WO2007037514A9 - ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子の新規医薬用途 - Google Patents

ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子の新規医薬用途

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Cin Khai Ngin
Tomoyuki Takahashi
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Ken-Ichiro Kosai
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    • C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmaceutical use of a heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (heparin-binding EGF-like growth factor; hereinafter abbreviated as “HB-EGF”) or a nucleic acid encoding the same.
  • HB-EGF heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor
  • liver disease Drugs currently used in clinical settings for liver disease are only symptomatic treatments, curative drugs that suppress liver damage (hepatocyte death) and induce liver regeneration-radical treatment not exist. Therefore, at present, the primary treatment strategy for acute hepatitis is rest and diet, and no drug has been demonstrated to be truly effective. In particular, various drugs and treatments are used for fulminant hepatitis, but the mortality rate is still close to 70%, which is far from effective treatments and treatments. Is the first choice.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • HB-EGF is a growth factor belonging to the EGF family that is also expressed in normal liver. First, it is synthesized as a membrane-bound precursor (proHB-EGF), and then it is expressed in the near-membrane domain. 2 ' ⁇ ''A biologically unique characteristic that soluble HB-EGF produced by cleavage by a different meta-proteinase has a mitogenic effect on many cell types. Have. HB-EGF is rapidly increased in the liver after partial hepatectomy and is also increased in chronic liver disease. From these facts, it has been speculated that HB-EGF may be one of the liver trophic factors as well as HGF.
  • HB-EGF HB-EGF
  • IC interstitial cystitis
  • APF growth inhibitory factor
  • W0 99/54706 chronic damage of fl urinary epithelium
  • HB-EGF has an effect on the treatment of hemorrhoid regeneration 'diabetes (Kozawa, J. et al.,. Pancreas, 31: 32-42 (2005)).
  • HB-EGF actually has a therapeutic effect on liver disease, that is, exogenous HB-EGF suppresses liver damage and / or induces liver regeneration.
  • HB-EGF is also known as a cardiac hypertrophic growth factor as well as HGF and insulin-like growth factor (IGF).
  • IGF insulin-like growth factor
  • HB-EGF does not necessarily act therapeutically on all organ disorders.
  • the object of the present invention is to identify a substance exhibiting a stronger liver damage suppression and liver regeneration-inducing action than HGF, and thus to provide a more useful novel preventive / therapeutic agent for liver disease (particularly fulminant hepatitis). It is.
  • the present inventors As a result of introducing and expressing an adenoviral vector containing DNA encoding HB-EGF in an animal model of fulminant hepatitis, the present inventors remarkably suppressed liver damage and apoptosis of hepatocytes. And found to induce liver regeneration. Surprisingly, the therapeutic effect of HB-EGF was stronger than that of HGF, the most promising therapeutic agent for liver diseases currently known. As a result of extensive research based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention provides a hepatoprotective and / or hepatic regeneration promoter comprising a nucleic acid encoding HB-EGF or a partial peptide thereof.
  • a hepatoprotective and / or hepatic regeneration promoter comprising a nucleic acid encoding HB-EGF or a partial peptide thereof.
  • the nucleic acid when the nucleic acid is inserted into a target cell and then introduced into a target cell, the nucleic acid is expressed in the cell to produce and release HB EGF or a partial peptide thereof. Inhibits liver death and induces liver regeneration.
  • the present invention also provides a hepatoprotective and / or hepatic regeneration promoter comprising HB-EGF or a partial peptide thereof.
  • the protein (or peptide) can be produced and used in large quantities using genetic recombination techniques, as will be described later.
  • the present invention provides a method for producing a cell for promoting liver protection and / or liver regeneration, which comprises introducing a nucleic acid encoding HB-EGF or a partial peptide thereof into a cell collected from an animal.
  • a method for producing a cell for promoting liver protection and / or liver regeneration comprises introducing a nucleic acid encoding HB-EGF or a partial peptide thereof into a cell collected from an animal.
  • HB-EGF has strong liver damage suppression, apoptosis suppression and liver regeneration induction action
  • administration of HB-EGF or its encoding nucleic acid prevents various diseases associated with liver damage and liver cell death.
  • ⁇ Has a therapeutic effect.
  • FIG. 1 shows that the target gene can be efficiently introduced into the liver and liver cells by tail vein injection of adenovirus vector.
  • Fig. 1A X-gal staining positive cells are observed in almost the entire liver tissue after Ad. LacZ is introduced.
  • FIG. 1B by introducing Ad. HB-EGF, HB-EGF expression is observed at the edge of the cell membrane.
  • FIG. 2 shows the effect of administration of Ad. HB-EGF,. Ad. HGF or Ad. DE l. 3 on blood liver deviation enzyme concentrations in fulminant hepatitis model mice.
  • Figure 2A shows the experimental schedule.
  • Fig. 2B shows serum ALT values
  • FIG. 2C shows serum AST values (white bars: 24 hours after antibody administration, black bars: 36 hours after antibody administration).
  • Figure 3 shows the effect of Ad. HB-EGF (middle), Ad, HGF (lower) or Ad. DEl.3 (upper) administration on liver tissue apoptosis in fulminant hepatitis model mice.
  • the left side shows the microscopic images of the liver tissue of each group of mice 24 hours after administration of the antibody and the right side after 36 hours. .
  • FIG. 4 shows the results of TUNEL staining in the liver of a fulminant hepatitis model mouse administered with Ad. HB-EGF, Ad. HGF, or Ad. DE l.
  • FIG. 4A shows from the left microscopic images of Ad. DE l.3, Ad. HB-EGF, Ad. HGF administration group mice (upper: 24 hours after antibody administration, lower: 36 hours after antibody administration).
  • Figure 4B is a graph quantifying TUNEL positive cells (white bars: 24 hours after antibody administration, black bars: 36 hours after antibody administration).
  • FIG. 5 shows the effect of Ad. HB-EGF, Ad. HGF, or Ad. DE l. 3 administration on liver regeneration in fulminant hepatitis model mice.
  • Fig. 5A Ad. DE l .3, Ad. HB-EGF Ad. From the left, Ki-67-stained image of the liver of mice administered with HGF (Upper: 24 hours after antibody administration, Lower: 36 hours after antibody administration) ) Respectively.
  • Fig. 5B is a graph quantifying Ki-67 positive cells (white bars: 24 hours after antibody administration, black bars: 36 hours after antibody administration).
  • HB-EGF used in the present invention is not particularly limited in its origin as long as it is a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • warm-blooded animal cells eg, rabbits, pigs, mice, rats, hamsters, monkeys, horses, hidges, goats, rabbits, guinea pigs, chickens, etc.
  • Splenocytes eg, rabbits, pigs, mice, rats, hamsters, monkeys, horses, hidges, goats, rabbits, guinea pigs, chickens, etc.
  • Splenocytes eg, rabbits, pigs, mice, rats, hamsters, monkeys, horses, hidges, goats, rabbits, guinea pigs, chickens, etc.
  • Splenocytes eg., rabbits, pigs, mice, rats, hamsters, monkeys, horses, hidges, goats
  • organs eg, brain, brain parts (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord pituitary, stomach, spleen, kidney, Liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle (skeletal muscle, smooth muscle), lung, gastrointestinal tract (eg large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, It may be a protein derived from the ureter, prostate, testicles, ovary, placenta, uterus, bones, joints, adipose tissue (eg brown adipose tissue, white adipose tissue), etc.
  • brain eg, brain parts (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, hypothal
  • E.g. chemically or cell-free protein synthesis system It may be a protein synthesized biochemically using Alternatively, it may be a recombinant protein produced from a transformant introduced with a nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • homology refers to two amino acids using a mathematical algorithm known in the art. Over alignment in an optimal alignment (preferably the algorithm may allow for the introduction of a gear into one or both of the sequences for optimal alignment). It means the ratio (%) of the same amino acid residue and similar amino acid residue to all amino acid residues to be wrapped.
  • Similar amino acids means amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids (Gln, Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), small side chains, amino acids (Gly, Ala, Ser, Amino acids that fall into the same group such as Thr, Met). Such substitution with similar amino acids is not expected to cause changes in protein phenotype (ie, conservative amino acid substitutions). Specific examples of conservative amino acid substitution are well known in the art and are described in various literature (see, for example, Bowie et al, 5ce? Ce, 247: 1306-1310 (1990)).
  • Other algorithms for determining amino acid sequence homology include, for example, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) Algorithm [the algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))], Needleman et al. , J. Mol.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • R is an amino acid sequence having about 80% or more, particularly preferably about 90% or more identity.
  • substantially the same quality examples include hepatoprotection (liver damage suppression) action, apoptosis (hepatocyte death) inhibitory action, liver regeneration (hepatocyte differentiation and / or division) induction action, etc. .
  • “Substantially the same quality” indicates that their activities are qualitatively identical (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, it is preferable that the activities such as hepatoprotective action, apoptosis-inhibiting action, and liver regeneration-inducing action are equivalent (for example, about 0.5 to about 2 times), but the amount of these activities and the molecular weight of the protein Target elements may be different.
  • Measurement of activities such as hepatoprotective action,-.
  • Apoptosis inhibitory action, liver regeneration-inducing action, etc. can be carried out according to a method known per se, for example, a liver tissue section as described in the Examples below.
  • Histopathological observations eg, hematoxylin-eosin (H-E) staining
  • TUNEL Atssey and immunohistochemical assays using proliferation markers such as Ki67 antigen as indices. It is not limited to these.
  • the HB-EGF of the present invention includes, for example, (1) 1 or 2 or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30] More preferably, about 1 to 10, particularly preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acid sequences deleted.
  • 1 or 2 or more [preferably, about 1-50, preferably about 1-30, more preferably about 1-10, particularly preferably 1-number (2, 3, 4 or 5) Amino acid sequences in which the amino acid is replaced with other amino acids, or (5) a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity of the protein is maintained.
  • the position of HB-EGF that affects the active life is, for example, the EGF-like domain involved in binding to the HB-EGF receptor EGFR (amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) (Regions indicated by numbers 105 to 148) and protease recognition cleavage sites in s hedd i ng, and so on.
  • Examples of insertion, deletion, and substitution positions include pro-sequence and intracellular domain of C-terminal. Can be mentioned.
  • heparin-binding domain main (region represented by amino acid numbers 93 to 105 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) has been reported to negatively regulate the binding activity between HB-EGF and EGFR (/. Biol. Chem., 279 (45): 47335-43 (2004).), Deletions, insertions and substitutions in the domain can also retain or enhance the activity of HB-EGF.
  • the ⁇ -EGF of the present invention is preferably human HB-EGF (GenBank accession number: NP-001936) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or its ortholog in other phlebotomized animals [ For example, the mouse, rat, and u registered in GenBan.k as the accession numbers NP—034545, NP—037077, XP—60 12 10, NP—999 464, AAD52998, and NP—990 180, respectively. Shi, pork, Chinese hamster and chicken triortholog (about 81%, about 82%, about 73%, about 91%, about 86% and about 73% of human HB-EGF, respectively. Etc.).
  • HB-EGF may be any of a carboxyl group (—C00H), a carboxylate (—C00—), an amide (_C0NH 2 ), or an ester (—C00R) at the C-terminus.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n -.. Propyl, isopropyl, (6 alkyl group such as n- heptyl, for example, C 3, such as cyclohexyl cyclopentyl, to consequent opening - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, alpha-Flip 6 such as naphthyl - 12 Ariru group, for example ,, benzyl, phenyl, such Fuenechi les - C 1 -2 alkyl group, such as alpha-naphthyl -C ⁇ alkyl group such as alpha-naphthylmethyl If C 7 _ 14 Ararukiru group, HB EGF Viva such Roy Ruo carboxymethyl group is used.
  • 'present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, amino de of the carboxyl group
  • those that are esterified are also included in the protein of the present invention, and examples of the ester in this case include the above-mentioned C-terminal ester. .
  • the HB-EGF of the present invention if example Amino group protecting groups (examples of Amino acid residues at the N-terminus, a formyl group,. Asechiru groups such as C 1 -6 Arukanoiru such in (such as 6 Ashiru group) Protected, N-terminal glutamine residue that can be cleaved in vivo is pyroglutamine oxidized, Substituents on the side chain of amino acids in the molecule (eg -0H, _SH, amino group, imidazole) Group, indole group, guanidino group, etc.) are protected with an appropriate protecting group (for example, C 6 acyl group such as alkanoyl group such as formyl group, acetyl group, etc.) Complex proteins such as proteins are also included.
  • Amino group protecting groups examples of Amino acid residues at the N-terminus, a formyl group,.
  • Asechiru groups such as C
  • the partial peptide of HB-EGF may be any peptide as long as it is a peptide having the above-mentioned partial amino acid sequence of HB-EGF and has substantially the same activity as HB-EGF.
  • “substantially the same quality of activity” has the same meaning as described above.
  • “substantially the same quality of activity” can be measured as in the case of HB-EGF.
  • HB-EGF partial peptide for example, among the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a partial amino acid sequence containing an EGF-like domain (described above) involved in binding to the receptor EGFR, Soluble HB-EGF (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) A partial amino acid sequence comprising the amino acid sequence shown in amino acid numbers 63 to 148), or a cell domain (and a membrane vicinity / transmembrane domain) (amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) such as those having a consisting of the amino acid sequence) represented by the incense No. 63-2 08 is used.
  • HB-EGF partial peptide a peptide having 40 or more amino acids, more preferably 80 or more amino acids, and even more preferably 140 or more amino acids is used.
  • the HB-EGF partial peptide may have a carboxy group (-C00H), carboxylate (-COP-), amide (_C0NH 2 ) or ester (-C00R) at the C-terminus.
  • R in the ester include the same as those described above for HB-EGF.
  • the HB-EGF partial peptide has a carboxyl group (or force alkoxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the HB-EGF partial peptide.
  • the ester in this case, for example, the same ester as the C-terminal ester is used.
  • the amino acid residue of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group
  • the glutamine residue at the N-terminal is pi-glutamic acid.
  • a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
  • Salts of HB-EGF or its partial peptides include physiologically acceptable salts with acids (eg, inorganic acids, 'organic acids) and bases (eg, alkali metals), especially physiologically acceptable.
  • the acid addition salts are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, oxalic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid).
  • HB-EGF or a salt thereof is known per se from the aforementioned warm-blooded animal cells or tissues. It can be produced by a protein purification method. Specifically, homogenize warm-blooded animal tissues or cells, remove cell debris by low-speed centrifugation, and then centrifuge the supernatant at high speed to precipitate the cell membrane-containing fraction (if necessary, density gradient centrifugation.
  • HB-EGF or its salt is prepared by subjecting this fraction to chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. be able to.
  • soluble HB-EGF as an HB-EGF partial peptide, cultivate warm-blooded animal tissue or cells in an appropriate medium * and then remove the cells by filtration or centrifugation.
  • the resulting culture supernatant can be obtained by subjecting it to chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like. .
  • HB-GF or a partial peptide thereof or a salt thereof can also be produced according to known peptide synthesis methods.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by removing the protecting group.
  • condensation or removal of the protecting group is carried out according to a method known per se, for example, the method described in the following (1) to (5).
  • the protein (peptide) thus obtained can be purified and isolated by known purification.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, a combination thereof, and the like. .
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely
  • (peptide) is obtained as a salt, it can be converted to a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto. ..
  • HB-EGFs For the synthesis of HB-EGFs, commercially available resins for protein synthesis can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydride resin. Droxymethyl methyl sulfamide amide resin, Polyamide acrylamide resin, 4- (2 ', 4'-Dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethyl resin Toxiphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin.
  • an ⁇ -amino group and an amino acid having an appropriately protected side chain functional group are condensed on the resin according to the sequence of the target protein (peptide) according to various known condensation methods.
  • proteins, etc. are cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and then a molecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein (peptide) or its amide. To do.
  • calpositimides are particularly preferable.
  • carbodiimides include DCC, ⁇ , ⁇ '-diisopropylcarbodiimide, ⁇ -ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopositimide, and the like.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, H0Bt, HOOBt), or a symmetric acid anhydride, HOBt ester or HOOBt ester is added. It can be added to the resin after the activation of the protected amino acid as tellurium.
  • Solvents used for the activation of protected amiso acids and condensation with resins may be selected from those known to be used in protein condensation reactions: I: For example, acid amides such as ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -dimethylacetamide, ⁇ -methyl pyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, black mouth form, etc.
  • Ananolols such as chloroethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitryl, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or These appropriate mixtures are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • the condensation reaction can be repeated without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole. .
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Examples of the protecting group of the starting amino group include 1, Boc, tertiary benzyloxycarboninole, isobornyl / reoxycarboninole, 4-methoxybenzige / leoxysikareponyl, Cl-Z, Br-Z, adamantinore Oxycanoleboni ⁇ /, Trifonoleoloa cetinole, Phuta roninore, Honoreminole, 2-nitrophenenolesnorefenenore, Difeninore phosphinochi oil, Fmoc, etc. are used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentinole, cyclohexenole, Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as cloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl), aralkyl esterification (eg benzyl ester.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentinole, cyclohexenole, Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as cloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl
  • aralkyl esterification eg benzyl ester.
  • the hydroxyl group of serine can be protected by, for example, esterification or etherification.
  • groups suitable for esterification include low-rank alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonino groups, and groups derived from carbonic acid such as ethoxycarbonyl groups. It is done.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydr.robilanyl group, and a t-butyl group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, .Br-Z, and tert-butyl.
  • protecting groups for histidine imidazole include Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, Penzinoreoxymethinole, Bum, Boc, Trt, Fmoc, etc. Is used. .
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoroethylene sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture of these, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Is also used.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • the activated carboxyl group of the raw material may be the corresponding acid anhydride, azide, activated ester [alkanol (eg, pentachloro: 7enol, 2,4,5-trichlorophenol) , 2,4-Gini trofenenole, Cyanmethino oleoreco 'Inore, ⁇ 0 lani trofenol, H0 B, N-hydroxy succinide, N-hydroxy phthalimide, HOBt) and the like] are used .
  • the corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • an amide form of a protein for example, first, the ⁇ -carboxyl group of the amino group at the strong hydroxyl group is amidated and protected, and then the peptide chain is made to the desired chain length on the amino group side. After extension, a protein (peptide) from which only the ⁇ -a and mino protecting groups at the ⁇ -terminal of the peptide chain are removed and a protein (peptide) from which only the protecting group at the C-terminal carboxyl group is removed are produced.
  • the two proteins (peptides) are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the protected protein (protected peptide) obtained by the condensation After purifying the protected protein (protected peptide) obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and the desired crude protein (crude peptide) can be obtained.
  • This crude protein (crude peptide) can be purified by using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide of the desired protein (peptide).
  • a protein (peptide) ester is obtained, for example, by condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then obtaining the same as the protein (peptide) amide. be able to.
  • ⁇ -EGF partial peptide or a salt thereof can also be produced by cleaving HB-EGF or a salt thereof with an appropriate peptidase (for example, ADAM9, ADAM12, etc.). wear. .
  • an appropriate peptidase for example, ADAM9, ADAM12, etc.
  • HB-EGFs can be obtained by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding HB-EGF or a partial peptide thereof, and separating and purifying HB-EGFs from the resulting culture.
  • the nucleic acid encoding HB-EGF or a partial peptide thereof may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded.
  • DNA encoding HB-EGF or a partial peptide thereof includes genomic DNA, humans or other warm-blooded animals (eg, monkeys, tusks, horses, pigs, hidges, goats, rabbits, mice, rats).
  • Cells eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glia cells, knee 0 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, 'epidermal cells, Epithelial cells, Goblet cells, Endothelial cells, Smooth.
  • Muscle cells Fibroblasts, Fibrocytes, Muscle cells, Fatty cysts, Immune cells (Example: Macrophages, T cells, B cells, Natural killer cells, Mast cells, Favor Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells or stromal cells, or precursor cells of these cells, Trunk Or cancer cells] or any tissue or organ in which those cells exist [eg, brain, brain regions (eg, olfactory bulb, amygdala, basal ganglia, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata) , Cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, knee, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large
  • genomic DNA and cDNA encoding HB-EGF or its partial peptide use the genomic DNA fraction prepared from the cells and tissues described above and the total RNA or tnRNA fraction as a cage, respectively.
  • n Direct amplification can also be performed by React ion (hereinafter abbreviated as “PCR method”) and Reverse Transcriptase_PCR (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”).
  • PCR method React ion
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase_PCR
  • genomic DNA and cDNA encoding HB-EGF or its partial peptide can be prepared by inserting genomic DNA and total RNA or mRNA fragments prepared from the above-mentioned cells' tissues into appropriate vectors.
  • Cloning can be performed from a single genomic DNA library and a single cDNA library by colony or plaque hybridization or PCR.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • nucleic acid encoding HB-EGF for example, a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (however, when the nucleic acid is RNA, “t” ′ is read as “”) Or a nucleotide sequence that can hybridize with a complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under the condition of a stringent condition, and substantially the same activity as the HB-EGF described above.
  • EGFR binding activity, liver protection (liver damage suppression) action, apoptosis (hepatocyte death) inhibition action, liver regeneration (hepatocyte differentiation and / or minute) induction action, etc. A nucleic acid etc. are mentioned.
  • the nucleic acid capable of hybridizing with the complementary strand sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions is, for example, about 60% or more, preferably about the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a nucleic acid containing a base sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, and particularly preferably about 90% or more is used.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Informat ion Local Identification Search Tool
  • the above-described algorithm for calculating homology of amino acid sequences is also preferably exemplified.
  • Hybridization is a method known per se or a method equivalent thereto, for example (i, Molecular Cloning, 2nd ed. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the high pre-crystallization can be performed preferably under highly stringent conditions.
  • the stringent conditions are as follows: (1) Low ionic strength and high temperature for washing, for example, 0.005 M sodium chloride / 0.0015 sodium citrate / 0.1% dodecyl sodium sulfate at 50 ° C (2) Denaturing agents such as formamide, for example, 0.1% ushi serum albumin / 0.1% Ficoll / 0.1% Polyvinylpyrrolidone / 750 mM sodium chloride, 75 mM 50m sodium phosphate buffer containing sodium citrate. (PH 6.5) and 42% 0% ( ⁇ / ⁇ ) formamide. The reaction conditions characterized by using in C are illustrated.
  • small linting conditions are: 50% honremamide, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% pyro Sodium phosphate, 5x Denhart solution; sonicated vats; sperm DNA (50 g / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate at 42 ° C, 0.2x SSC and 50% formaldehyde Wash at 55 ° C and then 55. It may be a highly stringent wash consisting of 0.1 x SSC containing EDTA at C. A person skilled in the art can easily adjust the hybridization reaction and / or the temperature during washing, the ionic strength of the buffer solution, etc. according to the factor of the probe length ⁇ to easily obtain the desired stringency. Can be realized.
  • the nucleic acid encoding HB-EGF is preferably a nucleic acid (GenBank accession number: NM-001945) containing a base sequence encoding human HB-EGF represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or its orthologs in other warm-blooded animals [eg, mice, rats, tusks, pigs, registered with GenBank as accession numbers ⁇ —010415, NM_012945, XM_601210, NM_214299, AF069753 and ⁇ —204849, respectively] Chinese hamster and duo triortholog (about 83%, about 83%, about 74%, about 88%, about 74% and about 63% of human HB-EGF cDNA, respectively) Etc.).
  • the nucleic acid encoding the HB-EGF partial peptide includes a nucleotide sequence that copies a peptide having an amino acid sequence identical or substantially identical to a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Anything can be used. Further, genomic DNA, cDNA (cRNA) derived from the cells / tissues described above, or synthetic DNA (RNA) may be used.
  • the vector used for the library may be any of batteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. It can also be directly amplified by RT-PCR using the mRNA fraction prepared from the cell tissue described above.
  • examples of the nucleic acid encoding the HB-EGF partial peptide include (1) a nucleic acid having a partial base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (2) SEQ ID NO: 1
  • a nucleic acid having a base sequence that is hybridized under stringent conditions, and having substantially the same quality of activity as HB-EGF described above [eg, binding activity to EGFR,
  • a nucleic acid encoding a peptide having a liver protective (liver damage suppression) action, apotosis (hepatocyte death) suppression production, liver regeneration (hepatocyte differentiation and / or division) induction action, etc. is used.
  • the DNA that can be hybridized with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions includes, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more with the base sequence.
  • a nucleic acid containing a base sequence having an identity of about 85% or more is preferably used.
  • DNA encoding HB-EGF or its partial peptide is amplified by PCR using a synthetic DM primer having a part of the base sequence encoding the HB-EGF or its partial peptide, or appropriate expression
  • the DNA incorporated into the vector can be cloned by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the HB-EGF protein or a labeled synthetic DNA.
  • Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecule Clarion, 2nd ed. (Supra).
  • the hybridization must be attached to the library. It can be performed according to the method described in the instruction manual. .
  • the DNA nucleotide sequence can be determined using known kits such as Mutan TM -super Expres s Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. Conversion can be carried out according to a method known per se such as the Gapped dup lexe method and the Kunkel method or a method analogous thereto. '
  • the cloned DNA can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker as required.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codons and translation stop codons can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • an expression vector containing a person who encodes HB-EGF or a partial peptide thereof is, for example, excised from the DNA encoding HB-EGF, and the DNA fragment is appropriately used. It can be produced by linking it downstream of the promoter. '.
  • Expression vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB 110, pTP5, pC194), and plasmids derived from yeast (eg, pSH19).
  • insect cell expression plasmids eg pFast-Bac
  • animal cell expression plasmids eg pAll, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo
  • Insect virus vectors such as Baccueriophage, Baculovirus (eg BmNPV, AcNPV), animal virus vectors such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus, etc. are used.
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • a cytomegalovirus (CMV) -derived promoter eg, CMV immediate early promoter
  • a human immunodeficiency virus (HIV) -derived promoter motor eg, HI V LTR
  • Raus sarcoma virus (RSV) promoter Eg RSV LTR
  • mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter eg MMTV LTR
  • Moroni mouse leukemia virus (MoMLV) promoter eg MoMLV LTR
  • HSV herpes simplex virus
  • HSV herpes simplex virus
  • trp promoter host is Esherihia genus, lac promoter, recA promoter, 1 P L promoter lpp promoter, T7 promoter 'is preferred.
  • SP01 promoter When the host is Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like are preferable.
  • PH05 promoter When the host is yeast, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter, etc. are preferred.
  • an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 origin of replication, etc. can be used as desired.
  • Selectable markers include, for example, 'dihydrofolate reductase (dhfr) gene [Mesotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance (Amp r ) gene, neomycin resistance (Neo gene (G418 resistance), etc.
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster (CH0-dhfr-) cells are used and the dhfr gene is used as a selection marker
  • the target gene can also be selected in a medium not containing thymidine.
  • the base sequence encoding the signal sequence suitable for the host is added to the 5 'end of the DNA encoding HB-EGF or its partial peptide. May be added.
  • the host is Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc.
  • the host is Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc.
  • the host is yeast
  • an insulin signal sequence, an a-interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, etc. are used for the MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, and the like.
  • hosts examples include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Escherichia genus for example, Escherichia zo K12, DH1, JM103,
  • JA221, HB.101, C600, etc. are used.
  • Bacillus bacteria examples include Bacillus subtil is MI 114, 207-21.
  • yeast For yeast, ⁇ Sacc aromyces cerevisiae AH22 AH22R ⁇ , NA87-11A, DKD-5D, 20B_12, Schizosaccharomyces po be CYC1913, NCYC2036, ⁇ Passion's KM71, etc.
  • Insect cells for example, in the case of the virus power SAcNPV, a larvae-derived strain of night stealing moss (Spodoptera frugi erda. Cell; Sf ⁇ ffl ⁇ ) Trichoplusia? High Five TM Hosotsuki sac from the eggs of ??, cells derived from Mamestra ⁇ asw'cae, cells derived from Estigmena acres, etc. are used.
  • the vinores are BmNPV
  • moth-derived cell lines otnbyx mori cells; BmN cells
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (above,. Vaughn, J. et al., In Vivo, 13: 213-217 (1977)).
  • insects examples include silkworm larvae.
  • animal cells examples include monkey-derived cells (eg, COS-1, COS-7, CV-1, Vero), hamster-derived cells (eg, BHK, CH0, CH0_K1, CH0-dhfr-), mice Visitor cells (eg NIH3T3, L929, CTLL-2, AtT-20), rat-derived cells (eg: ⁇ 4 ⁇ ⁇ , PC-12, 3Y1, NBT-11), human-derived cells (eg, HEK293, A549, HeLa, HepG2, HL-60, Jurkat, U937).
  • monkey-derived cells eg, COS-1, COS-7, CV-1, Vero
  • hamster-derived cells eg, BHK, CH0, CH0_K1, CH0-dhfr-
  • mice Visitor cells eg NIH3T3, L929, CTLL-2, AtT-20
  • rat-derived cells eg: ⁇ 4 ⁇ ⁇ , PC-12, 3Y1, NBT-11
  • human-derived cells
  • Transformation can be performed according to known methods according to the type of host. 'Escherichia can be transformed, for example, according to the method described in Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69: 21 10 (1972), Gene, 17: 107 (1982).
  • Nocchinoles can be transformed according to the method described in, for example, Molecular and General Genetics, 168: 1 1 1 (1979). ⁇ Yeast ⁇ For example, f, Methods in Enzymology, 194: 182—187 (1991), Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978). it can.
  • Insect cells and insects can be transformed according to the methods described in, for example, Bio / Technology, 6: 47-55 (1988).
  • Animal cells should be transformed according to the method described in, for example, Cell Engineering Annex 8 New Cell Engineering-Experimental Protocol, .263-267. (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52: 456 (1973). Can do.
  • HB-EGFs can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • HB-EGFs are extracted from cultured cells or cytoplasm of cells
  • the cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or
  • a method of suitably obtaining a soluble white matter crude extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by freeze-thawing or the like is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM (in the case of containing a surfactant, one of the membrane protein and the Galganella protein). Part or all can be extracted simultaneously).
  • Isolation and purification of HB-EGFs contained in the soluble fraction, membrane fraction or culture supernatant thus obtained can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include methods that utilize solubility, such as salting-out solvent precipitation; dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ; The method using the difference in charge such as ion exchange chromatography. The method utilizing the specific affinity such as affinity mouthmatography. The hydrophobicity such as reversed-phase high-speed liquid chromatography.
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and the protein or peptide Is obtained as a salt, the salt can be converted into a free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the HB-EGFs produced by the transformants can be modified arbitrarily or partially removed from the poly'peptide by allowing an appropriate protein-modifying enzyme to act before or after purification. it can.
  • an appropriate protein-modifying enzyme examples include trypsin, chymotoribsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • the presence of the HB-EGFs thus obtained can be confirmed by Western blotting or the like using an antibody specific to them.
  • HB-EGF or its partial peptide corresponds to the DNA that encodes it.
  • the RNA can also be synthesized by in vitro translation using a cell-free protein translation system consisting of rabbit reticulocyte lysate, comb embryo lysate, coliform lysate, etc., in the form of RNA.
  • a cell-free transcription / translation system further containing RNA polymerase can be used to synthesize DNA encoding HB-EGF or a partial peptide thereof as a saddle type.
  • the cell-free protein transcription / translation system can be a commercially available one, or a method known per se, specifically, the extract of Koji mold is Pratt, J..
  • Examples of commercially available cell lysates include E. coli S30 extract system (Promega) and RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche), which are derived from E. coli. Examples include t Reticulocyte Lysate System (Promega) and PR0 ⁇ EI0S TM (T0Y0B0). Of these, those using wheat germ lysate are preferred.
  • Johnston, F.-B. et al., Nature, 179 160—161 (1957) can be used to prepare wheat germ lysate.
  • Erickson, AH et al., Meth. Enzymol., 96 38-50 ( 1996) can be used.
  • HB-EGF has hepatoprotection (liver injury suppression) action, apoptosis (hepatocyte death) inhibition action, liver regeneration (hepatocyte differentiation and / or division) induction action, etc.
  • HB-EGFs Alternatively, nucleic acids encoding HB-EGF or its partial peptides have uses as hepatoprotective agents, hepatic cell apoptosis inhibitors, and liver regeneration promoters.
  • liver diseases such as hematocytosis, hepatosomiasis), hepatic amyloidosis, and hepatitis
  • HB-EGF-containing hepatoprotective 'liver regeneration promoter is effective for acute liver disease, especially acute liver disease with hepatocyte death due to inflammation, because it is effective within a few hours after administration. be able to.
  • it is possible to improve the stability by taking a dosage form of a sustained-release preparation or by forming an immunoconjugate with an antibody, so that chronic chronic hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, etc. It can also be preferably used as a prophylactic / progressive inhibitor for preventing hepatic cell death and cell death caused by common diseases.
  • the HB-EGFs may be used as they are, but they can also be used as the above-mentioned medicament after mixing with a pharmacologically acceptable carrier as necessary to obtain a pharmaceutical composition.
  • the pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations; solvents in liquid preparations It is formulated as a solubilizer, suspending agent, tonicity agent, buffering agent, soothing agent and the like. If necessary, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used.
  • excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, starch, pregelatinized starch, dextrin, crystalline cellulose, low substituted hydroxy Propinorescenellose, carboxymethylcellulose sodium, arabiago, pullulan, light anhydrous caustic anhydride ', synthetic aluminum silicate, magnesium metasilicate aluminate, and the like.
  • lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • binder examples include pregelatinized starch, sucrose, gelatin, gum arabic, methyl cellulose, carboxymethylol cellulose, canoleboxymethylenorescenellose sodium, crystalline cellulose, sucrose, D- Manni Tonole, Trehalose, Dex,. Thrin, Punoreran, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropinolemethinolele cellulose, Polybulol pyrrolidone, etc. '
  • disintegrants include lactose, sucrose, starch, carboxymethylse / relose, carboxymethylol cellulose calcium, croscanolose sodium, carboxymethyl starch small lithium, light anhydrous key acid, low Substitution degree Hydroxide Mouth 'pill cellulose etc. can be fisted.
  • the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, que Examples include sodium nitrate, sodium salicylate, and sodium acetate.
  • suspending agent examples include surfactants such as stearinotriethanolamine, sodium laurinosulfate sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate,
  • surfactants such as stearinotriethanolamine, sodium laurinosulfate sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate
  • hydrophilic polymers such as polybutyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose sodium, methinorescenellose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyxetylcellulose, hydroxypropylcellulose, Examples include polysorbates and polyoxyethylene hydrogenated castor oil.
  • the tonicity agent include sodium chloride, dalyserin, D-mannitol, D-sorbitol, grape grape and the like.
  • buffer solutions such as phosphates, acetates, carbonates and citrates.
  • soothing agents include benzyl alcohol and the like.
  • preservative examples include paraoxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • the antioxidant include sulfite and ascorbate.
  • Suitable examples of colorants include water-soluble edible tar dyes (eg, edible dyes such as edible red Nos. 2 and 3, edible yellows Nos. 4 and 5, and edible blue Nos. 1 and 2), water-insoluble Examples include lake pigments (eg, aluminum salts of the above-mentioned water-soluble edible tar pigments), natural pigments (eg,] 3-carotene, chlorofuran, bengara, etc.).
  • sweetening agent examples include saccharin sodium, dipotassium glycyrrhizinate, aspartame, stevia and the like.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), oral preparations such as granules, powders, syrups, emulsions and suspensions; and injections.
  • oral preparations such as granules, powders, syrups, emulsions and suspensions
  • injections include subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.), external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, ointments, etc.), suppositories (eg, rectal seats)
  • parenteral preparations such as pills, vaginal suppositories, etc., pellets, drops, sustained-release preparations (eg, sustained-release microcapsules).
  • the pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the field of pharmaceutical technology, for example, a method described in the Japanese Pharmacopoeia. The specific production method of the drug product is described in detail below.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, the dose of the active ingredient, etc., but is, for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • oral preparations contain active ingredients, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, D-macro , Etc.), disintegrants (eg, carboxymethyl senorelose calcium), binders (eg, pregelatinized starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.) or lubricants (eg— : Talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000, etc.) and then compression-molded, and if necessary, using a coating base with a coating base for the purpose of taste masking, enteric properties or sustainability. Manufactured by coating. ''
  • coating base examples include sugar coating base, water-soluble film coating base, enteric film coating base, sustained-release film rotating base, and the like.
  • sucrose is used as the sugar coating base.
  • one or more kinds selected from talc, precipitated calcium carbonate, gelatin, gum arabic, pullulan, carnauba wax and the like may be used in combination.
  • water-soluble film coating bases include, for example, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropinoremethinoresenorelose, 7 drokisuccinoresenorero and methylhydroxetylcellulose Molecule, Polyvinylinoleacetal Getilaminoacetate, Aminoalkyl methacrylate Copolymer 1 [Oi Dragit (trade name), Rohmfarma Co., Ltd.], Polyvinylpyrrolidone, and other synthetic polymers, and pullulan Examples include sugars.
  • enteric film coating bases include cellulosic polymers such as hydroxypropylmethyl cenololose phthalate, hydroxypropinoremethi / resenellose acetate succinate, carboxymethylethylenolose, and senorelose acetate phthalate.
  • Acrylic acid copolymer L [Oi Dragit L (trade name), ROHM FALMA Co., Ltd.], methacrylic acid copolymer LD [OI DRAGITE L-30D55 (trade name), ROHM Falma Co., Ltd.], methacrylic acid copolymer S [Oi Dragit]
  • Acrylic polymers such as S (trade name), Rohmfarma Co., Ltd.] and natural products such as shellac.
  • Sustained release film coating S agents include, for example, cellulose polymers such as ethylcellulose, aminoalkyl methacrylate copolymers RS [Oidra Git RS '(trade name), ROHM Falma Co., Ltd.], ethyl acrylate' Examples include acrylic acid polymers such as a methyl methacrylate copolymer suspension [Eudragit NE (trade name), Rohmfarma Co., Ltd.].
  • the above-mentioned coating bases may be used by mixing two or more thereof in an appropriate ratio.
  • a light shielding agent such as titanium oxide or iron sesquioxide may be used.
  • Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Buffer solution, antibacterial agent, tonicity agent and the like may be contained.
  • Aqueous and non-aqueous sterile suspensions can also be mentioned, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • An injection solution is preferred when the administration method is local injection near the target site.
  • a biocompatible material such as collagen can be used to make a sustained release preparation.
  • Pull bite nick gels gel at body temperature and are liquid at lower temperatures, so long-term sustainability can be achieved by locally injecting HB-EGFs together with pull bite nick gels and gelling around target tissues. can do.
  • the protein preparation can be sealed in a unit dose or multiple doses like ampoules and vials.
  • HB-EGFs and pharmacologically acceptable carriers can be freeze-dried and stored in a state where they can be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
  • HB-EGFs Since antibodies against hepatocyte surface molecules can specifically deliver drugs to hepatocytes, the blood of HB-EGFs can be obtained by using HB-EGFs as immunoconjugates that are cross-linked to the antibodies. Medium stability and delivery efficiency to hepatocyte surface can be improved.
  • liver cell surface molecules include, but are not limited to, EGFR (HER 1), HER2, HER3, HER4, and the like.
  • anti-EGFR antibodies use non-neutralizing antibodies as targeting antibodies so as not to inhibit signal transmission from EGFR. Is desirable.
  • the antibody against the hepatocyte surface molecule may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody can be prepared by peripheral immunological techniques.
  • the antibody may be a complete antibody molecule or a fragment.
  • the fragment may be any fragment as long as it has an antigen binding site (CDR) for a hepatocyte surface molecule, and examples thereof include Fab, F (ab,) 2 , ScFv, minibody and the like.
  • Monoclonal antibodies can be obtained from cell fusion methods (for example, Takeshi Watanabe, Principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal antibodies and one cancer and clinical one”, 2-14, Can be created by Science Forum Publishing (1985)).
  • a target protein which can be a complex cross-linked to a carrier protein such as urine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).
  • a target protein which can be a complex cross-linked to a carrier protein such as urine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).
  • This leukocyte and myeloma cells are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor.
  • Cell fusion may be PEG method [zo. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (1985)] or voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)].
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a known EIA or RIA method.
  • Hybridomas that produce monoclonal antibodies can be cultured in vitro or in vivo, such as mouse or rat, preferably mouse ascites, and antibodies should be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively. Can do.
  • the antibody is preferably a chimeric antibody of human and other animals (eg, mouse etc.), more preferably a humanized antibody, and a complete human antibody. Most preferably, it is an antibody.
  • chimeric anti refers to an antibody that has a variable part (V region) derived from an immunized animal and a normal part (C region) derived from human, and “humanized antibody” refers to other regions except CDR. An antibody that has been replaced with a human antibody.
  • chimeric antibodies and humanized antibodies for example, a sequence encoding V region or CDR is excised from the gene of mouse monoclonal antibody prepared by the same method as described above, and the C region of antibody derived from human myeloma is encoded.
  • the chimeric gene fused with the DNA to be cloned can be cloned into an appropriate expression vector and introduced into an appropriate host cell to express the chimeric gene.
  • a complete human antibody is obtained using a known phage display library or a human antibody-producing mouse developed by Medarex and a KM mouse jointly developed by Medarex and Kirin. be able to.
  • Examples of the bridge method between antibodies against hepatocyte surface molecules and HB-EGFs include the methods described in Adv. Drug Deli v. Rev., 53 171 -2 16 (200 1). Not limited to.
  • a hepatoprotective and hepatic regeneration promoter containing HB-EGFs designed in the above-mentioned dosage form is> dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle, eg, a mammal (eg,' And can be administered orally or parenterally to wots, rabbits, hidges, pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • suitable sterile vehicle eg, a mammal
  • parenteral routes of administration include intravenous vein, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, and airway fistula.
  • Hepatic protection containing HB-EGFs ⁇ The dosage of liver regeneration promoter is the molecular weight of the active ingredient, administration route, severity of disease, animal species to be administered, drug acceptability of the subject to be administered, body weight, age Usually, the amount of active ingredient per adult is about 0.05 to about 10 mg / kg, preferably about 0.1 to about mg / kg. Can be administered separately.
  • nucleic acids encoding HB-EGFs can produce HB-EGFs for a long time by long-term gene expression, a sustained therapeutic effect can be expected. Therefore, in addition to the prevention and treatment effects of acute liver disease, it is associated with chronic liver disease such as chronic hepatitis, liver fibrosis, and cirrhosis. It can also be preferably used as a prophylactic / progressive inhibitor for preventing hepatocyte exhaustion and cell death.
  • the nucleic acid encoding HB-EGF is preferably provided in a form supported on an appropriate expression vector.
  • the expression vector is functionally linked to a promoter capable of exerting a promoter activity in a target cell of a mammal to which a nucleic acid encoding HB-EGFs is administered, or a target cell of an administered animal. In such a position, it can change into a functionally linked form under certain conditions.
  • the promoter used is not particularly limited as long as it can function in the target cell of the mammal to be administered.
  • a promoter derived from a cytomegalovirus (CMV) eg, an early promoter of CMV
  • CMV cytomegalovirus
  • HI V Human immunodeficiency virus
  • oral motor eg, HIV LTR
  • RSV Rous sarcoma virus
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • Moroni murine leukemia virus (MoMLV) promoter eg MoMLV LTR
  • HSV herpes simplex virus
  • HSV herpes simplex virus
  • HSV herpes simplex virus
  • SV40 promoter eg: SV40 early promoter 1
  • Adeno-associated virus (AAV) promoter eg AAV p5 promoter) Motor
  • AdV adenovirus
  • AdV adenovirus (AdV) -derived promoter
  • Ad2 or Ad5 major late promoter adenovirus (Ad
  • the nucleic acid to be transferred has a structure separated by two recombinase recognition sequences arranged in the same direction, separated by a spacer sequence having a length sufficient to prevent expression of the nucleic acid from the promoter.
  • the spacer sequence is excised in the presence of recombinase that specifically recognizes the recognition sequence, and arranged so that the nucleic acid encoding ⁇ -EGFs is functionally linked to the promoter. A child placed.
  • the expression vector preferably contains a transcription termination signal, ie, a terminator region downstream of the nucleic acid encoding HB-EGFs.
  • selectable marker genes for selection of transformed cells can be further contained.
  • the expression vector has a spacer sequence sandwiched between recombinase recognition sequences as described above, the selectable marker gene can also be arranged in the spacer sequence.
  • the vector used for the expression vector of the present invention is not particularly limited to lj, but vectors suitable for administration to mammals such as humans include retrovirus, adenovirus, adeno-associated wienerless, and henolepe. Examples include Suiunoles, Simple Herpesvirus, Lentiwinores, Vaccinia Winores, Boxwinores, Poliowinores, Sindbis virus, Sendai virus, etc.
  • Adenoviruses have such advantages that gene transfer efficiency is extremely high, they can be introduced into non-dividing cells, and the integration of the transgene into the host chromosome is extremely rare.
  • next-generation vectors called gutted '(gut less) vectors, in which almost the entire length of the adenovirus genome other than the packaging signal () is replaced with a transgene, eliminates the problem of immunogenicity in first-generation vectors.
  • the long-term sustainability of transgene expression has been realized, further increasing the usefulness of adenovirus in gene therapy.
  • adeno-associated virus is also relatively high in gene transfer efficiency and can be introduced into non-dividing cells including hepatocytes, and animal experiments have shown that transgene expression persists for a long time when administered in vivo. Therefore, it is preferable as a virus vector in the present invention.
  • the expression vector is used for overexpression of HB-EGFs at an unnecessary time and / or an unnecessary site.
  • HB-EGFs can be expressed in a time-specific and / or target cell-specific manner in order to prevent the adverse effects caused by.
  • target cells of the animal to be administered in the present invention, preferably hepatocytes, but soluble HB-EGF can be released and delivered to the liver.
  • a liver-specific promoter is a vector containing a nucleic acid encoding an HB-EGF operably linked to a promoter derived from a specifically expressed gene.
  • a promoter containing a serum albumin promoter, a cytochrome P-450 promoter, or a liver-specific transcription factor (HNF 1, HNF3, HNF4, C / EBP, etc.) binding cis element is a promoter containing a serum albumin promoter, a cytochrome P-450 promoter, or a liver-specific transcription factor (HNF 1, HNF3, HNF4, C / EBP, etc.) binding cis element.
  • a conductive promoter whose expression is controlled in trans by an exogenous substance.
  • Vegter containing As an induction promoter, for example, when the meta-orchionein-1 gene promoter is used, heavy metals such as gold, zinc, and cadmium ', telloids such as dexamethasone, alkylating agents, chelating agents, and site power
  • an inducer such as in the target cell position at a desired time, the expression of HB-EGFs can be induced specifically at the target cell at any time.
  • the promoter and the nucleic acid encoding HB-EGFs are of sufficient length to prevent expression of the nucleic acid from the promoter. It is a betater having a structure separated by two recombinase recognition sequences arranged in the same direction, separated by a spacer sequence having A promoter cannot direct transcription of a nucleic acid encoding HB-EGFs only by introducing the vector into a target cell.
  • a recombinase that specifically recognizes the recognition sequence is locally administered to a target cell at a desired time, or an expression vector containing a nucleic acid encoding the recombinase is locally administered to express the recombinase in the target cell. Then, homologous recombination between the recognition sequences via the recombinase occurs, and as a result, the spacer sequence is excised. Nucleic acid encoding HB-EGFs is operably linked to a promoter, and HB-s are expressed in the desired B phase specifically for the target cell. .
  • the recombinase recognition sequence used for the vector is preferably a heterologous recombinase recognition sequence that is not recognized by the endogenous recombinase in order to prevent recombination by the endogenous recombinase in the administration subject. Therefore, it is desirable that the recombinase acting on the vector in trans is also a heterologous recombinase.
  • Preferred examples of the combination of the heterologous recombinase and the recombinase recognition sequence include Cre limpinase derived from bacteriophage P1 of E. coli and lox P sequence, or Flp recombinase derived from yeast and frt sequence. It is not limited to them.
  • promoter of the time-specific and tissue-specific expression vector utilizing the interaction of recombinase / recombinase recognition sequence it is preferable to ensure the expression at the desired time and location. Promoters of virus-derived promoters and mammalian constituent protein genes can be used.
  • An expression vector containing a nucleic acid encoding a gene can be prepared using conventional genetic engineering technology, cell culture technology, virus production technology [eg, Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausuoel et al. Eds (1994) John Wiley && Sons, 'Inc.;. Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 3rd ed. Volumes 1-3, Jbsseph Sambrook & David W. Russel eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001); Culture of Animal Cells; A Manual of Basic Technique, R. Freshney eds., 2nd ed.
  • the expression vector when a viral vector is used as an expression vector containing a nucleic acid encoding HB-EGFs, the expression vector may be introduced using a polymer carrier such as a polylysine nucleic acid complex, It can be performed by encapsulating in ribosomes.
  • a liposome is a capsule made of phospholipid and having a particle size of several tens to several hundreds of nanometers, and a vector such as a plasmid encoding HB-EGF can be enclosed in the capsule.
  • the vector can be introduced directly into the target cells using the parthenol method.
  • recombinase itself is locally administered as a trans-acting substance.
  • recombinase is dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle. Inject into the target site.
  • a recombinase expression vector when a recombinase expression vector is locally administered to a target site as a substance, the recombinase expression vector shows that the nucleic acid encoding the recombinase exerts a promoter activity in the target cell to be administered.
  • the recombinase expression vector shows that the nucleic acid encoding the recombinase exerts a promoter activity in the target cell to be administered.
  • the vector administered to the target site can be integrated into the chromosome of the host cell, for example, adenovirus, to prevent recombinase expression during unnecessary periods. It is desirable that it is rare.
  • Another approach for expressing recombinase at a desired time is to use an inducible promoter such as a metallothione gene promoter. In this case, it is possible to use a virus vector having high integration efficiency such as retrovirus.
  • An expression vector containing a nucleic acid encoding HB-EGFs can be mixed with a pharmacologically acceptable carrier as necessary to obtain various pharmaceutical forms such as injections, and can also be used as the medicament.
  • a pharmacologically acceptable carrier include those described above for preparations containing HB-EGFs, but are not limited thereto.
  • hepatoprotective / hepatic regeneration promoter containing an expression vector containing nucleic acid encoding HB-EGFs depends on the target cell of the treated animal itself (or allogeneic of the treated animal) Remove cells from cells of different shapes or species), incubate, introduce and return (or transplant) into the body, and introduce a vector directly into the subject's body Is done in any of the ⁇ methods.
  • the vector can be introduced into the target cell by microinjection method, calcium phosphate coprecipitation method, PEG method, electoral position method or the like.
  • the preparation can be administered, for example, by injection, catheter, balloon catheter or the like. .
  • Liver protection of the present invention containing an expression vector containing a nucleic acid encoding HB-EGFs.
  • the dose of liver regeneration promoter is the type of vector, the size of the active ingredient molecule, the promoter activity, the route of administration.
  • the animal species to be administered the drug acceptability of the subject to be administered, sex, weight, age, etc.
  • the gene for conventional liver disease In clinical trials for treatment, safety has been confirmed using 2 X 10 11 part icl es / kg (total amount of 1..5 X 10 13 particles) in the viral particle (part icle). It is a guide for administration.
  • HB-EGF HB-EGF
  • HB-EGF HB-EGF
  • it is not a congenital disease, so it is not necessary to introduce the HB-EGF gene into all hepatocytes. Conceivable'.
  • a non-viral vector was encapsulated in ribosomes same for safety by intravenous administration of DNA 666 mu 8 in clinical studies using a force two Kuizaru weighing about 4 kg is confirmed The amount is a guide.
  • a single adult dose is about 2 to about 10 mg, preferably about 5 to about 8 nig.
  • the present invention is also intended for the expression of endogenous HB-EGF gene.
  • means for enhancing the expression of the endogenous HB-EGF gene include a transactivator that binds to the regulatory region of the HB-EGF gene and activates its transcription, and a substance that stabilizes the HB-EGF mRNA.
  • administration of a substance that increases the translation efficiency from HB-EGF mRNA, and other means for enhancing the activity of endogenous HB-EGF include, for example, pro-HB-EGF.
  • Substances that promote the production of active soluble HB-EGF for example, specific proteases involved in shedding such as ADAM
  • substances that suppress the degradation of HB-EGF for example, pear tearing inhibitors
  • another aspect of the present invention is to provide a method for screening for a hepatic protection 'liver regeneration promoting substance by selecting the above-mentioned substance capable of enhancing the expression of endogenous HB-EGF gene and the activity of HB-EGF.
  • This screening method is characterized by culturing cells that naturally express HB-EGF in the presence and absence of a test substance and comparing the expression level and / or activity of HB-EGF. ..
  • the expression level of HB-EGF can be assayed at the transcription level for Northern blot or RT-PCR, or at the translation level by imsoassay using anti-HB-EGF antibody.
  • the activity of HB-EGF is examined for the proliferation promoting activity in cells such as hepatocytes, the activation of the EGFR family that is the target receptor for HB-EGF (receptor phosphorylation, etc.) and its downstream.
  • the activation of activated kinase molecules such as MAPK can be used as an indicator.
  • HB-EGF hepatoprotective and liver regeneration promoters containing HB-EGFs.
  • liver protection containing this substance ⁇ The dose of the liver regeneration promoter is the type of active ingredient ⁇ molecular weight, administration route, disease severity, animal species to be administered, drug acceptability of the administration subject, body weight, age Usually, the amount of active ingredient per day for adults is in the range of about 0: 001 to about 100 mg / kg, preferably about 1 to about 10 mg / kg. Can be administered.
  • RNA Ribonucleic acid
  • RNA Messenger ribonucleic acid
  • dATP Deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP Deoxythymidine triphosphate
  • dGTP Deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP Deoxycytidine triphosphate
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • Trt Trityl Bum: t-Butoxymethyl
  • HOOBt 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine.
  • H0NB 1-Hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxyimide
  • Plasmid pADL.1 / RSV (B. Fang et al., Gene Therapy (.1994) 1, 247-254) is a 0-455 base portion from the 3 'side of human type 5 adenovirus from upstream.
  • Incorporated into the pBR322 plasmid are the tumor virus (RSV) LTR promoter, the multiple cloning site, the poly A signal sequence of cypress growth hormone, and the 3328-5788 base from the 3 'side of human 5' type adenovirus.
  • the created plasmid was provided by Shu-. Hsia Chen (Mount Sinai Univ.).
  • This pADL.1 / RSV plasmid was digested with restriction enzymes ga /? D III and ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ I and purified to obtain a vector for ligation.
  • the plasmid pRpHBEGF containing the full-length cDNA of human HB-EGF in the plasmid pRc / CMV was provided by Eisuke Mekada (Osaka Univ.).
  • pRcHBEGF plasmid is digested with restriction enzymes // dIII and yVoiI to excise the full length of HB-EGF eDNA, which is agarose gel electrophoresed to recover the desired DNA fragment from the gel and ligate the purified product.
  • the insert used in The thus-treated pADL.1 / RSV vector and -EGF cDNA insert were ligated using T4 DNA ligase to obtain pADL.1 / RSV-HB-EGF.
  • Ad. HB-EGF was virus-amplified in 293 cells and concentrated by density gradient centrifugation of cesium chloride.
  • the concentrated virus is purified with an Ekonopak 10DG desalting column (Bio-Rad Cat No. 732-2011), eluted with PBS (-), added with glycerol, and frozen in liquid nitrogen. After ligation, it was stored at -80 ° C. When the virus was used, the particle dose was calculated and diluted with PBS (-) so that the dose volume was 100 ⁇ / animal.
  • AD. LacZ a recombinant adenovirus that expresses the LacZ gene of Escherichia coli used for gene transfer confirmation
  • Ad. DEl. 3 is a recombinant adenovirus that does not express any of these genes because HB-EGF is not incorporated.
  • Ad.dEl.3 was prepared in the same manner and process by co-introducing pADLl / RSV and pJM17 without HB-EGF into 293 cells as described above.
  • HB-EGF (1X10 11 particles) prepared in Example 1 were injected into 6-week-old male C57BL / 6J mice (Chubu Science; 10 mice in each group) via tail and vein. Later, the expression of exogenous LacZ and HB-EGF in the liver was examined by X-gal staining and immunostaining, respectively. The mice were anesthetized with ether and then the thoracotomy was performed, and organs (heart, lung, liver, kidney, spleen) were collected.
  • the organ was divided into two halves, one of which was used for preparation of an OCT specimen with a compound (TissueTek OCT compound), and the other was fixed with 10% formaldehyde, and then a paraffin-embedded specimen.
  • OCT specimen sections were 0.2% formaldehyde / 0.02 ° /.
  • Immunostaining was fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes and blocked with 10% skim milk (snow mark) for 60 minutes.
  • Fig. 1 shows the results of ⁇ -gal staining and immunostaining of negatively treated non-stained samples treated with the same treatment after tail vein injection of Ad. DE 1..3.
  • X-gal staining is observed in 60-90% of hepatocytes of the mouse liver injected with Ad. LacZ via the tail vein. It was revealed that efficient gene transfer into hepatocytes is possible (Fig. 1A).
  • Ad. HB-EGF was injected into the tail vein of the mouse liver, and HB-EGF expression was mainly observed in the cell membrane. Biologically active exogenous HB-EGF was converted to membrane-bound HB_EGF. It was revealed that the synthesized or further processed soluble HB-EGF acts as an autocrine hepatocyte (Fig. 1B).
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT and AST decreased to 500 IU / L or less in the Ad. DE l. 3 administration group 36 hours after antibody administration, but no significant difference was observed in the Ad. HGF administration group.
  • the Ad. HB-EGF administration group showed 250 IU / L or less, which was significantly lower than the Ad. DE l. 3 administration group. Based on the above results, Ad. HB-EGF is associated with fulminant hepatitis.
  • Example 3 Ad. HB-EGF suppresses hepatocyte apoptosis
  • Hepatocyte death due to apoptosis the main condition of fulminant hepatitis, was evaluated by performing HE staining and TUNEL staining of liver tissue. 24 hours after Agonisu preparative antibody administration, from OCT sample in paraffin-embedded specimens of Tiny mouse liver after 36 hours (each 96 from adenovirus tail vein injection, 10 8 hours after), respectively after sectioned, HE staining It was stained with TUNEL.
  • Liver regeneration which is an indicator of the essential therapeutic effect of fulminant hepatitis, is the anti-Ki-67 mouse monoclonal-nanore antibody (clone name, TEC-3, Dako Cytomat ion, Denmark). It was evaluated by. Immunostaining with anti-Ki-67 antibody was performed using paraffin sections of mouse liver 24 hours and 36 hours after administration of the agonist antibody (96 and 108 hours after adenovirus tail vein injection, respectively).
  • HB-EGF has strong liver damage suppression, apoptosis suppression and liver regeneration inducing actions
  • HB-EGF or its nucleic acid can be used in various diseases associated with liver damage, hepatocyte death, especially fulminant hepatitis. It is extremely useful as a prophylactic / therapeutic agent for liver disease. While the invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the preferred embodiments can be modified. The present invention is described in detail herein. It is intended to be carried out in ways other than those listed. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed within the spirit and scope of the appended claims. This application is based on Japanese Patent Application No.

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Abstract

本発明は、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子 (HB-EGF) もしくはその部分ペプチド、あるいはそれをコードする核酸を含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤、肝疾患の予防・治療剤を提供する。本発明はまた、動物から採取した細胞に、HB-EGFもしくはその部分ペプチドをコードする核酸を導入することを含む、肝保護および/または肝再生促進用、肝疾患の予防・治療用細胞の製造方法を提供する。

Description

. 明細書
へパリ ン結合性上皮増殖因子様増殖因子の ff規医薬用途 技術分野
本発明は、 へパリ ン結合性上皮増殖因子様増殖因子 （heparin- binding EGF - like growth factor; 以下、 「HB- EGF」 と略記する） またはそれをコードする 核酸の新規医薬用途、 より具体的には、 肝疾患の予防 '.治療用途に ι する。 背景技術
肝疾患に対して、 現在臨床の現場で用いられている医薬 '治療法は、 あくまで 対症療法に過ぎず、 肝障害 （肝細胞死） を抑制し、 肝再生を誘導する根治薬 - 根治療法は存在しない。 そのため、 現在、 急性肝炎における第一の治療方針は安. 静と食事であり、 現に使用されている薬剤で真に有効性が実証されたものはない。 なかでも、 劇症肝炎には様々な薬剤、 治療法が用いられているものの、 未だに死 亡率は 70%近くにのぼり、 効果的な治療薬 ·治療法には程遠く、 欧米では肝移植 が治療の第一選択となっている。
このように、 肝疾患 （特に劇症肝炎） に対する根治薬は臨床レベルでは存在 しないのが実状である。 'かかる状況下において、 研究レベルでその有効性が確認 され、 近い実用化が最も期待されているものが、 肝細胞増殖因子 （HGF) である。 本発明者の一人は以前、 劇症肝炎モデルにおいて HGFが肝細胞死を強力に阻止し、 同時に肝障害後の肝再生を誘導することを報告しており （W0 98/24467; Kosai, K. et al. , Hum. Gene Ther. , 92 1293-1301 (1998)； Kosai, K. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 244 683—90 (1998) ; Kosai, K. et al. , Hepatol ogy, 30 151-9 (1999))、 現在、 臨床応用へ向けて開発が進められて いる。
HB- EGFは、 正常肝でも発現している EGFファ ミ リ一に属する増殖因子である力 まず膜結合型の前駆体 （proHB- EGF) として合成された後、 膜近傍ドメインで特 2 ' · ■ . · . · ·· ■ ' 異的なメタ口プロティナーゼにより切断されて生じる 溶性 HB - EGFが、 多くの 細胞種に対して分裂促進作用を示すという生物学的にユニークな特徵を有してい る。 HB- EGFは、 肝臓においては、 肝部分切除術後に急激な発現上昇がみられ、 また、 慢性肝疾患でも発現亢進がみられる。 これらの事実より、. HB- EGFは HGFな どと同様に、 肝臓栄養因子の 1つであろうと推察されてきた。
さらに、 HB- EGFの投与または遺伝子治療が、 いくつかの臓器障害に対して治 療効果を示すことが報告されている。 例えば、 間質性膀胱炎 （IC) 患者の損傷 した上皮細胞への組換え HB- EGFの投与 （遺伝子治療による局所産生を含む) 1Α、 ICにおける上皮異常の要因である増殖抑制因子 （APF) の効果を遮断し、 fl旁胱上 皮の慢性的損傷を軽減または排除し得ることが示唆されている （W0 99/54706)。 また、 糖尿病マウスに、 HB-EGF遺伝子を含むアデノウイルスベクターを、 膝管 を通じて逆行性に注入すると、 膝 β細胞の増殖、 膝管細胞のィンスリン産生細胞 への分化、 耐糖能改善が認められることから、 HB-EGFが陴再生 '糖尿病治療効 果を示すことが示唆されている （Kozawa, J. et al . , . Pancreas, 31： 32-42 (2005) )。 - しかしながら、 HB-EGFが肝疾患に対して実際に治療効果を示す、 即ち、 外因 性の HB-EGFが肝障害を抑制し、 および/または肝再生を誘導するという報告はこ れまでに皆無である。 また.、 HB- EGFは、 HGFやインス リ ン様増殖因子 （IGF) と 同様に心肥大性増殖因子としても知られているが、 本発明者らが実施したゥサギ での心筋梗塞治療試験において、 HB-EGFを用いた遺伝子治療は、 HGFや IGFを用 いた場合とは異なって治療効果を示さず、 むしろ梗塞後リモデリングを増悪した ことから （Ush ikoshi , H. et al. , Lab. Inves t. , 85： 862-73 (2005) )、 HB- EGFは、 あらゆる臓器障害に対して必ずしも治療的に作用するわけではないらし い。
このように、 HB-EGFが肝疾患【'こ対して実際に治療効果を示すか否かは全く不 明であり、 ましてや、 その遺伝子治療の有効性については何ら保証がないという のが実状である。 発明の開示
本発明の目的は、 HGFよりもさらに強力な肝障害抑制および肝再生誘導作用を 示す物質を同定し、 以つて肝疾患 （特に劇症肝炎） のより有用な新規予防 *治 療薬を提供することである。
本発明者らは、 劇症肝炎の動物モデルにおいて、 HB-EGFをコードする DNAを含 むアデノウイルスベクターを導入 '発現させた結果、 HB-EGFが肝障害および肝 細胞のアポトーシスを顕著に抑制し、 且つ肝再生を誘導することを見出した。 し かも驚くべきことに、 HB- EGFの該治療効果は、 現在知られている最も有望な肝 疾患治療薬である HGFのそれよりも強力であった。 本発明者らは、 これらの知見 に基づいてざらに研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 HB-EGFもしくはその.部分ペプチドをコードする核酸を. 含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤を提供する。 該核酸は、 例えば、 後述のウィルスベクターなどに挿入されて標的細胞内に導入されると、 該細胞内. で発現して HB EGFもしくはその部分ペプチドを産生 '放出して、 肝障害 （肝細 胞死） を抑制するとともに、.肝再生を誘導する。
従って、 本発明はまた、 HB-EGFもしくはその部分ペプチドを含有してなる肝 保護および/または肝再生促進剤を提供する。 該蛋白質 （もしくはペプチド） は、 後述するように、 遺伝子組換え技術を用いて大量に生産され、 使用され得る。
さらに、 本発明は、 動物から採取した細胞に、 HB - EGFもしくはその部分ぺプ チドをコードする核酸を導入することを含む、 肝保護および/または肝再生促進 用細胞の製造方法を提供する。 .該核酸を導入され、 発現が確認された細胞を、 該 細胞を採取した個体に戻すか、 または他の個体に移植することにより、 該動物個 体における肝障害 （肝細胞死） が抑制されるとともに、 肝再生が誘導される。
HB- EGFは強力な肝障害抑制、 アポトーシス抑制および肝再生誘導作用を示す ので、 HB-EGFまたはそれをコードする核酸を投与することにより、 肝障害、 肝 細胞死を伴う各種疾患に対して予防 ·治療効果を奏する。 本発明の具体的な態様および本発明のさらなる利点等こついては、 以下の 「発 明の実施の形態」 においてさらに詳述する。 図面の簡単な説明 .
図 1は、 アデノ ウイルス クターの尾静脈注射によって、 効率良く肝臓、 肝細 胞に目的遺伝子を導入できることを示す。 図 1Aでは、 Ad. LacZを導入後、 肝組織 のほぼ全域で X-ga l染色陽性の細胞が認められる。 図 1Bでは、 Ad. HB-EGFを導入 することによって、 細胞膜の辺縁に HB-EGF発現が認められる。 , .図 2は、 劇症肝炎モデルマウスの血中肝臓逸脱酵素濃度に及ぼす Ad. HB-EGF, . Ad. HGFまたは Ad. dE l . 3の投与の影響を示す。 図 2Aは実験スケジュールを示す。 図 2Bは血清中 ALT値、 図 2Cは血清中 AST値をそれぞれ示している （白棒： 抗体投 与 24時間後、 黒棒： 抗体投与 36時間後）。 ： 図 3は、 劇症肝炎モデルマウスの肝臓組織のアポトーシスに及ぼす Ad. HB- EGF (中段）、 Ad, HGF (下段） または Ad. dE l . 3 (上段） 投与の影響を示す。 左側は抗. 体投与 24時間後、 右側は 36時間後の、 各投与群マウスの肝臓組織の顕微鏡像を それぞれ示す。.
図 4は、 Ad. HB- EGF、 Ad. HGFまたは Ad. dE l . 3を投与した劇症肝炎モデルマウス 肝臓における TUNEL染色の結果を示す。 図 4Aは、 左から Ad. dE l . 3、 Ad. HB-EGF, Ad. HGF投与群マウスの顕微鏡像 （上段： 抗体投与 24時間後、 下段： 抗体投与 36 時間後） をそれぞれ示す。 図 4Bは、 . TUNEL陽性細胞を定量化したグラフである (白棒： 抗体投与 24時間後、 黒棒： 抗体投与 36時間後）。
図 5は、 劇症肝炎モデルマウスにおける肝再生に及ぼす Ad. HB-EGF、 Ad. HGFま たは Ad. dE l . 3投与の影響を示す。 図 5Aは、 左から Ad. dE l . 3、 Ad. HB-EGF Ad. HGF投与群マウスの肝臓の K i - 67染色像 （上段： 抗体投与 24時間後、 下段： 抗 体投与 36時間後） をそれぞれ示す。 図 5Bは、 K i- 67陽性細胞を定量化したグラフ である （白棒： 抗体投与 24時間後、 黒棒： 抗体投与 36時間後）。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる HB- EGFは、. 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質であれば、 その由来に特に 制限はなく、 ヒ トもしくは他の温血動物 （例えば、 ゥシ、 ブタ、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 サル、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 モルモッ ト、 ニヮ トリな ど） の細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細、胞、 グリア細胞、 膝 β細胞、 骨髄 細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 骨格筋細胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 脂肪細胞、 免 ^細. 胞 （例： マクロファージ、 Τ細胞、 Β細胞、 ナチュラルキラ—細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球）、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨 芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞、 株化もしくは癌細胞など] またはそ.れらの細胞が存在するあらゆる組. 織もしくは器官 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例： 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳)、 脊髄 下垂体、 胃、 鸱臓、 腎 臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉 （骨格筋、 平滑筋)、 肺、 消化管 （例： 大腸、 小腸）、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 尿 管、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤.、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織 （例： 褐色脂肪組 織、 白色脂肪組織） など] に由 *する蛋白質であってもよく、 また、 後述のよ うに、 化学的に、 もしくは無細胞蛋白質合成系を用いて生化学的に合成された蛋 白質であってもよい。 あるいは、 上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有す る核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、 配 列番号： 2に示されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 さらに 好ましくは約 90%以上、 特に好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配 列であって、 該アミノ酸配列を含む蛋白質が配列番号： 2に示されるアミノ酸配 列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有するような配列をいう。 ここで 「相同 性」 とは、 当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミ ノ酸配列をァラインさせた場合の、 最適なアラインメント （好ましくは、 該ァ ルゴリズムは最適なァラインメ トのために配列の一方もしくは両方へのギヤッ プの導入を考慮し得るものである） における、 オーバーラップする全アミノ酸 残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 （％) を意味する。 「類似アミノ酸」 とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、 例え ば、 芳香族アミノ酸 （Phe、 Trp、 Tyr)、 脂肪族アミノ酸 （Ala、 Leu、 Ile、 Val)、 極性アミノ酸 （Gln、 Asn)、 塩基性アミノ酸 （Lys、 Arg, His) , 酸性ァ ミノ酸 （Glu、 Asp)、 水酸基を有するアミノ酸 （Ser、 Thr)、 側鎖の小さいアミ,. ノ酸 （Gly、 Ala, Ser、 Thr、 Met) などの同じグループに分類されるアミノ酸が 挙げられる。 このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもた らさない （即ち、 保存的アミノ酸置換である） ことが予測される。 保存的アミ ノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、 種々の文献に記載されている (例えば、 Bowie et a.l. , 5c e?ce, 247: 1306—1310 (1990) を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、 相同性.計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Iniormation Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （^待値 =10; ギャップを許す； マトリクス =BL0SUM62; フィルタリング =0FF) にて計算することができる。 アミ ノ酸配列の相同性を決定する めの他のアルゴリズムと しては、 例えば、 Karlin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 (1993) 【こ記 載のアルゴ リ ズム [該アルゴリ ズムは NBLASTおよび XBLASTプロ グラム (version 2.0) tこ組み込まれてレヽる (Altschul et al. , Nucleic Acids Res. , 25： 3389— 3402 (1997))]、 Needleman et al. , J. Mol. Biol. , 48 444一 453 (1970) に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフ トウェアパッケ ージ中の GAPプログラムに組み込まれている]、 Myers and Miller, CABIOS, 4 11-17 (1988) に記載のアルゴリ ズム [該アルゴリズムは CGC配列ァラインメ ン トソフ トウェアパッケージの一部である ALIGNプログラム （version 2.0) に組 み込まれてレヽる ]、 Pearson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 2444-2448 ( 1988) に記載のアルゴリズム [該ァルゴリ..ズムは GCGソフ トウェア パッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれている] 等が挙げられ、 それらも 同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ ノ酸配列とは、 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列と約 60 %以上、 好ましくは 約 70%以上、 さらに好まレくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上の同一性を 有するアミノ酸配列である。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 肝保護 （肝障害抑制) 作用、 アポト 一シス （肝細胞死） 抑制作用、: 肝再生 （肝細胞の分化および/または分裂） 誘導 作用などが挙げられる。 「実質的に同質」 とはく それらの活性が定性的に （例： 生理学的に、 または薬理学的に） 同一であることを示す。 したがって、 肝保護 作用、 アポトーシス抑制作用、 肝再生誘導作用などの活性は同等 （例えば、 約 0. 5〜約 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の分子量 などの量的要素は異なっていてもよい。
肝保護作用、 -. アポトーシス抑制作用、 肝再生誘導作用などの活性の測定は、，自 体公知の方法に準じて行なうことができ、 例えば、 後述の実施例に記載されるよ うな肝組織切片の組織病理学的観察 （例： へマトキシリ ン-ェォシン （H- E) 染 色）、 TUNELアツセィ、 Ki67抗原等の増殖マーカーを指標とした免疫組織化学ァ ッセィなどの方法がそれぞれ挙げられるが、 これらに限定されない。
また、 本発明の HB- EGFには、 例えば、 （1 ) 配列番号： 2に示されるアミノ酸配 列のうち 1または 2個以上 [好ましくは、 1〜50個程度、 好ましくは 1〜30個程度、 さらに好ましくは 1〜10個程度、 特に好ましくは 1〜数 （2、 3、 4または 5) 個] のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （2) 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列 に 1または 2個以上 [好ましくは、 1〜50個程度、 好ましくは 1〜30個程度、 さら に好ましくは 1〜10個程度、 特に好ましくは 1〜数 （2、 3、 4または 5) 個] のァ ミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （3) 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列に 1 または 2個以上 [好ましくは、 1〜50個程度、 好ましくは 1〜30個程度、 さらに好 ましくは 1〜10個程度、 特に好ましくは 1〜数 （2、 3、 4または 5) 個] のァミノ 酸が挿入されたアミノ酸配列、 （4) 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列の.うち 1または 2個以上 [好ましくは、 1〜50個程度、 好ましくは 1〜30個程度、 さらに 好ましぐは 1〜10個程度、 特に好ましくは 1〜数 （2、 3、 4または 5) 個] のアミ ノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （5) それらを組み合わ せたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入、 欠失または置換の位置は、 蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。 ' HB- EGFの.活†生に影響を与える位置としては、 例えば.、 HB-EGF受容体である EGFR との結合に関わる EGF様ドメイン （配列番号： 2に示されるアミノ酸配列中アミ ノ酸番号 105〜148で示される領域） や s hedd i ngにおけるプロテアーゼ認識切断 部位などが挙げられるので、 挿入、 欠失、 置換の位置としては、 例えば、 プロ配 列や C末の細胞内ドメイン等が挙げられる。 あるいは、 へパリン結合ド、メイン (配列番号： .2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 93〜105で示される領域） は HB - EGFと EGFRとの結合活性を負に制御することが報告されているので （/· Biol. Chem. , 279(45)： 47335-43 (2004).)、 該ドメインにおける欠失、 揷入、 置換もまた、 HB- EGFの活性を保持または増強し得る。
本発明の ΗΒ - EGFは、 好ましくは、 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列を有す るヒ ト HB-EGF (GenBankァクセッショ ン番号： NP— 001936)、 あるいは他の瘟血 動物におけるそのオルソログ [例えば、 GenBan.kにそれぞれァクセッション番号 NP— 034545、 NP— 037077、 XP— 60 12 10、 NP— 999464、 AAD52998および NP— 990 180と して登録されているマウス、 ラ.ッ ト、 ゥシ、 ブタ、 チャイニーズハムスターおよ びニヮ トリオルソログ （それぞれヒ ト HB-EGFに対して約 81%、 約 82%、 約 73%、 約 9 1%、 約 86%および約 73%の同一性を有する） 等] である。
本明細書において、 蛋白質およびペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従って左 端が N末端 （ァミノ末端）、 右端が C末端 （カルボキシル末端） で記載される。 配 列番号： 2に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、 本発明の HB- EGFは、 C末端がカルボキシル基 （- C00H)、 カルボキ レート （- C00 -)、 アミ ド （_C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、.例えば、 メチル， ェチル， . n -プロピル, イソプロピル， n-プチルなどの ( 6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル， シク 口へキシルなどの C3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル， α-ナフチルなどの じ6-12ァリール基、 例えば、， ベンジル， フエネチ レなどのフエニル- C1 -2アルキル基、 α-ナフチルメチルなどの α-ナフチル -C^アルキル基などの C7_14ァラルキル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。 ' 本発明の HB- EGFが C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を 有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステル化されているものも 本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末 端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の HB-EGFには、 N末端のァミノ酸残基のァミノ基が保護基 （例 えば、 ホルミル基,. ァセチル基などの C1 -6アルカノィルなどの ( 6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成し得る N末端のグルタミン残基 がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば- 0H、 _SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適 当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アルカノィル基などの C 6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖 蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
HB-EGFの部分ぺプチドは、 上記した HB- EGFの部分ァミノ酸配列を有するぺプ チドであり、 且つ HB-EGFと実質的に同質の活性を有する限り、 何れのものであ つてもよい。 ここで 「実質的に同質の活性」 とは上記と同意義を示す。 また、 「実質的に同質の活性」 の測定は HB- EGFの場合と同様に行なうことができる。 具体的には、 HB-EGF部分ペプチドとして、 例えば、 配列番号： 2に示されるァ ミノ酸配列のうち、 受容体である EGFRとの結合に関わる EGF様ドメイン （上述） を含む部分アミノ酸配列、 可溶性 HB-EGF (配列番号： 2に示されるアミノ酸配列 中アミノ酸番号 63〜148で示されるアミノ酸配列からなる.). を含む部分ァミノ酸 配列、 あるいはさらに細胞內ドメイン （および膜近傍/膜貫通ドメイン） （配列 番号： 2に'示されるアミノ酸配列中アミノ酸香号63〜 208で示されるアミノ酸配 列からなる） を有するものなどが用いられる。
好ましくは、 HB-EGF部分ペプチドとして、 40個以上のアミノ酸、 より好まし くは 80個以上のァミノ酸、 さらに好ましくは 140個以上のアミノ酸を有するぺプ チドなどが用いちれる。
また、 HB- EGF部分ペプチドは C末端がカルボ'キシル基 （- C00H)、 カルボキシ レ ト （-COP―)、 アミ ド （_C0NH2) またはエステル . (-C00R) の何れであっても' よい。 ここでエステルにおける Rとしては、 HB- EGFについて前記したと同様のも のが挙げられる。 HB-EGF部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基 （または力 ルポキシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステ ル化されているものも HB-EGF部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルと しては、 例えば、 C末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、 HB- EGF部分ペプチドには、 上記した HB - EGFと同様に、 N.末端のァミノ 酸残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N末端のグルタミン残基がピ 口グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基 で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合 ペプチドなども含まれる。
HB-EGFまたはその部分ペプチドの塩としては、 酸 （例： 無機酸、'有機酸） や 塩基 （例： アルカリ金属） との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ 生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機 酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例 えば、 齚酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン 酸） との塩などが用いられる。
HB-EGFまたはその塩は、 前述した温血動物の細胞または組織から自体公知の 蛋白質の精製方法によって製造することができる。 具体的には、 温血動物の組織 または細胞をホモジナイズし、 低速遠心により細胞デブ.リスを除去した後、.上清 を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ （必要に応じて密度勾配遠心などに より細胞膜画分を精製し）、 該画分を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換ク口 マトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー 等に付すことにより HB-EGFまたはその塩を調製することができる。 HB - EGF部分 ぺプチドとして可溶性 HB- EGFを調製する場合は、 温血動物の組織または細胞を. 適当な培地中で培 *した後、 濾過もしくは遠心分離等により細胞を除去して得ら' れる培養上清を、 逆相クロマトグラフィー、 イオン^換クロマトグラフィー、 ァ フィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより. '得ることができる。 .
HB- GFもしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 「HB-EGF類」 と総称. する場合がある） は、 公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
'ペプチド合成法は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれであってもよい。 HB-EGF類を構成し得る部分べプチドもしくはァミノ酸と残余部分とを縮合し、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を 製造することができる。
ここで、' 縮合や保護基の脱離は、 自体公知の方法、 例えば、 以下の （1 )〜（5) に記載された方法に従って行われる。
( 1) M. Bodanszky and M. A. Ondet t i , Pepti de Syn tnesi s, I ntersc ience Pub l i shers, New York ( 1966)
(2) Schroeder and Luebke,. The Pe tide, Academi c Press, New York ( 1965)
(3) 泉屋信夫ら、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （1975)
(4) 矢島治明および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV 205 ( 1977) (5) 木曽良明および大髙章、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書 店 （1991 ) このようにして得られた蛋白質. （ペプチド） は、 公知の精製 により精製単 離することができる。 ここで、 精製法としては、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラ ムクロマトグラフィー、 液体クロャトグラフィ.一、 再結晶、 これらの組み合わせ などが挙げられる。.
上記方法で得られる蛋白質 （ペプチド） が遊離体である.場合には、 該遊離体 を公知の方法あるいはそれに準じる方法によつ、て適当な塩に変換することができ るし、 逆に蛋白質 （ペプチド） が塩として得られた場合には、 該诲を公知の方. 法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができ る。..
HB-EGF類の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 .ヒ ドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4-ベンジルォキシベンジルァ. ルコール'樹脂、 4-メチルベンズヒ ドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4-ヒ ドロキシメ チルメチルフエ二.ルァセ トアミ 'ドメチル樹脂、 ポリ ア..ク リルアミ ド樹脂、 4 - (2'，4' -ジメ トキシフエ二ル-ヒ ドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4- (2' , 4' -ジ メ トキシフエ二ル- Fmocァミノェチル）フエノキシ樹脂などを挙げることができ る。 このような樹脂を用い、 α-ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したァミノ 酸を、 目的とする蛋白質 （ペプチド） の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法 に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白 等を切り出すど同時 に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子內ジスルフイ ド結合形成反応 を実施し、 目的の蛋白質 （ペプチド） またはそのアミ ド体を取得する。
上記した保護ァミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性化 試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類がよい。 カルボジイミ ド 類と しては、 DCC、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルボジイミ ド、 Ν-ェチル -N' - (3-ジメ チルァミノプロリル）カルポジイミ ドなどが用いられる。 これらによる活性化に はラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H0Bt、 HOOBt) とともに保護アミノ酸を直接樹 脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または HOBtエステルあるいは HOOBtエス テルとしてあらかじめ保護ァミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加すること ができる。
保護アミソ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、 蛋白質縮合反応に 使用しうることが知られている溶媒から適： I：選択されうる。 例えば、 Ν，Ν-ジメ チルホルムアミ ド， Ν, Ν-ジメチルァセ トアミ ド， Ν-メチル.ピロリ ドンなどの酸 アミ ド類、 塩化メチレン，， クロ.口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、. 卜リフノレ ォロエタノールなどのァノレコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド 類、 ピリジンなどのアミン類、 ジォキサン， テトラヒ ドロフランなどのエーテル 類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェ チルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温 度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲か.ら適宜選択さ れ、 通常約- 20°C〜50°Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導 体は通常 1. 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテス トの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことに. より十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られ ないときには、 無水酢酸またはァセチルイ.ミダゾールを用いて未反応ァミノ酸を ァセチル化することができる。 .
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 1、 Boc、 ターシャリー ンチル ォキシカルボ二ノレ、 イソボル二/レオキシカルボ二ノレ、 4-メ トキシベンジ /レオキ シカノレポニル、 Cl-Z、 Br- Z、 ァダマンチノレオキシカノレボニ^/、 トリフノレオロア セチノレ、 フタ ロイノレ、 ホノレミノレ、 2-ニ ト ロ フエニノレスノレフエ二ノレ、 ジフエ二ノレ ホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2-ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化）、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステ. ノレ、 4—二十口べンジノレエステノレ、 ' 4—メ.トキシベンジノレエステノレ、 4—クロ口ベン ジルエステル、 ベンズヒ ドリルエステル化） > フエナシノレエステル化、 ベンジノレ ォキシカルボニルヒ ドラジド化、 ターシャリーブトキシカルボニルヒ ドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによって保護することができる。 . .
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテルィ匕によって保護するこ . とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などめ低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボ二ノレ 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される'基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒ ド.ロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bzl、 Cl2- Bzl、 2 -ニトロベンジル、 . Br- Z、 タージャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイ ミダゾールの保護基と しては、 例えば、 Tos、. 4-メ トキシ- 2, 3, 6-ト リメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ペンジノレオキシメチノレ、 Bum, Boc、 Trt、 Fmocなどが用いられる。 .
保護基の除去 （脱離） 方法と しては、 例えば、 Pd-黒あるいは Pd-炭素などの 触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリ フノレオロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの 混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ウム による還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約- 20°C〜 40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノ —ル、 チオアエソール、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチノレスノレフイ ド、 1， 4-ブタンジチオール、 1 , 2-エタンジチオールなどのよ うなカチオン捕捉剤の 添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により [^去され、. トリプトファ ンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は ±記の 1， 2-エタンジチォ ール、 1 , 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水 酸化ナトリゥム溶液、 希アンモニアなどによるアル力リ処理によっても除去され る。，
原料のカルボキシル基の活性化されたものと.しては、 例えぱ、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル [アルコーノレ （例えば、 ペンタクロロ： 7ェノール、 2， 4, 5-ト リ クロ口フエノーノレ、 2， 4-ジニ トロフエノーノレ、 シァノメチノレアノレコ' 一ノレ、 ノヽ0ラニ トロフエノール、 H0 B、 N-ヒ ドロキシスクシミ ド、 N-ヒ ドロキシ フタルイミ ド、 HOBt) とのエステル] などが用いられる。 原料のァミノ基の活 性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ.ドが用いられる。
蛋白質 （ペプチド） のアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 力 ルポキシ末端アミノ酸の α-カルボキシル基をアミ ド化して保護した後、 ァミノ 基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端の α-ァ, ミノ基の保護基のみを除いた蛋白質 （ペプチド） と C末端のカルボキシル基の保 護基のみを除去した蛋白質 （ペプチド） とを製造し、 この両蛋白質 （ペプチド） を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同 様である。 縮合により得られた保護蛋白質 （保護ペプチド） を精製した後、 上 記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗蛋白質 （粗ペプチド） を得る ことができる。 .この粗蛋白質 （粗ペプチド） は既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質 （ペプチド） の Τミ ド体 を得ることができる。
蛋白質 （ペプチド） のエステル体は、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の α- カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しァミノ酸エステルとした後、 上記 蛋白質 （ペプチド） のアミ ド体の場合と同様にして得ることができる。
ΗΒ- EGF部分ペプチドまたはその塩は、 HB-EGFまたはその塩を適当なぺプチダ ーゼ （例えば、 ADAM9、 ADAM 12等） で切断することによつても製造することがで きる。.
さらに、 HB- EGF類は、 HB-EGFまたはその部分べプチドをコ一ドする核酸を含 有する形質転換体を培養し'、 得られる培養物から HB-EGF類を分離精製すること によ όて製造することもできる。 HB- EGFまたはその部分べプチドをコードする 核酸は DNAであっても RNAであってもよく、 あるいは DNA/RNAキメラであってもよ い。 好ましくは DNAが挙げられる。 また、 該核酸は二本鎖であっても、 一本鎖で あってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA : RNAのハイブ リ ツ ドでもよレ、。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード鎖） であっても、 · アンチセンス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。
HB-EGFまたはその部分ペプチド.をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ヒ ト もしくは他の温血動物 （例えば、 サル、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥ サギ、 マウス、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ハムスター、 ニヮ トリなど） の細胞 [例. えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝 0細胞、 骨髄細胞、 メサンギ ゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 '表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑. 筋細胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 筋細胞、 脂肪糸田胞、 免疫細胞 （例： マクロフ ァージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球）、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細 胞など] またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例： 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大 脳皮質、 延髄、 小脳）、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例： 大腸、 小腸）、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂 肪組織 （例： 褐色脂肪組織、 白色脂肪組織）、 骨格筋など] 由来の cDNA (cRNA)、 合成 DNA (RNA) などが挙げられる。 HB-EGFまたはその部分ペプチドをコードす るゲノム DNAおよび cDNAは、 上記した細胞 ·組織より調製したゲノム DNA画分お よび全 RNAもしくは tnRNA画分をそれぞれ铸型と して用い、 Po l ymerase Chai n React ion (以下、 「PCR法」 と略称する） および Reverse Transcriptase_PCR (以下、 「RT- PCR法」 と略称する） によって直接増幅することもできる。 あるい は、 HB-EGFまたはその部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDNAは、 上 IE した細胞 '組織より調製したゲノム DNAおよび全 RNAもしくは mRNAの断片を適当 なべクター中に挿入して調製されるゲノム DNAライブラリ一および cDNAライブラ リ一から、 コロニーもしくはプラークハイブリダイゼ—ション法または PCR法な どにより、 それぞれクローユングすることもできる。 ライブラリーに使用するべ クタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいず. れであってもよい。
HB- EGFをコードする核酸としては、 例えば、 配列番号： 1で表される塩基配列 (但し、 該核酸が RNAの場合、 該塩基配列中の 「t」' は 」 と読み替える） を含 有する核酸、 または配列番号： 1で表される塩基配列の相補鎖配列とス ト'リ ンジ ェン トな条件下でハイブリダィズし得る塩基配列を含有し、 前記した HB-EGFど 実質的に同質の活性 [例： EGFRへの結合活性、 肝保護 （肝障害抑制） 作用、 ァ ポトーシス （肝細胞死） 抑制作用、 肝再生 （肝細胞の分化および/または分 ) 誘導作用など] を有する蛋白質をコードする核酸などが挙げられる。 ' 配列番号： 1で表される塩基配列の相補鎖配列とス トリンジェン卜な条件下で ハイブリダィズし得る核酸とし は、 例えば、 配列番号： 1で表される塩基配列 と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 さらに好ましくは約 80%以上、 特に好まし くは約 90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional Center for B iotechno logy Informat ion Basi c Local Al i gnment Search Tool ) を用い、 以下の条件 （期待値 =10 ; ギャップを許す； フィルタリ ング =0N ; マッチスコア =1 ; ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。 塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、 上記したァミノ 酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダィゼーシ.ヨ ンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え {i 、 Molecular Cloning, 2nd ed. (J. Sambrook et a l . , Col d Spri ng Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 ハイブリダィゼーシヨンは、.添付の 使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 ハイプリダイゼーシヨン は、 好ましくは、 ハイス トリンジェントな条件に従って行なうことができる。 ス トリ ンジェン卜な条件としては、 （1 ) 洗^に低イオン強度及び高温、 例え ば、 50°Cで 0. 015 M 塩化ナトリゥム /0. 0015 クェン酸ナトリゥム /0. 1% 硫酸 ドデシルナトリ ウムを使用し、 （2) ホルムアミ ドのような変性剤、 例えば、 . 0. 1% ゥシ血清アルブミン /0. 1% フィ コール /0. 1% ポリ ビエルピロ リ ドン/ 750 mM 塩化ナトリウム、 75 mM クェン酸ナトリゥムを含む 50 m リン酸ナトリウム 緩衝液. （pH 6. 5) とともに、 ち0% (ν/ν) ホルムアミ ドを 42。Cで使用することを 特徴とする反応条件が例示される。 あるいは、 ス小リンジェントな条件は、 50% ホノレムァミ ド、 5xSSC (0. 75 M NaCl、 0. 075 クェン酸ナトリ ウム）、 50 mM リン酸ナトリ ウム （pH 6. 8)、 0. 1% ピロ燐酸ナトリウム、 5xデンハート溶液、 ； 超音波処理鮭.精子 DNA (50 g/ml)、 0. 1% SDS、 及び 10% 硫酸デキス トランを 42°Cで使用し、 0. 2xSSC及び 50% ホルムアルデヒ ドで 55°Cで洗浄し、 続いて 55。C で EDTAを含有する 0. l xSSCからなる高ス トリンジェント洗浄を行うものであって もよい。 当業者は、 プローブ長^のファクターに応じて、 ハイブリダィゼーショ ン反応および/または洗浄時の温度、 緩衝液のイオン強度等を適宜調節すること により、 容易に所望のス トリンジエンシーを実現することができる。
HB-EGFをコードする核酸は、 好ましくは、 配列番号： 1で表される塩基配列で 示されるヒ ト HB-EGFをコードする塩基配列を含有する核酸 （GenBankァクセッシ ヨン番号： NM— 001945)、 あるいは他の温血動物におけるそのオルソログ [例え ば、 GenBankにそれぞれァクセッション番号■— 010415、 NM_012945、 XM_601210、 NM_214299、 AF069753および删— 204849として登録されているマウス、 ラッ ト、 ゥシ、 ブタ、 チャイニーズハムスターおよびュヮ トリオルソログ （それぞれヒ ト HB-EGF cDNAに対して約 83%、 約 83%、 約 74%、 約 88%、 約 74%および約 63%の同 一性を有する） 等] である。
HB-EGF部分ペプチドをコードする核酸は、 配列番号： 2に示されるアミノ酸配. 列の一部と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するぺ チドをコ一 K する塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 上記した細胞 ·組織由来の cDNA (cRNA)、 合成 DNA (RNA) のいずれでもよ い。 ライブラリーに使用するベクターは、 バタテリオファージ、 プラスミ ド、 コ スミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 '組織よ り調製した mRNA画分を用いて直接 RT-PCR法によって増幅するこどもできる。 ' ， 具体的には、 HB-EGF部分ペプチドをコードする核酸としては、 例えば、 （1 ) 配列番号： 1で表される塩基配列の部分塩基配列を有する核酸、 または（2) 配列 番号： 1で表される塩基配列を有する核酸とス ト リ ンジェン卜な条件下でハイブ リダィズする塩基配列を有し、 前記した HB- EGFと実質的に同質の活性 [例:. EGFRとの結合活性、 肝保護 (肝障害抑制） 作用、 アポ.トーシス （肝細胞死） 抑 制作用、 肝再生 （肝細胞の分化および/または分裂） 誘導作用など] を有するぺ プチドをコードする核酸などが用いられる。
配列番号： 1で表される塩基配列とス トリンジヱントな条件下でハイプリダイ ズできる DNAとしては、 例えば、. 該塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 特【こ好ましくは約 85%以上の同一性を有する塩基配 列を含有する核酸などが用いられる。
HB-EGFまたはその部分ペプチドをコードする DNAは、 該 HB-EGFまたはそめ部分 ぺプチドをコ一ドする塩基配列の一部分を有する合成 DMプライマーを用いて PCR法によって増幅するか、 または適当な発現ベクターに組み込んだ DNAを、 HB - EGF蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 DNAを標識し たものとハイブリダイゼ一ションすることによってクローニングすることができ る。 ハイブリダィゼ一シヨ ンは、 例えば、 Mo l ecu l ar Cl on i ng, 2nd ed. (前 述） に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用する場合、 ハイブリダィゼーシヨンは、 該ライブラリーに添付された使 用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 .
DNAの塩基配列は、 公知のキッ ト、 例えば、 MutanTM- super Expres s Km (宝酒 造 （株）） 、 Mutan™-K (宝酒造 （株）） 等を用いて、 ODA-LA PCR法、 Gapped dup l ex法、 Kunke l法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って 変換することができる。'
クローン化された DNAは、 目的によりそのま 、 または所望により制限酵素で 消化するか、 リンカ一を付加した後に、 使用することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コ ドンとしての ATGを有し、 また 3'末端側には翻訳終止コ ドン としての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コ ドンや翻 訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用:いて付加することができる。
. HB-EGFまたはその部分ペプチドをコードする 人を含む発現ベクターは、 例え ば、 HB- EGFをコ一ドする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 該 DNA断片を適. 当な発現^ クター中のプロモーターの下流に連結することにより製造す ことが できる。 ' .
発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例： pBR322、 pBR325、 pUC 12、 pUC 13)、 枯草菌由来のプラスミ ド （例： pUB 1 10、 pTP5、 pC194)、 酵母 由来プラスミ ド （例： pSH19、 pSH 15)、 昆虫細胞発現プラスミ ド （例： pFast- Bac) , 動物細胞発現プラスミ ド （例： pA l- l l、 pXT l、 pRc/CMV、 pRc/RSV , pcDNAI/Neo) えファージなどのバクデリオファージ,、 バキュロウィルスなどの 昆虫ウィルスベクター （例： BmNPV、 AcNPV)、 レ トロゥイノレス， ワクシニアウイ ルス， アデノウイルス， アデノ随伴ウィルスなどの動物ウィルスベクターなど が用いられる。
プロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー ターであればいかなるものでもよい。
例えば、 宿主が動物細胞である場合、 サイ トメガロウィルス （CMV) 由来プロ モーター （例： CMV前初期プロモーター）、 ヒ ト免疫不全ウィルス （HI V) 由来プ 口モーター （例： HI V LTR)、 ラウス肉腫ウィルス （RSV) 由来プロモーター (例： RSV LTR)、 マウス乳癌ウィルス （MMTV) 由来プロモーター （例： MMTV LTR)、 モロニ一マウス白血病ウィルス （MoMLV) 由来プロモーター （例： MoMLV LTR) 、 単純へルぺスウィルス （HSV) 由来プロモーター （例： HSVチミジンキナ ーゼ （TK) プロモータ一）、 SV40由来プロモーター （例： SV40初期プロモータ ―)、 ェプスタインバ一ウィルス （EBV) 由来プロモータ一、 アデノ随伴ウィル ス （AAV) 由来プロモーター .（例： AAV p5プロモーター）、 アデノ ウイルス (AdV) 由来プロモーター （Ad2または Ad5主要後期プロモーター） などが用いら れる。 ■ 宿主がェシェリヒァ属菌である ¾合、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモーター、 1 PLプロモーター、 lppプロモーター、 T7プロモーターなど 'が好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、 SP01プロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーターなどが好ましい。
'宿主が酵母である場合、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモー タ一、 ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、 ポリヘドリ ンプロモータ一、 P 10プロモーターな どが好ましい。
発現ベクターとしては、 上記の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシン グシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製起点などを含有して いるものを用いることができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 'ジヒ ドロ葉酸 還元酵素 （dhfr) 遺伝子 [メソ トレキセート （MTX) 耐性]、 アンピシリン耐性 (Ampr) 遺伝子、 ネオマイシン耐性 （Neo 遺伝子 （G418耐性） 等が挙げられる, 特に、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター （CH0- dhfr-) 細胞を用い、 dhfr 遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培 地によって選択することもできる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列 （シ グナルコ ドン） を、 HB-EGFまたはその部分ペプチドをコードする DNAの 5'末端側 に付加してもよい。 宿主がェシエリ ヒア属菌である場合、 PhoAシグナル配列、 OmpAシグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合、 α-アミラーゼシグ ナル配列、 サブチリシンシグナル配列などが、 宿主が酵母である場合、 MFaシグ ナル配列、 SUC2シグナル配列などが、 宿主が動物細胞である場合、 インシユリ ンシグナル配列、 a-インターフェロンシグナル配列、 抗体分子シグナル配列な どがそれぞれ用いられる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。 ' ■ ェシエリ ヒア属菌と しては、 例えば、 Escherichia ゾ K12、 DH1、 JM103、
；■ ノ ■
JA221、 HB.101、 C600などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 Bacillus subtil is MI 114, 207-21などが 用いられる。
酵母と しては、
Figure imgf000023_0001
· Sacc aromyces cerevisiae AH22 AH22R―、 NA87- 11A、 DKD-5D, 20B_12、 Schizosaccharomyces po be CYC1913, NCYC2036、 ■ 尸 ? pas ion's KM71などが用レヽられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルス力 SAcNPVの場合、 夜盗蛾の幼虫由来株化 細月包 {Spodoptera frugi erda. cell； Sf ^ffl^) Trichoplusia ? の中月昜由来 の MG1細'月包、 Trichoplusia /? の卵由 来の High Five™細月包、 Mamestra ^asw'cae由来の細胞、 Estigmena acres由来の細胞などが用いられる。 ヴィノレ スが BmNPVの場合、 昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞 otnbyx mori 細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 Sf細胞と しては、 例えば、 Sf9細胞 （ATCC CRL1711)、 Sf21細胞 （以上、 . Vaughn, J.し et al. , In Vivo, 13： 213-217 (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる。
動物細胞と しては、 例えば、 サル由来細胞 （例： COS- 1、 COS- 7、 CV- 1、 Vero)、 ハムスター由来細胞 （例： BHK、 CH0、 CH0_K1、 CH0- dhfr―)、 マウス由 来細胞 （例： NIH3T3、 し、 L929、 CTLL- 2、 AtT-20)、 ラッ ト由来細胞 （例： Η4ΠΕ·、 PC- 12、 3Y 1、 NBT - 11 )、 ヒ ト由来細胞 （例： HEK293、 A549、 He La , HepG2、 HL- 60、 Jurkat, U937) などが用いられる。
形質転換は、 宿主の種類に^じ、 公知の方法に従って実施することができる。 ' ェシエリ ヒ ア属菌は、 例えば、 Pro Na tl. Acad. Sci. USA, 69： 21 10 ( 1972) や Gene, 17： 107 ( 1982) などに記載の方法に従って形質転換すること ができる。
ノくチノレス属菌は、 例えば、 Molecular and General Gene tics, 168： 1 1 1 ( 1979) などに記載め方法に従って形質転換することができる。 ■ 酵母 {ま、 例え f 、 Me thods in Enzymology, 194： 182— 187 ( 1991)、 Proc, Na tl. Acad. Sci. USA, 75： 1929 ( 1978) などに記載の方法に従って形質転換 することができる。
昆虫細胞および昆虫は、 例えば、 Bio/Technology, 6： 47-55 ( 1988) などに. 記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は； 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学-実験プロ トコール， .263-267. ( 1995) (秀潤社発行）、 Virology, 52： 456 ( 1973) に記載の方法に従って形 転換することができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、 HB- EGF類を自体公知の方法 に従って分離精製することができる。
例えば、 HB-EGF類を培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、 培養 . 物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 . リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、 遠心分離やろ過により可溶性 白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 該緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X- 100TMな どの界面活性剤を含んでいてもよい （界面活性剤を含む場合は、 膜蛋白質ゃォ ルガネラ蛋白質の一部もしくは全部も同時に抽出され得る）。 一方、 膜画分から HB-EGF類を抽出する場合は、 上記と同様に菌体あるいは細胞を破壊した後、 低 速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、 上清を高速遠心して膜含有画分を沈澱させ る （必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分、. ミ トコンドリァ画分、 核画分などを分離精製することもできる） などの方法が用いられる。 また、 HB- EGF類が菌体 （細胞） 外に分泌される場合には、 培養物から遠心分陣またはろ過 等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、 膜画分あるいは培養上清中に含まれる HB- EGF類の単離精製は、 自体 知の方法に従って行うことができる。 このよ う な方法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法； 透析法、 限 外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS-ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動法など ;の, . 主として分子量の差を利用する方 ； イオン交換クロマドグラフィーなどの荷 電の差を利用する方法； ァフィ二ティーグ口マトグラフィーなどの特異的親和 性を利用する方法； 逆相高速液体クロマ トダラフイ一などの疎水性の差を利用 する方法； 等電点電気泳動法などの等電点の.差を利用する方法； などが用いら. れる。 これらの方法は.、 適宜組み合わせることもできる。
'かぐして得ちれる HB-EGFまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、 . 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換するこ ί ができ、 該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することがで きる。 ' '
なお、 形質転換体が産生する HB-EGF類を、 精製前または精製後に適当な蛋白 質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリ'ペプチ を部 分的に除去することもできる。 該蛋白質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモト リブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリ コ シダーゼなどが用いられる。
かく して得られる HB-EGF類の存在は、 それらに特異的な抗体を用いたェンザ ィムィムノアツセィゃウェスタンブロッテイングなどにより確認することができ る。
さらに、 HB- EGFまたはその部分ペプチドは、 それをコードする DNAに対応する RNAを铸型として、 ゥサギ網状赤血球ライセート、 コム 胚芽ライセ一ト、 大腸 菌ライセ一トなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳すること によっても合成することができる'。 あるいは、 さらに RNAポリメラーゼを含む無 細胞転写/翻訳系を用いて、 HB- EGFまたはその部分ぺプチドをコ一ドする DNAを 铸型としても合成することができる。 無細胞蛋白質転写/翻訳系は市販のものを 用いることもできるし、 それ自体既知の方法、 具体的には大暍菌抽出液は Pratt, J. . et al. , Transcript ion and Tranlation, Hames, B. D. and Higgins, S.J. eds.， IRL Press, Oxford 179-209 (1984) に記載の方法等に準じて調 製することもできる。 市販の細胞ライセートと しては、 大腸菌由来のものは E. coli S30 extract system (Promega社製） や RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製） 等が挙げられ、 ゥサギ網^赤血球由来のものは Rabbi t Reticulocyte Lysate System (Promega社製） 等、 さらにコムギ胚芽由来のも のは PR0†EI0STM (T0Y0B0社製） 等が挙げられる。 このうちコムギ胚芽ライセー トを用いたものが好適である。 コムギ胚芽ライセートの作製法としては、 例えば Johnston, F.-B. et al. , Nature, 179 160— 161 (1957) あるレヽは Erickson, A.H. et al. , Meth. Enzymol. , 96 38-50 (1996) 等に記載の方法を用いる ことができる。
蛋白質'合成のためのシステムまたは装置と しては、 バッチ法 （Pratt, J. M. et al. (1984) 前述） や、 アミノ酸、 エネルギー源等を連続的に反応系に供給 する連続式無細胞蛋白質合成システム. （Spirin, A. S. et al. , Science, 242 1162-1164 (1988))、 透析法 （木川ら、 第 21回日本分子生物学会、 WIEi6)、 ある レヽは重層法 (PR0TEI0S™ Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書： T0Y0B0社製） 等が挙げられる。 さらには、 合成反応系に、 铸型 の RNA、 アミノ酸、 エネルギー源等を必要時に供給し、 合成物や分解物を必要時 に排出する方法 （特開 2000-333673) 等を用いることができる。
HB- EGFは、 肝保護 （肝障害抑制） 作用、 アポトーシス （肝細胞死） 抑制作用、 肝再生 （肝細胞の分化および/または分裂） 誘導作用などを示すので、 HB- EGF類、 あるいは HB-EGFまたはその部分ペプチドをコードする核酸は、 肝保護剤、 肝細 胞のアポトーシス抑制剤、 .肝再生促進剤としての用途を有しており、 肝障害、 肝 細胞死を伴う種々の疾患、 例えば、 急性肝障害 （劇症肝炎、 急性肝炎、 薬剤 14 肝炎）、 慢性肝炎、 .自己免疫性肝疾患 （自己免疫性肝炎、 原発性胆汁性肝硬変）、 ウィルス性肝炎 （A- E型）、. 肝線維症、 肝硬変、 肝癌、 アルコール性肝障害、 薬 剤性肝障害 （中毒性薬剤性肝障害、 アレルギ^"性薬剤性肝障害）、 肝膿瘍、 肝寄 生虫症 （日本住血吸虫症、 肝吸虫症）、 肝アミロイ ド一シス、 ルポイ ド肝炎） 等 の肝疾患の予防 ·治療、 あるいは肝切除術、 肝移植後の肝再生の促進に使用する, . ことができる。
( 1 ) HB- EGF類を含有する肝保護 ·肝再生促進剤
HB-EGF類を含有する肝保護 '肝再生促進剤は、 投与から数時間で効果を奏す ることにより、 急性の肝疾患、 特に炎症によって肝細胞死を伴う急性肝疾患に好. 適に用いることができる。 しかしながら、 後述するように、.徐放性製剤の剤形を とったり、 あるいは抗体とィムノコンジュゲートを形成させて安定性を向上させ, ることにより、- 慢性肝炎、 肝線維症、 肝硬変など慢性的な疾患に う肝細胞の 弊や細胞死を防止するための予防 ·進行抑制剤としても好ましく用いることがで きる。
HB-EGF類は原体のまま用いてもよいが、 必要に応じて薬理学的に許容し得る 担体とともに混合して医薬組成物とした後に、 上記医薬として用いることもでき る。
ここで、 薬理学的に許容される担体としては、 製剤素材として慣用の各種有機 あるいは無機担体物質が用いられ、 固形製剤における賦形剤、 滑沢剤、 結合剤、 崩壊剤； 液状製剤における溶剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張化剤、 緩衝剤、 無痛化剤などとして配合される。 また必要に応じて、 防腐剤、 抗酸化剤、 着色剤、 甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 D-マンニトール、 D-ソルビトール、 デンプン、 α化デンプン、 デキス トリン、 結晶セルロース、 低置換度ヒ ドロキシ プロピノレセノレロース、 カルボキシメチルセルロースナトリ ウム、 ァラビアゴ 、 プルラン、 軽質無水ケィ酸'、 合成ケィ酸アルミニウム、 メタケイ酸アルミン酸マ グネシゥムなどが挙げられる。 ' 滑沢剤の好適な例としては、 ステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸カルシ ゥム、 タルク、 コロイ ドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、 α化デンプン、 ショ糖、 ゼラチン、 アラビアゴム、 メチルセル口 ス、 カルボキシメチノレセルロース、.カノレボキシメチノレセノレロース ナ ト リ ウム、 結晶セルロース、 白糖、 D-マンニ トーノレ、 トレハロース、 デキス, . トリン、 プノレラン、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロ.キシプロピノレメチノレ セルロース、 ポリビュルピロリ ドンなどが挙げられる。 '
崩壊剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 デンプン、 ,カルボキシメチルセ/レロ ース、 カルボキシメチノレセルロースカルシゥ 、 クロスカノレメ ロースナトリ ウム、 カルボキシメチルスターチナ小リ ウム、 軽質無水ケィ酸.、 低置換度ヒ ドロキシプ 口'ピルセルロースなどが拳げられる。
溶剤の好適な例としては、 注射用水、 生理的食塩水、 リンゲル液、 アルコール、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ゴマ油、 トウモロコシ油、 ォ リーブ油、 綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコ ール、 D-マンニ トーノレ、 ト レハロース、 安息香酸ベンジル、 エタノーノレ、 ト リ スァミノメタン、 コレステロール、 トリエタノールァミン、 炭酸ナ トリ ウム、 ク ェン酸ナトリウム、 サリチル酸ナトリ ウム、 酢酸ナトリウムなどが挙げちれる。 懸濁化剤の好適な例としては、 ステアリノレトリエタノールァミ ン， ラウリノレ 硫酸ナトリ ウム， ラウリルアミノプロピオン酸， レシチン， 塩化ベンザルコニ ゥム， 塩化べンゼトニゥム， モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、 例えばポリ ビュルアルコール， ポリ ビニルピロ リ ドン， カルボキシメチルセル ロースナ ト リ ウム， メチノレセノレロース， ヒ ドロキシメチノレセノレロース， ヒ ドロ キシェチルセルロース， ヒ ドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子、 ポリソルベート類、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、 塩化ナトリ ウム、 ダリセリン、 D -マンニトー ル、 D-ソルビトール、 ブドウ鰭などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、 リン酸塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェン酸塩などの緩 衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては.、 ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、 パラォキシ 息香酸エステル類、 クロロブタノ一 ノレ、 ベンジルアルコール、 フエネチルアルコ"ル、 デヒ ドロ酢酸、 ソルビン酸な. どが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、 亜硫酸塩、 ァスコルビン酸塩などが挙げられる。 着色剤の好適な例としては、 水溶性食用タール色素 ， (例： 食用赤色 2号および 3号、 食用黄色 4号および 5号、 食用青色 1号および 2号などの食用色素）、 水不溶 性レーキ色素 （例： 前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、 天然色 素 （例： ]3 -カロチン、 クロロフ ル、 ベンガラなど） などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、 サッカリンナトリウム、 グリチルリチン酸二カリ ゥム、 アスパルテーム、 ステビアなどが挙げられる。
前記医薬組成物の剤形として.は、 例えば錠剤、 カプセル剤 （ソフ トカプセル、 マイクロカプセルを含む）、. 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などの経 口剤； および注射剤 （例： 皮下注射剤、 静脈内注射剤、 筋肉内注射剤、 腹腔内 注射剤など）、 外用剤 （例： 経鼻投与製剤、 経皮製剤、 軟膏剤など）、 坐剤 （例: 直腸坐剤、 膣坐剤など）、 ペレッ ト、 点滴剤、 徐放性製剤 （例： 徐放性マイクロ カプセルなど） 等の非経口剤が挙げられる。
医薬組成物は、 製剤技術分野において慣用の方法、 例えば日本薬局方に記載の 方法等により製造することができる。 以下に、 製剤の具体的な製造法について詳 述する。 医薬組成物中の有効成分の含量は、 剤形、 有効成分の投与量などにより 異なるが、 例えば約 0. 1ないし 100重量％である。
例えば、 経口剤は、 有効成分に、 賦形剤 （例： 乳糖、 白糖、 デンプン、 D-マ ンニトールなど）、 崩壊剤 （例: カルボキシメチルセノレロースカルシウムなど）、 結合剤 （例： α化デンプン、 アラビアゴム、 カルボキシメチルセルロース、 ヒ ド ロキシプロピルセルロース、 ポリ ビニルピロリ ドンなど） または滑沢剤 （例—： タルク、 ステアリン酸マグネシウム、 ポリエチレングリコール 6000など） など を添加して圧縮成形し、 次いで必要により、 味のマスキング、 腸溶性あるいは持 続性を目的として、 コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングす ることにより製造される。 . ' '
該コーティング基剤と.しては、 例えば糖衣基剤、 水溶性フィルムコ一ティング 基剤、 腸溶性フィルムコーティング基剤、 徐放性フィルムローテイング基剤など が挙げられる。
糖衣基剤として.は、 白糖が用いられ、 さらに、.タルク、 沈降炭酸カルシウム、 ゼラチン、 アラビアゴム、 プルラン、 カルナバロウなどから選ばれる 1種または 2種以上を併用してもよレ、。
一水溶性フィルムコーティング基剤としては、 例えばヒ ..ドロキシプロピルセル口 ース， ヒ ドロキシプロピノレメチノレセノレロース， 七 ドロキシェチノレセノレロー ， メチルヒ ドロキシェチルセルロースなどのセノレロース系高分子、 ホ°リビニノレアセ タ一ルジェチルァミノアセテート， アミノアルキルメタァクリ レートコポリマ 一 Ε [オイ ドラギッ ト Ε (商品名'） 、 ロームフアルマ社] , ポリビニルピロリ ドン などの合成高分子、 プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、 例えばヒ ドロキシプロピルメチル セノレロース フタレー ト， ヒ ドロキシプロピノレメチ /レセノレロース アセテートサ クシネート， カルボキシメチルェチルセノレロース， 酢酸フタル酸セノレロースな どのセルロース系高分子、 メタアクリル酸コポリマ一 L [オイ ドラギッ ト L (商 品名）、 ロームフアルマ社] , メタアクリル酸コポリマー LD [オイ ドラギッ ト L - 30D55 (商品名）、 ロームフアルマ社] , メタアクリル酸コポリマー S [オイ ドラ ギッ ト S (商品名）、 ロームフアルマ社] などのアクリル酸系高分子、 セラック などの天然物などが挙げられる。 徐放性フィルムコーティング S剤としては、 例えばェチルセルロースなどのセ ルロース系高分子、 アミノアルキルメタァクリ レートコポリマー RS [オイ ドラ ギッ ト RS' (商品名）、 ロームフアルマ社] , アクリル酸ェチル ' メタアクリル酸 メチル共重合体懸濁液 [オイ ドラギッ ト NE (商品名）、 ロームフアルマ社] など のアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、 その 2種以上.を適宜の割合で混合して用いても よい。 また、 コーティングの際 、 例えば酸化チタン、 三二酸化鉄等のような遮 光剤を用いてもよい。
非経口的な投与 （例えば、 皮下注射、 筋肉注射、 局所注入、 腹腔内投与など） に好適な製剤としては、 水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、 これ には抗酸化剤、 緩衝液、 制菌剤、 等張化剤等が含まれていてもよい。 また、 水性 および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、 これには懸濁剤、 可溶化剤、 増粘剤、 安定化剤、 防腐剤等が含まれていてもよい。 投与方法が標的部位付近への局所注 入の場合、 注射液剤が好ましい。 'あるいは、 コラーゲン等の生体親和性の材料を. 用いて、 徐放性製剤とすることもできる。 プル一口ニックゲルは体温でゲル化し、 それ以下の低温では液体であることから、 HB-EGF類をプル一口ニックゲルとと もに局所注入して標的組織周辺でゲル化させることにより、 長期持続性とするこ とができる。 当該蛋白質製剤は、 アンプルやバイアルのように単位投与量あるい は複数回投与量ずつ容器に封入することができる。 また、. HB- EGF類並びに薬理 学的に許容し得る担体を凍結乾燥し、 使用直前に適当な無菌のビビクルに溶解ま たは懸濁すればよい状態で保存することもできる。
肝細胞表面分子に対する抗体は、 肝細胞に薬剤を特異的に送達することができ るので、 HB - EGF類を該抗体に架橋したィムノコンジユゲートとすることにより、 HB-EGF類の血中安定性と肝細胞表面への送達効率を改善することができる。 肝 細胞表面分子としては、 EGFR (HER 1 ) , HER2、 HER3、 HER4などが挙げられるカ 、 それらに限定されない。 抗 EGFR抗体を用いる場合には、 EGFRからのシグナル伝 達を阻害しないように、 非中和抗体をタ一ゲッティング用抗体として用いること が望ましい。
肝細胞表面分子に対する抗体は、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の いずれであってもよいが、 好ましくはモノクローナル抗体である。 該抗体は周^ の免疫学的手法により作製することができる。 また、 該抗体は完全抗体分子であ つても、 フラグメントであってもよい。 フラグメントは、 肝細胞表面分子に対す る抗原結合部位 （CDR) を有する限りいかなるものであってもよく、 例えば、 Fab、 F (ab，）2、. ScFv、 mi n ibody等カ挙げられる。
モノクローナル抗体は、.細胞融合法 （例えば、 渡邊武、 細胞融合法の原理と モノクローナル抗体の作成、 谷内昭、 高橋利忠編、 「モノクローナル抗体とがん 一基^と臨床一」 、 2- 14、 サイエンスフォーラム出版、 （1985) ) により作成す ることができる。 例えば、 マウスに標的蛋白質 （必要,に応じて、 ゥシ血清アル ブミン、 KLH (Keyhol e L impet Hemocyani n) .等のキャリア蛋白質に架橋した複 合体とすることもできる） を抗原どして、 市販のアジュバントと共に 2〜4回皮 下あるいは腹腔内に投与し、.最終投与の約 3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取. し、 白血球を採取する。 この白血球と骨髄腫細胞 （例えば、 NS- 1、 P3X63Ag8 ど） を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイプリ ド 一マを得る。 細胞融合は PEG法 [ゾ. Immunol. Methods, 81 {2)：. 223-228 ( 1985) ] でも電圧パルス法 [Hybridoma, 7(6)： 627-633 ( 1988) ] であっても よい。 所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマは、 周知の EIAまた は RIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、 培養上清中から検出するこ とにより選択できる。 モノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマの培養は、 インビトロ、 またはマウスもしくはラット、 好ましくはマウス腹水中等のインビ ボで行うことができ、 抗体はそれぞれハイプリ ドーマの培養上清および動物の腹 水から取得することができる。
しかしながら、 ヒ トへの投与を考慮すると、 該抗体は、 ヒ トと他の動物 （例 えば、 マウス等） のキメラ抗体であることが好ましく、 ヒ ト化抗体であること がさらに好ましく、 完全ヒ ト抗体であることが最も好ましい。 ここで 「キメラ抗 体」 とは免疫動物由来の可変部 （V領域） とヒ ト由来の 常部 （C領域) を有す る抗体をいい、 「ヒ ト化抗体」 とは CDRを除いて他の領域をすベてヒ ト抗体に置 き換えた抗体をいいう。 キメラ抗体やヒ ト化抗体は、 例えば、 上記と同様の方法 により作製したマウスモノクローナル抗体の遺伝子から V領域もしくは CDRをコ —ドする配列を切り出し、 ヒ ト骨髄腫由来の抗体の C領域をコードする DNAと融 合したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、. これを適当な宿 主細胞に導入して該キメラ遺伝子を発現させることにより取得することができる。 また、 完全ヒ ト抗体は、 公知のファージディスプレイライブラリーを用いて、 あ' . るいはメダレックス社が開発したヒ ト抗体産生マウスゃメダレックス社とキリン が共同で開発した KMマウスを用いて取得することができる。
肝細胞表面分子に対する抗体と HB - EGF類との^橋法と しては、 Adv. Drug Deli v. Re v. , 53 171 -2 16 (200 1 ) に記載の方法が挙げられるが、 それらに限. 定されない。
'上記のような剤形に設計された HB-EGF類を含有する肝保護 ·肝再生促進剤は > 適当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、 例えば、 哺乳動物 （例えば、' ヒ ト、 ヲッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対し て経口的又は非経口的に投与され得る。 非経口的投与経路としては、 例えば、 静 脈内、 動脈内、 筋肉内、 腹腔内、 気道內等が挙げられる。
HB-EGF類を含有する肝保護 ·肝再生促進剤の投与量は、 有効成分の分子量、 投与経路、 病気の重篤度、 投与対象となる動物種、 投与対象の薬物受容性、 体重、 年齢等によって異なるが、 通常、 成人 1日あたり有効成分量として約 0. 05〜約 10 mg/kg , 好ましくは約 0. 1〜約 mg/kgの範囲であり、 これを 1回もしくは数回に 分けて投与することができる。
(2) HB- EGF類をコードする核酸を含有する肝保護 ·肝再生促進剤
HB-EGF類をコードする核酸は、 長期の遺伝子発現により長期間 HB- EGF類を産 生し得るので、 持続的な治療効果が期待できる。 そのため、 急性の肝疾患の予 防 ·治療効果に加えて、 慢性肝炎、 肝線維症、 肝硬変などの慢性的な肝疾患に伴 う肝細胞の疲弊や細胞死を防止するための予防 ·進行抑制剤としても好ましく用 いることができる。
HB-EGF類をコードする核酸は、 適当な発現べクター上に担持された形態で 与されることが好ましい。 当該発現ベクターは、 HB-EGF類をコードする核酸が 投与対象である哺乳動物の標的細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモー ターに機能的に連結されているか、 あるいは投与された動物の標的細胞内で、 一 定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置される。 使 用されるプロモーターは、 投与対象である哺乳動物の標的細胞内で機能し得 も のであれば特に制限はないが 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) 由来プロ モーター （例： CMV前初期プロモータ一）、 ヒ ト免疫不全ウィルス （HI V) 由来:/ 口モーター （例： H I V LTR)、 ラウス肉腫ウィルス （RSV) 由来プロモーター (例： RSV LTR)、 マウス乳癌ウィルス （MMTV) 由来プロモーター （例： MMTV LTR)、 モロニ一マウス白血病ウィルス （MoMLV) 由来プロモーター （例： MoMLV LTR)、 単純べルぺスウィルス （HSV) 由来プロモーター （例： HSVチミジンキナ ーゼ （TK) プロモーター）、 SV40由来プロモーター （例： SV40初期プロモータ 一）、 ェプスタインバーウィルス （EBV) 由来プロモーター、 アデノ随伴ウィル ス （AAV) 由来プロモーター （例： AAV p5プロモーター）、 アデノ ウイルス (AdV) 由来プロモーター （Ad2または Ad5主要後期プロモーター） 等のウィルス プロモーター、 並びに β-ァクチン遺伝子プロモーター、 PGK遺伝子プロモーター、 トランスフェリ ン遺伝子プロモータ一等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモー ターなどが挙げられる。 「一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得る ような位置に配置される」 とは、 例えば、 以下でさらに詳述するように、 プロモ 一ターと HB-EGF類をコ一ドする核酸が、 該プロモーターからの該核酸の発現を 妨げるのに十分な長さを有するスぺーサー配列により隔てられた、 同方向に配置 される 2つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有し、 該認識配 列を特異的に認識するリコンピナーゼの存在下に該スぺーサー配列が切り出され て、 ΗΒ- EGF類をコードする核酸がプロモーターに機能的に連結されるように配 置されるこどをいう。
該発現べクタ一は、 好ましくは HB-EGF類を.コードする核酸の下流に転写終結 シグナル、. すなわちターミネータ一領域を含有する。 さちに、 形質転換細胞選択 のための選択マーカー遺伝子 （テ トラサイク リ ン、 アンピシリ ン、 カナマイシ ン、 ハイグロマイシン、 ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する 遺伝子、 栄養要求性変異を相補する遺伝子等） をさらに含有することもできる。 発現べクターが上述のようにリ コンビナーゼ認識配列に挟まれたスぺーサー配列 を有する場合、 該選択マーカー遺伝子は当該スぺーサー配列内に配置することも, できる。 ■ . ' ·
本 ¾明の発現ベクターに使甩されるベクターは特に lj限されないが、 ヒ ト等の 哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、 レ トロゥ.ィルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ゥイノレス、 へノレぺスゥイノレス、 単純へルぺスウィルス、 レンチウイノレ ス、 ワクシニアウイノレス、 ボックスゥイノレス、 ポリオゥイノレス、 シンドビスウイ. ルス、 センダイウィルス等のウイソレスべクタ一が挙げられる。 アデノウイルスは、 遺伝子導入効率が極めて高く、 非分裂細胞にも導入可能であり、 導入遺伝子の宿 主染色体への組込みが極めて稀である等の利点を有する。 特に、 パッケージング シグナル （ ) 以外のアデノウイルスゲノムのほぼ全長を導入遺伝子に置換し た gutted ' (gut less) ベクターと呼ばれる次世代ベクターの開発によって、 第一 世代ベクターにおける免疫原性の問題が解消され、 また、 それに伴い導入遺伝子 発現の長期持続性が実現されたことにより、 遺伝子治療におけるアデノウィルス の有用性はさらに增している。 同様に、 アデノ随伴ウィルスも、 比較的遺伝子導 入効率が高く、 肝細胞を含む非分裂細胞にも導入可能で、 動物実験で生体内投与 により導入遺伝子の発現が長期にわたって持続することが知られているので、 本 発明におけるウィルスベクターとして好ましい。
HB-EGF類の構成的且つ過剰な発現は、 当該遺伝子を導入された動物において 副作用を引き起こす場合も考えられる。 従って、 本発明の好ましい態様において は、 発現ベクターは、 不要な時期及び/又は不要な部位での HB-EGF類の過剰発現 による悪影響を防ぐために、 HB-EGF類を時期特異的及び/又は標的細胞特異的に 発現させることができる。 このようなベクタ ^"の第一の実施態様としては、 投与 対象となる動物の標的細胞 （本発明においては、 好ましくは肝細胞であるが、 可溶性 HB- EGFを放出して肝臓に送達し得る細胞であれば特に制限はない） にお いて、 特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターに機能的に連結した HB-EGF 類をコードする核酸を含むベクターが挙げられる。 例えば、 肝臓特異的プロモー タ一としては、 血清アルブミンプロモータ一、 チトクローム P-450プロモーター、 または肝臓特異的転^因子. （HNF 1、 HNF3、 HNF4、 C/EBP等） 結合シスエレメント. を含むプロモーターなどが挙げら る。 .
本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターの第二の実施態様として、 外 因性の物質によってトランスに発現が制御される 導プロモーターに機能的に連 結した HB-EGF類をコードする核酸を含むべグターが挙げられる。 誘導プロモー ターと して、 例えば、，メタ口チォネイン- 1遺伝子プロモータ一を用いた場合、 金、 亜鉛、 カドミウム等の重金属'、 デキサメサゾン等の テロイ ド、 アルキル化. 剤、 キレート剤またはサイ ト力インなどの誘導物質を、 所望の時期に標的細胞の 位置に局所投与することにより、 任意の時期に標的細胞特異的に HB-EGF類の発 現を誘導することができる。
本発明の時期特異的且つ組織特異的発現ベクターの別の好ましい態様は、 プロ モーターと HB- EGF類をコードする核酸とが、 該プロモーターからの該核酸の発 現を妨げるのに十分な長さを有するスぺーサー配列により隔てられた、 同方向に 配置される 2つのリコンピナーゼ認識配列によって分断された構造を有するベタ ターである。 該ベクターが標的細胞内に導入されただけではプロモーターは HB - EGF類をコードする核酸の転写を指示することができない。 しかしながら、 所望 の時期に標的細胞に該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼを局所投与す るか、 あるいは該リコンビナーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを局所投 与して該リコンビナーゼを標的細胞で発現させると、 該認識配列間で該リコンビ ナーゼを介した相同組換えが起こり、 その結果、 該スぺーサー配列が切り出され、 HB-EGF類をコードする核酸がプロモーターに機能的に 結されて、 所望の B 期 に標的細胞特異的に HB- 類が発現される。 .
上記ベクターに使用されるリコンビナーゼ認識配列は、 投与対象に内在のリコ ンビナーゼによる組換えを防ぐために、 内在のリコンビナーゼによっては認識さ れない異種リコンビナ一ゼ認識配列であるごとが望ましい。 したがって、 該べク ターにトランスに作用するリコンビナーゼもまた異種リコンビナーゼであること が望ましい。 このような異種.リコンビナーゼと該リコンビナーゼ認識配列の組み 合わせとしては、 大腸菌のバクテリオファージ P1由来の Creリ ンピナ一ゼと. lox P配列、 あるいは酵母由来の Flpリコンビナーゼと frt配列が好ましく例示さ れるが、 それらに限定されるものではない。
リ コンビナーゼ /リ コンビナーゼ認識配列の相互作用を利用した本発明の時期 特異的且つ組織特異的発現べクタ一のプロモーターとしては、 所望の時期及び部 位での 現を確実にするために、 好ましくはウィルス由来プロモーターや哺乳動 物の構成蛋白質遺伝子のプロモ^タ一が使用きれる。
類をコードする核酸を含む発現ベクターの作成は、 従来の遺伝子工学 技術、 細胞培養技術、 ウィルス作成技術を利用して行うことができる [例えば、 Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausuoel et al. eds. (1994) John Wiley ■& Sons,' Inc. ；. Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 3rd ed. Volumes 1-3， Jbsseph Sambrook & David W. Russel eds. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring■ Harbor, New York) (2001)； Culture of Animal Cells; A Manual of Basic Technique, R. Freshney eds. , 2nd ed. (1987)， i ley-Liss； Frank し Graham, Manipulation of adenovirus vec tor, Chapter 11. pl09-pl28； E. J. Murray eds.， Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols (1991)； Chen, S-H. et al. , Combination gene therapy for 丄 lver metastases of colon carcinoma in vivo. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 2477- 2581等]。 また、 HB-EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターとして ウィルスべク ターを使用する場合、.該発現べグターの導入は、 ポリいリ ジン 核酸複合体など の高分子キャリア一を用いるか、 リボソームに被包して行うことができる。 リポ ノームはリン脂質からなる数 10〜数 100 nmの粒径のカプセルで、 その内部に HB- EGFをコードするプラスミ ド等のベクターを封入できる。 あるいは、 パーテイク ルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。
リコンビナ ゼ /リ コンビチーゼ認識配列の相互作用を利用したベクターの使 用において、 トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ自体を局所投与 る. 場合、 例えば、 リコンビナーゼを適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁して標 的部位に注入すればよい。 一方、 トランスに作用する.物質としてリコンビナーゼ 発現ベクターを標的部位に局所投与する場合、 該リコ^ビナーゼ発現ベクターは、 リコンビナーゼをコードする核酸が、 投与対象の標的細胞内でプロモータ一活性. を発揮し得るプロモーターに機能的に連結した発現カセッ トを有するものであれ ば特に制限されない。 使用されるプロモーターが構成プ Pモーターであ ό場合、 不要な時期におけるリ コンビナーゼの発現を防ぐために、 標的部位に投与される ベクターは、 例えばアデノウイルスのように、 宿主細胞の染色体への組込みが稀 なものであることが望ましい。 リコンビナーゼを所望の時期に発現させる別のァ プローチとして、 メタロチォネィン遺伝子プロモーターのような誘導プロモータ 一の^ Κ用が挙げられる。 この場合、 レ トロウイルス等のインテグレーション効率 の高いウィルスベクターの使用が可能となる。
HB-EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターは、 必要に応じて薬理学的に 許容し得る担体とともに混合して注射剤などの種々の製剤形態とした後に、 上記 医薬として用いることもできる。 ここで薬理学的に許容し得る担体としては、 HB-EGF類を含有する製剤について上記したものが同様に例示されるが、 それら に限定されない。
HB-EGF類をコードする核酸を含む発現ベクターを含有する肝保護 ·肝再生促 進剤の投与は、 治療対象動物自身の標的細胞 （あるいは治療対象動物と同種異 形もしくは異種の動物における細胞） を体外に取り出し.、 培養してから導入を 行って体内に戻す （あるいは移植する） ex ' ra法と、 投与対象の体内に直接べ クタ一を投与して導入を行う ^ 法のいずれかで行われる。 ex 法の場 合、 檫的細胞へのベクターの導入は、 マイクロインジェクション法、 リン酸カル シゥム共沈殿法、 PEG法、 エレク ト口ポレーシヨン法等により行うことができる。 また、 in W ra法の場合、 該製剤の投与は、 例えば、 注射、 カテーテル、 バル一 ンカテーテルな ··どにより行うことができる。 .
HB-EGF類をコードする核酸を含む発現べクタ一を含有する本発明の肝保護■ 肝再生促進剤の投与量は、 ベクター'の種類、 有効成分分子の大きさ、 プロモータ 一活性、 投与経路、 病気の重篤度、，投与対象となる動物種、 投与対象の薬物受容. 性、 体重、 年齢等によって異なるが、 例えば、 ウィルスベクタ一としてアデノウ ィルスを用いる場合、 従来の肝疾患への遺伝子治療の臨床試験において、 ウィル ス粒子 （part i c l e) で 2 X 1011 part i c l es/kg (総量で 1..5 X 1013粒子） を用いて 安全性が確認されているため、 同量が投与の目安となる。 例えば、 成人 1回あた り 約 2 Χ 109〜-約 2 Χ 1011 part i c l es/kg、 好ま しく は約 2 X 101。〜約 2 X 1011 part i c l es/kgである。 ただし、 実際に HB- EGFを投与する場合に、 先天性疾患で は無いため、 全部の肝細胞に HB-EGF遺伝子を導入する必要は無く、.実際にはこ れ以下の量で十分だと考えられる'。 一方、 非ウィルスベクターをリボソームに被 包して用いる場合には、 体重約 4 kgの力二クイザルを用いた臨床研究では 666 μ8の DNAを静脈投与して安全性が確認されているため同量が目安となる。 例えば 成人 1回投与量は約 2〜約 10 mgで、 好ましくは約 5〜約 8 nigである。
また、 本発明は、 内因性の HB- EGF遺伝子の発現■ HB- EGFの活性を増強するこ とによる肝保護，肝再生促進、 ひいては肝疾患の予防 ·治療をも意図する。 内因 性の HB-EGF遺伝子の発現を増強する手段としては、 例えば、 HB-EGF遺伝子の調 節領域に結合してその転写を活性化させる トランス活性化因子、 HB-EGF mRNAを 安定化する物質、 HB-EGF mRNAからの翻訳効率を増大させる物質の投与などが、 また、 内因性の HB - EGFの活性を増強する手段と しては、 例えば、 pro- HB - EGFか ら活性型の可溶性 HB-EGFの生成を促進する物質 （例えば、 ADAMなどの shedding に関与する特異的プロテアーゼ等）、 HB- EGFの分解を抑制する物質 （例えば、 プ 口テア一せ阻害剤等） の投与などが、 それぞれ挙げられる。
従 όて、 別の本発明は、 内因性の HB-EGF遺伝子の発現 · HB- EGFの活性を増強 し得る上記物質を選択することによる、 肝保護 '肝再生促進物質のスクリーニン グ方法を提供する。 本スク リーニング方法は、 HB- EGFを生来的に発現する細胞 を被験物質の存在下及び非存在下で培養し、' HB- EGFの発現量及び/又は活性を比 較することを特徴とする.。 HB-EGFの発現量は、 ノーザンブロッ トや RT - PCR 用, いて転写レベルで、 あるいは抗 HB- EGF抗体等を用いたィムソァッセィにより翻 訳レベルで検定することができる。 一方、 HB- EGFの活性は肝細胞等の細胞にお ける増殖促進活性を調べたり、 HB-EGFの標的受容体である EGFRファミ リーの活 性化 （受容体のリン酸化等） やその下流で、 活性化される MAPKなどのキナーゼ 分子の活性化を指標に検定することができる。
このようにして潭択された内因性の HB-EGF遺伝子の ¾現 · HB- EGFの活性を増 強し得る上記物質は、 例えば、 HB-EGF類を含有する肝保護 ·肝再生促進剤につ いて上記.したと同様の、 薬理学的に許容し得る担体ととも医薬組成物とした後に、 肝保護 ·肝再生促進剤として、 ヒ トなどの哺乳動物に経口的もしくは非経口的に 投与することができる。 . '
該物質を含有する肝保護 ·肝再生促進剤の投与量は、 有効成分の種類 ·分子量、 投与経路、 病気の重篤度、 投与対象となる動物種、 投与対象の薬物受容性、 体重、 年齢等によって異なるが、 通常、 成人 1日あたり有効成分量として約 0: 001〜約 100 mg/kg、 好ましくは約 1〜約 10 mg/kgの範囲であり、 これを 1回もしくは数回 に分けて投与することができる。
本明細書および図面において、 塩基ゃァミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commiss ion on Biochemi cal Nomenc lature (こよる略号あるレヽ fま当 該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸 に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。 DM ：デォキシリボ核酸
cDNA ：相補的デォキシリボ核酸
A . ： アデニン
T ： チミン
G ： グァニン
C ： シトシン
RNA ： ： リボ核酸
mRNA ： メッセンジャーリボ核酸 dATP ：デォキシアデノシン三リン酸 dTTP ：デォキシチミジン三リン酸 dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸 dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ： アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS . - ： ドデシル硫酸ナトリウム
Gly ： グリシン
Ala. ： ァラニン.
Val ： バリン
し eリ ： ロイシン
l i e ： ィソロイシン
Ser ： セリ ン
Thr ： スレ才ニン
Cys ： システィン
Met ： メチォニン
Glu ： グルタミン酸
Asp ： ァスパラギン酸
し ys ： リジン Arg ： アルギニン
Hi s ： ヒスチジン
Phe - ： フエニノレアラニン
Tyr ： チロシン
Trp ： トリブトファン
Pro ： プロ リン
Asn ： ァスパラギン
Gin ： グノレタミン
pG lu · ： ピログノレタミン酸
Me ： メチル基
Et ： ェチル基
Bu ： ブチノレ基
Ph ： フエニル基
TC ： チアゾリジン- 4 (R) -カルボキサミ ド基:.
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
Tos ： p- トノレエンスノレフォニノレ
CH0 ： ホノレミ ,レ
Bz l ： ベンジノレ
Cl„Bzl 2， 6-ジク口 口べンジノレ
Bom
Z ： ベンジルォキシカルボニル
Cl-Z ： 2-ク口 口べンジノレォキシカノレボニノレ
Br- Z ： 2 -ブロモペンジノレオキシカノレボニノレ
Boc ： t-ブトキシカルボニル
DNP ： ジニ トロフエノ一ノレ
Trt ： ト リチル Bum ： t-ブトキシメチル
Ftnoc ： N- 9-フルォレニルメ トキシカルボニル
HOBt ' ： 1-ヒ ドロキシベンズトリァゾーノレ
HOOBt ： 3, 4-ジヒ ドロ— 3-ヒ ドロキシ- 4-ォキソ -1, 2, 3—ベンゾト リア ジン .
H0NB ： 1-ヒ ドロキシ- 5 -ノルボルネン -2, 3-ジカルボキシイ ミ ド
DCC ： Ν,Ν' -ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは単なる例示 であって、 本発明の範囲を何ら限 するものではない。 なお、 実施 ί歹 ij中のプラス ミ ド、 DNA、 各種酵素、 大腸菌、 培養細胞など取り扱う遺伝子工学技術や細胞培 養技術 fま、 特 tこ断らなレヽ限り上記の C£A re/7i Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al. eds. (1994) John Wiley & Sons, Inc.； - Molecular. Cloning (A Laboratory Manual) , 3rd ed. Volume 1-3, Josseph Sambrook & David W. Russel eds; , Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold. Spring - Harbor, New York) (2001)； Culture of Animal Cells; A Manual of Basic Technique, R. Freshney eds. , 2nd ed. (1987) Wiley— Lisstこ 己載 の方法に準じて行った。 また、 特に断りがない限り、 アデノウイルスの一般的な 取り极レ、に して ίま、 上 己の Frank.L. Graham, Manipulation of aaenovirus vector, Chapter 11， pl09-pl28； E.J. Murray eds.， Methods in Molecular Biology, Vol . 7: Gene Transfer and Expression Protocols (1991)； Chen, S - H. et al. , Combination gene therapy for liver metastases of colon carcinoma in vivo. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 2477-2581に記載の方法に準じて行った。 また、 治療効果や現象 に関しては、 いずれかの群間での有意差を先ず Anova検定で解析し、 続いて各二 群間の個々の有意差の検定は Student t-test (二群間非対称 t検定） で解析した。 また、 生存率の有意差の解析には、 Kaplan- Meier検定を用いて解析した。 実施例
実施例 1 アデノウイルスベクターの構築
後記の実験例で用いるアデノウイルスベクタ一は、 以下のように作成した。 プラス ミ ド pADL.1/RSV (B. Fang et al.， Gene Therapy (.1994) 1, 247- 254) は、 上流よりヒ ト 5型アデノウィルスの 3'側から 0-455塩基部分、 ラウス肉 腫ウィルス （RSV) LTRプロモーター、 マルチクローニングサイ ト、 ゥシ成長ホ ルモンの poly Aシグナル配列、 及びヒ ト 5'型アデノ ウィルスの 3 '側から 3328- 5788塩基部分を、 pBR322プラスミ ドに組み込んで作成されたプラスミ ドで Shu-. Hsia Chen氏 （Mount Sinai大） より供与を受けた。 .この pADL.1/RSVプラスミ ド を制限酵素ガ /?d III及び Λ¾ί Iで消化し、 精製したも,のをライゲーシヨンに用い るベクターとした。 一方、 プラスミ ド pRc/CMV (インビトロジェン社） 中にヒ ト HB - EGFの 0RF全長の cDNAを含むプラスミ ド pRpHBEGFは、 目加田英輔氏 （大阪大 学 微生物病研究所） より供与を受けた。 pRcHBEGFプラスミ ドを制限酵素// d III及び yVoi Iで消化して HB-EGF eDNAの全長を切り出し、 これをァガロースゲル 電気泳動して、 目的の DNA断片をゲルから回収し、 精製したものをライゲーショ ンに用いるィンサートとした。 このように処理された pADL.1/RSVベクターとの- EGF cDNAインサー トとを、 T4 DNAリガーゼを用いてライゲーシヨ ンさせ、 pADL.1/RSV-HB-EGFを得た。 更に、 ヒ ト 5型アデノ ウイルスの E1領域以外の遺伝 子 を含むプラ ス ミ ド pJM17 ( icorobix Biosystems Inc. ) と 共に、. pADL.1/RSV-HB-EGFを 293細胞にリン酸カルシウム法で共導入した。 これにより、 相同組換えを起こして正しい目的のアデノウィルスが出来たプラークが共導入 10 - 14日後に出現した。 このプラークを回収し、 目的の HB-EGFを発現する正しい 非増殖型組み換えアデノウイルス Ad. HB-EGFであることを、 抗 HB- EGF抗体 （M- 18:sc_1414、 SANTA CRUZ社） を用いた免疫染色などで確認した後、 Ad. HB- EGF を 293細胞でウィルス増幅し、 塩化セシウムの密度勾配遠心法によって濃縮した。 濃縮したウィルスはェコノパック 10DG脱塩カラム （バイオラッド Cat番号 732- 2011) にて精製、 PBS (-) にて溶出し、 グリセロールを加えて、 液体窒素にて凍 結後、 - 80°Cにて保存した。 ウィルス使用時には粒子用量計算後、 投与容量が 100 μΐ/匹となるように PBS (-) によって希釈して投与した。
また、 遺伝子導入確認に用いる大腸菌の LacZ遺伝子を発現する組換えアデノ ウィルスの AD. LacZは上記と同じ方法で作成したが、 Ad. LacZの作成法の詳細は Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92， 2577-2581に記載されている。 また、 Ad. dEl.3は、 HB-EGFが組み込まれていないために、 これらの遺伝子を何ら発現 しない組換えアデノウイルスである。 Ad.dEl.3は HB-EGFが挿入されていない pADLl/RSVと pJM17を前述のように 293細胞に共導入して同様の方法と過程で作成 した。 なお、 ヒ ト HB— EGF cDNAiま、 Higashiyama, S. et al. , Science 251： 936-939 (1991) に記載力 S り 、 Gene Bankの accession番号 fま M60278 (NM—001945と同一配列） である。
実験例 1 アデノウイルスベクターによる肝臓への遺伝子導入の確認
実施例 1 で作製したアデノ ウイノレスベタ ター Ad. LacZおよび Ad. HB-EGF (1X1011 粒子） を、 6週齢の雄性 C57BL/6Jマウス （中部科学； 各群 10匹） に尾, 静脈注射した後、 肝臓における外因性の LacZならびに HB-EGF発現を各々 X- gal染' 色、 免疫染色によって調べた。 マウスをエーテルによって全身麻酔した後、 開胸 し、 臓器 （心臓、 肺、 肝臓、 腎臓、 脾臓） を採取した。 採取後、 臓器を二等分 し、 一方をコンパウンド （TissueTek OCT compound) による OCT標本作成に供 し、 もう一方を 10% ホルムアルデヒ ドによる固定後、 パラフィン包埋標本とし た。 X-gal染色は OCT標本切片を 0.2% ホルムアルデヒ ド /0.02°/。 ダルタルアルデ ヒ ド固定液により 30分間固定後、 X-gal染色溶液に浸し、 37°C、 24時間の反応に より行った。 免疫染色は 4% パラホルムアルデヒ ドにて 10分間固定し、 10% スキ ムミルク （雪印） にて 60分ブロッキングした。 その後、 一次抗体 （抗ヒ ト HB - EGFャギポリクローナノレ抗体、 R&D Systems Inc. , Minneapolis, MN カタログ 番号 AF- 259- NA) 100倍希釈液 （2 μ§/ηι1) を 1時間反応させ、 HB-EGFの可視化は 抗ャギ Alexa568 (MOLECULAR PROBES, Inc. , Eugene, OR カタ ロ グ番号 A- 11029) で標識して行った。 核染色は Hoechst33342 (MOLECULAR PROBES, Inc. , Eugene, OR カタログ番号 H- 3570) 1000倍希釈にて5分 行った。 観察画像 記 録は共焦点レーザー顕微鏡 （Carl Zei ss 製品番号 LSM510) によって行った。 Ad. dE 1..3.を尾静脈注射後、 同様の処理を行った試料を染色されないネガティフ' コントロールとした、 χ-gal染色、 免疫染色の結果を図 1に示した。
図 1に示すように、 Ad. .LacZを尾静脈注射したマウス肝臓の 60〜90%の肝細胞 において、 X- ga l染色が認められることから、 アデノウイルスベクタ一の尾静脈 注射によって、 .肝細胞へ効率良い遺伝子導入が可能となることが明らかとなった (図 1 A)。 吏に、 Ad. HB- EGFを尾静脈注射したマウス肝臓では、 主に HB- EGFの細. 胞膜における発現が認められ、 生物活性を有する外来性の HB-EGFが膜結合型 HB_ EGFとして合成、 あるいは更にプロセッシングされた可溶性 HB-EGFが、 肝細胞 オートクライン的に作用していることが明らかとなった （図 1 B)。
実験例 2 Ad. HB-EGFによる血中肝臓逸脱酵素の上昇抑制効果 '
6週齢の雄性 C57BL/6Jマウス （中部科学； 各群 10匹) に、 一匹あたり 4 μ§の Fasァゴニス ト抗体 （抗マウス Fa マウスモノクローナル：抗体、 クローン名、 Jo_2、 Becktone - Dickinson Biosc ience, San Jose, CA カダログ番号 55425.5) ¾r 尾静脈注射することによって、 Fas刺激劇症肝炎モデルを作成した。 劇症肝炎の 防止■治療効果を検討するため、 Fasァゴニス ト抗体を尾静脈注射する 72時間前 に、 予めアデノウイルスベクタ一 （Ad. HB - EGF、 Ad. HGF、 Ad. LacZ、 ならびに Ad. dE l . 3) を、 一匹あたり I X 1011粒子で尾静脈注射した。 Fasァゴニス ト抗体 の尾静脈注射から 24時間後、 36時間後 （アデノ ウイルス尾静脈注射から各々 96、 108時間後） に採血し、 屠殺して臓器を採取した （実験スケジュールを図 2Aに示 す）。 劇症肝炎の発症防止■治療の指標となる肝機能は、 血中肝臓逸脱酵素であ るァラニンアミノ トランスフェラーゼ （ALT) ならびにァスパラギン酸アミノ ト ランスフェラーゼ （AST) の測定によって評価した。 測定は、 自動臨床分析機器 Hi tachi 736 (日立 （株）） を用いて常法に従って実施した。
採血後に血清 ALTならびに ASTレベルを測定した結果、 図 2Bおよび 2Cに示され るように、 ァゴニス ト Fas抗体の尾静脈注射から 24時間後には、 Ad. dE l . 3投与群 で ALT,ならびに ASTが各々、 2240 ± 450、 1665 ± 391 IU/Lと上昇したのに対して、 Ad. HB- EGF投与群ではともに 23Q I U/L以下と.、 ALTならびに ASTの上昇が抑制さ れていることが明らかとなつた。 更に、 この血中肝臓逸脱酵素の上昇抑制効果【こ おいて、 HB- EGFは、 これまで唯一強い劇症肝炎の防止 '治療効果を示すことが 知られている HGFと同等の効果を示すことが明らかとなった。 また、 抗体投与か ら 36時間後には、 Ad. dE l . 3投与群でも ALTならびに ASTは 500 IU/L以下に低下す るが、 Ad. HGF投与群はこれらと有意差が認められなかったのに対して、 Ad. HB- EGF投与群では 250 IU/L以下と、 Ad. dE l . 3投与群に対して有意に低いことが明ら,. かとなつた。 以上の結果から、， Ad. HB-EGFは劇症肝炎に伴う.肝障害を抑制、 軽減
、
し、 且つその効果は Ad, HGFよりも強力であることが示きれた。
実験例 3 Ad. HB-EGFによる肝細胞アポトーシス抑制効果
劇症肝炎の主な病態であるアポトーシスに.よる肝細胞死は、 肝臓組織の HE染 色ならびに TUNEL染色を行うことで評価した。 ァゴニス ト抗体投与から 24時間後、 36時間後 （アデノウイルス尾静脈注射から各々96、 108時間後） におけるマウス 肝臓のパラフィン包埋標本なちびに OCT標本より、 各々切片を作成後、 HE染色な らびに TUNEL染色した。
図 3に示されるように、 Ad. dE l. 3投与群では 24時間後、 肝臓逸脱酵素の上昇 (図 2Bおよび 2C) と相関した、 好中球^3マクロファージ浸潤を伴う典型的なアポ トーシス形態を示す肝細胞が認められるのに対して、 Ad. HB-EGF投与群では、 Ad. HGF投与群と同様に肝細胞のアポトーシス形態は認められなかった。 更に、 36時間後には、 Ad. dE l . 3投与群で肝細胞アポトーシスの進行による肝組織の脱 落が観察され、 Ad. HGF投与群でも炎症が認められたのに対して、 Ad. HB-EGFはほ ぼ完全に肝臓組織の障害が抑えられていた。
更に、 肝細胞のアポトーシスを詳細に評価するために TUNEL染色を行った結果、 24、 36時間後ともに、 Ad. dE l . 3投与群における TUNEL陽性肝細胞数に対して、 Ad. HB- EGF投与群、 Ad. HGF群では有意に陽性細胞数が少なく、 Ad. HB— EGFならび に Ad. HGF投与群では、 劇症肝炎の本態である肝細胞のアポトーシスが抑制され ていることが明らかどなった。
実験例 4 Ad. HB-EGFによる肝再生促進効果 .
劇症肝炎の本質的な治療効果の指標どなる肝再生は、 抗 K i-67マウスモノク口 ーナノレ抗体 （クローン名、 TEC— 3、 Dako Cytomat ion, Denmark) 【こよって同定 された増殖肝細胞の割合によつて評価した。 ァゴニス ト抗体投与から 24時間後、 36時間後 （アデノウイルス尾静脈注射から各々 96、 108時間後） におけるマウス 肝臓のパラフィン切片を用いて、 抗 Ki-67抗体による免疫染色を行った。
図 5に示されるように、. Ad. dEl. 3投与群では 24、 36時間後とも、 肝細胞の 殖: を示す Ki-67陽性細胞はほとんど検出されないのに対して、. Ad. HB- EGF投与群で は、 Ad. HGF群と同様に K i - 67陽性細胞の有意な増加が認められた。 とりわけ、 24 時間後の Ad. HB- EGF投与群における Ki- 67陽性細胞の割合は、 これまで唯一の強 力な劇症肝炎治療因子として報告されている HGFと比較しても約 1. 5倍高く、 HB- EGFは HGFを凌ぐ劇症肝炎治療効果を有することが明らかとなった。
これらの結果は、 Ad. HB-EGF投与後、 肝臓で発現—した HB-EGFが、 劇症肝炎の本 態である肝細胞アポトーシスを強力に抑制することによって、 病態の発症や進展 を防止し、 肝再生、 即ち残存肝細胞の増殖を促進させることによって、 本質的な 治癒を促すのに効果的であることを示すものである。 従って、 HB-EGFを用いる 本発明の医薬は、 肝障害 （肝細胞死） を伴う他の任意の疾患についても広く適 用し得るものである。 産業上の利用可能性
HB-EGFは強力な肝障害抑制、 アポトーシス抑制および肝再生誘導作用を示す ので、 HB-EGFまたはそれをコードする核酸は、 肝障害、 肝細胞死を伴う各種疾 患、 特に劇症肝炎などの肝疾患の予防■治療薬として、 極めて有用である。 本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、 好ましい態様が変更され得 ることは当業者にとって自明であろう。 本発明は、 本発明が本明細書に詳細に記 载された以外の方法で実施され得ることを意図す.る。 したがって、 本発明は^付 の 「請求の範囲」 の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。 本出願は、 日本国で出願された特願 2005-283085を基礎としており、 そこに 開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。 また、 ここで述べら れた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、 ここに 引用されたことによって、 その全てが明示きれたと同程度に本明細書に組み込ま れるものである。

Claims

請求の範囲
I . へバリン結合性上皮増殖囟子様増殖因子もしくはその部分ペプチドを含有し てなる肝保護および/または肝再生促進剤。 '
5. 2 . 肝疾患予防 ·治療用である請求項 1記載の剤。
3 . 肝疾患が、 劇症肝炎または 性肝炎である請求項 2記載の剤。
4 . 肝疾患が、 慢性肝炎、 自己免疫性肝疾 、 ウィルス性肝炎、 肝線維症、 肝硬 変、 肝癌、 アルコール性肝障害、 薬剤性肝障害、 肝膿瘍、 肝寄生虫症、 肝アミ口. ィ ドーシスおよびルポィ ド肝炎からなる群より選択される、，請求項 2記載の剤。0 5 . へパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子もしくはその部分ペプチドをコード する核酸を含有してなる肝保護および/または肝再生促進剤。
6 . 核酸が、 アデノウイルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクター、 レトロゥ. イノレスベクター、 レンチウィルスベクターおよびへルぺスウィルスベクターから なる群より選択されるウィルスベクター上に担持されている、 請求項 5記載の剤。5 .7 . 肝疾患予防 .治療用である請求項 5または 6記載の剤。
8 . 肝疾患が、 .劇症肝炎または急性肝炎である請求項 7記載の剤。
9 . 肝疾患が、 慢性肝炎、 自己免疫性肝疾患、 ウイ/レス性肝炎、 肝線維症、 肝硬 変、 肝癌、' アルコール性肝障害、'薬剤性肝障害、 肝膿瘍、 肝寄生虫症、 肝アミ口 ィ ドーシスおよびルポイ ド肝炎からなる群より選択ざれる、 請求項 7記載の剤。0 1 0 . 動物から採取した細胞に、 へパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子もしぐ はその部分べプチドをコ一ドする核酸を導入することを含む、 肝保護および/ま たは肝再生促進用細胞の製造方法。
I I . 核酸が、 アデノウイルスベクタ一、 アデノ随伴ウィルスベクター、 レトロ ウイノレスベクター、 レンチウィルスベクターおよびへルぺスウイノレスベタタ一力5 らなる群より選択されるウィルスベクタ一上に担持されている、 請求項 1 0記載 の方法。
1 2 . 細胞が肝疾患予防 ·治療用である請求項 1 0または 1 1記載の方法。
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