JPWO2007063820A1 - エレクトロスピニング法により形成された生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を有する生体適合材、及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、組織又は骨の再生を誘導、促進するための様々な因子が通過するための細孔を有する組織再生用膜（GTR膜）、骨再生用膜（GBR膜）、シート材、貼付材、補填材等の生体適合材、及び該生体適合材を容易に製造する方法を提供する。生体適合材をエレクトロスピニング法により形成された生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を使用して形成することにより、組織又は骨の再生を誘導、促進するための様々な因子が通過するための細孔を有する生体適合材を容易に製造することができる。

Description

本発明は、生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を有する生体適合材、及び該生体適合材の製造方法に関する。

従来、歯科、口腔外科などの医療領域において組織若しくは骨等を再生する目的で使用される組織再生用膜（GTR膜）、骨再生用膜（GBR膜）などの生体適合材は、グリコール酸、乳酸、カプロラクトンなどのホモポリマー、あるいはコポリマーまたはその混合物からなる材料である（特許文献１参照）。例えば、微細孔を有したポリマー−セラミック物質を含む材料（特許文献２参照）、乳酸、グリコール酸若しくはカプロラクトンの重縮合体又はそれらの共重合体からなるスポンジ状材料（特許文献３参照）、膜用高分子材料をエマルジョン溶液としたのち成形することで完全に貫通した気孔を形成した生体吸収膜（特許文献４参照）、コラーゲンIIからなる多層膜（特許文献５参照）、Ｌ−乳酸、ＤＬ−乳酸、グリコール酸、ε−カプロラクトンのホモポリマー又はコポリマーから選ばれる高分子ブレンド材料から成り、孔のサイズが１〜５０μｍφ、有孔率５〜９５％、厚さ５０〜５００μｍである有孔性シート状構造をなす材料（特許文献６参照）などの報告がある。さらに、付着した細胞の成長を促進するとともに幹細胞の付着性を向上させる、生体組織欠損部を再生するための、多孔体からなる足場材も開示されている（特許文献７及び８参照）。

これらの材料及び膜を製造する場合、ポリマーを溶剤に溶解し、溶剤を蒸発させてフィルムを作成する方法、エマルジョン溶液を保形材に塗布して乾燥後剥離させて作成する方法などが採用されていた。しかしながら、膜に孔を開ける場合には膜製造後にレーザーなどで穿孔する必要があり、製造工程が複雑であった。
特表平６−５０４７０２号公報 特開平６−３１９７９４号公報 特開平１０−２３４８４４号公報 特開平１１−８０４１５号公報 特表２００１−５１９２１０号公報 特開２００２−８５５４７号公報 特開２００５−１１０７０９号公報 特開２００４−２９８５４４号公報

組織再生及び骨再生では、組織又は骨の再生を誘導、促進するための様々な因子が利用される。このため、組織再生用膜（GTR膜）；骨再生用膜（GBR膜）；幹細胞や成長因子等を含むことのできる組織再生のための足場材（例えば組織再生の足場となるシート材、貼付材、補填材など）；等の組織及び骨の再生用材等の生体適合材はこのような因子が行き来するための細孔が必要である。したがって、本発明は、細孔を有する組織再生用膜（GTR膜）、骨再生用膜（GBR膜）、シート材、貼付材、補填材等の生体適合材、及び該生体適合材を容易に製造する方法の提供を目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、エレクトロスピニング法によって、ナノ又はマイクロファイバー不織布を有する組織再生用膜、骨再生用膜等の生体適合材を容易に製造できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は下記の生体適合材及び製造方法に関する。
項１．エレクトロスピニング法により形成された生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を有する生体適合材。
項２．生体分解性である項１に記載の生体適合材。
項３．組織再生用又は骨再生用である項１又は２に記載の生体適合材。
項４．歯科又は口腔用である項１〜３のいずれかに記載の生体適合材。
項５．幹細胞及び／又は成長因子を含み、組織再生の足場材用である項１又は２に記載の生体適合材。
項６．エレクトロスピニング法により生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を形成することを特徴とする生体適合材の製造方法。
項７．生体適合材が生体分解性である項６に記載の製造方法。
項８．生体適合材が組織再生用又は骨再生用である項６又は７に記載の製造方法。
項９．生体適合材が歯科又は口腔用である項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
項１０．生体適合材が幹細胞及び／又は成長因子を含み、組織再生の足場材用である項６又は７に記載の製造方法。

本明細書において、生体適合性とは、生体の許容範囲を超えた悪影響を生体に与えない特性をいう。また、ナノ又はマイクロファイバーとは、ナノファイバー又はマイクロファイバーのような微細繊維を意味する。ナノファイバーは繊維径が１μｍ未満の繊維であり、マイクロファイバーは繊維径が１μｍ以上１ｍｍ未満の繊維である。ナノ又はマイクロファイバーの好ましい繊維径は１０ｎｍ〜５００μｍ、より好ましい繊維径は１００ｎｍ〜１００μｍである。また、ナノ又はマイクロファイバー不織布とはナノ又はマイクロファイバーからなる不織布をいい、不織布の繊維径の平均がナノ又はマイクロメートル単位であるものを包含するが、不織布におけるナノ又はマイクロファイバーの含有量が５０重量％以上であることが好ましい。なお、ナノ又はマイクロファイバーの直径測定はSEMで測定し、画像処理などにより、平均直径を算出することにより行われる。

エレクトロスピニング法は、基本的に溶液紡糸であり、ナノ又はマイクロファイバーの不織布の製造方法としては公知の方法である。エレクトロスピニング法の原理は、図１に示すように、一般的には紡糸液（ポリマー溶液）にプラスの高電圧を与え、ポリマー溶液の液滴（ドロップ）がプラス電極において鋭い円錐になり、さらにそれが細長くなってアースやマイナスに向かって飛散し、飛散中に溶媒が揮散してポリマーが繊維化（ナノファイバー化）して、マイナス電極において回収されて、ナノ又はマイクロファイバーの不織布が形成される手法であり、加工技術、vol. 40, No.2 (2005) 101-103、加工技術、vol.40, No.3 (2005) 167-171、加工技術、vol. 40, No.4 (2005) 272-275などにその説明がなされている。本発明においてエレクトロスピニング法とは、このような原理を利用したナノ又はマイクロファイバー不織布製造手法をすべて含む。

次に、本発明におけるエレクトロスピニング法の代表的な例を説明する。

エレクトロスピニング法では、紡糸液に高電圧を負荷させる。このため、高電圧発生器を利用すると便利である。この際の電圧は通常１００ｋＶ以下、好ましくは１〜４０ｋＶである。

紡糸液を入れる容器には、シリンジ、ピペット、キャピラリーなどが利用される。これらの材質は、通常ポリプロピレン、ガラスなどである。容器の容積量は形成するナノ又はマイクロファイバー不織布の形状、大きさ、厚みなどに応じて適宜設定すればよい。

容器にはノズル（例えば注射針）が装着される。ノズルは通電性の材質が好ましく、プラス電極が接続される。ノズル出口の形状は円が好ましいが、これに限定されず、形成するナノファイバーに応じて適宜変更すればよい。また、ノズルから複数のファイバーを吹き出させることも可能である。ノズルにプラス電極を接続する。

ノズルから吹き出されたナノ又はマイクロファイバーはターゲット表面上で堆積し不織布となる。ターゲットの形状は通常板状、棒状、ワイヤーメッシュ、特定の形状に型取りされた立体形状などであり、その材質は銅、ステンレスなどである。不織布の取り出しを容易にするため、ターゲット表面上にアルミ箔などを敷き、その上に不織布を形成させても良い。また、板状ターゲットを回転させたり、棒状ターゲットをローリングさせることによって、より均質な不織布が得られる。さらに、大きな不織布を得るため、ベルトコンベヤー式、帯状のローラーを備えたターゲットを利用することができる。例えば、立体形状を形成するときには、Ｘ、Ｙ、Ｚ方向に移動できるテーブルと、形成面を水平等のある特定の方向に保つためのテーブルとを特定の角度に回転できる移動装置を用い、目的とする形状を形成させるための適切な位置にターゲットまたはノズルを移動させながら、不織布を形成させる。ただし、本発明はこの形成方法に限られる訳ではない。ターゲットは高電圧発生器のアースと接続される。

ノズルのついたシリンジなどを垂直にし、その真下にターゲットを配置することができる。しかし、この配置では、ノズルからの液滴が落下するとターゲットに付着する。この付着を回避することが望まれる場合には、ナノ又はマイクロファイバーが真下ではなく、斜め（例えば３０〜４５°）に吹き出すようにシリンジなどを配置し、吹き出したナノ又はマイクロファイバーが堆積する位置にターゲットを配置することが好ましい。ノズル先端からターゲットまでの距離は通常５〜７０ｃｍ、好ましくは５〜３０ｃｍである。

本発明の生体適合材に含まれるナノ又はマイクロファイバー不織布の材質としては、例えば、ポリスチレン（PS）、ポリカーボネート（PC）、ポリメタクリレート（PMMA）、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリアミド（PA）等の熱可塑性樹脂、ポリウレタン（PU）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリ乳酸（PLA）、ポリ酪酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリカプロラクトン（PCL）及びこれらの共重合体、ポリエチレン−酢酸ビニル共重合体（PEVA）、ポリエチレン−ビニルアルコール共重合体（PEVOH）、ポリエチレンオキサイド（PEO）、コラーゲン（CO）、キチン−キトサン（CHI）等の生体適合性又は分解性樹脂、上記樹脂の混合物、PVAとシリカの混合物、ポリアクリロニトリル（PAN）と酸化チタンの混合物等のポリマーが用いられる。特に、生体分解性樹脂が好ましく、とりわけ、乳酸、グリコール酸及びε−カプロラクトンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物のホモポリマー、コポリマー又はこれらポリマーの混合物が好ましい。

ポリマーの重量平均分子量は、エレクトロスピニング法によりナノ又はマイクロファイバー化できる限り特に限定されない。例えば、重量平均分子量が１０万〜１０００万、好ましくは１０万〜１００万のポリマーが使用できる。なお、分子量が低いためにナノ又はマイクロファイバー化ができない場合には、他のナノ又はマイクロファイバー化に適したポリマーを混合することによってナノ又はマイクロファイバー化することができる。また、ポリマー鎖の剛直性を考慮する場合には、結晶性ポリマーが好ましい。紡糸液中のポリマーの濃度はエレクトロスピニング法によりナノ又はマイクロファイバー化できる限り特に限定されない。例えば、１〜３０重量％、好ましくは５〜１０重量％である。紡糸液に使用される溶媒は、ポリマーを溶解できる物が好ましく、ポリマーに応じて適宜選択可能である。溶媒の例としては、水；酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフランなどの水親和性有機溶媒；クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、テトラクロロエタン、トリクロロエタン、ジブロモメタン、１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノールなどの水非親和性有機溶媒；アセチルクエン酸エステル、アジピン酸エステル、セバシン酸エステル、フタル酸エステル等の可塑剤；これらの混合物などがあげられる。

また、紡糸液に、組織又は骨の再生を誘導、促進するための様々な機能性物質を包含させることによって、ナノ又はマイクロファイバー不織布にこれら機能性物質に由来する様々な機能を付与することができる。これにより、生体適合材製造後にこれら因子を別途添加する作業が不要となる。機能性物質としては、PDGF（血小板由来成長因子）、IGF（インシュリン様成長因子）、BMP（骨形成促進因子）、bFGF（塩基性繊維芽細胞増殖因子）、オステオポンチン等の骨及び／又は生体組織の成長因子；、アメロジェニン、エナメリン等のエナメルタンパク質；アルブミン、グロブリン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、エラスチン等の生体由来物質；ミノサイクリン、ドキシサイクリン等のテトラサイクリン系，クラリスロマイシン、アジスロマイシン等のマクロライド系、レボフロキサシン等のニューキノロン系，テリスロマイシン等のケトライド系などの抗菌性物質；フルルビプロフェン等の非ステロイド系、デキサメタゾン等のステロイド系等の抗炎症剤；アズレン等の天然由来物；ビスフォスホネート等の骨吸収阻害剤等の薬剤；などがあげられる。なお、ナノ又はマイクロファイバー不織布を形成後に該不織布にこれら機能性物質を、例えばゲル状、ジェル状の形態で塗布等により配合することができる。また、前述のポリマーを溶媒に溶解して紡糸液を調製する際に、薬剤の性質を損なわない範囲で、薬剤も溶解させて紡糸液に含有させて薬剤含有紡糸液を調製し、この紡糸液を利用してエレクトロスピニング法を行うことにより、ファイバー中に薬剤が配合された不織布を製造することもできる。

また、紡糸液には、上記した以外の、エレクトロスピニング法において利用される添加物を使用することができる。例えば、界面活性剤、塩化リチウム等の電解質などである。

本発明の生体適合材は、エレクトロスピニング法により形成された生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を有する。また、本発明の製造方法では、同じターゲット表面に、ポリマー溶液を繰り返して噴出し、ナノファイバーを堆積させることによって、より立体的な構造物（固形物）を得ることができる。

歯科用生体適合材は、歯科の分野で使用される生体適合材であり、例えば、組織再生用膜（GTR膜）；骨再生用膜（GBR膜）；幹細胞や成長因子等を含むことのできる組織再生のための足場材（例えば組織再生の足場となるシート材、貼付材、補填材など）；等の組織及び骨の再生用材などがあげられる。幹細胞や成長因子等は生体適合材の中及び／又は表面に含有させることができる。口腔用生体適合材は、口腔外科の分野で使用される生体適合材であり、例えば、手術後の癒着防止材、組織再生用膜（GTR膜）；骨再生用膜（GBR膜）；幹細胞や成長因子等を含むことのできる担体組織再生のための足場材（例えば組織再生の足場となるシート材、貼付材、補填材など）；等の組織及び骨の再生用材などがあげられる。好ましいのは、歯科用生体適合材である。また、生体適合材は生体分解性であると、より生体に対して安全である。また、生体分解性であれば、患部に生体適合材を適用後、該膜を取り外す作業を不要とすることが可能である。

本発明の生体適合材の厚みは特に限定されないが、GTR膜及びGBR膜の場合、通常１００〜１０００μｍ、好ましくは２００〜７００μｍである。組織再生のための幹細胞の足場の場合、足場の適用される患部の大きさに相当する大きさがよく、患部の大きさに応じて切断し、用いることができる。

本発明の生体適合材における空隙率は５〜９５％が好ましく、細孔の分布は、ポリマー濃度、分子量、塗布回数などにより制御できる。

本発明の生体適合材の形状及び大きさは、患部の形状及び大きさに応じて適切な形状とすればよい。

生体適合材の形状、大きさ、細孔系、厚みなどは、エレクトロスピニング法における条件（例えば繊維径、ターゲットの回転速度など）を適宜設定することにより実現できる。また、生体適合材が複雑な形状の場合には、エレクトロスピニング法により製造した後、必要な形状及び構造に形成すればよい。

本発明によれば、エレクトロスピニング法を採用することにより、空隙を有するナノ又はマイクロファイバー不織布が容易に得られ、該不織布は優れた生体適合材として利用できる。

図１は、実施例１〜３において利用された装置の概念図である。 図２は、実施例２において形成されたナノファイバー不織布の光学顕微鏡写真である。１目盛りは１μｍを示す。 図３は、実施例４においてモデルとされた犬の患部を示す概念図であり、歯槽骨とそこに適用されたナノファイバー不織布（GTR膜）との位置を示す。GTR膜は黒い太い線で示されている。なお、図では施術後を示し、不織布上を再生した上皮組織が覆い、骨は主として矢印の方向に沿って新生していた。 図４は、実施例６においてモデルとされた犬の患部を示す概念図であり、骨欠損部と本発明不織布の位置を示す。GBR膜は黒い太い線で示されている。なお、図では施術後を示し、不織布上を再生した上皮組織が覆い、骨は主として矢印の方向に向かって新生していた。

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
ｌ−ポリ乳酸（重量平均分子量：約１１万）をクロロホルムに溶解し、７重量％溶液とした。この溶液を図１のシリンジに入れて、１２ｋＶでエレクトロスピニングを行い、ナノファイバーの不織布を形成した。なお、ノズル先端からターゲットまでの距離は１５ｃｍであった。不織布のナノファイバーの平均径は約５００ｎｍであり、不織布の厚みは約４０μｍであった。

実施例２
ｄ，ｌ−ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（組成比１０：９０）、重量平均分子量：約７５万）を１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに溶解し、１０重量％溶液とした。２ｋＶでエレクトロスピニングを行い、ナノファイバーの不織布を形成した。なお、ノズル先端からターゲットまでの距離は１５ｃｍであった。不織布のマイクロファイバーの平均径は約１０００ｎｍであり、不織布の厚みは約２８０μｍであった。得られた不織布の顕微鏡写真を図２に示す。

実施例３
粘度が約５００ｍＰａ・ｓ（０．５％酢酸）のキトサンを９０％酢酸に溶解し、７重量％溶液とした。４ｋＶでエレクトロスピニングを行い、ナノファイバーの不織布を形成した。なお、ノズル先端からターゲットまでの距離は５ｃｍであった。不織布のナノファイバーの平均径は約１５０ｎｍであった。

実施例４：GTR膜
ビーグル犬の下顎左右の第４小臼歯を抜歯して、人工的２壁性骨欠損状態とした。このビーグル犬モデルに対して、患部を暴露した後、スケーリング、ルートプレーニングを施した。実施例１で作製したナノファイバー不織布（GTR膜）を滅菌処理した後、歯槽骨や歯根膜が回復する空間を確保できるように患部に適用し、歯肉をもどし吸収性縫合糸で結束した。患部適用１ヶ月、３ヶ月後に病理標本組織を作製し、画像処理により歯周組織形態を経過観察した。あわせて骨密度を軟Ｘ線写真にて解析した。患部に適用されたGTR膜の概念図を図３に示す。

さらに、同様の犬モデルに対して、実験的に作成したポリ乳酸からなる膜を用いて、同様に施術し経過を観察した。

その結果、ナノ又はマイクロファイバー不織布は、３ヶ月後新生歯根膜は太いコラーゲン繊維束の斜行が認められ、その断端が新生セメント質や新生歯槽骨へ埋入する新付着が認められた。また骨欠損部の密度は１ヶ月後に約１０％、３ヶ月後に約２０％回復した。これに対し、ポリ乳酸からなる膜を使用した犬モデルでは３ヶ月後に組織の一部に新付着が認められたものの、骨欠損部の密度は１ヶ月後、３ヶ月後とも開始時と同様で、骨欠損部における透過像の観察において改善は認められなかった。これにより、ナノファイバー不織布が歯周組織再生へ適用可能であることが示された。

実施例５：GBR膜
ｄ，ｌ−ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（組成比７５：２５、重量平均分子量：約６０００）をテトラヒドロフランとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合液（容積比１：１）に溶解し、５重量％溶液とした。１８ｋＶでエレクトロスピニングを行い、ナノファイバーの不織布を形成した。なお、ノズル先端からターゲットまでの距離は２０ｃｍであった。本不織布のナノファイバーの平均径は約７００ｎｍであった。この不織布に、bFGF（メルク社製）をアミノ酸緩衝液に溶解した０．１重量％溶液を滴下し、凍結乾燥を行い、bFGF含有不織布を製造した。

ラット（３０週齢、３匹）に全身麻酔を施し、上顎臼歯右側口蓋部及び左側口蓋部を切開後、口蓋粘膜を全層剥離する処置を施した。既存骨と新生骨とを区別するため、切開により現れた右側口蓋部骨面及び左側口蓋部骨面にナイロン糸（登録商標、一般名ポリアミド糸）を置いた。左側口蓋部では該糸上に先に製造したbFGF含有不織布を口蓋溝に適合するように置き、右側口蓋部ではbFGFを含有しないことを除いてbFGF含有不織布と同様な不織布を同様に口蓋溝に適合するように置いて、両口蓋部を単純縫合した。６週間の観察期間経過後、患部を病理組織学的に観察した。

bFGFを含有しない不織布を適用した右側口蓋部の新生骨の高さは平均４１μｍであり、該不織布が新生骨の再生に有用であった。また、bFGF含有不織布を適用した左側口蓋部の新生骨の高さは平均９８μｍであり、右側口蓋部と比較してさらに再生が促進されていた。

実施例６：GBR膜
ビーグル犬の下顎左右の第４小臼歯を抜歯して、人工的２壁性骨欠損状態とした。このビーグル犬モデルに対して、患部を暴露した後、実施例５で製造したbFGF含有不織布で左側欠損部を覆い、FGFを含有しないことを除いてbFGF含有不織布と同様な不織布で右側欠損部を覆った（図４参照）。さらにその上から両方の欠損部を歯肉組織で被覆した。患部適用１ヶ月、３ヶ月後に病理標本組織を作製し、骨密度を軟Ｘ線写真にて解析した。患部に適用されたGBR膜の概念図を図４に示す。

骨欠損部の密度は、左右とも回復が認められた。左側骨欠損部の密度の回復率は１ヶ月後及び３ヶ月後において右側骨欠損部の密度の回復率より約５０％高かった。したがって、bFGFを含有しない不織布は歯槽骨密度増加に有用であった。さらに、bFGFを含有した不織布はより歯槽骨密度増加を促進した。

本発明は生体適合材の分野等において利用できる。

Claims (10)

1. エレクトロスピニング法により形成された生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を有する生体適合材。
2. 生体分解性である請求項１に記載の生体適合材。
3. 組織再生用又は骨再生用である請求項１又は２に記載の生体適合材。
4. 歯科又は口腔用である請求項１〜３のいずれかに記載の生体適合材。
5. 幹細胞及び／又は成長因子を含み、組織再生の足場材用である請求項１又は２に記載の生体適合材。
6. エレクトロスピニング法により生体適合性のナノ又はマイクロファイバー不織布を形成することを特徴とする生体適合材の製造方法。
7. 生体適合材が生体分解性である請求項６に記載の製造方法。
8. 生体適合材が組織再生用又は骨再生用である請求項６又は７に記載の製造方法。
9. 生体適合材が歯科又は口腔用である請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
10. 生体適合材が幹細胞及び／又は成長因子を含み、組織再生の足場材用である請求項６又は７に記載の製造方法。

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