JPWO2007037514A1 - ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子の新規医薬用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子(HB−EGF)もしくはその部分ペプチド、あるいはそれをコードする核酸を含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤、肝疾患の予防・治療剤を提供する。本発明はまた、動物から採取した細胞に、HB−EGFもしくはその部分ペプチドをコードする核酸を導入することを含む、肝保護および/または肝再生促進用、肝疾患の予防・治療用細胞の製造方法を提供する。

Description

本発明は、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子(heparin−binding EGF−like growth factor;以下、「HB−EGF」と略記する)またはそれをコードする核酸の新規医薬用途、より具体的には、肝疾患の予防・治療用途に関する。
肝疾患に対して、現在臨床の現場で用いられている医薬・治療法は、あくまで対症療法に過ぎず、肝障害(肝細胞死)を抑制し、肝再生を誘導する根治薬・根治療法は存在しない。そのため、現在、急性肝炎における第一の治療方針は安静と食事であり、現に使用されている薬剤で真に有効性が実証されたものはない。なかでも、劇症肝炎には様々な薬剤、治療法が用いられているものの、未だに死亡率は70%近くにのぼり、効果的な治療薬・治療法には程遠く、欧米では肝移植が治療の第一選択となっている。
このように、肝疾患(特に劇症肝炎)に対する根治薬は臨床レベルでは存在しないのが実状である。かかる状況下において、研究レベルでその有効性が確認され、近い実用化が最も期待されているものが、肝細胞増殖因子(HGF)である。本発明者の一人は以前、劇症肝炎モデルにおいてHGFが肝細胞死を強力に阻止し、同時に肝障害後の肝再生を誘導することを報告しており(WO 98/24467;Kosai,K.et al.,Hum.Gene Ther.,92:1293−1301(1998);Kosai,K.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,244:683−90(1998);Kosai,K.et al.,Hepatology,30:151−9(1999))、現在、臨床応用へ向けて開発が進められている。
HB−EGFは、正常肝でも発現しているEGFファミリーに属する増殖因子であるが、まず膜結合型の前駆体(proHB−EGF)として合成された後、膜近傍ドメインで特異的なメタロプロテイナーゼにより切断されて生じる可溶性HB−EGFが、多くの細胞種に対して分裂促進作用を示すという生物学的にユニークな特徴を有している。HB−EGFは、肝臓においては、肝部分切除術後に急激な発現上昇がみられ、また、慢性肝疾患でも発現亢進がみられる。これらの事実より、HB−EGFはHGFなどと同様に、肝臓栄養因子の1つであろうと推察されてきた。
さらに、HB−EGFの投与または遺伝子治療が、いくつかの臓器障害に対して治療効果を示すことが報告されている。例えば、間質性膀胱炎(IC)患者の損傷した上皮細胞への組換えHB−EGFの投与(遺伝子治療による局所産生を含む)が、ICにおける上皮異常の要因である増殖抑制因子(APF)の効果を遮断し、膀胱上皮の慢性的損傷を軽減または排除し得ることが示唆されている(WO 99/54706)。また、糖尿病マウスに、HB−EGF遺伝子を含むアデノウイルスベクターを、膵管を通じて逆行性に注入すると、膵β細胞の増殖、膵管細胞のインスリン産生細胞への分化、耐糖能改善が認められることから、HB−EGFが膵再生・糖尿病治療効果を示すことが示唆されている(Kozawa,J.et al.,Pancreas,31:32−42(2005))。
しかしながら、HB−EGFが肝疾患に対して実際に治療効果を示す、即ち、外因性のHB−EGFが肝障害を抑制し、および/または肝再生を誘導するという報告はこれまでに皆無である。また、HB−EGFは、HGFやインスリン様増殖因子(IGF)と同様に心肥大性増殖因子としても知られているが、本発明者らが実施したウサギでの心筋梗塞治療試験において、HB−EGFを用いた遺伝子治療は、HGFやIGFを用いた場合とは異なって治療効果を示さず、むしろ梗塞後リモデリングを増悪したことから(Ushikoshi,H.et al.,Lab.Invest.,85:862−73(2005))、HB−EGFは、あらゆる臓器障害に対して必ずしも治療的に作用するわけではないらしい。
このように、HB−EGFが肝疾患に対して実際に治療効果を示すか否かは全く不明であり、ましてや、その遺伝子治療の有効性については何ら保証がないというのが実状である。
本発明の目的は、HGFよりもさらに強力な肝障害抑制および肝再生誘導作用を示す物質を同定し、以って肝疾患(特に劇症肝炎)のより有用な新規予防・治療薬を提供することである。
本発明者らは、劇症肝炎の動物モデルにおいて、HB−EGFをコードするDNAを含むアデノウイルスベクターを導入・発現させた結果、HB−EGFが肝障害および肝細胞のアポトーシスを顕著に抑制し、且つ肝再生を誘導することを見出した。しかも驚くべきことに、HB−EGFの該治療効果は、現在知られている最も有望な肝疾患治療薬であるHGFのそれよりも強力であった。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、HB−EGFもしくはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤を提供する。該核酸は、例えば、後述のウイルスベクターなどに挿入されて標的細胞内に導入されると、該細胞内で発現してHB−EGFもしくはその部分ペプチドを産生・放出して、肝障害(肝細胞死)を抑制するとともに、肝再生を誘導する。
従って、本発明はまた、HB−EGFもしくはその部分ペプチドを含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤を提供する。該蛋白質(もしくはペプチド)は、後述するように、遺伝子組換え技術を用いて大量に生産され、使用され得る。
さらに、本発明は、動物から採取した細胞に、HB−EGFもしくはその部分ペプチドをコードする核酸を導入することを含む、肝保護および/または肝再生促進用細胞の製造方法を提供する。該核酸を導入され、発現が確認された細胞を、該細胞を採取した個体に戻すか、または他の個体に移植することにより、該動物個体における肝障害(肝細胞死)が抑制されるとともに、肝再生が誘導される。
HB−EGFは強力な肝障害抑制、アポトーシス抑制および肝再生誘導作用を示すので、HB−EGFまたはそれをコードする核酸を投与することにより、肝障害、肝細胞死を伴う各種疾患に対して予防・治療効果を奏する。
本発明の具体的な態様および本発明のさらなる利点等については、以下の「発明の実施の形態」においてさらに詳述する。
図1は、アデノウイルスベクターの尾静脈注射によって、効率良く肝臓、肝細胞に目的遺伝子を導入できることを示す。図1Aでは、Ad.LacZを導入後、肝組織のほぼ全域でX−gal染色陽性の細胞が認められる。図1Bでは、Ad.HB−EGFを導入することによって、細胞膜の辺縁にHB−EGF発現が認められる。
図2は、劇症肝炎モデルマウスの血中肝臓逸脱酵素濃度に及ぼすAd.HB−EGF、Ad.HGFまたはAd.dE1.3の投与の影響を示す。図2Aは実験スケジュールを示す。図2Bは血清中ALT値、図2Cは血清中AST値をそれぞれ示している(白棒:抗体投与24時間後、黒棒:抗体投与36時間後)。
図3は、劇症肝炎モデルマウスの肝臓組織のアポトーシスに及ぼすAd.HB−EGF(中段)、Ad.HGF(下段)またはAd.dE1.3(上段)投与の影響を示す。左側は抗体投与24時間後、右側は36時間後の、各投与群マウスの肝臓組織の顕微鏡像をそれぞれ示す。
図4は、Ad.HB−EGF、Ad.HGFまたはAd.dE1.3を投与した劇症肝炎モデルマウス肝臓におけるTUNEL染色の結果を示す。図4Aは、左からAd.dE1.3、Ad.HB−EGF、Ad.HGF投与群マウスの顕微鏡像(上段:抗体投与24時間後、下段:抗体投与36時間後)をそれぞれ示す。図4Bは、TUNEL陽性細胞を定量化したグラフである(白棒:抗体投与24時間後、黒棒:抗体投与36時間後)。
図5は、劇症肝炎モデルマウスにおける肝再生に及ぼすAd.HB−EGF、Ad.HGFまたはAd.dE1.3投与の影響を示す。図5Aは、左からAd.dE1.3、Ad.HB−EGF、Ad.HGF投与群マウスの肝臓のKi−67染色像(上段:抗体投与24時間後、下段:抗体投与36時間後)をそれぞれ示す。図5Bは、Ki−67陽性細胞を定量化したグラフである(白棒:抗体投与24時間後、黒棒:抗体投与36時間後)。
本発明で用いられるHB−EGFは、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質であれば、その由来に特に制限はなく、ヒトもしくは他の温血動物(例えば、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ニワトリなど)の細胞[例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例:マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞、株化もしくは癌細胞など]またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官[例えば、脳、脳の各部位(例:嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉(骨格筋、平滑筋)、肺、消化管(例:大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、尿管、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織(例:褐色脂肪組織、白色脂肪組織)など]に由来する蛋白質であってもよく、また、後述のように、化学的に、もしくは無細胞蛋白質合成系を用いて生化学的に合成された蛋白質であってもよい。あるいは、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
配列番号:2に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、特に好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列を含む蛋白質が配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有するような配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント(好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである)における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合(%)を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族アミノ酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性アミノ酸(Gln、Asn)、塩基性アミノ酸(Lys、Arg、His)、酸性アミノ酸(Glu、Asp)、水酸基を有するアミノ酸(Ser、Thr)、側鎖の小さいアミノ酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない(即ち、保存的アミノ酸置換である)ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている(例えば、Bowie et al.,Science,247:1306−1310(1990)を参照)。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873−5877(1993)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389−3402(1997))]、Needleman et al.,Mol.Biol.,48:444−453(1970)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、Myers and Miller,CABIOS,4:11−17(1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている]、Pearson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444−2448(1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
実質的に同質の活性としては、例えば、肝保護(肝障害抑制)作用、アポトーシス(肝細胞死)抑制作用、肝再生(肝細胞の分化および/または分裂)誘導作用などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に(例:生理学的に、または薬理学的に)同一であることを示す。したがって、肝保護作用、アポトーシス抑制作用、肝再生誘導作用などの活性は同等(例えば、約0.5〜約2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
肝保護作用、アポトーシス抑制作用、肝再生誘導作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができ、例えば、後述の実施例に記載されるような肝組織切片の組織病理学的観察(例:ヘマトキシリン−エオシン(H−E)染色)、TUNELアッセイ、Ki67抗原等の増殖マーカーを指標とした免疫組織化学アッセイなどの方法がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明のHB−EGFには、例えば、(1)配列番号:2に示されるアミノ酸配列のうち1または2個以上[好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数(2、3、4または5)個]のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号:2に示されるアミノ酸配列に1または2個以上[好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数(2、3、4または5)個]のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3)配列番号:2に示されるアミノ酸配列に1または2個以上[好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数(2、3、4または5)個]のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号:2に示されるアミノ酸配列のうち1または2個以上[好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜30個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数(2、3、4または5)個]のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。HB−EGFの活性に影響を与える位置としては、例えば、HB−EGF受容体であるEGFRとの結合に関わるEGF様ドメイン(配列番号:2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号105〜148で示される領域)やsheddingにおけるプロテアーゼ認識切断部位などが挙げられるので、挿入、欠失、置換の位置としては、例えば、プロ配列やC末の細胞内ドメイン等が挙げられる。あるいは、ヘパリン結合ドメイン(配列番号:2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号93〜105で示される領域)はHB−EGFとEGFRとの結合活性を負に制御することが報告されているので(J.Biol.Chem.,279(45):47335−43(2004))、該ドメインにおける欠失、挿入、置換もまた、HB−EGFの活性を保持または増強し得る。
本発明のHB−EGFは、好ましくは、配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するヒトHB−EGF(GenBankアクセッション番号:NP_001936)、あるいは他の温血動物におけるそのオルソログ[例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NP_034545、NP_037077、XP_601210、NP_999464、AAD52998およびNP_990180として登録されているマウス、ラット、ウシ、ブタ、チャイニーズハムスターおよびニワトリオルソログ(それぞれヒトHB−EGFに対して約81%、約82%、約73%、約91%、約86%および約73%の同一性を有する)等]である。
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)で記載される。配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明のHB−EGFは、C末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO)、アミド(−CONH)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル,エチル,n−プロピル,イソプロピル,n−ブチルなどのC1−6アルキル基、例えば、シクロペンチル,シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基、例えば、フェニル,α−ナフチルなどのC6−12アリール基、例えば、ベンジル,フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基、α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のHB−EGFがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のHB−EGFには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基,アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など)で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
HB−EGFの部分ペプチドは、上記したHB−EGFの部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つHB−EGFと実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はHB−EGFの場合と同様に行なうことができる。
具体的には、HB−EGF部分ペプチドとして、例えば、配列番号:2に示されるアミノ酸配列のうち、受容体であるEGFRとの結合に関わるEGF様ドメイン(上述)を含む部分アミノ酸配列、可溶性HB−EGF(配列番号:2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号63〜148で示されるアミノ酸配列からなる)を含む部分アミノ酸配列、あるいはさらに細胞内ドメイン(および膜近傍/膜貫通ドメイン)(配列番号:2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号63〜208で示されるアミノ酸配列からなる)を有するものなどが用いられる。
好ましくは、HB−EGF部分ペプチドとして、40個以上のアミノ酸、より好ましくは80個以上のアミノ酸、さらに好ましくは140個以上のアミノ酸を有するペプチドなどが用いられる。
また、HB−EGF部分ペプチドはC末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO)、アミド(−CONH)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、HB−EGFについて前記したと同様のものが挙げられる。HB−EGF部分ペプチドがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものもHB−EGF部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、C末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、HB−EGF部分ペプチドには、上記したHB−EGFと同様に、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
HB−EGFまたはその部ペプチドの塩としては、酸(例:無機酸、有機酸)や塩基(例:アルカリ金属)との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。
HB−EGFまたはその塩は、前述した温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ(必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製し)、該画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことによりHB−EGFまたはその塩を調製することができる。HB−EGF部分ペプチドとして可溶性HB−EGFを調製する場合は、温血動物の組織または細胞を適当な培地中で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により細胞を除去して得られる培養上清を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより得ることができる。
HB−EGFもしくはその部分ペプチドまたはその塩(以下、「HB−EGF類」と総称する場合がある)は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。HB−EGF類を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法に従って行われる。
(1)M.Bodanszky and M.A.Ondetti,Peptide Synthesis,Interscience Publishers,New York(1966)
(2)Schroeder and Luebke,The Peptide,Academic Press,New York(1965)
(3)泉屋信夫ら、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)(1975)
(4)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座1、蛋白質の化学IV 205(1977)
(5)木曽良明および大▲たか▼章、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店(1991)
このようにして得られた蛋白質(ペプチド)は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質(ペプチド)が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に蛋白質(ペプチド)が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
HB−EGF類の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質(ペプチド)の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質(ペプチド)またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤(例えば、HOBt、HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N−ジメチルホルムアミド,N,N−ジメチルアセトアミド,N−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン,クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類、ジオキサン,テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル,プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル,酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Z、Br−Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、アラルキルエステル化(例えば、ベンジルエステル、4−ニトロベンジルエステル、4−メトキシベンジルエステル、4−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl−Bzl、2−ニトロベンジル、Br−Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
保護基の除去(脱離)方法としては、例えば、Pd−黒あるいはPd−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−20℃〜40℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジチオール、1,2−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル[アルコール(例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5−トリクロロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N−ヒドロキシスクシミド、N−ヒドロキシフタルイミド、HOBt)とのエステル]などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
蛋白質(ペプチド)のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質(ペプチド)とC末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質(ペプチド)とを製造し、この両蛋白質(ペプチド)を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質(保護ペプチド)を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質(粗ペプチド)を得ることができる。この粗蛋白質(粗ペプチド)は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質(ペプチド)のアミド体を得ることができる。
蛋白質(ペプチド)のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記蛋白質(ペプチド)のアミド体の場合と同様にして得ることができる。
HB−EGF部分ペプチドまたはその塩は、HB−EGFまたはその塩を適当なペプチダーゼ(例えば、ADAM9、ADAM12等)で切断することによっても製造することができる。
さらに、HB−EGF類は、HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からHB−EGF類を分離精製することによって製造することもできる。HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖(即ち、コード鎖)であっても、アンチセンス鎖(即ち、非コード鎖)であってもよい。
HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードするDNAとしては、ゲノムDNA、ヒトもしくは他の温血動物(例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリなど)の細胞[例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例:マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など]またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官[例えば、脳、脳の各部位(例:嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例:大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織(例:褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋など]由来のcDNA(cRNA)、合成DNA(RNA)などが挙げられる。HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction(以下、「PCR法」と略称する)およびReverse Transcriptase−PCR(以下、「RT−PCR法」と略称する)によって直接増幅することもできる。あるいは、HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
HB−EGFをコードする核酸としては、例えば、配列番号:1で表される塩基配列(但し、該核酸がRNAの場合、該塩基配列中の「t」は「u」と読み替える)を含有する核酸、または配列番号:1で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含有し、前記したHB−EGFと実質的に同質の活性[例:EGFRへの結合活性、肝保護(肝障害抑制)作用、アポトーシス(肝細胞死)抑制作用、肝再生(肝細胞の分化および/または分裂)誘導作用など]を有する蛋白質をコードする核酸などが挙げられる。
配列番号:1で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸としては、例えば、配列番号:1で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning,2nd ed.(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ストリンジェントな条件としては、(1)洗浄に低イオン強度及び高温、例えば、50℃で0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%硫酸ドデシルナトリウムを使用し、(2)ホルムアミドのような変性剤、例えば、0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)とともに、50%(v/v)ホルムアミドを42℃で使用することを特徴とする反応条件が例示される。あるいは、ストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド、5xSSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロ燐酸ナトリウム、5xデンハート溶液、超音波処理鮭精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%硫酸デキストランを42℃で使用し、0.2xSSC及び50%ホルムアルデヒドで55℃で洗浄し、続いて55℃でEDTAを含有する0.1xSSCからなる高ストリンジェント洗浄を行うものであってもよい。当業者は、プローブ長等のファクターに応じて、ハイブリダイゼーション反応および/または洗浄時の温度、緩衝液のイオン強度等を適宜調節することにより、容易に所望のストリンジェンシーを実現することができる。
HB−EGFをコードする核酸は、好ましくは、配列番号:1で表される塩基配列で示されるヒトHB−EGFをコードする塩基配列を含有する核酸(GenBankアクセッション番号:NM_001945)、あるいは他の温血動物におけるそのオルソログ[例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号NM_010415、NM_012945、XM_601210、NM_214299、AF069753およびNM_204849として登録されているマウス、ラット、ウシ、ブタ、チャイニーズハムスターおよびニワトリオルソログ(それぞれヒトHB−EGF cDNAに対して約83%、約83%、約74%、約88%、約74%および約63%の同一性を有する)等]である。
HB−EGF部分ペプチドをコードする核酸は、配列番号:2に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、上記した細胞・組織由来のcDNA(cRNA)、合成DNA(RNA)のいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織より調製したmRNA画分を用いて直接RT−PCR法によって増幅することもできる。
具体的には、HB−EGF部分ペプチドをコードする核酸としては、例えば、(1)配列番号:1で表される塩基配列の部分塩基配列を有する核酸、または(2)配列番号:1で表される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、前記したHB−EGFと実質的に同質の活性[例:EGFRとの結合活性、肝保護(肝障害抑制)作用、アポトーシス(肝細胞死)抑制作用、肝再生(肝細胞の分化および/または分裂)誘導作用など]を有するペプチドをコードする核酸などが用いられる。
配列番号:1で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、該塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約85%以上の同一性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードするDNAは、該HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、HB−EGF蛋白質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning,2nd ed.(前述)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM−super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM−K(宝酒造(株))等を用いて、ODA−LA PCR法、Gappedduplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、HB−EGFをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例:pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、枯草菌由来のプラスミド(例:pUB110、pTP5、pC194)、酵母由来プラスミド(例:pSH19、pSH15)、昆虫細胞発現プラスミド(例:pFast−Bac)、動物細胞発現プラスミド(例:pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)、λファージなどのバクテリオファージ、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター(例:BmNPV、AcNPV)、レトロウイルス,ワクシニアウイルス,アデノウイルス,アデノ随伴ウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、サイトメガロウイルス(CMV)由来プロモーター(例:CMV前初期プロモーター)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来プロモーター(例:HIV LTR)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)由来プロモーター(例:RSV LTR)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)由来プロモーター(例:MMTVLTR)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)由来プロモーター(例:MoMLVLTR)、単純ヘルペスウイルス(HSV)由来プロモーター(例:HSVチミジンキナーゼ(TK)プロモーター)、SV40由来プロモーター(例:SV40初期プロモーター)、エプスタインバーウイルス(EBV)由来プロモーター、アデノ随伴ウイルス(AAV)由来プロモーター(例:AAV p5プロモーター)、アデノウイルス(AdV)由来プロモーター(Ad2またはAd5主要後期プロモーター)などが用いられる。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子[メソトレキセート(MTX)耐性]、アンピシリン耐性(Amp)遺伝子、ネオマイシン耐性(Neo)遺伝子(G418耐性)等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター(CHO−dhfr)細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列(シグナルコドン)を、HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoAシグナル配列、OmpAシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母である場合、MFαシグナル配列、SUC2シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、Escherichia coli K12、DH1、JM103、JA221、HB101、C600などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、Bacillus subtilis MI114、207−21などが用いられる。
酵母としては、例えば、Saccharomyces cerevisiae AH22、AH22R、NA87−11A、DKD−5D、20B−12、Schizosaccharomyces pombe NCYC1913、NCYC2036、Pichia pastoris KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N細胞;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCCCRL1711)、Sf21細胞(以上、Vaughn,J.L.et al.,In Vivo,13:213−217(1977))などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル由来細胞(例:COS−1、COS−7、CV−1、Vero)、ハムスター由来細胞(例:BHK、CHO、CHO−K1、CHO−dhfr)、マウス由来細胞(例:NIH3T3、L、L929、CTLL−2、AtT−20)、ラット由来細胞(例:H4IIE、PC−12、3Y1、NBT−II)、ヒト由来細胞(例:HEK293、A549、HeLa、HepG2、HL−60、Jurkat、U937)などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972)やGene,17:107(1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular and General Genetics,168:111(1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology,194:182−187(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:1929(1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology,6:47−55(1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール,263−267(1995)(秀潤社発行)、Virology,52:456(1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、HB−EGF類を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、HB−EGF類を培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX−100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい(界面活性剤を含む場合は、膜蛋白質やオルガネラ蛋白質の一部もしくは全部も同時に抽出され得る)。一方、膜画分からHB−EGF類を抽出する場合は、上記と同様に菌体あるいは細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して膜含有画分を沈澱させる(必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分、ミトコンドリア画分、核画分などを分離精製することもできる)などの方法が用いられる。また、HB−EGF類が菌体(細胞)外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、膜画分あるいは培養上清中に含まれるHB−EGF類の単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法;アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法;逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法;などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるHB−EGFまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するHB−EGF類を、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるHB−EGF類の存在は、それらに特異的な抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、HB−EGFまたはその部分ペプチドは、それをコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写/翻訳系を用いて、HB−EGFまたはその部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質転写/翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt,J.M.et al.,Transcription and Tranlation,Hames,B.D.and Higgins,S.J.eds.,IRL Press,Oxford 179−209(1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system(Promega社製)やRTS 500 Rapid Tranlation System(Roche社製)等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System(Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM(TOYOBO社製)等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston,F.B.et al.,Nature,179:160−161(1957)あるいはErickson,A.H.et al.,Meth.Enzymol.,96:38−50(1996)等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法(Pratt,J.M.et al.(1984)前述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム(Spirin,A.S.et al.,Science,242:1162−1164(1988))、透析法(木川ら、第21回日本分子生物学会、WID6)、あるいは重層法(PROTEIOSTM Wheat germ cell−free protein synthesis corekit取扱説明書:TOYOBO社製)等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法(特開2000−333673)等を用いることができる。
HB−EGFは、肝保護(肝障害抑制)作用、アポトーシス(肝細胞死)抑制作用、肝再生(肝細胞の分化および/または分裂)誘導作用などを示すので、HB−EGF類、あるいはHB−EGFまたはその部分ペプチドをコードする核酸は、肝保護剤、肝細胞のアポトーシス抑制剤、肝再生促進剤としての用途を有しており、肝障害、肝細胞死を伴う種々の疾患、例えば、急性肝障害(劇症肝炎、急性肝炎、薬剤性肝炎)、慢性肝炎、自己免疫性肝疾患(自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変)、ウイルス性肝炎(A−E型)、肝線維症、肝硬変、肝癌、アルコール性肝障害、薬剤性肝障害(中毒性薬剤性肝障害、アレルギー性薬剤性肝障害)、肝膿瘍、肝寄生虫症(日本住血吸虫症、肝吸虫症)、肝アミロイドーシス、ルポイド肝炎)等の肝疾患の予防・治療、あるいは肝切除術、肝移植後の肝再生の促進に使用することができる。
(1)HB−EGF類を含有する肝保護・肝再生促進剤
HB−EGF類を含有する肝保護・肝再生促進剤は、投与から数時間で効果を奏することにより、急性の肝疾患、特に炎症によって肝細胞死を伴う急性肝疾患に好適に用いることができる。しかしながら、後述するように、徐放性製剤の剤形をとったり、あるいは抗体とイムノコンジュゲートを形成させて安定性を向上させることにより、慢性肝炎、肝線維症、肝硬変など慢性的な疾患に伴う肝細胞の疲弊や細胞死を防止するための予防・進行抑制剤としても好ましく用いることができる。
HB−EGF類は原体のまま用いてもよいが、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、上記医薬として用いることもできる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤;液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、D−マンニトール、D−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、D−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン,ラウリル硫酸ナトリウム,ラウリルアミノプロピオン酸,レシチン,塩化ベンザルコニウム,塩化ベンゼトニウム,モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、例えばポリビニルアルコール,ポリビニルピロリドン,カルボキシメチルセルロースナトリウム,メチルセルロース,ヒドロキシメチルセルロース,ヒドロキシエチルセルロース,ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D−マンニトール、D−ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素(例:食用赤色2号および3号、食用黄色4号および5号、食用青色1号および2号などの食用色素)、水不溶性レーキ色素(例:前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など)、天然色素(例:β−カロチン、クロロフィル、ベンガラなど)などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。
前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤(ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む)、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤;および注射剤(例:皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など)、外用剤(例:経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など)、坐剤(例:直腸坐剤、膣坐剤など)、ペレット、点滴剤、徐放性製剤(例:徐放性マイクロカプセルなど)等の非経口剤が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の有効成分の含量は、剤形、有効成分の投与量などにより異なるが、例えば約0.1ないし100重量%である。
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤(例:乳糖、白糖、デンプン、D−マンニトールなど)、崩壊剤(例:カルボキシメチルセルロースカルシウムなど)、結合剤(例:α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなど)または滑沢剤(例:タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール6000など)などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングすることにより製造される。
該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる。
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる1種または2種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース,ヒドロキシプロピルメチルセルロース,ヒドロキシエチルセルロース,メチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース系高分子、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート,アミノアルキルメタアクリレートコポリマーE[オイドラギットE(商品名)、ロームファルマ社],ポリビニルピロリドンなどの合成高分子、プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース フタレート,ヒドロキシプロピルメチルセルロース アセテートサクシネート,カルボキシメチルエチルセルロース,酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子、メタアクリル酸コポリマーL[オイドラギットL(商品名)、ロームファルマ社],メタアクリル酸コポリマーLD[オイドラギットL−30D55(商品名)、ロームファルマ社],メタアクリル酸コポリマーS[オイドラギットS(商品名)、ロームファルマ社]などのアクリル酸系高分子、セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばエチルセルロースなどのセルロース系高分子、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーRS[オイドラギットRS(商品名)、ロームファルマ社],アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液[オイドラギットNE(商品名)、ロームファルマ社]などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、その2種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい。
非経口的な投与(例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など)に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。投与方法が標的部位付近への局所注入の場合、注射液剤が好ましい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。プルーロニックゲルは体温でゲル化し、それ以下の低温では液体であることから、HB−EGF類をプルーロニックゲルとともに局所注入して標的組織周辺でゲル化させることにより、長期持続性とすることができる。当該蛋白質製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、HB−EGF類並びに薬理学的に許容し得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
肝細胞表面分子に対する抗体は、肝細胞に薬剤を特異的に送達することができるので、HB−EGF類を該抗体に架橋したイムノコンジュゲートとすることにより、HB−EGF類の血中安定性と肝細胞表面への送達効率を改善することができる。肝細胞表面分子としては、EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4などが挙げられるが、それらに限定されない。抗EGFR抗体を用いる場合には、EGFRからのシグナル伝達を阻害しないように、非中和抗体をターゲッティング用抗体として用いることが望ましい。
肝細胞表面分子に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。該抗体は周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子であっても、フラグメントであってもよい。フラグメントは、肝細胞表面分子に対する抗原結合部位(CDR)を有する限りいかなるものであってもよく、例えば、Fab、F(ab’)、ScFv、minibody等が挙げられる。
モノクローナル抗体は、細胞融合法(例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、2−14、サイエンスフォーラム出版、(1985))により作成することができる。例えば、マウスに標的蛋白質(必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH(eyhole impet emocyanin)等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる)を抗原として、市販のアジュバントと共に2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞(例えば、NS−1、P3X63Ag8など)を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はPEG法[J.Immunol.Methods,81(2):223−228(1985)]でも電圧パルス法[Hybridoma,7(6):627−633(1988)]であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
しかしながら、ヒトへの投与を考慮すると、該抗体は、ヒトと他の動物(例えば、マウス等)のキメラ抗体であることが好ましく、ヒト化抗体であることがさらに好ましく、完全ヒト抗体であることが最も好ましい。ここで「キメラ抗体」とは免疫動物由来の可変部(V領域)とヒト由来の定常部(C領域)を有する抗体をいい、「ヒト化抗体」とはCDRを除いて他の領域をすべてヒト抗体に置き換えた抗体をいいう。キメラ抗体やヒト化抗体は、例えば、上記と同様の方法により作製したマウスモノクローナル抗体の遺伝子からV領域もしくはCDRをコードする配列を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体のC領域をコードするDNAと融合したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、これを適当な宿主細胞に導入して該キメラ遺伝子を発現させることにより取得することができる。また、完全ヒト抗体は、公知のファージディスプレイライブラリーを用いて、あるいはメダレックス社が開発したヒト抗体産生マウスやメダレックス社とキリンが共同で開発したKMマウスを用いて取得することができる。
肝細胞表面分子に対する抗体とHB−EGF類との架橋法としては、Adv.Drug Deliv.Rev.,53:171−216(2001)に記載の方法が挙げられるが、それらに限定されない。
上記のような剤形に設計されたHB−EGF類を含有する肝保護・肝再生促進剤は、適当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的又は非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等が挙げられる。
HB−EGF類を含有する肝保護・肝再生促進剤の投与量は、有効成分の分子量、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0.05〜約10mg/kg、好ましくは約0.1〜約5mg/kgの範囲であり、これを1回もしくは数回に分けて投与することができる。
(2)HB−EGF類をコードする核酸を含有する肝保護・肝再生促進剤
HB−EGF類をコードする核酸は、長期の遺伝子発現により長期間HB−EGF類を産生し得るので、持続的な治療効果が期待できる。そのため、急性の肝疾患の予防・治療効果に加えて、慢性肝炎、肝線維症、肝硬変などの慢性的な肝疾患に伴う肝細胞の疲弊や細胞死を防止するための予防・進行抑制剤としても好ましく用いることができる。
HB−EGF類をコードする核酸は、適当な発現ベクター上に担持された形態で投与されることが好ましい。当該発現ベクターは、HB−EGF類をコードする核酸が投与対象である哺乳動物の標的細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されているか、あるいは投与された動物の標的細胞内で、一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置される。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の標的細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)由来プロモーター(例:CMV前初期プロモーター)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来プロモーター(例:HIV LTR)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)由来プロモーター(例:RSV LTR)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)由来プロモーター(例:MMTVLTR)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)由来プロモーター(例:MoMLVLTR)、単純ヘルペスウイルス(HSV)由来プロモーター(例:HSVチミジンキナーゼ(TK)プロモーター)、SV40由来プロモーター(例:SV40初期プロモーター)、エプスタインバーウイルス(EBV)由来プロモーター、アデノ随伴ウイルス(AAV)由来プロモーター(例:AAV p5プロモーター)、アデノウイルス(AdV)由来プロモーター(Ad2またはAd5主要後期プロモーター)等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。「一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置される」とは、例えば、以下でさらに詳述するように、プロモーターとHB−EGF類をコードする核酸が、該プロモーターからの該核酸の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される2つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有し、該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼの存在下に該スペーサー配列が切り出されて、HB−EGF類をコードする核酸がプロモーターに機能的に連結されるように配置されることをいう。
該発現ベクターは、好ましくはHB−EGF類をコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子(テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等)をさらに含有することもできる。発現ベクターが上述のようにリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスペーサー配列を有する場合、該選択マーカー遺伝子は当該スペーサー配列内に配置することもできる。
本発明の発現ベクターに使用されるベクターは特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能であり、導入遺伝子の宿主染色体への組込みが極めて稀である等の利点を有する。特に、パッケージングシグナル(ψ)以外のアデノウイルスゲノムのほぼ全長を導入遺伝子に置換したgutted(gutless)ベクターと呼ばれる次世代ベクターの開発によって、第一世代ベクターにおける免疫原性の問題が解消され、また、それに伴い導入遺伝子発現の長期持続性が実現されたことにより、遺伝子治療におけるアデノウイルスの有用性はさらに増している。同様に、アデノ随伴ウイルスも、比較的遺伝子導入効率が高く、肝細胞を含む非分裂細胞にも導入可能で、動物実験で生体内投与により導入遺伝子の発現が長期にわたって持続することが知られているので、本発明におけるウイルスベクターとして好ましい。
HB−EGF類の構成的且つ過剰な発現は、当該遺伝子を導入された動物において副作用を引き起こす場合も考えられる。従って、本発明の好ましい態様においては、発現ベクターは、不要な時期及び/又は不要な部位でのHB−EGF類の過剰発現による悪影響を防ぐために、HB−EGF類を時期特異的及び/又は標的細胞特異的に発現させることができる。このようなベクターの第一の実施態様としては、投与対象となる動物の標的細胞(本発明においては、好ましくは肝細胞であるが、可溶性HB−EGFを放出して肝臓に送達し得る細胞であれば特に制限はない)において、特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターに機能的に連結したHB−EGF類をコードする核酸を含むベクターが挙げられる。例えば、肝臓特異的プロモーターとしては、血清アルブミンプロモーター、チトクロームP−450プロモーターまたは肝臓特異的転写因子(HNF1、HNF3、HNF4、C/EBP等)結合シスエレメントを含むプロモーターなどが挙げられる。
本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターの第二の実施態様として、外因性の物質によってトランスに発現が制御される誘導プロモーターに機能的に連結したHB−EGF類をコードする核酸を含むベクターが挙げられる。誘導プロモーターとして、例えば、メタロチオネイン−1遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に標的細胞の位置に局所投与することにより、任意の時期に標的細胞特異的にHB−EGF類の発現を誘導することができる。
本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターの別の好ましい態様は、プロモーターとHB−EGF類をコードする核酸とが、該プロモーターからの該核酸の発現を妨げるのに十分な長さを有するスペーサー配列により隔てられた、同方向に配置される2つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有するベクターである。該ベクターが標的細胞内に導入されただけではプロモーターはHB−EGF類をコードする核酸の転写を指示することができない。しかしながら、所望の時期に標的細胞に該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼを局所投与するか、あるいは該リコンビナーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを局所投与して該リコンビナーゼを標的細胞で発現させると、該認識配列間で該リコンビナーゼを介した相同組換えが起こり、その結果、該スペーサー配列が切り出され、HB−EGF類をコードする核酸がプロモーターに機能的に連結されて、所望の時期に標的細胞特異的にHB−EGF類が発現される。
上記ベクターに使用されるリコンビナーゼ認識配列は、投与対象に内在のリコンビナーゼによる組換えを防ぐために、内在のリコンビナーゼによっては認識されない異種リコンビナーゼ認識配列であることが望ましい。したがって、該ベクターにトランスに作用するリコンビナーゼもまた異種リコンビナーゼであることが望ましい。このような異種リコンビナーゼと該リコンビナーゼ認識配列の組み合わせとしては、大腸菌のバクテリオファージP1由来のCreリコンビナーゼとlox P配列、あるいは酵母由来のFlpリコンビナーゼとfrt配列が好ましく例示されるが、それらに限定されるものではない。
リコンビナーゼ/リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用した本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターのプロモーターとしては、所望の時期及び部位での発現を確実にするために、好ましくはウイルス由来プロモーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターが使用される。
HB−EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターの作成は、従来の遺伝子工学技術、細胞培養技術、ウイルス作成技術を利用して行うことができる[例えば、Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel et al.eds.(1994)John Wiley & Sons,Inc.;Molecular Cloning(A Laboratory Manual),3rd ed.Volumes 1−3,Josseph Sambrook & David W.Russeleds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,New York)(2001);Culture of Animal Cells;A Manual of Basic Technique,R.Freshney eds.,2nd ed.(1987),Wiley−Liss;Frank L.Graham,Manipulation of adenovirus vector,Chapter 11.p109−p128;E.J.Murray eds.,Methods in Molecular Biology,Vol.7,Gene Transfer and Expression Protocols(1991);Chen,S−H.et al.,Combination gene therapy for liver metastases of colon carcinoma in vivo.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92,2477−2581等]。
また、HB−EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターとして非ウイルスベクターを使用する場合、該発現ベクターの導入は、ポリL−リジン−核酸複合体などの高分子キャリアーを用いるか、リポソームに被包して行うことができる。リポソームはリン脂質からなる数10〜数100nmの粒径のカプセルで、その内部にHB−EGFをコードするプラスミド等のベクターを封入できる。あるいは、パーティクルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。
リコンビナーゼ/リコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用したベクターの使用において、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ自体を局所投与する場合、例えば、リコンビナーゼを適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁して標的部位に注入すればよい。一方、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ発現ベクターを標的部位に局所投与する場合、該リコンビナーゼ発現ベクターは、リコンビナーゼをコードする核酸が、投与対象の標的細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結した発現カセットを有するものであれば特に制限されない。使用されるプロモーターが構成プロモーターである場合、不要な時期におけるリコンビナーゼの発現を防ぐために、標的部位に投与されるベクターは、例えばアデノウイルスのように、宿主細胞の染色体への組込みが稀なものであることが望ましい。リコンビナーゼを所望の時期に発現させる別のアプローチとして、メタロチオネイン遺伝子プロモーターのような誘導プロモーターの使用が挙げられる。この場合、レトロウイルス等のインテグレーション効率の高いウイルスベクターの使用が可能となる。
HB−EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターは、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して注射剤などの種々の製剤形態とした後に、上記医薬として用いることもできる。ここで薬理学的に許容し得る担体としては、HB−EGF類を含有する製剤について上記したものが同様に例示されるが、それらに限定されない。
HB−EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する肝保護・肝再生促進剤の投与は、治療対象動物自身の標的細胞(あるいは治療対象動物と同種異形もしくは異種の動物における細胞)を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻す(あるいは移植する)ex vivo法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うin vivo法のいずれかで行われる。ex vivo法の場合、標的細胞へのベクターの導入は、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法等により行うことができる。また、in vivo法の場合、該製剤の投与は、例えば、注射、カテーテル、バルーンカテーテルなどにより行うことができる。
HB−EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する本発明の肝保護・肝再生促進剤の投与量は、ベクターの種類、有効成分分子の大きさ、プロモーター活性、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、例えば、ウイルスベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、従来の肝疾患への遺伝子治療の臨床試験において、ウイルス粒子(particle)で2×1011particles/kg(総量で1.5×1013粒子)を用いて安全性が確認されているため、同量が投与の目安となる。例えば、成人1回あたり約2×10〜約2×1011particles/kg、好ましくは約2×1010〜約2×1011particles/kgである。ただし、実際にHB−EGFを投与する場合に、先天性疾患では無いため、全部の肝細胞にHB−EGF遺伝子を導入する必要は無く、実際にはこれ以下の量で十分だと考えられる。一方、非ウイルスベクターをリポソームに被包して用いる場合には、体重約4kgのカニクイザルを用いた臨床研究では666μgのDNAを静脈投与して安全性が確認されているため同量が目安となる。例えば成人1回投与量は約2〜約10mgで、好ましくは約5〜約8mgである。
また、本発明は、内因性のHB−EGF遺伝子の発現・HB−EGFの活性を増強することによる肝保護・肝再生促進、ひいては肝疾患の予防・治療をも意図する。内因性のHB−EGF遺伝子の発現を増強する手段としては、例えば、HB−EGF遺伝子の調節領域に結合してその転写を活性化させるトランス活性化因子、HB−EGF mRNAを安定化する物質、HB−EGF mRNAからの翻訳効率を増大させる物質の投与などが、また、内因性のHB−EGFの活性を増強する手段としては、例えば、pro−HB−EGFから活性型の可溶性HB−EGFの生成を促進する物質(例えば、ADAMなどのsheddingに関与する特異的プロテアーゼ等)、HB−EGFの分解を抑制する物質(例えば、プロテアーゼ阻害剤等)の投与などが、それぞれ挙げられる。
従って、別の本発明は、内因性のHB−EGF遺伝子の発現・HB−EGFの活性を増強し得る上記物質を選択することによる、肝保護・肝再生促進物質のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、HB−EGFを生来的に発現する細胞を被験物質の存在下及び非存在下で培養し、HB−EGFの発現量及び/又は活性を比較することを特徴とする。HB−EGFの発現量は、ノーザンブロットやRT−PCRを用いて転写レベルで、あるいは抗HB−EGF抗体等を用いたイムノアッセイにより翻訳レベルで検定することができる。一方、HB−EGFの活性は肝細胞等の細胞における増殖促進活性を調べたり、HB−EGFの標的受容体であるEGFRファミリーの活性化(受容体のリン酸化等)やその下流で、活性化されるMAPKなどのキナーゼ分子の活性化を指標に検定することができる。
このようにして選択された内因性のHB−EGF遺伝子の発現・HB−EGFの活性を増強し得る上記物質は、例えば、HB−EGF類を含有する肝保護・肝再生促進剤について上記したと同様の、薬理学的に許容し得る担体ととも医薬組成物とした後に、肝保護・肝再生促進剤として、ヒトなどの哺乳動物に経口的もしくは非経口的に投与することができる。
該物質を含有する肝保護・肝再生促進剤の投与量は、有効成分の種類・分子量、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0.001〜約100mg/kg、好ましくは約1〜約10mg/kgの範囲であり、これを1回もしくは数回に分けて投与することができる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
Gly :グリシン
Ala :アラニン
Val :バリン
Leu :ロイシン
Ile :イソロイシン
Ser :セリン
Thr :スレオニン
Cys :システイン
Met :メチオニン
Glu :グルタミン酸
Asp :アスパラギン酸
Lys :リジン
Arg :アルギニン
His :ヒスチジン
Phe :フェニルアラニン
Tyr :チロシン
Trp :トリプトファン
Pro :プロリン
Asn :アスパラギン
Gln :グルタミン
pGlu :ピログルタミン酸
Me :メチル基
Et :エチル基
Bu :ブチル基
Ph :フェニル基
TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Tos :p−トルエンスルフォニル
CHO :ホルミル
Bzl :ベンジル
ClBzl :2,6−ジクロロベンジル
Bom :ベンジルオキシメチル
Z :ベンジルオキシカルボニル
Cl−Z :2−クロロベンジルオキシカルボニル
Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニル
Boc :t−ブトキシカルボニル
DNP :ジニトロフェノール
Trt :トリチル
Bum :−ブトキシメチル
Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt :3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン
HONB :1−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド
DCC :N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、実施例中のプラスミド、DNA、各種酵素、大腸菌、培養細胞など取り扱う遺伝子工学技術や細胞培養技術は、特に断らない限り上記のCurrent Protocols in Nolecular Biology,F.Ausubel et al.eds.(1994)John Wiley & Sons,Inc.;Molecular Cloning(A Laboratory Manual),3rd ed.Volume 1−3,Josseph Sambrook & David W.Russel eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,New York)(2001);Culture of Animal Cells;A Manual of Basic Technique,R.Freshney eds.,2nd ed.(1987)Wiley−Lissに記載の方法に準じて行った。また、特に断りがない限り、アデノウイルスの一般的な取り扱いに関しては、上記のFrank L.Graham,Manipulation of adenovirus vector,Chapter 11,p109−p128;E.J.Murray eds.,Methods in Molecular Biology,Vol.7:Gene Transfer and Expression Protocols(1991);Chen,S−H.et al.,Combination gene therapy for liver metastases of colon carcinoma in vivo.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92,2477−2581に記載の方法に準じて行った。また、治療効果や現象に関しては、いずれかの群間での有意差を先ずAnova検定で解析し、続いて各二群間の個々の有意差の検定はStudent t−test(二群間非対称t検定)で解析した。また、生存率の有意差の解析には、Kaplan−Meier検定を用いて解析した。
実施例1 アデノウイルスベクターの構築
後記の実験例で用いるアデノウイルスベクターは、以下のように作成した。
プラスミドpADL.1/RSV(B.Fang et al.,Gene Therapy(1994)1,247−254)は、上流よりヒト5型アデノウイルスの3’側から0−455塩基部分、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、マルチクローニングサイト、ウシ成長ホルモンのpoly Aシグナル配列、及びヒト5型アデノウイルスの3’側から3328−5788塩基部分を、pBR322プラスミドに組み込んで作成されたプラスミドでShu−Hsia Chen氏(Mount Sinai大)より供与を受けた。このpADL.1/RSVプラスミドを制限酵素Hind III及びNot Iで消化し、精製したものをライゲーションに用いるベクターとした。一方、プラスミドpRc/CMV(インビトロジェン社)中にヒトHB−EGFのORF全長のcDNAを含むプラスミドpRcHBEGFは、目加田英輔氏(大阪大学 微生物病研究所)より供与を受けた。pRcHBEGFプラスミドを制限酵素Hind III及びNot Iで消化してHB−EGF cDNAの全長を切り出し、これをアガロースゲル電気泳動して、目的のDNA断片をゲルから回収し、精製したものをライゲーションに用いるインサートとした。このように処理されたpADL.1/RSVベクターとHB−EGF cDNAインサートとを、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションさせ、pADL.1/RSV−HB−EGFを得た。更に、ヒト5型アデノウイルスのE1領域以外の遺伝子を含むプラスミドpJM17(Micorobix Biosystems Inc.)と共に、pADL.1/RSV−HB−EGFを293細胞にリン酸カルシウム法で共導入した。これにより、相同組換えを起こして正しい目的のアデノウイルスが出来たプラークが共導入10−14日後に出現した。このプラークを回収し、目的のHB−EGFを発現する正しい非増殖型組み換えアデノウイルスAd.HB−EGFであることを、抗HB−EGF抗体(M−18:sc−1414、SANTA CRUZ社)を用いた免疫染色などで確認した後、Ad.HB−EGFを293細胞でウイルス増幅し、塩化セシウムの密度勾配遠心法によって濃縮した。濃縮したウイルスはエコノパック10DG脱塩カラム(バイオラッドCat番号732−2011)にて精製、PBS(−)にて溶出し、グリセロールを加えて、液体窒素にて凍結後、−80℃にて保存した。ウイルス使用時には粒子用量計算後、投与容量が100μl/匹となるようにPBS(−)によって希釈して投与した。
また、遺伝子導入確認に用いる大腸菌のLacZ遺伝子を発現する組換えアデノウイルスのAD.LacZは上記と同じ方法で作成したが、Ad.LacZの作成法の詳細はProc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92,2577−2581に記載されている。また、Ad.dE1.3は、HB−EGFが組み込まれていないために、これらの遺伝子を何ら発現しない組換えアデノウイルスである。Ad.dE1.3はHB−EGFが挿入されていないpADL1/RSVとpJM17を前述のように293細胞に共導入して同様の方法と過程で作成した。なお、ヒトHB−EGF cDNAは、Higashiyama,S.et al.,Science 251:936−939(1991)に記載があり、Gene Bankのaccession番号はM60278(NM_001945と同一配列)である。
実験例1 アデノウイルスベクターによる肝臓への遺伝子導入の確認
実施例1で作製したアデノウイルスベクターAd.LacZおよびAd.HB−EGF(1×1011粒子)を、6週齢の雄性C57BL/6Jマウス(中部科学;各群10匹)に尾静脈注射した後、肝臓における外因性のLacZならびにHB−EGF発現を各々X−gal染色、免疫染色によって調べた。マウスをエーテルによって全身麻酔した後、開胸し、臓器(心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓)を採取した。採取後、臓器を二等分し、一方をコンパウンド(TissueTek OCT compound)によるOCT標本作成に供し、もう一方を10%ホルムアルデヒドによる固定後、パラフィン包埋標本とした。X−gal染色はOCT標本切片を0.2%ホルムアルデヒド/0.02%グルタルアルデヒド固定液により30分間固定後、X−gal染色溶液に浸し、37℃、24時間の反応により行った。免疫染色は4%パラホルムアルデヒドにて10分間固定し、10%スキムミルク(雪印)にて60分ブロッキングした。その後、一次抗体(抗ヒトHB−EGFヤギポリクローナル抗体、R&D Systems Inc.,Minneapolis,MNカタログ番号AF−259−NA)100倍希釈液(2μg/ml)を1時間反応させ、HB−EGFの可視化は抗ヤギAlexa568(MOLECULAR PROBES,Inc.,Eugene,ORカタログ番号A−11029)で標識して行った。核染色はHoechst33342(MOLECULAR PROBES,Inc.,Eugene,ORカタログ番号H−3570)1000倍希釈にて5分間行った。観察画像の記録は共焦点レーザー顕微鏡(Carl Zeiss製品番号LSM510)によって行った。Ad.dE1.3を尾静脈注射後、同様の処理を行った試料を染色されないネガティブコントロールとした、X−gal染色、免疫染色の結果を図1に示した。
図1に示すように、Ad.LacZを尾静脈注射したマウス肝臓の60〜90%の肝細胞において、X−gal染色が認められることから、アデノウイルスベクターの尾静脈注射によって、肝細胞へ効率良い遺伝子導入が可能となることが明らかとなった(図1A)。更に、Ad.HB−EGFを尾静脈注射したマウス肝臓では、主にHB−EGFの細胞膜における発現が認められ、生物活性を有する外来性のHB−EGFが膜結合型HB−EGFとして合成、あるいは更にプロセッシングされた可溶性HB−EGFが、肝細胞にオートクライン的に作用していることが明らかとなった(図1B)。
実験例2 Ad.HB−EGFによる血中肝臓逸脱酵素の上昇抑制効果
6週齢の雄性C57BL/6Jマウス(中部科学;各群10匹)に、一匹あたり4μgのFasアゴニスト抗体(抗マウスFasマウスモノクローナル抗体、クローン名、Jo−2、Becktone−Dickinson Bioscience,San Jose,CAカタログ番号554255)を尾静脈注射することによって、Fas刺激劇症肝炎モデルを作成した。劇症肝炎の防止・治療効果を検討するため、Fasアゴニスト抗体を尾静脈注射する72時間前に、予めアデノウイルスベクター(Ad.HB−EGF、Ad.HGF、Ad.LacZ、ならびにAd.dE1.3)を、一匹あたり1×1011粒子で尾静脈注射した。Fasアゴニスト抗体の尾静脈注射から24時間後、36時間後(アデノウイルス尾静脈注射から各々96、108時間後)に採血し、屠殺して臓器を採取した(実験スケジュールを図2Aに示す)。劇症肝炎の発症防止・治療の指標となる肝機能は、血中肝臓逸脱酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)ならびにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の測定によって評価した。測定は、自動臨床分析機器Hitachi 736(日立(株))を用いて常法に従って実施した。
採血後に血清ALTならびにASTレベルを測定した結果、図2Bおよび2Cに示されるように、アゴニストFas抗体の尾静脈注射から24時間後には、Ad.dE1.3投与群でALTならびにASTが各々、2240±450、1665±391 IU/Lと上昇したのに対して、Ad.HB−EGF投与群ではともに230 IU/L以下と、ALTならびにASTの上昇が抑制されていることが明らかとなった。更に、この血中肝臓逸脱酵素の上昇抑制効果において、HB−EGFは、これまで唯一強い劇症肝炎の防止・治療効果を示すことが知られているHGFと同等の効果を示すことが明らかとなった。また、抗体投与から36時間後には、Ad.dE1.3投与群でもALTならびにASTは500 IU/L以下に低下するが、Ad.HGF投与群はこれらと有意差が認められなかったのに対して、Ad.HB−EGF投与群では250 IU/L以下と、Ad.dE1.3投与群に対して有意に低いことが明らかとなった。以上の結果から、Ad.HB−EGFは劇症肝炎に伴う肝障害を抑制、軽減し、且つその効果はAd.HGFよりも強力であることが示された。
実験例3 Ad.HB−EGFによる肝細胞アポトーシス抑制効果
劇症肝炎の主な病態であるアポトーシスによる肝細胞死は、肝臓組織のHE染色ならびにTUNEL染色を行うことで評価した。アゴニスト抗体投与から24時間後、36時間後(アデノウイルス尾静脈注射から各々96、108時間後)におけるマウス肝臓のパラフィン包埋標本ならびにOCT標本より、各々切片を作成後、HE染色ならびにTUNEL染色した。
図3に示されるように、Ad.dE1.3投与群では24時間後、肝臓逸脱酵素の上昇(図2Bおよび2C)と相関した、好中球やマクロファージ浸潤を伴う典型的なアポトーシス形態を示す肝細胞が認められるのに対して、Ad.HB−EGF投与群では、Ad.HGF投与群と同様に肝細胞のアポトーシス形態は認められなかった。更に、36時間後には、Ad.dE1.3投与群で肝細胞アポトーシスの進行による肝組織の脱落が観察され、Ad.HGF投与群でも炎症が認められたのに対して、Ad.HB−EGFはほぼ完全に肝臓組織の障害が抑えられていた。
更に、肝細胞のアポトーシスを詳細に評価するためにTUNEL染色を行った結果、24、36時間後ともに、Ad.dE1.3投与群におけるTUNEL陽性肝細胞数に対して、Ad.HB−EGF投与群、Ad.HGF群では有意に陽性細胞数が少なく、Ad.HB−EGFならびにAd.HGF投与群では、劇症肝炎の本態である肝細胞のアポトーシスが抑制されていることが明らかとなった。
実験例4 Ad.HB−EGFによる肝再生促進効果
劇症肝炎の本質的な治療効果の指標となる肝再生は、抗Ki−67マウスモノクローナル抗体(クローン名、TEC−3、Dako Cytomation,Denmark)によって同定された増殖肝細胞の割合によって評価した。アゴニスト抗体投与から24時間後、36時間後(アデノウイルス尾静脈注射から各々96、108時間後)におけるマウス肝臓のパラフィン切片を用いて、抗Ki−67抗体による免疫染色を行った。
図5に示されるように、Ad.dE1.3投与群では24、36時間後とも、肝細胞の増殖を示すKi−67陽性細胞はほとんど検出されないのに対して、Ad.HB−EGF投与群では、Ad.HGF群と同様にKi−67陽性細胞の有意な増加が認められた。とりわけ、24時間後のAd.HB−EGF投与群におけるKi−67陽性細胞の割合は、これまで唯一の強力な劇症肝炎治療因子として報告されているHGFと比較しても約1.5倍高く、HB−EGFはHGFを凌ぐ劇症肝炎治療効果を有することが明らかとなった。
これらの結果は、Ad.HB−EGF投与後、肝臓で発現したHB−EGFが、劇症肝炎の本態である肝細胞アポトーシスを強力に抑制することによって、病態の発症や進展を防止し、肝再生、即ち残存肝細胞の増殖を促進させることによって、本質的な治癒を促すのに効果的であることを示すものである。従って、HB−EGFを用いる本発明の医薬は、肝障害(肝細胞死)を伴う他の任意の疾患についても広く適用し得るものである。
HB−EGFは強力な肝障害抑制、アポトーシス抑制および肝再生誘導作用を示すので、HB−EGFまたはそれをコードする核酸は、肝障害、肝細胞死を伴う各種疾患、特に劇症肝炎などの肝疾患の予防・治療薬として、極めて有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願2005−283085を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
[配列表]
Figure 2007037514
Figure 2007037514

Claims (12)

  1. ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子もしくはその部分ペプチドを含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤。
  2. 肝疾患予防・治療用である請求項1記載の剤。
  3. 肝疾患が、劇症肝炎または急性肝炎である請求項2記載の剤。
  4. 肝疾患が、慢性肝炎、自己免疫性肝疾患、ウイルス性肝炎、肝線維症、肝硬変、肝癌、アルコール性肝障害、薬剤性肝障害、肝膿瘍、肝寄生虫症、肝アミロイドーシスおよびルポイド肝炎からなる群より選択される、請求項2記載の剤。
  5. ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子もしくはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤。
  6. 核酸が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクター上に担持されている、請求項5記載の剤。
  7. 肝疾患予防・治療用である請求項5または6記載の剤。
  8. 肝疾患が、劇症肝炎または急性肝炎である請求項7記載の剤。
  9. 肝疾患が、慢性肝炎、自己免疫性肝疾患、ウイルス性肝炎、肝線維症、肝硬変、肝癌、アルコール性肝障害、薬剤性肝障害、肝膿瘍、肝寄生虫症、肝アミロイドーシスおよびルポイド肝炎からなる群より選択される、請求項7記載の剤。
  10. 動物から採取した細胞に、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子もしくはその部分ペプチドをコードする核酸を導入することを含む、肝保護および/または肝再生促進用細胞の製造方法。
  11. 核酸が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクター上に担持されている、請求項10記載の方法。
  12. 細胞が肝疾患予防・治療用である請求項10または11記載の方法。
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