を測定することにより検体中の
高分子ヒアルロン酸の濃度を高感度に定量する方法を開
発することに成功した。
すなわち、本発明は、固相に固着されたヒアルロン酸結
合性蛋白に検体ヒアルロン酸を含む試料を添加して該固
着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸
を結合せしめ、さらにヒアルロン酸結合性蛋白と標識物
質とをそれぞれ添加するか、あるいは予め標識物質で標
識されたヒアルロン酸結合性蛋白を添加して、該固相に
固着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン
酸と該標識されたヒアルロン酸結合性蛋白とのサンドイ
ッチ状結合体を形成せしめ、該サンドイッチ状結合体中
の標識物質により該検体ヒアルロン酸を定量とすること
を特徴とする高分子ヒアルロン酸の測定方法を提供する
ものである。
合性蛋白に検体ヒアルロン酸を含む試料を添加して該固
着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸
を結合せしめ、さらにヒアルロン酸結合性蛋白と標識物
質とをそれぞれ添加するか、あるいは予め標識物質で標
識されたヒアルロン酸結合性蛋白を添加して、該固相に
固着されたヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン
酸と該標識されたヒアルロン酸結合性蛋白とのサンドイ
ッチ状結合体を形成せしめ、該サンドイッチ状結合体中
の標識物質により該検体ヒアルロン酸を定量とすること
を特徴とする高分子ヒアルロン酸の測定方法を提供する
ものである。
本発明の測定方法に従えば、先ず、固相の表面にヒアル
ロン酸結合性蛋白を固着する。この際、該固相上にはさ
らにヒアルロン酸結合性蛋白または他の分子種が固着し
得る表面部分が存在し、測定すべき試料を添加の際に試
料中に含まれる検体ヒアルロン酸である高分子ヒアルロ
ン酸やその他の血中成分などが固着する恐れがある。
ロン酸結合性蛋白を固着する。この際、該固相上にはさ
らにヒアルロン酸結合性蛋白または他の分子種が固着し
得る表面部分が存在し、測定すべき試料を添加の際に試
料中に含まれる検体ヒアルロン酸である高分子ヒアルロ
ン酸やその他の血中成分などが固着する恐れがある。
このため、試料を添加する前にブロック体を添加してヒ
アルロン酸結合性蛋白が固着していない部分を被覆して
おくことが好ましい。
アルロン酸結合性蛋白が固着していない部分を被覆して
おくことが好ましい。
このようなブロック体としては、例えば、牛等から採取
できるγ−グロブリン、血清アルブミン、血清等が挙げ
られ、固相にファルコンプレートを使用した場合には牛
γ−グロブリンが好適である。
できるγ−グロブリン、血清アルブミン、血清等が挙げ
られ、固相にファルコンプレートを使用した場合には牛
γ−グロブリンが好適である。
次いで、上記ヒアルロン酸結合性蛋白が固着した固相
に、検体である高分子ヒアルロン酸を含む試料を添加す
る。この際、試料は高分子ヒアルロン酸が抽出分離され
ている必要はなく、人体などの血液や体液をそのまま使
用できる。或いはブロック体溶液や希釈血清で試料を溶
解してヒアルロン酸結合性蛋白が固着した固相に加えて
もよい。
に、検体である高分子ヒアルロン酸を含む試料を添加す
る。この際、試料は高分子ヒアルロン酸が抽出分離され
ている必要はなく、人体などの血液や体液をそのまま使
用できる。或いはブロック体溶液や希釈血清で試料を溶
解してヒアルロン酸結合性蛋白が固着した固相に加えて
もよい。
このようにして固相に固着したヒアルロン酸結合性蛋白
に高分子ヒアルロン酸を結合した後、固相表面を洗浄す
るのが好ましい。
に高分子ヒアルロン酸を結合した後、固相表面を洗浄す
るのが好ましい。
さらに本発明に従えば、該高分子ヒアルロン酸を結合し
た上記固相に、予め所定の標識物質で標識されたヒアル
ロン酸結合性蛋白を添加する。この標識物質としては、
アイソトープ、蛍光色素、アビジン、ビオチン、化学発
光物質、酵素等が挙げられるが、通常、高分子物質の標
識に使用可能なものであれば特に限定されない。
た上記固相に、予め所定の標識物質で標識されたヒアル
ロン酸結合性蛋白を添加する。この標識物質としては、
アイソトープ、蛍光色素、アビジン、ビオチン、化学発
光物質、酵素等が挙げられるが、通常、高分子物質の標
識に使用可能なものであれば特に限定されない。
また、該高分子ヒアルロン酸を結合した上記固相に、標
識物質と結合しやすい蛋白物質などをヒアルロン酸結合
性蛋白に予め結合させ、この標識物質と結合しやすい蛋
白物質などと結合したヒアルロン酸結合性蛋白を標識物
質とともに添加してもよい。
識物質と結合しやすい蛋白物質などをヒアルロン酸結合
性蛋白に予め結合させ、この標識物質と結合しやすい蛋
白物質などと結合したヒアルロン酸結合性蛋白を標識物
質とともに添加してもよい。
上記のようにヒアルロン酸結合性蛋白をさらに添加する
ことにより、固相に固着れたヒアルロン酸結合性蛋白と
該高分子ヒアルロン酸と該標識された或いは容易に標識
可能なヒアルロン酸結合性蛋白とのサンドイッチ状結合
体を形成することができる。
ことにより、固相に固着れたヒアルロン酸結合性蛋白と
該高分子ヒアルロン酸と該標識された或いは容易に標識
可能なヒアルロン酸結合性蛋白とのサンドイッチ状結合
体を形成することができる。
次に、本発明に従い、該サンドイッチ状の結合体の有す
る標識物質を測定して該高分子ヒアルロン酸を定量す
る。
る標識物質を測定して該高分子ヒアルロン酸を定量す
る。
この際、該サンドイッチ状結合体は測定対象物である高
分子ヒアルロン酸を挟み込んでおり、一方、本発明の測
定対象物以外の低分子のヒアルロン酸は上記のようなサ
ンドイッチ状の結合体を形成しえない。
分子ヒアルロン酸を挟み込んでおり、一方、本発明の測
定対象物以外の低分子のヒアルロン酸は上記のようなサ
ンドイッチ状の結合体を形成しえない。
従って、固相表面上の標識物質の濃度を測定することで
上記サンドイッチ状結合体を形成しうる高分子ヒアルロ
ン酸のみが定量される。
上記サンドイッチ状結合体を形成しうる高分子ヒアルロ
ン酸のみが定量される。
標識物質の濃度の測定方法としては、標識物質により異
なるが、例えば標識物質に化学発光物質を使用する場合
には該物質による反応後の溶液の吸光度を測定すればよ
い。
なるが、例えば標識物質に化学発光物質を使用する場合
には該物質による反応後の溶液の吸光度を測定すればよ
い。
本発明の方法では、予め使用する標識物質および検体ヒ
アルロン酸である高分子ヒアルロン酸について、既知濃
度の試料を用意し、信号強度と該既知濃度の関係につい
て検量線を作成しておき、測定値を較正可能とすること
が好適である。
アルロン酸である高分子ヒアルロン酸について、既知濃
度の試料を用意し、信号強度と該既知濃度の関係につい
て検量線を作成しておき、測定値を較正可能とすること
が好適である。
上述した本発明において使用する固相としては、プレー
ト、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙げられ
るが、特にこれらに限定されるものではなく、ヒアルロ
ン酸結合性蛋白が固着し得る固相ならばいずれも使用可
能である。
ト、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙げられ
るが、特にこれらに限定されるものではなく、ヒアルロ
ン酸結合性蛋白が固着し得る固相ならばいずれも使用可
能である。
また、本発明において使用するヒアルロン酸結合性蛋白
とは、Ａ．Ｅ．ローレント（Laurent）らにより精製さ
れたプロテオグリカン(Analytical Biochemistry 109,3
86-394,(1980)、リンクプロティン、ヒアルロネクチン
等が挙げられる。
とは、Ａ．Ｅ．ローレント（Laurent）らにより精製さ
れたプロテオグリカン(Analytical Biochemistry 109,3
86-394,(1980)、リンクプロティン、ヒアルロネクチン
等が挙げられる。
本発明の他の観点から提供されるヒアルロン酸測定用キ
ットは、基本的に、ヒアルロン酸結合性蛋白が固着され
た固相体と、添加用ヒアルロン酸結合性蛋白と、検体ヒ
アルロン酸定量用標識物質とによって構成され、これら
３つの成分はそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用
時に上記処方に従って使えるキットとして保存しておく
ことができる。
ットは、基本的に、ヒアルロン酸結合性蛋白が固着され
た固相体と、添加用ヒアルロン酸結合性蛋白と、検体ヒ
アルロン酸定量用標識物質とによって構成され、これら
３つの成分はそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用
時に上記処方に従って使えるキットとして保存しておく
ことができる。
上記キットに、ヒアルロン酸結合性蛋白が固着していな
い部分を被覆するブロック体や、通常容易に入手可能な
前記洗浄液等をさらに追加することも可能である。
い部分を被覆するブロック体や、通常容易に入手可能な
前記洗浄液等をさらに追加することも可能である。
また、上記添加用ヒアルロン酸結合性蛋白は予め上記標
識物質で標識したものでもよい。さらに、上記ヒアルロ
ン酸結合性蛋白を固着した固相の表面の該ヒアルロン酸
結合性蛋白が固着していない部分をブロック体により被
覆しておくこともできる。このブロック体としては、γ
−グロブリン、血清アルブミン、血清からなる群より選
択した１種にすることができる。
識物質で標識したものでもよい。さらに、上記ヒアルロ
ン酸結合性蛋白を固着した固相の表面の該ヒアルロン酸
結合性蛋白が固着していない部分をブロック体により被
覆しておくこともできる。このブロック体としては、γ
−グロブリン、血清アルブミン、血清からなる群より選
択した１種にすることができる。
上記固相体としては、プレート、チューブ、ビーズ、メ
ンブレン、ゲルからなる群より選択することができ、上
記標識物質は、アイソトープ、蛍光色素、アビジン、ビ
オチン、化学発光物質、酵素から選択することができ
る。
ンブレン、ゲルからなる群より選択することができ、上
記標識物質は、アイソトープ、蛍光色素、アビジン、ビ
オチン、化学発光物質、酵素から選択することができ
る。
作用 本発明の測定対象物はリウマチ等の炎症の診断あるいは
癌等の診断において重要な因子とされている比較的高分
子のヒアルロン酸であるため、非対象物である低分子の
ヒアルロン酸までが測定されるのを防止する必要があ
る。
癌等の診断において重要な因子とされている比較的高分
子のヒアルロン酸であるため、非対象物である低分子の
ヒアルロン酸までが測定されるのを防止する必要があ
る。
本発明においては、高分子ヒアルロン酸を２以上のヒア
ルロン酸結合性蛋白が結合したサンドイッチ状結合体と
して定量するため、上記のような低分子ヒアルロン酸、
すなわちヒアルロン酸結合性蛋白との結合サイトが一つ
しかないものは上記サンドイッチ状結合体を形成せず全
く測定されないという特徴がある。
ルロン酸結合性蛋白が結合したサンドイッチ状結合体と
して定量するため、上記のような低分子ヒアルロン酸、
すなわちヒアルロン酸結合性蛋白との結合サイトが一つ
しかないものは上記サンドイッチ状結合体を形成せず全
く測定されないという特徴がある。
また、ヒアルロン酸の測定方法は、従来、競合反応を用
いていたが、本発明では競合反応を用いない点に特徴が
ある。このため、予め精製した試薬としてのヒアルロン
酸を必要とせず、しかも操作が簡単であるという特徴を
有する。
いていたが、本発明では競合反応を用いない点に特徴が
ある。このため、予め精製した試薬としてのヒアルロン
酸を必要とせず、しかも操作が簡単であるという特徴を
有する。
さらに、本発明のヒアルロン酸の測定方法は高感度であ
るため10ngという極めて微量の高分子のヒアルロン酸の
検出および定量にも好適である。
るため10ngという極めて微量の高分子のヒアルロン酸の
検出および定量にも好適である。
実施例 以下、本発明を実施例により詳細に説明するが本発明は
これらに何ら限定されるものではない。
これらに何ら限定されるものではない。
最初に本発明に用いるヒアルロン酸結合性蛋白の精製方
法について述べ、次いで既知量の高分子ヒアルロン酸を
含む試料を用いて本発明の方法を実施して検量線を作製
した具体例について述べる。
法について述べ、次いで既知量の高分子ヒアルロン酸を
含む試料を用いて本発明の方法を実施して検量線を作製
した具体例について述べる。
以下において、使用する単位表示としてＭは（mol／
）を示し、％は（ｇ／100ｍ）を示すものである。
）を示し、％は（ｇ／100ｍ）を示すものである。
ヒアルロン酸結合性蛋白の精製 本発明に用いるヒアルロン酸結合性蛋白を抽出、精製す
るために、Ａ．Ｅ．ローレント（Laurent）ら(Analytic
al Biochemistry109,386-394(1980)の精製方法に従っ
て、以下のような操作を行った。
るために、Ａ．Ｅ．ローレント（Laurent）ら(Analytic
al Biochemistry109,386-394(1980)の精製方法に従っ
て、以下のような操作を行った。
まず、牛の鼻中隔軟骨（東京芝浦臓器より入手）300ｇ
をハサミで小片に切断し、予め４℃に保持された塩酸グ
アニジン４Ｍを含むナトリウムアセテート0.5Ｍ溶液（p
H5.8）（以下、緩衝液Ａと称する）に投入して４℃に保
持したまま一夜、攪拌抽出した。
をハサミで小片に切断し、予め４℃に保持された塩酸グ
アニジン４Ｍを含むナトリウムアセテート0.5Ｍ溶液（p
H5.8）（以下、緩衝液Ａと称する）に投入して４℃に保
持したまま一夜、攪拌抽出した。
次いで、13000Ｇにて20分間遠心分離した後、上清液を
分離採取した。
分離採取した。
該上清液を精製水に透析させた後、凍結、乾燥させた。
このようにして得られた固形分を粉砕して粗抽出粉末を
得た。
このようにして得られた固形分を粉砕して粗抽出粉末を
得た。
このようにして得られた粗抽出粉末についてトリプシン
（Trypsin）処理するため以下のような操作を行った。
（Trypsin）処理するため以下のような操作を行った。
粗抽出粉末1600mgとトリプシン（シグマ社製）0.8mgと
をナトリウムアセテート0.1Ｍを含んだ0.1Ｍトリス−塩
酸緩衝溶液（pH7.3）25ｍ中に加え、37℃にて２時間
保存させた。
をナトリウムアセテート0.1Ｍを含んだ0.1Ｍトリス−塩
酸緩衝溶液（pH7.3）25ｍ中に加え、37℃にて２時間
保存させた。
次いで、大豆からのトリプシン阻害剤１mg（シグマ社
製）および塩酸グアニジン（和光純薬製）19.1ｇを加え
た後、さらに0.5Ｍのナトリウムアセテート溶液を足し
て総量を50ｍとした。
製）および塩酸グアニジン（和光純薬製）19.1ｇを加え
た後、さらに0.5Ｍのナトリウムアセテート溶液を足し
て総量を50ｍとした。
以上のようにしてトリプシン処理したヒアルロン酸結合
性蛋白含有溶液についてアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて次のようにしてヒアルロン酸結合性蛋白を
精製した。
性蛋白含有溶液についてアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて次のようにしてヒアルロン酸結合性蛋白を
精製した。
上記トリプシン処理されたヒアルロン酸結合性蛋白含有
溶液50ｍに、予め作成したヒアルロン酸結合セファロ
ース＊（作成方法は後述）50ｍを加え混合し、直ちに
透析膜の中に入れた後、４℃に冷却した９倍量の精製水
中で一夜透析させた。
溶液50ｍに、予め作成したヒアルロン酸結合セファロ
ース＊（作成方法は後述）50ｍを加え混合し、直ちに
透析膜の中に入れた後、４℃に冷却した９倍量の精製水
中で一夜透析させた。
透析後、ゲル全量を内径3.2cmのカラムに充填した後、
１ＭのNaCl溶液で洗浄し、未吸着分を除去した。
１ＭのNaCl溶液で洗浄し、未吸着分を除去した。
さらに１Ｍ〜３ＭのNaClで順次、洗浄し不要な蛋白を除
去した後、緩衝液Ａで吸着分を溶出させて回収した。
去した後、緩衝液Ａで吸着分を溶出させて回収した。
次いで、回収分をDIAFLO PM-10（アミコン社製）にて濃
縮させて全量を４ｍとし、セファロース（Sepharos
e）６Ｂカラム（φ3.1×43cm）を通過させた。第２およ
び第３ピークを示す成分を回収し、それぞれ、上記DIAF
LO PM-10で分離濃縮し、ヒアルロン酸結合性蛋白試薬と
した。
縮させて全量を４ｍとし、セファロース（Sepharos
e）６Ｂカラム（φ3.1×43cm）を通過させた。第２およ
び第３ピークを示す成分を回収し、それぞれ、上記DIAF
LO PM-10で分離濃縮し、ヒアルロン酸結合性蛋白試薬と
した。
ヒアルロン酸ナトリウム600mg（生化学工業製）、ＡＨ
−セファロース（ファルマシア社製）75ｍおよび精製
水200ｍの混合液に水溶性カルボジイミド1.4ｇを添加
した後、室温にて24時間放置した。
−セファロース（ファルマシア社製）75ｍおよび精製
水200ｍの混合液に水溶性カルボジイミド1.4ｇを添加
した後、室温にて24時間放置した。
このような溶液に酢酸10ｍを加え反応を停止させた。
得られたゲルを取り出し、それぞれ１の１ＭNaCl、１
ＭNaClを含む0.1ＭTris-HCl（pH8.1）、0.05Ｍギ酸エス
テル（pH3.1）、精製水および0.5Ｍナトリウム−アセテ
ート（pH5.7）により、順次、ゲルを洗浄してヒアルロ
ン酸結合セファロースを得た。
得られたゲルを取り出し、それぞれ１の１ＭNaCl、１
ＭNaClを含む0.1ＭTris-HCl（pH8.1）、0.05Ｍギ酸エス
テル（pH3.1）、精製水および0.5Ｍナトリウム−アセテ
ート（pH5.7）により、順次、ゲルを洗浄してヒアルロ
ン酸結合セファロースを得た。
ビオチン−ヒアルロン酸結合性蛋白の調製 上記のように得られたヒアルロン酸結合性蛋白につい
て、標識物質であるＰＯＤを結合させるための前処理と
してビオチンの結合体を調製するため以下のような操作
を行った。
て、標識物質であるＰＯＤを結合させるための前処理と
してビオチンの結合体を調製するため以下のような操作
を行った。
ヒアルロン酸を結合したヒアルロン酸結合性蛋白液１mg
（１mg／ｍNaHCO3溶液中）に、ビオチン−Ｏ−Su（PI
RCE社より入手）（１mg／ｍジメチルスルフォキサイ
ド中）を加え室温にて４時間保存した。
（１mg／ｍNaHCO3溶液中）に、ビオチン−Ｏ−Su（PI
RCE社より入手）（１mg／ｍジメチルスルフォキサイ
ド中）を加え室温にて４時間保存した。
次いで、このような保存液をカラム（coloumns PD-10）
に充填されたセファデックス（Sephadex）Ｇ25〔0.1％N
aN3および0.9％NaClを含む10ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）（以下、ＰＢＳと称す）で平衡化したもの〕
を通過させた。
に充填されたセファデックス（Sephadex）Ｇ25〔0.1％N
aN3および0.9％NaClを含む10ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）（以下、ＰＢＳと称す）で平衡化したもの〕
を通過させた。
蛋白部分を回収した後、塩酸グアニジン（和光純薬製）
1.53ｇを加え、ヒアルロン酸結合性セファロースゲル懸
濁液〔ヒアルロン酸結合セファロースゲル（10ml wet v
olume）を0.1％BSAを含む緩衝液（1.5ＭNaClを含む25ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム（pH7.0）（以下、緩衝液Ｂと称す
る）40mlに混合したもの〕に投入した。このような懸濁
液を４℃にて一夜保存した。
1.53ｇを加え、ヒアルロン酸結合性セファロースゲル懸
濁液〔ヒアルロン酸結合セファロースゲル（10ml wet v
olume）を0.1％BSAを含む緩衝液（1.5ＭNaClを含む25ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム（pH7.0）（以下、緩衝液Ｂと称す
る）40mlに混合したもの〕に投入した。このような懸濁
液を４℃にて一夜保存した。
その後、全量をカラムに充填させ、緩衝液Ｂを250ｍ
、プロテース（Protease）阻害剤（ＥＤＴＡ，トリプ
シン阻害剤、フェニルメチルスルホニルフルオライド、
ヨウ素化酢酸、ε−アミノカプロン酸、ベンズアミジ
ン、ペプスタチンの混合物）を含む緩衝液Ｂを250ｍ
、および３ＭのNaCl溶液で順次、洗浄した後、緩衝液
Ａで吸着分を溶出させて回収した。
、プロテース（Protease）阻害剤（ＥＤＴＡ，トリプ
シン阻害剤、フェニルメチルスルホニルフルオライド、
ヨウ素化酢酸、ε−アミノカプロン酸、ベンズアミジ
ン、ペプスタチンの混合物）を含む緩衝液Ｂを250ｍ
、および３ＭのNaCl溶液で順次、洗浄した後、緩衝液
Ａで吸着分を溶出させて回収した。
回収液につき、紫外光吸光度（波長280nm）が0.2以上に
なるまで濃縮した。
なるまで濃縮した。
得られた濃縮分を分注し、凍結保存したものをビオチン
−ヒアルロン酸結合性蛋白試薬とした。
−ヒアルロン酸結合性蛋白試薬とした。
実施例１（ヒアルロン酸の定量） 精製されたヒアルロン酸結合性蛋白のNaHCO3溶液（結合
性蛋白の濃度20μｇ／ｍ）50μをファルコンプレー
ト（Becton Dikinson社製）に均一にコーティングし、
４℃にて一夜保存した。
性蛋白の濃度20μｇ／ｍ）50μをファルコンプレー
ト（Becton Dikinson社製）に均一にコーティングし、
４℃にて一夜保存した。
次いで、ファルコンプレート上のヒアルロン酸結合性蛋
白が被覆されていない表面部分を完全に被覆するための
ブロック体として、牛−γ−グロブリン0.5％を含む溶
液を加え、さらに室温にて２時間保存した。
白が被覆されていない表面部分を完全に被覆するための
ブロック体として、牛−γ−グロブリン0.5％を含む溶
液を加え、さらに室温にて２時間保存した。
このようなプレートを洗浄液（Tween20を0.05％含む0.8
5ＭのNaCl溶液）で３回洗浄した。
5ＭのNaCl溶液）で３回洗浄した。
次いで、このようなプレートに濃縮10ng／ｍの高分子
ヒアルロン酸を含む血清を11倍に稀釈した標準試料50μ
を加え室温にて２時間保存した。血清に代えてブロッ
ク体溶液を使用してヒアルロン酸の試料を加えてもよい
ことを確認した。
ヒアルロン酸を含む血清を11倍に稀釈した標準試料50μ
を加え室温にて２時間保存した。血清に代えてブロッ
ク体溶液を使用してヒアルロン酸の試料を加えてもよい
ことを確認した。
この後、上記洗浄液にて３回洗浄し、前記調製したビオ
チン−ヒアルロン酸結合性蛋白（前記ブロック体溶液に
て300倍希釈したもの）をヒアルロン酸等量に対して過
剰量加え、さらに室温にて２時間保存した。
チン−ヒアルロン酸結合性蛋白（前記ブロック体溶液に
て300倍希釈したもの）をヒアルロン酸等量に対して過
剰量加え、さらに室温にて２時間保存した。
その後、上記洗浄液で３回洗浄した後、アビジン−ＰＯ
Ｄ（VECTOR社製）を前記ブロック体溶液にて3000倍希釈
した溶液を加え、室温にて45分間保存した。
Ｄ（VECTOR社製）を前記ブロック体溶液にて3000倍希釈
した溶液を加え、室温にて45分間保存した。
次いで、上記洗浄液で３回洗浄後、濃度２mg／ｍのオ
ルトフェニレンジアミン（半井化学製）（H2O20.015
％、クエン酸0.018Ｍ、リン酸水素ナトリウム0.064Ｍお
よびサリチル酸0.1％を含む）溶液100μを加えて室温
にて30分間保存した後、８規定H2SO4を２滴滴下してオ
ルトフェニレンジアミンの分解反応を停止させた。
ルトフェニレンジアミン（半井化学製）（H2O20.015
％、クエン酸0.018Ｍ、リン酸水素ナトリウム0.064Ｍお
よびサリチル酸0.1％を含む）溶液100μを加えて室温
にて30分間保存した後、８規定H2SO4を２滴滴下してオ
ルトフェニレンジアミンの分解反応を停止させた。
こうしてオルトフェニレンジアミンの分解による着色液
を紫外・可視吸光光度計にて492nmの吸光度を測定し
た。
を紫外・可視吸光光度計にて492nmの吸光度を測定し
た。
以上の操作について、ヒアルロン酸標準品の濃度を50、1
00、500、100ng／ｍとした場合についてそれぞれ試料を
作製し、オルトフェニレンジアミンの分解発色について
分光光度計にて吸光度（492nm）を測定した。
00、500、100ng／ｍとした場合についてそれぞれ試料を
作製し、オルトフェニレンジアミンの分解発色について
分光光度計にて吸光度（492nm）を測定した。
得られた結果を第１図に示す。
これより、本発明の測定方法によれば10ngのオーダの高
分子ヒアルロン酸の検出および測定が可能であることが
判る。
分子ヒアルロン酸の検出および測定が可能であることが
判る。
発明の効果 以上、説明したように本発明のヒアルロン酸の測定方法
は、低分子ヒアルロン酸を除外し高分子のヒアルロン酸
だけを選択的に測定することができる。
は、低分子ヒアルロン酸を除外し高分子のヒアルロン酸
だけを選択的に測定することができる。
また本発明は競合反応を使用しないため、試薬としての
ヒアルロン酸を必要とせず簡単な操作でありしかも10ng
という極微量な高分子ヒアルロン酸の検出および測定が
可能である。
ヒアルロン酸を必要とせず簡単な操作でありしかも10ng
という極微量な高分子ヒアルロン酸の検出および測定が
可能である。
従って、本発明の方法は、リウマチ等の炎症の診断ある
いは癌の診断に極めて有効な方法であり、その技術的な
価値は高い。
いは癌の診断に極めて有効な方法であり、その技術的な
価値は高い。
第１図は、本発明のヒアルロン酸の測定方法により得ら
れた高分子ヒアルロン酸濃度と吸光度の関係を示すグラ
フである。
れた高分子ヒアルロン酸濃度と吸光度の関係を示すグラ
フである。
Claims (13)
- 【請求項１】固相に固着されたヒアルロン酸結合性蛋白
に検体ヒアルロン酸を含む試料を添加して該固着された
ヒアルロン酸結合性蛋白と該検体ヒアルロン酸とを結合
せしめ、次いで、これに標識物質で標識されたヒアルロ
ン酸結合性蛋白を結合させて、 「固相固着ヒアルロン酸結合性蛋白−高分子ヒアルロン
酸−標識物質結合ヒアルロン酸結合性蛋白」からなるサ
ンドイッチ状結合体を形成せしめ、該サンドイッチ状結
合体中の標識物質を測定することにより、該検体ヒアル
ロン酸を定量とすることを特徴とする高分子ヒアルロン
酸の測定方法。 - 【請求項２】ヒアルロン酸結合性蛋白を固着した後に、
ブロック体を添加することによって、ヒアルロン酸結合
性蛋白を固着した固相の表面の該ヒアルロン酸結合性蛋
白が固着していない部分をブロック体により被覆する請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】検体ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸結合性
蛋白と少なくとも２ケ所の結合サイトを有している請求
項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】固相がプレート、チューブ、ビーズ、メン
ブレン、ゲルからなる群より選択した１種である請求項
１〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】ヒアルロン酸結合性蛋白がプロテオグリカ
ン、リンクプロティン、ヒアルロネクチンからなる群よ
り選択した一種である請求項１〜４のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項６】標識物質がアイソトープ、蛍光色素、アビ
ジン、ビオチン、化学発光物質、酵素からなる群より選
択した１種である請求項１〜５のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項７】ブロック体がγ−グロブリン、血清アルブ
ミン、血清からなる群より選択した１種である請求項２
〜６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】ヒアルロン酸結合性蛋白が固着された固相
体と、添加用ヒアルロン酸結合性蛋白と、検体ヒアルロ
ン酸定量用標識物質とによって構成される高分子ヒアル
ロン酸測定用キット。 - 【請求項９】添加用ヒアルロン酸結合性蛋白が予め標識
物質で標識されて一体になっている請求項８に記載のキ
ット。 - 【請求項１０】ヒアルロン酸結合性蛋白を固着した固相
の表面の該ヒアルロン酸結合性蛋白が固着していない部
分がブロック体により被覆されている請求項８または９
に記載のキット。 - 【請求項１１】ブロック体がγ−グロブリン、血清アル
ブミン、血清からなる群より選択した１種である請求項
10に記載のキット。 - 【請求項１２】固相体がプレート、チューブ、ビーズ、
メンブレン、ゲルからなる群より選択した１種である請
求項８〜11のいずれか一項に記載のキット。 - 【請求項１３】標識物質がアイソトープ、蛍光色素、ア
ビジン、ビオチン、化学発光物質、酵素からなる群より
選択した１種である請求項８〜12のいずれか一項に記載
のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63049227A JPH0641952B2 (ja) | 1987-03-03 | 1988-03-02 | 高分子ヒアルロン酸の測定方法および測定キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4851887 | 1987-03-03 | ||
| JP62-48518 | 1987-11-28 | ||
| JP63049227A JPH0641952B2 (ja) | 1987-03-03 | 1988-03-02 | 高分子ヒアルロン酸の測定方法および測定キット |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01469A JPH01469A (ja) | 1989-01-05 |
| JPS64469A JPS64469A (en) | 1989-01-05 |
| JPH0641952B2 true JPH0641952B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=26388806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63049227A Expired - Lifetime JPH0641952B2 (ja) | 1987-03-03 | 1988-03-02 | 高分子ヒアルロン酸の測定方法および測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0641952B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008018519A1 (en) | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Seikagaku Corporation | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000012122A2 (de) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Universitätsklinikum Freiburg | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen |
| CN117664885B (zh) * | 2023-11-28 | 2024-05-07 | 中国计量科学研究院 | 一种织物中透明质酸含量的定量检测方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS607229B2 (ja) * | 1976-10-07 | 1985-02-22 | 持田製薬株式会社 | 免疫化学的測定方法 |
| US4244940A (en) * | 1978-09-05 | 1981-01-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Single-incubation two-site immunoassay |
-
1988
- 1988-03-02 JP JP63049227A patent/JPH0641952B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008018519A1 (en) | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Seikagaku Corporation | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid |
| JPWO2008018519A1 (ja) * | 2006-08-08 | 2010-01-07 | 生化学工業株式会社 | ヒアルロン酸の分子量の測定方法 |
| JP5466405B2 (ja) * | 2006-08-08 | 2014-04-09 | 生化学工業株式会社 | ヒアルロン酸の分子量の測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS64469A (en) | 1989-01-05 |
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