JPWO2006118248A1 - 細胞増殖抑制部材、細胞転移抑制部材、細胞増殖抑制方法、細胞転移抑制方法、積層フィルムおよび医療用具 - Google Patents
細胞増殖抑制部材、細胞転移抑制部材、細胞増殖抑制方法、細胞転移抑制方法、積層フィルムおよび医療用具Info
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Abstract
Description
外科療法は、固形腫瘍に対する治療に有効であるが、白血病やリンパ腫、転移性のガン細胞には十分に対応できない。制ガン剤を用いる化学療法は、白血病やリンパ腫に対して有効である。しかしながら、腫瘍細胞と正常細胞は類似した性質を示すことから、優れた選択毒性を示す制ガン剤は少ない。また、制ガン剤は、患者毎にその治療効果が異なり、その効果を制ガン剤投与前に予想することが難しい。さらに制ガン剤投与による副作用が生じることが多く、制ガン剤は、患者に過度の苦痛を強いるものである。
しかしながら、この医療器具においては、生理活性物質が人体に与える副作用が大きく、患者に与える負担も大きいという問題があった。
すなわち、前記フィルムを医療用具基材に被覆することにより、生理活性物質の副作用による患者への負担が無く、ガン細胞の増殖や転移を抑制することができ、しかも、被覆されたフィルムが破損し難い医療用具を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
(1)多孔構造を有することを特徴とする細胞増殖抑制部材。
(2)前記多孔構造が、少なくとも表面部に形成されていることを特徴とする(1)に記載の細胞増殖抑制部材。
(3)フィルムである(1)または(2)に記載の細胞増殖抑制部材。
(5)前記フィルムは酸化防止剤を含有してなることを特徴とする(3)または(4)に記載の細胞増殖抑制部材。
(6)前記多孔構造を構成する孔がハニカム様に配列されていることを特徴とする(1)〜(5)のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材。
(8)前記多孔構造を構成する孔の孔径の変動係数が30%以下であることを特徴とする(1)〜(7)のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材。
(9)前記酸化防止剤の含有量が、樹脂100重量部に対して、0.1重量部〜5重量部であることを特徴とする(5)に記載の細胞増殖抑制部材。
(10)前記(1)〜(9)のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材の多孔構造が形成されている部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞増殖抑制方法。
(11)第1の樹脂フィルムと第2の樹脂フィルムとが積層された積層フィルムであって、前記第2の樹脂フィルムが、(1)〜(9)のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材であることを特徴とする積層フィルム。
(12)多孔構造を有することを特徴とする細胞転移抑制部材。
(13)前記多孔構造が、少なくとも表面部に形成されていることを特徴とする(12)に記載の細胞転移抑制部材。
(14)フィルムである(12)または(13)に記載の細胞転移抑制部材。
(16)前記フィルムは酸化防止剤を含有してなることを特徴とする(14)または(15)に記載の細胞転移抑制部材。
(17)前記多孔構造を構成する孔がハニカム様に配列されていることを特徴とする(12)〜(16)のいずれかに記載の細胞転移抑制部材。
(19)前記多孔構造を構成する孔の孔径の変動係数が30%以下であることを特徴とする(12)〜(18)のいずれかに記載の細胞転移抑制部材。
(20)前記酸化防止剤の含有量が、樹脂100重量部に対して、0.1重量部〜5重量部であることを特徴とする(16)に記載の細胞転移抑制部材。
(21)前記(12)〜(20)のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材の多孔構造が形成されている部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞転移抑制方法。
(22)第1の樹脂フィルムと第2の樹脂フィルムとが積層された積層フィルムであって、前記第2の樹脂フィルムが、(12)〜(20)のいずれかに記載の細胞転移抑制部材であることを特徴とする積層フィルム。
(23)医療用具基材の表面の全部または一部を、(1)〜(9)のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材、または、(12)〜(20)のいずれかに記載の細胞転移抑制部材で被覆してなることを特徴とする医療用具。
本発明によれば、本発明の細胞増殖抑制部材を用いた細胞増殖抑制方法と、医療用具基材にこの部材が被覆されてなる医療用具が提供される。
本発明によれば、生理活性物質を使用しなくとも優れた細胞転移抑制作用を示し、破損し難く劣化し難い、医療用具を構成するために好適な、細胞転移抑制部材および積層フィルムが提供される。
本発明によれば、本発明の細胞転移抑制部材を用いた細胞転移抑制方法と、医療用具基材にこの部材が被覆されてなる医療用具が提供される。
1)細胞増殖抑制部材
本発明の細胞増殖抑制部材は、多孔構造を有することを特徴とし、細胞増殖抑制作用を発揮するものである。
これらの中でも、サイクリックネオペンタンテトライルビス(2,6−ジ−第3ブチル−4−メチルフェニルホスファイト)を用いることが特に好ましい。
本発明の細胞増殖抑制部材を作製する方法は特に限定されない。例えば、フィルム状の本発明の細胞増殖抑制部材を製造する場合には、前記樹脂および所望により酸化防止剤を含有する樹脂組成物を含む有機溶媒溶液を基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させるとともに前記キャストした有機溶媒溶液表面で結露を起こさせ、該結露により生じた水滴を蒸発させることにより、多孔構造を有する細胞増殖抑制部材を得る方法が挙げられる。
高湿度ガスを吹き付けるときの雰囲気の温度は、キャストに用いた溶媒が蒸発することができる温度であればよいが、5〜80℃の温度であることが望ましい。
本発明の細胞増殖抑制方法は、上記した本発明の細胞増殖抑制部材の多孔構造が形成されている部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の増殖を抑制することを特徴とする。本発明の細胞増殖抑制部材が、少なくとも表面部に多孔構造が形成されているものである場合には、本発明の細胞増殖抑制部材の表面部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の増殖を抑制することができる。本発明の方法によれば、生理活性物質を使用しなくとも優れた細胞増殖抑制効果を得ることができる。
本発明の細胞転移抑制部材は、多孔構造が形成されていることを特徴とし、細胞転移抑制作用を発揮するものである。この際、細胞転移抑制部材は、少なくとも表面部に多孔構造が形成されていることが好ましい。
本発明の細胞転移抑制部材は、上記工程のうち、特に腫瘍細胞が脈管等の周辺組織への浸潤を抑制することができるものであり、かかる作用によって、腫瘍、特に悪性腫瘍の転移を抑制することができるものである。
本発明の細胞転移抑制部材が、腫瘍細胞の転移を抑制する機能を有するか否かを評価する方法としては、例えば、ヒト胎児線維芽細胞を含有するコラーゲンゲル上に、腫瘍細胞を重層し、細胞転移抑制部材を腫瘍細胞に接触させて培養を行なった場合と、細胞転移抑制部材を腫瘍細胞に接触させずに培養を行なった場合とにおいて、腫瘍細胞のコラーゲンゲルへの浸潤の程度を比較する方法が挙げられる。
本発明の細胞転移抑制方法は、上記した本発明の細胞転移抑制部材の多孔構造が形成されている部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の転移を抑制することを特徴とする。本発明の細胞転移抑制部材が、少なくとも表面部に多孔構造が形成されているものである場合には、本発明の細胞転移抑制部材の表面部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の転移を抑制することができる。本発明の方法によれば、生理活性物質を使用しなくとも優れた細胞転移抑制効果を得ることができる。
また上記腫瘍は、扁平上皮・腺上皮の腫瘍である上皮性腫瘍であっても、結合組織・血管・造血組織・筋組織・神経組織の腫瘍である非上皮性腫瘍であってもよい。悪性の上皮性腫瘍としてはガン腫、悪性の非上皮性腫瘍は肉腫、白血病等が挙げられる。より具体的には、口腔扁平上皮ガン(例えば歯肉、舌)、扁平上皮ガン(例えば食道ガン、肺ガン、子宮頚ガン、皮膚ガン)、腺ガン(例えば肝内胆管ガン、総胆管ガン、胆嚢ガン、乳ガン、腎ガン、胃ガン、膵ガン、甲状腺ガン、前立腺ガン、大腸ガン、肺ガン)、肝細胞ガン、膀胱ガン(移行上皮ガン)、卵巣ガン、神経膠芽腫、悪性黒色腫、骨肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、絨毛ガン等が挙げられる。
本発明の医療用具は、医療用具基材の表面の全部または一部を、本発明の細胞増殖抑制部材または細胞転移抑制部材で被覆してなることを特徴とする。
(細胞増殖抑制部材の作製)
本発明にかかる細胞増殖抑制部材を以下のようにして作製した。
ポリ(ε−カプロラクトン)(Poly(ε−caprolactone);(株)和光純薬工業、重量平均分子量:70,000〜100,000、以下「PCL樹脂」という。)と、Cap樹脂(重量平均分子量:62,000、数平均分子量:21,000)とを重量比10:1の割合で混合した後にクロロホルムに溶解し、濃度5.0mg/mLの樹脂溶液(1)を調製した。
作製した各フィルムの多孔構造(を構成する孔)の孔径、幹幅および空孔率を、走査型電子顕微鏡(SEM)(HITACHI,S−3500)を用いて測定し求めた。
孔径は、合計5枚の画像を用いて、画像1枚あたり任意の5個の孔を選択し、合計25個の孔の直径の平均値を計算することにより求めた。また幹幅は、合計5枚の画像を用いて、画像1枚あたり任意の5箇所、合計25箇所について孔同士間の最短距離を測定し、その平均値を計算することにより求めた。
また空孔率は、SEM写真を用い、画像解析用ソフトウエアScion Image(Scion Corporation製)により算出して求めた。
(細胞増殖抑制部材の作製)
本発明にかかる細胞増殖抑制部材を以下のようにして作製した。
PCL樹脂とCap樹脂(重量平均分子量:62,000、数平均分子量:21,000)とを重量比10:1の割合で混合した後にクロロホルムに溶解し、濃度5.0mg/mLの混合溶液を調製した。
作製した各フィルムの、多孔構造を構成する孔の孔径、幹幅および空孔率を、走査型電子顕微鏡(SEM)(HITACHI,S−3500)を用いて測定し求めた。
孔径は、合計5枚の画像を用いて、画像1枚あたり任意の5個の孔を選択し、合計25個の孔の直径の平均値を計算することにより求めた。また幹幅は、合計5枚の画像を用いて、画像1枚あたり任意の5箇所、合計25箇所について孔同士間の最短距離を測定し、その平均値を計算することにより求めた。
また空孔率は、SEM写真を用い、画像解析用ソフトウエアScion Image(Scion Corporation製)により算出して求めた。
上記で作製した細胞増殖抑制部材(フィルムA〜N)、またはPCL平膜(1)、(2)を切り取り、直径約14mmの円型カバーガラス(MATSUNAMI製)に密着させた。その後、24−well tissue culture plate(ファルコン社製)のウェル内に敷いた。当該カバーガラスを固定するため、外径約14mmのガラスシリンダーをウェルの内側にセットした。なお、コントロールの場合は上記カバーガラスを敷かずに、上記ガラスシリンダーのみをセットした。
上記で作製した腫瘍細胞培養プレートの断面図を図2に示す。
上記腫瘍細胞培養プレートのウェル内に100%(v/v)エタノールを0.1mLずつ注入した。エタノールが蒸発する前に、DME/F12培地(ダルベッコ改変MEM培地(入手先:日水製薬社)とハムF12培地(入手先:シグマ社)を1:1の容量で混合した培地)をウェルあたり1mLずつ注入し、アスピレータを用いて当該培地を除去した。
1×107個/mLとなるように、DME/F12−10%FBSで調製した各種腫瘍細胞浮遊液を、0.05mL/ウェルずつ添加し、37℃、2〜4日間培養を行なった(CO2濃度5%v/v)。
Ca9−22(口腔扁平上皮ガン(歯肉)、入手先:ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、HSC−3(口腔扁平上皮ガン(舌)、入手先:ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、KYSE−110(食道ガン(扁平上皮ガン)、入手先:ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、Li−7(肝細胞ガン、入手先:東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター)、HuH−28(肝内胆管ガン(腺ガン)、入手先:東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター)、TFK−1(総胆管ガン(腺ガン)、入手先:東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター)、GB−dl(胆嚢ガン(腺ガン)、入手先:福岡大学医学部志村英生氏)、A549(肺ガン(腺ガン)、入手先:ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、Lu99(肺ガン(扁平上皮ガン)、入手先:東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センター)、MDA−MB−435S(乳ガン(腺ガン)、入手先:American Type Culture Collection)、RXF−631L(腎ガン(腺ガン)、入手先:National Cancer Institute,USA)、EJ−1(膀胱ガン(移行上皮ガン)、入手先:ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、HeLa(子宮頚ガン(扁平上皮ガン)、入手先:ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、SK−OV−3(卵巣ガン、入手先:National Cancer Institute,USA)、SF295(神経膠芽腫、入手先:National Cancer Institute,USA)、SF539(神経膠芽腫、入手先:National Cancer Institute,USA)、SNB75(神経膠芽腫、入手先:National Cancer Institute,USA)、SNB−78(神経膠芽腫、入手先:National Cancer Institute,USA)、T98G(神経膠芽腫、入手先:ヒューマンサイエンス研究資源バンク)、
培養した腫瘍細胞の細胞数は、Cell Counting Kit−8(Dojindo社)を用いて測定した。
胆嚢ガン由来細胞株(GB−dl)の結果を図3および図4に、総胆管ガン由来細胞株(TFK−1)の結果を図5および図6に、悪性黒色腫由来細胞株(MeWo)の結果を図7および図8に、乳ガン由来細胞株(MDA−MB−435S)の結果を図9および図10にそれぞれ示した。
(細胞転移抑制部材の作製)
PCL樹脂とCap樹脂(重量平均分子量:62,000、数平均分子量:21,000)とを重量比10:1の割合で混合した後にクロロホルムに溶解し、濃度5.0mg/mLの樹脂溶液を調製した。この溶液をガラスシャーレ(直径9cm)にキャストし、次いで、23℃、相対湿度35%の雰囲気下で、相対湿度80%の高湿度空気を2.0L/minの流量で、ガラスシャーレ上の液面に吹き付けることにより、多孔構造を有する細胞転移抑制部材(フィルム(O))を作製した。
(a)コラーゲン溶液(Cellmatrix type IA,Nitta Gelatin)、中和緩衝液(0.05N NaOH,2.2%NaHCO3,200mM HEPES)、10倍濃縮のDulbcco’s modified Eagle’s培地(DEM培地、インビトロゲン社製)、およびヒト胎児線維芽細胞浮遊液を8:1:1:0.5の割合で混合し、6−well tissue culture plate(ファルコン社)に3mL/ウェルずつ注入した。
(b)30分間、CO2インキュベーター内(CO25%v/v)で静置し、コラーゲンのゲル化を行なった。
(d)CO2インキュベーター内(CO25%v/v)で、37℃、1日間培養を行なった。
(e)その後、コラーゲンゲルをウェルから剥離し、DEM液体培地上に当該コラーゲンゲルを浮遊させ、さらにCO2インキュベーター内(CO25%v/v)で、37℃、2日間培養を行なった(この培養方法を「ラフトカルチャー」と称する)。
(g)コラーゲンゲルの最上面(腫瘍細胞側の面)に、フィルムHまたは実施例1で作製したPCL平膜(1)を載せ、CO2インキュベーター内(CO25%v/v)で、37℃、7日間培養を行なった。
(i)ヘマトキシリン・エオジン染色を行なったパラフィン切片を顕微鏡により観察を行ない、腫瘍細胞がコラーゲンゲル内に浸潤しているか否かを評価した。
PCL平膜(1)を腫瘍細胞(SAS)側の面に載せた場合の顕微鏡像を図13に示した。図13(a)は倍率100倍で観察したもの、図13(b)は倍率200倍で観察したものである。なお、図13において、矢印より左側の領域がPCL平膜(1)で覆われていた領域であり、右側がPCL平膜(1)で覆われていなかった領域(すなわちコントロール領域)を示している。
(積層型の細胞増殖抑制フィルムまたは細胞転移抑制フィルムの製造)
(製造例1)
1,2−ポリブタジエン(商品名:RB820、JSR社製)とCap樹脂(重量平均分子量:62,000、数平均分子量:21,000)を、10:1の重量比でクロロホルムに溶解した樹脂溶液(1,2−ポリブタジエンの濃度:0.27重量%)6mlを、直径10cmのガラスシャーレ上に一様に展開した。
次いで、23.0℃、相対湿度40%の雰囲気下、相対湿度70%の高湿度空気を2L/minの流量で、1分間ガラスシャーレ上の液面に吹き付けることにより、膜厚3〜5μmフィルム(P)を得た。
フィルム(P)の膜厚および多孔構造を構成する孔の平均孔径、孔径の変動係数を第2表に示す。
24.0℃、相対湿度40%の雰囲気下、相対湿度70%の高湿度空気を2L/minの流量で、1分間ガラスシャーレ上の液面に吹き付けたこと以外は前記(1)と同様にして、フィルム(Q)を得た。
得られたフィルム(Q)の膜厚および多孔構造を構成する孔の平均孔径、孔径の変動係数を前記と同様に測定した。測定結果を第2表に示す。
樹脂として、1,2−ポリブタジエンに代えて、ポリウレタン(商品名:ミラクトランE385、日本ミラクトラン社製)を使用し、溶媒として、クロロホルムに代えて、クロロホルムとテトラヒドロフランとの混合溶媒(混合比は重量比で、クロロホルム10に対してテトラヒドロフラン1)を使用すること以外は、それぞれ製造例1、2と同様にして、フィルム(R)、(S)を得た。
得られたフィルム(R)、(S)を光学顕微鏡で観察した結果、孔がハニカム様に配列されている多孔構造が形成されていることが確認された。フィルム(R)、(S)の膜厚および多孔構造を構成する孔の平均孔径、孔径の変動係数を第2表に示す。
得られたフィルム(P)とフィルム(R)を重ね合わせたもの(このものを「フィルムT」とする)、フィルム(Q)とフィルム(S)を重ね合わせたもの(このものを「フィルムU」とする)、フィルム(P)、およびフィルム(Q)のそれぞれを直径10cmの円形に切り取った。フィルム(T)、(U)、(P)および(Q)のそれぞれを、幅10cm、チャック間距離1cmのチャックで両側から挟んで、引張試験機にセットした。この際、チャックとフィルムの間には、1mm厚シリコーンゴム製シートを挟み、フィルムの中心がチャック間に位置するようにした。そして、30mm/minの引張速度で、フィルムを両側から引張り、フィルムが破断したとき(フィルムを重ねた場合は、どちらか一方でも破断したとき)の荷重を記録した。試験結果を第3表に示す。
従って、積層フィルム(T)、(U)を体内に設置して使用する場合においては、破損し難く、細胞増殖および/または細胞転移を抑制する作用が長期間維持されることが期待される。
Claims (23)
- 多孔構造を有することを特徴とする細胞増殖抑制部材。
- 前記多孔構造が、少なくとも表面部に形成されていることを特徴とする請求項1に記載の細胞増殖抑制部材。
- フィルムである請求項1または2に記載の細胞増殖抑制部材。
- 樹脂組成物を含む有機溶媒溶液を基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させるとともに、前記有機溶媒溶液表面で結露を起こさせ、該結露により生じた水滴を蒸発させることにより得られるフィルム、またはその延伸フィルムであることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材。
- 前記フィルムは酸化防止剤を含有してなることを特徴とする請求項3または4に記載の細胞増殖抑制部材。
- 前記多孔構造を構成する孔がハニカム様に配列されていることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材。
- 前記多孔構造を構成する孔の平均孔径が0.1〜100μmであることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材。
- 前記多孔構造を構成する孔の孔径の変動係数が30%以下であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材。
- 前記酸化防止剤の含有量が、樹脂100重量部に対して、0.1重量部〜5重量部であることを特徴とする請求項5に記載の細胞増殖抑制部材。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材の多孔構造が形成されている部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞増殖抑制方法。
- 第1の樹脂フィルムと第2の樹脂フィルムとが積層された積層フィルムであって、前記第2の樹脂フィルムが、請求項1〜9のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材であることを特徴とする積層フィルム。
- 多孔構造を有することを特徴とする細胞転移抑制部材。
- 前記多孔構造が、少なくとも表面部に形成されていることを特徴とする請求項12に記載の細胞転移抑制部材。
- フィルムである請求項12または13に記載の細胞転移抑制部材。
- 樹脂組成物を含む有機溶媒溶液を基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させるとともに、前記有機溶媒溶液表面で結露を起こさせ、該結露により生じた水滴を蒸発させることにより得られるフィルム、またはその延伸フィルムであることを特徴とする請求項12〜14のいずれかに記載の細胞転移抑制部材。
- 前記フィルムは酸化防止剤を含有してなることを特徴とする請求項14または15に記載の細胞転移抑制部材。
- 前記多孔構造を構成する孔がハニカム様に配列されていることを特徴とする請求項12〜16のいずれかに記載の細胞転移抑制部材。
- 前記多孔構造を構成する孔の平均孔径が0.1〜100μmであることを特徴とする請求項12〜17のいずれかに記載の細胞転移抑制部材。
- 前記多孔構造を構成する孔の孔径の変動係数が30%以下であることを特徴とする請求項12〜18のいずれかに記載の細胞転移抑制部材。
- 前記酸化防止剤の含有量が、樹脂100重量部に対して、0.1重量部〜5重量部であることを特徴とする請求項16に記載の細胞転移抑制部材。
- 請求項12〜20のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材の多孔構造が形成されている部分を細胞に接触させることにより、該接触部における細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞転移抑制方法。
- 第1の樹脂フィルムと第2の樹脂フィルムとが積層された積層フィルムであって、前記第2の樹脂フィルムが、請求項12〜20のいずれかに記載の細胞転移抑制部材であることを特徴とする積層フィルム。
- 医療用具基材の表面の全部または一部を、請求項1〜9のいずれかに記載の細胞増殖抑制部材、または、請求項12〜20のいずれかに記載の細胞転移抑制部材で被覆してなることを特徴とする医療用具。
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