JPWO2006109561A1 - 顕微鏡撮像装置及び方法 - Google Patents

Abstract

高分解能、高深度及び明るい像を取得する顕微鏡撮像装置及び方法を提供する。単位多光点光源５は、均一な照明の像が結ばれる位置に設けられ、光を試料９の全面に対して均一に照明し、コヒーレント光又は部分コヒーレント光を、照明群ごとに試料９に複数回照明する。計算部１０は、照明群で照明された試料９に対応し、撮像部８で取得された画像を合成して、１枚の画像を構成する。照明群は、１個の明部又は互いに隣接しない複数の明部と、明部を包囲する暗部とを有し、照明群の全ての明部によって前記試料の全面が照明される。

Description

本発明は、高い分解能及び深い深度で観察及び撮像する顕微鏡撮像装置及び方法に関する。

従来の顕微鏡は、観察することを主目的とし、明るくかつ高倍率で観察するために、照明を均一にすることと開口数（ＮＡ）を大きくする工夫がなされてきた。顕微鏡を構成する要素には、大きく分けて（１）照明系と、（２）対物観察系に分けられる。顕微鏡は、これらが一体となり最適な条件で試料を観察又は撮像できる装置である。

照明は、試料から光学的な情報を得るプローブとしての役割を果たし、顕微鏡では人工の目的に最適な光源が作れることから、インコヒーレント光、部分コヒーレント光又はコヒーレント光で、広い波長帯域から単一の波長の光まで任意の条件の光を照射できる。

また、対物観察系の主な性能である光学分解能は、光の性質及び波長に依存し、理論的な分解能の限界は、インコヒーレント光では２NA／λ、コヒーレント光ではNA／λであり、ここで分解能を高めることができるパラメータは、光の波長を定めると開口数を上げることで、具体的には、対物レンズの倍率及び屈折率が大きくて波長特性の良好な光学材料を使うことであった。

従来、光学系で結ばれる像の観察は、肉眼による観察が主であり、そのために、照明系の性能は、目による像の検出に適した照明に焦点が絞られ、照明装置の果たす役割は次のようなものが挙げられる。
（１）標本を一様に照明する。
（２）対物レンズの開口を一様に照明する。
（３）結像に寄与しない光を対物レンズに入らないようにする。
これを可能にした照明法に以下のものがある。
（ａ）リレーコンデンサ系
（ｂ）ケーラ照明
（ｃ）クリティカル照明
そのなかで、最も優れた照明方法はケーラ照明である（例えば、非特許文献１）。

ケーラ照明は、像側でテレセントリックになっており、理論上無限遠に一様輝度のランバート面があり、これを、レンズの前側焦点面に開口絞り、後焦点面に標本（被照射面）となるようにレンズを配置して照明する。

しかしながら、現実の光源は、理論的に均一なランバート面ではなく、例えば、タングステンフィラメント、水銀放電灯の発光部等の輝度は、場所及び方向に関して不均一であり、これが照明斑の原因となる。

近年、像の検出の際に、目に代わって写真や撮像素子が使われるようになった。これらにより、更に均一な照明が必要になった。したがって、均一に照明するために、ケーラ照明のコレクタレンズとコンデンサレンズとの間に、インテグレータと呼ばれるフライアイ・レンズを更に配置し、その各単位レンズで標本面を均一に照明することによって、それらの合成された全照度が一様になる。（例えば、特許文献１）

また、照明系や対物光学系の両者の光学系の分解能の限界は、インコヒーレント光でλ／２NAすなわち２NA／λ（本/ｍｍ）であり、コヒーレント光ではλ／NAすなわちNA／λ（本/ｍｍ）である。部分コヒーレント光は、その間にあるが非線形であり、回折光はλ／４NAまで広がる。その分解能の基礎は、検出器としての肉眼の識別能力に置かれていて、現在でも人類が持つ最も高性能の検出器であり、かつ、画像情報の入力及び処理装置であることには変わりがない。

顕微鏡は、一般に照明系と対物光学系とを一体として働かせることによって伝達関数が決まり、照明系の絞りで照明をインコヒーレント光から部分コヒーレント光まで変えられる。また、対物光学系の開口数を変えることによって、インコヒーレント光から部分コヒーレント光まで変えて像を結ぶことができる。一般には、照明の絞りを対物光学系の開口数の0.9程度として観察するのが適当とされている。

しかしながら、光学系や光学系と電子装置を組み合わせた装置の基礎が肉眼のコントラスト識別能力にある以上、その限界は目にあり、例えば、目のコントラスト識別能力は背景光の輝度をL、目が識別できる輝度差をΔLとするとWeber・Fechnerの法則に従ってΔL／L＝一定（0.01から0.02）である。ただし、背景光Lは３から３×１０^３ｃｄ／ｍ^２の範囲内で成り立つ。

また、光学系の分解能は、Fraunhofer回折により開口関数の２次元Fourier変換となって、円形開口による点像の第一暗環、換言すれば、Airyの円盤と呼ばれる半径が0.61λ／NAで与えられる中央に明るい円があり、そこに光エネルギーの約８４％が含まれている。同様に、四角開口は、その辺と直角の放射状の線に沿って広がり、それを中心に回折光が同心円状の環に広がる。また、四角開口は、その辺と直角の放射状の線に沿って広がる。それらより微小な物体は、この大きさにまで回折して広がり、そのコントラストは、実物体より著しく低下する。この背景光とのコントラストの差の検出限界が、目のコントラスト識別能力の限界で決まる。

一方、近年は電子画像による計測が広がってきて、光学系も光センサーの一部と考えて光信号を扱うことが多くなった。その考えによると、光学系が結ぶ画像の深度、分解能、波長帯域等も電磁波と同様な信号として解析できるようになった。また、コントラストは、光学系を通すことによる背景光（例えば、光学系の結像特性や迷光、散乱光）、光学材料や試料保持材料の自己発光や蛍光及び撮像系のノイズにより低下する。これらを総合して設計ができるようになった。

低コントラスト物体の検出や独立微小物体の検出するためには、撮像素子の量子効率を上げ、撮像時間を長くし、又は複数重畳することによって、コントラストの差の検出を、光学系及び撮像素子の機能を総合して行う。したがって、それら各々の限界を極めることによって、肉眼の限界に迫り又はそれを超えることができる。

この論理を展開する上で重要となるのがFourier結像論であり、これは、光学系の空間周波数特性を電気信号伝送路の周波数特性と同様にして、光信号をFourierスペクトル空間で扱うFourier結像論（例えば、非特許文献２）に基づいて数式で表し、試料からの像が光学系を通過する関係を伝達関数として表し、その光信号の空間周波数スペクトルは、伝達関数によって定まり、伝達される特定の空間周波数領域と伝達されない空間周波数領域とに分かれる。その理論的な境界は、対物レンズの開口数で定まり、例えば、乾燥系では、インコヒーレント光は２NA／λとなり、コヒーレント光はNA／λとなり、その中間の部分コヒーレント光は、開口数の度合いで決まる。

この理論的な限界を超える方法として次の二つの方法があるが、いずれも基本となる原理は同じであり、観察物体と結像光学系との間に空間周波数を変調する手段を設けて位相を変えることにより、通常はコントラストの差として検出できないほど低い位相差の情報を、高周波空間スペクトル成分を含む位相変調スペクトルとして画像に反映させ、それらの像を、複数撮像するとともに画像処理で復調し及び合成する。

回折格子で変調した光を、光学系を通した後に復調して結像する方法（例えば、特許文献２及び非特許文献３）や、回折格子に120度ずつ異なる位相の光に変調して光学系を通した後、容易に復調できるようにする方法（例えば、特許文献３及び非特許文献４）や、空間変調パターンを用意して光学系を通して撮像された複数の画像を画像処理し合成する方法（例えば、特許文献４）が提案されている。

しかしながら、顕微鏡下の自然な生物標本を観察及び計測する限り、その中に含まれる多種多様な高分子による多種多様な光の振幅と位相をコントラストの差として検出するのには、物理現象をモデル化したFourier結像論では、一般性を持たない。

現実の試料は、スライドガラスの上に試料を置いた後に封入材を塗布してカバーガラスを載せて封入される。現在の観察では、焦点深度を、試料の極一部の層が像を結ぶ程度の厚さにしている。

しかしながら、試料に含まれる光学的な情報ができるだけ多く検出できることも重要な条件であり、一部の層だけ観察していたのでは、重要な病気の兆候等の情報を見落とす可能性がある。そこで、試料の厚さに対して、表面に付着するごみ、封入材等の各層に含まれるごみ、封入材の層の不均一さ等によるコントラストの違いが観察像に影響しないような深度、かつ、試料に含まれるできるだけ多くの物質が像として捕らえられるようにすることが望まれる。

したがって、それらができる照明は、インコヒーレント光又は部分コヒーレント光である。それらのうち、焦点深度が適度に深くて可視光全域の像が得られるのは、部分コヒーレント光である。

しかしながら、部分コヒーレント光は結像が線形でないことから、物体中に存在しなかったフーリエ成分の像が現れる。それがFourier結像論による解析を必要とし、物体から光学系を介した像への伝達関数が定義できない。しかしながら、例えば、低コントラストの試料は、背景光を明るくするとコントラストは低下するが、近似的に線形性が保たれることからその低下を撮像素子で補うことにより観察することができる。

一つの方法として、透明で乱反射するものや位相差が８／λ又は４／λより大きいものは、十分均一な照明系と焦点深度の深い顕微鏡であれば低いコントラストでも検出できるとされている。その一例として、照明系及び対物系をテレセントリックにして照明と虹彩絞りを可変にしたNA可変虹彩絞り対物レンズ（例えば、特許文献５）のように、虹彩絞りを0.6〜0.05程度の範囲で十分絞ることによって、ある程度大きな位相変化や透明で乱反射するものは検出できる。

さらに、高解像度の撮像素子と組み合わせて線形な感度領域で撮像することによって、Weber・Fechnerの法則に従い、目が識別できるコントラストの範囲ΔL／L＝一定（0.01から0.02）を超える試みがなされている。それら性能が高められる総合的な設計や信号処理が行われるとともに、電子計測に更に適応した装置となることが望ましい。

Airyの円盤とその周辺を分けるためには、光点とそれに隣接する点とを分離させる必要がある。その一つの手法として、世界地図で各国を隣接した国が同じ色にならないように最少の数の色で塗り分けるグラフ理論の地図塗り分け方法がある。これは、グラフ理論で最も有名な問題でそれまで解かれたことがないオープン問題となっていた。これは、「平面あるいは球の表面の上に描かれたどんな地図でも、四色あれば、隣接する国が同じ色にならないように色分けできる。」という仮説（例えば、非特許文献６）があり、その後、これは、計算機の支援を受けることによって４色で塗り分けできることが証明された（例えば、非特許文献７）。しかしながら、いまだに、数学の伝統的な証明方法でグラフ理論を用いてエレガントに解かれてはいない。
特開2002−182119号公報（図２） 特許第3066874号公報（第1図） 特開平11−242189号公報（第1図） 特開2001−235316号公報（第1図） 特開2003−028460号公報（第２図、第５図） E.Hect: "Optics Third Edition", ADDISON WESLEY, pp.453-465,Figure10.30,Figure10.24 , 1998.（図１，２） S.INOUE: "VIDEO MICROSCOPY The Fundamentals"， Plenum, 1997. W.Goodman: "Introduction to Fourier Optics", McGraw-Hill, 1986. W.Lukosz: "Optical System with Resolving Powers Exceeding the Classical Limit. II", J. Opt. Soc. Am. 57, pp.932-941, July 1967. D. Mendlovic et al: "One-dimensional superresolution optical system for temporally restricted objects", J. Applied Optics, Vol.36, pp.2353-2359, April 1997. F. Harary : "GRAPH THEORY", Addison-Wesley, 1971 K.APPEL, W.HAKEN : "THE SOLUTION OF THE FOUR-COLOR-MAP PROBLEM", Sci. Amer. 237 no.4 pp.108-121 1977.

一般の顕微鏡は、インコヒーレント光の照明系及び観察系であり、試料に含まれるあらゆる光学的な情報を検出するために必要な高い分解能と深い深度の条件を両立させた機能を達成するのは困難である。

高い分解能を得るためには、インコヒーレント光による像で観察することで達成される。しかしながら、インコヒーレント光を用いて結ばれた像は、深度が浅くなる。また、深い深度を得るためには、コヒーレント光による像で観察することで達成される。しかしながら、コヒーレント光は、一般に単色で深い深度が得られるものの、例えば、スライドガラスとカバーガラスの間に封入された生物試料や液晶などの観察・計測では、試料表面又はガラス表面のごみや傷が、試料の像とともに検出される。

部分コヒーレント光は、その中間にあり、適度な高い分解能と深い深度の像を観察できる。しかしながら、部分コヒーレント光は、Fourier結像論に基づき非線形であるが、低いコントラスト試料においては線形が保たれる。また、部分コヒーレント光は、インコヒーレント光に比べると分解能は低いが深い深度が得られる。

本発明の目的は、照明系と対物光学系の分解能及び撮像素子を有効に利用して、コントラストの濃淡の画像情報として処理及び合成し、高分解能及び深い深度の明るい像を取得する顕微鏡撮像装置及び方法を提供することである。

本発明による顕微鏡撮像装置は、試料を照明する照明光学系と、前記照明光学系によって照明された試料を観察する観察光学系と、前記観察光学系によって観察された試料の画像を取得する撮像系とを具え、前記照明光学系が、均一な照明の像が結ばれる位置に設けられ、光を前記試料の全面に対して均一に照明し、コヒーレント光又は部分コヒーレント光を、照明群ごとに前記試料に複数回照明する照明切替手段を有し、前記撮像系が、前記照明群で照明された試料に対応する画像を合成して、１枚の画像を構成する画像合成手段を有し、前記照明群が、１個の明部又は互いに隣接しない複数の明部と、前記明部を包囲する暗部とを有し、前記照明群の全ての明部によって前記試料の全面が照明されるようにしたことを特徴とする。

本発明による顕微鏡撮像方法は、試料を照明する照明ステップと、前記照明ステップによって照明された試料を観察する観察ステップと、前記観察ステップによって観察された試料の画像を取得する撮像ステップとを具え、前記照明ステップが、均一な照明の像が結ばれる位置において、光を前記試料の全面に対して均一に照明し、コヒーレント光又は及び部分コヒーレント光を、照明群ごとに前記試料に複数回照明する照明切替ステップを有し、前記撮像ステップが、前記照明群で照明された試料に対応する画像を合成して、１枚の画像を構成する画像合成ステップを有し、前記照明群が、１個の明部又は互いに隣接しない複数の明部と、前記明部を包囲する暗部とを有し、前記照明群の全ての明部によって前記試料の全面が照明されることを特徴とする。

本発明によれば、均一な照明の像が結ばれる位置において、光を試料の全面に対して均一に照明し、コヒーレント光又は部分コヒーレント光を、照明群ごとに複数回照明し、照明群で照明された試料に対応する画像を合成して、１枚の画像を構成する。この場合、照明群は、１個の明部又は互いに隣接しない複数の明部（本明細書中、「光点」とも称する。）と、明部を包囲する暗部（本明細書中、「暗点」とも称する。）とを有し、照明群の全ての明部によって試料の全面が照明される。

これによって、インコヒーレント光は高い分解能の画像を得られ、部分コヒーレント光やコヒーレント光は試料面に結ばれる光点とその周辺の暗点で分け、光点を独立させるようにして照明し、試料から透過又は反射してくる部分コヒーレント光又はコヒーレント光を検出し、照明された光点から成る複数の画像を集めて合成することによって、深い深度及び高い分解能の画像を取得することができる。

照明の切替は、液晶シャッタ配列、反射型マイクロミラー配列、反射型液晶配列又は移動・回転自在のピンホール配列若しくはモザイクミラー配列を通じて行われ、後に説明するように、照明切替の際の照明回数を４回、９回又は１６回とするのが好ましい。

試料に含まれる情報を高い分解能、深い深度及び高解像度で撮像するに際し、顕微鏡では、照明光学系から照射された試料の光を集める結像光学系を介して結像させた像を高い分解能及び深い深度を保って適正に行うことを目的としている。

試料の観察・撮像は、試料を透過する光又は反射する光の像を観察及び撮像をすることである。これらの像は、コントラストが高い像と低い像があり、生物試料、高分子材料等はコントラストが低い像である。特に、生物試料像は、コントラストが低いため、これを検出し易い透過光が使われ、試料に照射された光の一部で像面に一様に分布し、試料の情報を含まない背景光からその中に埋もれたコントラストの低い像を検出する必要がある。

その照明には、インコヒーレント光、部分コヒーレント光、又は、コヒーレント光がある。インコヒーレント光はさまざまな波長と位相の光の集まりの照明で、拡散光やコンデンサー照明によって結像レンズの開口全体が一様に照明される場合である。コヒーレント光はある波長及び位相のそろった光の照明で、近似的にはコンデンサーを絞り込んで点光源に近づけた場合である。部分コヒーレント光はその中間の照明で物体と像の間に線形関係はない。しかしながら、顕微鏡観察における生物試料のように物体のコントラストが十分に低いものにおいては近似的に線形となり伝達関数が定義できる。

試料を高い分解能で観察及び撮像するのには、検出プローブとなる照明光とそれを像として捕らえる対物光学系がある。倍率が一定の場合、画像を決めるパラメータとして、分解能と焦点深度のパラメータがある。その照明光については、
（１）試料に均一に照明できることと、
（２）対物光学系の開口数に適した絞りで照明できることが挙げられる。
対物光学系については、
（１）結像に適した倍率と、
（２）像の明るさと、
（３）試料の性質により開口数を選べることとが挙げられる。
これら照明系と対物光学系を備えた顕微鏡が望まれている。

従来の共焦点顕微鏡で用いられてきた技術は、ピンホールを通した光線を試料に移動させながら照明する、また、多角形回転ミラーやミラーを振動させて作り出した走査光線を試料に照射して撮像してきた。しかしながら、ピンホールを通過する光線は、走査線上に連続して試料に照射されるため、コヒーレント光では定められた光点を結ぶが、部分コヒーレント光では、Fourier結像論に従って回折光が非線形に広がり、光点を中心として周辺に不連続に照射される。例えば、円形は円形状に不連続に光エネルギーが広がり、四角形は各辺に沿って四方に不運続に光エネルギーが広がる。

この回折による光スペクトルの広がりでは、明るい部分を第0次回折光、第1次回折光、第2次回折光、‥、暗い部分を第0次暗部、第1次暗部、第2次暗部、…と呼び、図１のようになる。その像は、円形ビンホールは図２Ａに示す像になり、四角形のピンホールは図２Ｂに示す像になる。

部分コヒーレント光は、これら光の連続的な干渉により非線形な現象、例えば、エッジの強調などが像面に現れる。かかる干渉を避けるために、グラフの地図塗り分け問題を適応して、光の振幅の主成分であるAiryの環と呼ばれる回折の0次回折光部とその周辺に広がる0次暗輪部及び周辺の照明を遮り暗点として囲むことによって、図１のグラフのように照射される光のコントラストを強調して照射する。

また、試料に照射された光は、光点で吸収され、2次励起されて周辺の点に影響を与え、又は反射された光が周辺の点を間接的に照らすことが考えられる。これらの影響を低減させるためにも、周辺に暗点を設け、光点による相互間接照明を取り除いて撮像できるようにする。

このグラフ理論による世界地図の塗り分け方法は、「地図を塗り分けするのに最少何色を必要とするかを解く方法」で、第1次の項まで暗点で分離する、すなわち、周辺を1暗点で囲むように色分けするには、最少4色〈4点〉で塗り分け可能である。したがって、単位多光点で照明及び撮像するには、最少4回パターンを変えて行えば全ての点を照明して撮像できる。

また、第2次の項まで暗点で分離する、すなわち、周辺を2つの暗点で囲むように色分けするには最小9色（9点）で塗りわけできる。したがって、単位多光点で照明及び撮像するには9回パターンを変えて行えば、全ての点を照明して撮像できる。また、第3次の項まで時点で分離する、すなわち、周辺を3つの時点で囲むように色分けするには最小16色（16点）で塗り分けできる。したがって、単位多光点で照明及び撮像するには、16回パターンを変えて行えば、全ての点を照明して撮像できる。このように、一般には1次の項（Airyの円、角）の暗部までで光エネルギーの約84％が含まれ、2次の項の暗部までで光の約92％が含まれる。したがって、3次の項まで分離し非線形成分を除去して光点を合成することによって高い伝達関数が達成できる。

均一な独立した単位多光点で照明された試料から透過又は反射してくる光を、NA可変虹彩絞りを備えた試料面テレセントリック光学系で集光し、像面テレセントリックな第二対物レンズで撮像面に投影して撮像するのに、光点は、インコヒーレント光、部分コヒリレント光及びコヒーレント光のいずれかに関係なくFraunhofer回折現象を起す。その影響が顕著に現れるのは、部分コヒーレント光である。

また、コヒーレント光は、単色で深い深度がある。しかしながら、部分コヒーレント光は、回折現象の影響があっても、適度な深い深度及び高い分解能がある。これは、厚い試料内部に含まれる全ての画像情報を顕微鏡で読み出すのに優れている。例えば、深度が深すぎると、光学系の表面やカバーガラスの表面に付着したごみが検出されたり、カバーガラスと試料の間の封入剤による斑が検出されたりすることがある。したがって、試料に含まれる画像情報を十分検出し、かつ、それら試料に無関係なものを除去する光学系及び画像処理が必要になる。

深度と分解能の関係を表にまとめると以下のようになる。

また、顕微鏡の結像性能は伝達関数（OTF：Optical Transfer Function）で表し、照明系と観察系できまる。本発明は超解像技術の一種で撮像系も含めた総合的な伝達関数で表す。そのコントラストと空間周波数との関係は図3に示すグラフのようになる。

既に説明したように、部分コヒーレント光の照明を、２ＮＡ／λより低くなる伝達関数を周辺に暗部を設けて囲むことで高めてきたが、撮像においても、これと連動させて撮像した複数の画像に含まれているAiryの光点だけを検出して取り出し、それら光点を1枚の画像に合成することによって、更に深い深度で高分解能の画像を取得することができる。

照明の単位多光点と、撮像された画像の単位多光点とを1対1に対応させることによって、十分なコントラストで光点を検出できるとともに、高い透過部又は反射部の輻射が周辺の画素に間接照明効果や、蛍光等の自己発光現象を低減させて影響を及ぼす（、すなわち、背景光又はノイズとなる）のを軽減する。

照明における市松模様状の照明方法又は撮像における市松模様状の撮像方法を機能的に連動させて撮像することによって、撮像素子は、市松模様状の画像を撮像したときが最も映像周波数が高くなる。このときの撮像系の信号は、最も高い信号値と最も低い信号値とを繰り返す。これは、操像系を最も酷しい条件で働かせる。その一方で、常に光点と暗点（基準値）とを比較することができ、増幅回路や伝送路における映像信号の蓄積効果が最も低くなる。蓄積効果が低くなるということは、最も分解能が高くなることを意味する。また、映像信号の主成分が最も高い周波数の交流成分になるために、増幅及び信号号処理（例えば、ロックインアンプ方式による検出や、AGC：Automatic Gain Contoro1や、マルチ画像の合成処理）が容易になる。

回折による光の広がりを示すグラフである。 円形ビンホールを示す像及び四角形のピンホールを示す像を表す図である。 コントラストと空間周波数の関係を表したグラフである。 本発明による顕微鏡撮像装置の第１の実施の形態を示す図である。 本発明による顕微鏡撮像装置の第２の実施の形態を示す図である。 本発明による顕微鏡撮像装置の第３の実施の形態を示す図である。 光点を一つの暗点で囲む場合の照明群のパターンの一例を説明するための図である。 光点を二つの暗点で囲む場合の照明群のパターンの一例を説明するための図である。 光点を三つの暗点で囲む場合の照明群のパターンの一例を説明するための図である。

符号の説明

１ 光源
２ 第１コレクタレンズ
３ 光インテグレータ
４ 第２コレクタレンズ
５ 単位多光点光源
６ コンデンサ光学系
７ 観察光学系
８ 撮像部
９ 試料
１０ 計算部
１１ ビームスプリッタ

本発明による顕微鏡撮像装置及び方法の実施形態を、図面を参照して説明する。なお、図面中、同一の要素には同一の符号を付すものとする。光学系の詳しいFourier結像論による解析は、上記非特許文献2に従い、類推可能なものとして主要な部分のみを説明することとする。

図４は、本発明による顕微鏡撮像装置の第１の実施の形態を示す図である。この場合、本発明による顕微鏡撮像装置は、Fourier結像論に基づく透過型照明顕微鏡において実現され、光源１と、第１コレクタレンズ２と、光インテグレータ３と、第２コレクタレンズ４と、単位多光点光源５と、コンデンサ光学系６と、観察光学系７と、撮像部８とを具える。

光源１として、タングステンランプ、キセノンランプ、レーザー光源等を用いることができる。第１コレクタレンズ２は、光源１からの光を集光し、均一で平行な照明にする。光インテグレータ３は、第１コレクタレンズ２からの光を更に均一にする。第２コレクタレンズ４は、光インテグレータ３からの光を結像する。

単位多光点光源５は、均一な照明の像が結ばれる位置に設けたピンホール配列又は液晶シャッタ配列からなる。特に、液晶シャッタ配列の場合、光点の大きさ、暗点の大きさ及び暗部領域の大きさを適切にできることから、試料に適した照明と撮像の条件が設定できる。これにより高い分解能及び深い深度の像を得ることができる。コンデンサ光学系６は、単位多光点光源５から透過してくる単位多光点の照明を適切に絞り、試料９に照射する。観察光学系８は、例えばＮＡ可変虹彩絞り付き対物光学系によって構成され、試料９を透過し又は試料９から反射する光をインコヒーレント光、部分コヒーレント光又はコヒーレント光にして結像する。撮像部８は、結像された光を像として検出する。

単位多光点光源５、コンデンサ光学系６及び観察光学系７及び撮像部８は、計算部１０によって制御及び連動され、計算部１０は、撮像部８から入力された画像を記憶し、処理し及び合成して外部に伝送する。インコヒーレント光は、全面に均一に照明し、部分コヒーレント光又はコヒーレント光は、光点をピンホール配列又は透過型液晶シャッタ配列で構成し、その周辺の暗部は、それと等価な単位面積を遮蔽することで実現した単位多光点光の光で試料を照明している。これによって、光点の回折光が、照明されていない暗部にまで広がるが、その光エネルギーは、Airyの明部の数パーセント程度に制限される。また、インコヒーレント光として結ばれた像はそれを撮像する。部分コヒーレント光又はコヒーレント光として結ばれた像は、複数に分けて照明された数の像を撮像し、それらを計算部１０に入力し、処理及び合成して全体の画像を得る。

光点を暗点で囲むためには、グラフの地図塗り分け問題を適用する。例えば、光点を一つの暗点で囲むためには最低4色が必要であり、4色あれば一つの光点を暗点で囲むことができる。これにより、非線形の主な回折の0次暗部、1次明部を除去できる。

また、光点を二つの暗点で囲むためには最低9色が必要であり、9色あれば一つの光点を囲むことができる。すなわち、9枚の画像を撮像し、これらの光点を処理し、合成して撮像する。これにより、非線形の主な回折の0次暗部、1次明部、1次暗部，2次明部を除去できる。

さらに、光点を三つの暗部で囲むためには最低16色が必要であり、16色あれば一つの光点を囲むことができる。すなわち、16枚撮像し、これらの光点を処理して合成することで撮像する。これにより、非線形の主なスペクトルである0次暗部、1次明部、1次暗部、2次明部を除去できる。これにより不要なほとんどの非線形成分を除去できる。

後に説明する市松模様状の照明方法又は市松模様状の撮像方法により、計算部１０が、照明系（単位多光点光源５及びコンデンサ光学系６）と撮像系（観察光学系７及び撮像部８）とを機能的に連動させ、撮像することによって、撮像部８は、増幅回路や伝送路の蓄積効果を低くすることができ、常に基準値（暗点）と比較することができ、かつ、映像信号の主成分が最も高い周波数の交流成分になることから、増幅及び信号処理（例えば、ロックインアンプ方式による検出やAGC：Automatic Gain Controlや、得られたマルチ画像の合成処理）が容易にできる。

図５は、本発明による顕微鏡撮像装置の第２の実施の形態を示す図である。この場合、本発明による顕微鏡撮像装置は、Fourier結像論に基づく反射型照明顕微鏡において実現され、単位多光点光源５を、反射型マイクロミラー配列、反射型液晶配列又は移動・回転自在のモザイクミラー配列によって構成し、これによって、更にコントラストの高い照明が可能になり、撮像される像も鮮明になる。この顕微鏡撮像装置は、第２コレクタレンズ４から入射された光の一部を単位多光点光源５に向かって反射するとともに、第２コレクタレンズ４から入射された光の他の部分及び単位多光点光源５から入射された光の全てを透過するビームスプリッタ１１を更に具える。

図６は、本発明による顕微鏡撮像装置の第３の実施の形態を示す図である。この場合、本発明による顕微鏡撮像装置は、Fourier結像論に基づく反射型照明顕微鏡において実現され、単位多光点光源５を、結像された均一な照明の位置に設けたピンホール配列又は透過型液晶シャッタ配列から構成する。また、ビームスプリッタ１１は、観察光学系７に配置され、単位多光点光源５から入射された光の一部を試料９に向かって反射するとともに、単位多光点光源５から入射された光の他の部分及び試料９から入射された光の全てを透過する。

図７は、明部（光点）を一つの暗部（暗点）で囲む場合の照明群のパターンの一例を説明するための図である。既に説明したように、単位多光点で照明及び撮像するには、最少4回パターンを変えて行えば全ての点を照明して撮像できるので、４パターンの明部ａ１〜ａ４の照明群（図７Ａ）を有すればよく、ａ１〜ａ４のパターンで順次明部を構成する（図７Ｂ〜７Ｅ参照）。

図８は、明部（光点）を二つの暗部（暗点）で囲む場合の照明群のパターンの一例を説明するための図である。既に説明したように、単位多光点で照明及び撮像するには、最少９回パターンを変えて行えば全ての点を照明して撮像できるので、９パターンの明部ｂ１〜ｂ９の照明群（図８Ａ）を有すればよく、先ず、明部をｂ１のパターンで構成し、最後に、明部をｂ９のパターンで構成する（図８Ｂ及び８Ｃ参照）。

図９は、明部（光点）を三つの暗部（暗点）で囲む場合の照明群のパターンの一例を説明するための図である。既に説明したように、単位多光点で照明及び撮像するには、最少１６回パターンを変えて行えば全ての点を照明して撮像できるので、１６パターンの明部ｃ１〜ｃ１６の照明群（図９Ａ）を有すればよく、先ず、明部をｃ１のパターンで構成し、最後に、明部をｃ１６のパターンで構成する（図９Ｂ及び９Ｃ参照）。

本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
例えば、照明光学系及び観察光学系を、上記実施の形態で示した構成以外の構成とすることができる。また、照明群を、上記実施の形態で示したパターン以外のパターンとすることができ、コヒーレント光又は部分コヒーレント光の照明回数を、４,９,１６回以外の回数とすることができる。

Claims (6)

1. 試料を均一に照明する照明光学系と、
   前記照明光学系によって照明された試料を観察する観察光学系と、
   前記観察光学系によって観察された試料の画像を取得する撮像系とを具え、
   前記照明光学系が、
   均一な照明の像が結ばれる位置に設けられ、光を前記試料の全面に対して均一に照明し、コヒーレント光又は部分コヒーレント光を、照明群ごとに前記試料に複数回照明する照明切替手段を有し、
   前記撮像系が、
   前記照明群で照明された試料に対応する画像を合成して、１枚の画像を構成する画像合成手段を有し、
   前記照明群が、１個の明部又は互いに隣接しない複数の明部と、前記明部を包囲する暗部とを有し、前記照明群の全ての明部によって前記試料の全面が照明されるようにしたことを特徴とする顕微鏡撮像装置。
2. 前記照明切替手段が、液晶シャッタ配列、反射型マイクロミラー配列、反射型液晶配列又は移動・回転自在のピンホール配列若しくはモザイクミラー配列を有することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡撮像装置。
3. 前記照明切替手段の照明回数を、４回、９回又は１６回としたことを特徴とする請求項１又は２記載の顕微鏡撮像装置。
4. 試料を照明する照明ステップと、
   前記照明ステップによって照明された試料を観察する観察ステップと、
   前記観察ステップによって観察された試料の画像を取得する撮像ステップとを具え、
   前記照明ステップが、
   均一な照明の像が結ばれる位置において、光を前記試料の全面に対して均一に照明し、コヒーレント光又は部分コヒーレント光を、照明群ごとに前記試料に複数回照明する照明切替ステップを有し、
   前記撮像ステップが、
   前記照明群で照明された試料に対応する画像を合成して、１枚の画像を構成する画像合成ステップを有し、
   前記照明群が、１個の明部又は互いに隣接しない複数の明部と、前記明部を包囲する暗部とを有し、前記照明群の全ての明部によって前記試料の全面が照明されることを特徴とする顕微鏡撮像方法。
5. 前記照明切替ステップが、液晶シャッタ配列、反射型マイクロミラー配列、反射型液晶配列又は移動・回転自在のピンホール配列若しくはモザイクミラー配列を通じて行われることを特徴とする請求項４記載の顕微鏡撮像方法。
6. 前記照明切替ステップの照明回数を、４回、９回又は１６回とすることを特徴とする請求項４又は５記載の顕微鏡撮像方法。