DE102016107041A1

DE102016107041A1 - Mikroskop sowie Mikroskopieverfahren

Info

Publication number: DE102016107041A1
Application number: DE102016107041.6A
Authority: DE
Inventors: Ingo Kleppe; Thomas KALKBRENNER
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2017-10-19
Also published as: CN109073874A; GB201816800D0; WO2017178528A1; GB2564356A; US20190137751A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop (10) zur Abbildung eines Objekts (18) in einem Objektfeld, umfassend eine Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312) zur Weitfeldbeleuchtung des Objekts (18), wobei die Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312) eine Vielzahl von Lichtquellen (36) aufweist, eine Detektionseinrichtung (14) zur Aufnahme eines Weitfeldbilds des Objekts (18), und eine Steuereinrichtung (16) zur Steuerung der Detektionseinrichtung (14) und der Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312). Die Steuereinrichtung (16) teilt die Lichtquellen (36) in mindestens zwei Gruppen (50a, 50b) ein, wobei die Lichtquellen (36) aller Gruppen zusammen das Objektfeld lückenlos füllen, wobei die Steuereinrichtung (16) für jede Gruppe (50a, 50b) alle Lichtquellen (36) dieser Gruppe (50a, 50b) einschaltet, die Detektionseinrichtung (14) veranlasst, ein Einzelbild des Objekts (18) aufzunehmen, die Lichtquellen (36) dieser Gruppe (50a, 50b) ausschaltet, und so alle Gruppen durchschaltet sowie mehrere Einzelbilder erzeugt, und wobei die Steuereinrichtung (16) aus den erzeugten Einzelbildern ein Bild des Objekts (18) erzeugt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Abbildung eines Objekts in einem Objektfeld, wobei das Mikroskop eine Beleuchtungseinrichtung zur Weitfeldbeleuchtung des Objekts, welche eine Vielzahl von Lichtquellen aufweist, eine Detektionseinrichtung zur Aufnahme eines Weitfeldbilds des Objekts und eine Steuereinrichtung zur Steuerung der Detektionseinrichtung und der Bewegungseinrichtung umfasst. Ferner betrifft die Erfindung ein Mikroskopieverfahren zur Abbildung eines Objektes in einem Objektfeld, das im Weitfeld mit einer Beleuchtungseinrichtung, welche eine Vielzahl von Lichtquellen aufweist, beleuchtet wird.
In der klassischen Lichtmikroskopie besteht bei der Untersuchung dreidimensional ausgedehnter Objekte, d. h. von Objekten, deren Ausdehnung entlang der optischen Achse größer ist als die Tiefenschärfe der verwendeten Objektive ist, das Problem, dass dem scharfen Bild außerfokale Bildanteile, welche unscharf abgebildet werden, überlagert sind. Dies verhindern konfokale Abbildungen, bei welchen mittels eines Pinholes aus ober- und unterhalb der Fokalebene stammendes Licht ausgeblendet wird und somit nicht zur Abbildung beiträgt. Auf diese Weise entsteht ein sogenannter optischer Schnitt. Durch Aufnahme mehrerer optischer Schnittbilder in verschiedenen Fokuslagen kann ein „z-Stapel“ gewonnen werden, welcher eine dreidimensionale Darstellung des Objekts ermöglicht.
Ein anderer Weg zur Erzeugung optischer Schnitte ist die Anwendung strukturierter Beleuchtung. Beispielhaft sei auf die EP 1556728 B1 verwiesen. Die Verbesserung der Tiefendiskriminierung wird hier dadurch erreicht, dass ein Objekt mit periodischer Struktur beleuchtet wird, eine Registrierung der so entstehenden Helligkeitsverteilung erfolgt, die Phasenlage der periodischen Struktur verschoben wird und die registrierten Helligkeitsverteilungen miteinander verrechnet werden, um eine Objekthelligkeitsverteilung zu erhalten. Diese Vorgehensweise nutzt das Prinzip, dass das Objekt unterschiedlich beleuchtet wird und aufgrund der unterschiedlichen Beleuchtung eine Tiefendiskriminierung berechnet werden kann.
Darüber hinaus ist es auch möglich, eine Tiefendiskriminierung dadurch zu erreichen, dass ein Bild mit homogener Beleuchtung und ein Bild mit einer zufälligen Intensitätsverteilung erzeugt wird, wie dies beispielsweise in Daryl Lim et al., „Wide-field fluorescence sectioning with hybrid speckle and uniform-illumination microscopy", 15. August 2008, Vol. 33, Nr. 16, Optical Letters, beschrieben wird.
Für andere Verfahren mit gleicher Wirkung sei auf L. H. Schäfer et al., „Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach", Vol. 216, Pt 2, November 2004, Seiten 165 bis 174, Journal of Microscopy, und G. Danuser and C. Waterman-Storer, "Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics", Annu. Rev. Biophys, Biomol., Struct., 2006, 35:361–87, verwiesen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mikroskop sowie ein Mikroskopieverfahren bereitzustellen, mittels welchen eine verbesserte Tiefendiskriminierung erreicht werden kann.
Die Aufgabe wird durch das Mikroskop gemäß Anspruch 1 sowie durch das Mikroskopieverfahren gemäß Anspruch 9 gelöst. Die abhängigen Ansprüche beschreiben bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
Die Erfindung schafft ein Mikroskop zur Abbildung eines Objektes in einem Objektfeld, wobei das Mikroskop eine Beleuchtungseinrichtung, eine Detektionseirichtung oder eine Steuereinrichtung umfasst. Die Beleuchtungseinrichtung dient zur Erzeugung einer Weitfeldbeleuchtung des Objekts und weist eine Vielzahl von Lichtquellen auf. Die Detektionseinrichtung ist zur Aufnahme eines Weitfeldbilds des Objekts vorgesehen. Die Steuerung steuert die Detektionseinrichtung und die Beleuchtungseinrichtung. Die Steuereinrichtung teilt die Lichtquellen in mindestens zwei Gruppen ein, wobei die Lichtquellen aller Gruppen zusammen das Objektfeld lückenlos füllen. Für jede Gruppe schaltet die Steuereinrichtung alle Lichtquellen einer Gruppe ein, veranlasst die Detektionseinrichtung, ein Einzelbild des Objekts aufzunehmen, und schaltet die Lichtquellen dieser Gruppe aus. Die Steuereinrichtung erzeugt aus den erzeugten Einzelbildern, insbesondere unter Berücksichtigung der Lage der einzelnen Lichtquellen für das entsprechende Einzelbild, ein Bild des Objekts.
Die Vielzahl der Lichtquellen ermöglicht es, das Objekt zur Tiefendiskriminierung verschiedenartig zu beleuchten. Ferner ist es möglich, die Beleuchtung des Objekts hinsichtlich der optischen Eigenschaften des Objekts anzupassen, um somit optimale Ergebnisse zu erzielen. Ein weiterer Vorteil des Mikroskops ist, dass zur Erzeugung der unterschiedlichen Beleuchtung für die Einzelbilder keine Teile des Mikroskops mechanisch bewegt werden müssen. Beispielsweise ist es nicht notwendig, ein Gitter in dem Beleuchtungsstrahlengang zu bewegen. Auch auf das Einfügen eines Diffusors zur Erzeugung einer quasi-stochastischen Intensitätsverteilung kann verzichtet werden. Da keine mechanischen Teile bewegt werden müssen, kann die Messdauer reduziert werden, weil die Schaltzeit der Lichtquellen kürzer als die Dauer zur Bewegung von mechanischen Teilen ist.
Die Steuereinrichtung teilt die Lichtquellen in verschiedene Gruppen ein, wobei die Lichtquellen aller Gruppen zusammen das Objekt in einem vorgegebenen Bereich lückenlos beleuchten. Dies bedeutet, dass die Lichtquellen aller Gruppen derart ausgewählt sind, dass die Lichtquellen in das Objektfeld projiziert unmittelbar aneinander angrenzen. Es sind somit keine Lücken in der Beleuchtung des Objekts vorgesehen, welche auf eine nicht in eine der Gruppen eingeteilte Lichtquelle zurückzuführen sind. Dadurch ist es möglich, das Objekt mit einer regelmäßigen Intensitätsverteilung, insbesondere homogen, zu beleuchten. Die regelmäßige Intensitätsverteilung der Beleuchtung liegt beispielsweise dann vor, wenn die Lichtquellen aller Gruppen eingeschaltet sind und/oder wenn die Lichtquellen einer Gruppe eingeschaltet sind. Eine regelmäßige Beleuchtung des Objekts ist insbesondere dann gegeben, wenn die in das Objektfeld projizierte Intensitätsverteilung für jede Lichtquelle gleich ist und die eingeschalteten Lichtquellen – bei in das Objektfeld projizierter Betrachtung – regelmäßig verteilt sind. Die in das Objektfeld projizierten Intensitätsverteilungen der einzelnen Lichtquellen überlappen sich also vorzugsweise. Eine homogene Beleuchtung des Objekts liegt zum Beispiel vor, wenn die Lichtquellen derart in das Objektfeld projiziert werden, dass sich die Intensitätsverteilungen der einzelnen Lichtquellen in dem Überlappbereich der einzelnen Lichtquellen so aufsummieren, dass die Summe der Strahlungsintensität an jedem Punkt des Objekts konstant oder nahezu konstant ist, beispielsweise beträgt die Abweichung der Strahlungsintensität über das Objekt weniger als 5%, 10% oder 20%.
Die Einteilung der Lichtquellen in die einzelnen Gruppen kann automatisch oder manuell erfolgen und richtet sich insbesondere nach den Eigenschaften des Objekts. Beispielsweise kann die Einteilung der Lichtquellen in die Gruppen so optimiert sein, dass ein Bleichen von Fluoreszenzfarbstoffen in dem Objekt verhindert ist. Die gelingt zum Beispiel dadurch, dass eine bestimmte Stelle des Objekts nur einmal beleuchtet wird, wenn die Lichtquellen zweier Gruppen nacheinander eingeschaltet werden. Mögliche Arten der Einteilung in Gruppen werden im Folgenden im Einzelnen noch näher erläutert.
Die Beleuchtungseinrichtung umfasst beispielsweise ein Bildschirm oder Display, wobei in diesem Fall die Pixel der Beleuchtungseinrichtung den Lichtquellen entsprechen. In einer anderen Ausführungsform kann die Beleuchtungseinrichtung ein Array aus Light Emitting Diodes (LED) oder anderen punktförmigen Lichtquellen aufweisen. Optional sind die einzelnen Lichtquellen identisch ausgebildet. Ferner ist die Steuereinrichtung mit den einzelnen Lichtquellen datentechnisch, beispielsweise über elektrische Leitungen, verbunden, so dass die Steuereinrichtung die jeweiligen Lichtquellen einzeln ein- oder ausschalten kann.
Die Steuereinrichtung schaltet alle Lichtquellen einer ersten Gruppe ein, veranlasst die Detektionseinrichtung ein Einzelbild zu erzeugen und schaltet dann alle Lichtquellen der ersten Gruppe aus. Diese Vorgehensweise wird für alle Gruppen wiederholt, so dass für jede Gruppe ein Einzelbild erzeugt wird, dessen Beleuchtung sich von der anderer Einzelbilder unterscheidet. Daraus kann die Steuereinrichtung ein Bild des Objekts erzeugen, das eine verbesserte Tiefenschärfe hat. Bei der Berechnung des Bilds wird die Lage der einzelnen eingeschalteten Lichtquellen optional berücksichtigt. Insbesondere werden dazu die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und Prinzipien verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verrechnung der Einzelbilder zu dem Gesamtbild beim mobilen System direkt auf einer Kamera der Detektionseinrichtung, beispielsweise mithilfe eines Field Programmable Gate Array (FPGA). Ferner ist es möglich, dass die Detektionseinrichtung als Trigger für die Ansteuerung der Lichtquellen fungiert. Auf diese Weise kann eine direkte Ausgabe des Gesamtbilds mit erhöhter Tiefendiskriminierung erreicht werden.
Um das bekannte Verfahren nachzubilden, bei dem ein Gitter durch den Beleuchtungsstrahlengang bewegt wird, und damit bekannte Berechnungen zur Tiefendiskriminierung verwendet werden können, kann die Steuereinrichtung die Lichtquellen derart in Gruppen einteilen, dass die Lichtquellen eine Beleuchtung des Objekts bereitstellen, die einer homogenen Beleuchtung mit einem in den Beleuchtungsstrahlengang platzierten Gitter entspricht. Es ist daher bevorzugt, dass die Lichtquellen mindestens einer der Gruppen, insbesondere aller Gruppen, in dem Objektfeld unmittelbar aneinander angrenzen. Auf diese Weise lässt sich ein Beleuchtungsmuster in dem Objektfeld erzeugen, das beispielsweise gitterförmig oder streifenförmig ist. Dadurch dass die Lichtquellen einer Gruppe unmittelbar aneinander angrenzen, tauchen in dem Beleuchtungsmuster einer Gruppe von Lichtquellen keine Lücken in der Intensitätsverteilung der Strahlung innerhalb des beleuchteten Bereichs auf, sondern lediglich außerhalb des beleuchteten Bereichs. Vorzugsweise grenzen die Lichtquellen der anderen Gruppen in dem Objektfeld unmittelbar nebeneinander an, so dass sich die Lichtquellen der verschiedenen Gruppen zu einer Beleuchtung mit regelmäßiger Intensitätsverteilung des Objektfelds ergänzen. Beispielsweise sind die Lichtquellen einer ersten Gruppe und einer zweiten Gruppe streifenförmig angeordnet, wobei sich die Streifen zu einem Gesamtfeld ergänzen. Bevorzugt sind die Streifen alternierend angeordnet. Insbesondere ist jede Lichtquelle genau einer Gruppe zugeordnet, so dass die einzelnen Gruppen Mengen von Lichtquellen bilden, die paarweise disjunkt (pairwise disjoint) sind.
Ein Vorteil der Verwendung einer Vielzahl von Lichtquellen zur Erzeugung eines gitterförmigen oder streifenförmigen Beleuchtungsmusters ist es, dass die Gitterabstände bzw. die Streifenabstände auf einfache Art und Weise an die in dem Objekt vorherrschenden Gegebenheiten angepasst werden können. So lassen sich Beleuchtungsmuster mit verschiedenen Gitterkonstanten oder Streifenabständen realisieren, was bei gegebenen mechanischen Gittern nicht beliebig möglich wäre.
Eine weitere Beleuchtungsvariante ist es, dass die Beleuchtung eine quasi-stochastische Intensitätsverteilung hat, wie sie beispielsweise im Stand der Technik durch Speckle-Muster realisiert ist. Diese Form der Beleuchtung kann mit dem Mikroskop in einer Ausführungsform realisiert werden, in der zwischen den Lichtquellen mindestens einer der Gruppen, insbesondere aller Gruppen, in dem Objektfeld Lücken bestehen. Diese bedeutet insbesondere, dass bei dieser Form der Einteilung der Lichtquellen in Gruppen das Beleuchtungsmuster keine bereichsweise Beleuchtung mit regelmäßiger Intensitätsverteilung hat, wie beispielsweise beim Vorsehen einer Streifen- oder Gitterbeleuchtung, sondern die Lichtquellen, beispielsweise zufällig, einer Gruppe zugeteilt werden. Der Vorteil dieser Ausführungsform ist es, dass im Vergleich zum Stand der Technik eine zufällige Einteilung der Lichtquellen in die Gruppen erfolgt, so dass das Problem des Einbrennens (Bleichen) der Probe und damit verbundene Artefakte vermieden werden. Insbesondere lassen sich die Lichtquellen derart einteilen, dass alle Lichtquellen zusammen eine Beleuchtung des Objekts mit regelmäßiger Intensitätsverteilung, insbesondere eine homogene Beleuchtung, realisieren, so dass die Anzahl der zu erzeugenden Einzelbilder im Vergleich zur Beleuchtung mithilfe von Laser-Speckle verringert ist, da bei der Speckle-Beleuchtung eine Intensitätsverteilung bei der Beleuchtung des Objekts an einer vorgegebenen Stelle nicht einstellbar wäre. Somit kann mit der geringstmöglichen Anzahl an Beleuchtungszyklen der zu untersuchende Bereich des Objekts vollständig und regelmäßig beleuchtet werden, wobei der Kontrast durch die Einteilung der Lichtquellen in die einzelnen Gruppen maximiert werden kann. Bei einer im Stand der Technik verwendeten Speckle-Lichtquelle wäre eine Kontrolle der Intensitätsverteilung nicht möglich.
Aus dem Stand der Technik ist eine Erhöhung der Tiefendiskriminierung bekannt, indem ein Einzelbild mit einer lückenlosen Beleuchtung erzeugt wird und anschließend ein Einzelbild mit einer Speckle-Beleuchtung. Diese Variante zur Erzeugung eines Bilds mit erhöhter Tiefendiskriminierung kann bevorzugt dadurch realisiert werden, dass die Lichtquellen einer ersten Gruppe in dem Objektfeld unmittelbar zueinander benachbart sind und die Lichtquellen einer zweiten Gruppe eine Teilmenge der Lichtquellen der ersten Gruppe bilden. Vorzugsweise liegen die Lichtquellen der ersten Gruppe in dieser Ausführungsform unmittelbar aneinander angrenzend, so dass eine regelmäßige, insbesondere homogene, Beleuchtung des Objekts möglich ist. Beispielsweise bilden die Lichtquellen der ersten Gruppe auf der Detektionseinrichtung ein Rechteck oder Kreis, welche lückenlos von den Lichtquellen der ersten Gruppe gefüllt sind. Zur Erzeugung einer Speckle-Beleuchtung werden aus den Lichtquellen der ersten Gruppe zufällig oder quasi-stochastisch Lichtquellen ausgewählt und der zweiten Gruppe zugeordnet. Auch hier kann die Auswahl der Lichtquellen für die zweite Gruppe hinsichtlich der Probe optimiert sein.
In vielen Fällen ist es gewünscht, das Objekt mit mehreren Farben oder Wellenlängenbereichen abzubilden. Dazu ist es bevorzugt, dass die Lichtquellen jeweils ausgebildet sind, Strahlung in mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu erzeugen, wobei die Steuereinrichtung die Lichtquellen zur Abgabe von Strahlung mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen ansteuert, wobei vorzugsweise die Steuereinrichtung für jeden Wellenlängenbereich einen Satz von Gruppen vorsieht, und wobei weiter vorzugsweise die Lichtquellen eines Satzes das Objektfeld lückenlos füllen und sich die Sätze von Gruppen unterscheiden. Die Lichtquellen können beispielsweise ausgebildet sein, selbst die Strahlung in mindestens zwei verschiedenen Wellenlängenbereichen zu erzeugen. Alternativ ist es möglich, für jeden Wellenlängenbereich ein Array von Lichtquellen vorzusehen, deren Strahlung insbesondere mithilfe einer Strahlteilereinrichtung derart zusammengeführt wird, dass die in das Objektfeld projizierte Intensitätsverteilung für jedes Paar (bei mehr als zwei Wellenlängenbereiche: n-Tupel) von zusammengehörenden Lichtquellen identisch ist und am gleichen Ort im Objektfeld liegt.
Die Steuereinrichtung steuert die Lichtquellen an und teilt sie wellenlängenabhängig in Gruppen ein. Für jeden Wellenlängenbereich wird ein Satz von Gruppen vorgesehen, wobei für jeden Satz von Gruppen die oben angestellten Überlegungen gelten. Optional beleuchten die Lichtquellen eines Satzes von Gruppen das Objektfeld lückenlos, so dass, wenn die Lichtquellen eines Satzes von Gruppen gemeinsam eingeschaltet werden, das Objektfeld mit einer regelmäßigen Intensitätsverteilung beleuchtet wird. Sind die Lichtquellen für einen Wellenlängenbereich in Gruppen eingeteilt, so unterscheiden sich die Einteilungen der Lichtquellen der jeweiligen Wellenlängenbereiche. Somit werden die einzelnen Lichtquellen je nach Wellenlängenbereich der Beleuchtung unterschiedlich in Gruppen eingeteilt, so dass sich die Gruppen für die verschiedenen Wellenlängenbereiche unterscheiden. Beispielsweise ist ein und dieselbe Lichtquelle, je nachdem in welchem Wellenlängenbereich sie leuchten soll, in unterschiedliche Gruppen eingeteilt.
Ein bevorzugter Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass gleichzeitig Einzelbilder mit verschiedenen Wellenlängenbereichen erzeugt werden können, wobei je nach Wellenlängenbereich ein eigenes Beleuchtungsmuster verwendet werden kann, so dass Übersprechen (Crosstalk) zwischen den Wellenlängenbereichen minimiert werden kann. Insbesondere werden die Gruppen für die verschiedenen Wellenlängenbereiche derart eingeteilt, dass Lichtquellen nicht gleichzeitig Strahlung mit den unterschiedlichen Wellenlängenbereichen aussenden, sondern nur Strahlung eines Wellenlängenbereichs. Vorzugsweise sind die Lichtquellen derart in Gruppen eingeteilt, dass Lichtquellen, die gleichzeitig Licht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche aussenden, derart im Objektfeld voneinander beabstandet sind, dass ein Übersprechen verhindert werden kann. Insbesondere bilden die Gruppen für alle Wellenlängenbereiche Mengen von Lichtquellen, die paarweise disjunkt sind. Darüber hinaus lässt sich im Vergleich zum Stand der Technik das Beleuchtungsmuster individuell je nach Wellenlängenbereich anpassen, und somit kann eine höhere Variabilität erzielt werden.
Wenn ein Bild des Objekts erzeugt werden soll, das den größtmöglichen Bereich des Objekts anzeigt, ist es bevorzugt, dass die Lichtquellen aller Gruppen zusammen die Gesamtzahl der Lichtquellen sind. Auf diese Weise lässt sich die maximal mögliche Größe der Beleuchtung in dem Objektfeld erreichen. Alternativ ist es möglich, die Beleuchtung auf Interessensbereiche in dem Objekt zu konzentrieren, beispielsweise auf Ausschnitte des Objektes in denen tatsächlich Struktur vorhanden ist. Dazu ist es bevorzugt, dass die Lichtquellen aller Gruppen ein Teil aller Lichtquellen der Beleuchtungseinrichtung sind. Für diesen Zweck wird bevorzugt zuerst ein vorläufiges Bild aufgenommen, wobei alle Lichtquellen eingeschaltet sind und anschließend werden die Lichtquellen derart in Gruppen eingeteilt, dass die Lichtquellen aller Gruppen lediglich einen Teilbereich des Objekts beleuchten. Dieser Teilbereich entspricht einem Interessensgebiet, so dass manche Lichtquellen nicht in Gruppen eingeteilt werden und zur Erzeugung der Einzelbilder nicht eingeschaltet werden.
Zur Vereinfachung der Beleuchtungseinrichtung kann vorgesehen sein, dass die Lichtquellen in Spalten angeordnet sind, wobei die Lichtquellen lediglich in Spalten ein- und ausschaltbar sind, so dass sich bei dieser Ausführungsform der Beleuchtungseinrichtung insbesondere streifenförmige Beleuchtungsmuster als auch gitterförmige Beleuchtungsmuster erzeugen lassen. Auf diese Weise lässt sich der Aufbau der Beleuchtungseinrichtung vereinfachen. Die Spalten können auch als Reihen aufgefasst werden.
Die Erfindung schafft ferner ein Mikroskopieverfahren zur Abbildung eines Objekts in einem Objektfeld, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Beleuchten des Objekts im Weitfeld mit einer Beleuchtungseinrichtung, welche eine Vielzahl von Lichtquellen aufweist,
b) Einteilen der Lichtquellen in mindestens zwei Gruppen, wobei die Lichtquellen aller Gruppen zusammen das Objektfeld lückenlos füllen,
c) Einschalten aller Lichtquellen einer Gruppe, Erzeugen eines Einzelbilds des Objekts für diese Gruppe im Weitfeld und Ausschalten der Lichtquellen dieser Gruppe,
d) Wiederholen des Schritts c) für jede Gruppe, und
e) Erzeugen eines Bilds des Objektfelds aus den Einzelbildern, insbesondere unter Berücksichtigung der Lage der einzelnen Lichtquellen für das entsprechende Einzelbild.

Das Mikroskopieverfahren kann insbesondere an dem oben beschriebenen Mikroskop durchgeführt werden. Die im Zusammenhang mit dem Mikroskop beschriebenen Vorteile, bevorzugte Ausführungsformen und Varianten gelten analog für das Mikroskopieverfahren.
Es ist bevorzugt, dass die Lichtquellen mindestens einer der Gruppen das Objektfeld in Form eines Gitters oder mindestens eines Streifens beleuchten.
Es ist ferner bevorzugt, dass die Lichtquellen mindestens einer der Gruppen das Objektfeld quasi-stochastisch beleuchten.
Es ist außerdem bevorzugt, dass die Lichtquellen einer ersten Gruppe derart ausgewählt werden, dass ihre Lichtquellen das Objekt homogen beleuchten, und dass die Lichtquellen einer zweiten Gruppe aus den Lichtquellen der ersten Gruppe quasi-stochastisch ausgewählt werden.
Es ist bevorzugt, dass je Lichtquelle Strahlung mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen erzeugt wird, wobei für jeden Wellenlängenbereich einen Satz von Gruppen vorgesehen wird, wobei die Lichtquellen eines Satzes das Objektfeld lückenlos füllen und sich die Sätze von Gruppen unterscheiden.
Es ist ferner bevorzugt, dass die Lichtquellen aller Gruppen der Gesamtzahl der Lichtquellen entsprechen.
Es ist bevorzugt, dass zunächst ein vorläufiges Bild aufgenommen wird, bei dem alle Lichtquellen eingeschaltet sind, und anschließend die Lichtquellen derart in Gruppen eingeteilt werden, dass die Lichtquellen aller Gruppen lediglich einen Teilbereich des Objekts beleuchten.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
1 schematisch den Aufbau eines Mikroskops;
2a–2c schematisch Ausführungsformen einer Beleuchtungseinrichtung des in 1 gezeigten Mikroskops; und
3a–3g Möglichkeiten, die Lichtquellen der Beleuchtungseinrichtung des Mikroskops der 1 und 2 in Gruppen einzuteilen.
Ein Mikroskop 10 umfasst eine Beleuchtungseinrichtung 12, eine Detektionseinrichtung 14 und eine Steuereinrichtung 16. Das Mikroskop 10 dient zur Erzeugung eines Bilds eines Objekts 18 im Weitfeld. Dazu erzeugt die Beleuchtungseinrichtung 12 Beleuchtungsstrahlung 20, mittels welcher das Objekt 18 beleuchtet wird. Die Beleuchtungsstrahlung 20 passiert einen Strahlteiler 22, eine Zoomoptik 24 und ein Objektiv 26. Die Zoomoptik 24 hat die Aufgabe, die Beleuchtungseinrichtung 12 mit unterschiedlichen Vergrößerungsmaßstäben auf das Objekt 18 abzubilden. Das Objektiv 26 dient zur Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung 20 auf das Objekt 18.
In dem Objekt 18 sind Fluoreszenzfarbstoffe vorhanden, welche durch die Beleuchtungsstrahlung 20 zur Abgabe von Emissionslicht angeregt werden. Das von dem Objekt 18 emittierte oder reflektierte Licht wird von dem Objektiv 26 gesammelt und als Abbildungsstrahlung 28 von der Zoomoptik 24 dem Strahlteiler 22 zugeführt. Der Strahlteiler 22 ist als dichroitischer Spiegel ausgebildet, welcher die Beleuchtungsstrahlung 22 transmittierten lässt und die Abbildungsstrahlung 28 aufgrund der unterschiedlichen Wellenlängenbereiche des Emissions- und Absorptionsspektrums des in dem Objekt 18 vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs reflektiert. Der Strahlteiler 22 lenkt die Abbildungsstrahlung 28 zu einem Emissionsfilter 30, welcher ausgebildet ist, Strahlung im Spektralbereich der Beleuchtungsstrahlung 20 zu blockieren und Strahlung im Wellenlängenbereich des Emissionsspektrums des Fluoreszenzfarbstoffs zu transmittieren. Von dem Emissionsfilter 30 gelangt die Abbildungsstrahlung 28 auf die Detektionseinrichtung 14. Die Detektionseinrichtung 14 umfasst eine Abbildungsoptik 32 und einen Sensor 34. Die Abbildungsoptik 32 fokussiert die Abbildungsstrahlung 28 auf den Sensor 34. Der Sensor 34 wandelt die Abbildungsstrahlung 28 in elektrische Signale um, welche an die Steuereinrichtung 16 weitergeleitet werden. Dazu ist die Steuereinrichtung 16 datentechnisch über eine elektrische Leitung mit der Detektionseinrichtung 14 verbunden. Die Steuereinrichtung 16 erzeugt ein Bild des Objekts 18 aus den elektrischen Signalen.
Die Beleuchtungseinrichtung 12 umfasst in der in 1 gezeigten Ausführungsform eine Vielzahl von Lichtquellen 36 und eine Beleuchtungsoptik 38. Die Lichtquellen 36 sind jeweils ausgebildet, Strahlung in verschiedenen Wellenlängenbereichen abzugeben. Sie sind beispielsweise in einem Array angeordnet. Die Beleuchtungsoptik 38 hat eine Brennweite, welche dem Abstand zwischen den Lichtquellen 36 und der Beleuchtungsoptik 38 entspricht, so dass die Beleuchtungsstrahlung 20 nach Durchgang durch die Beleuchtungsoptik 38 parallelisiert ist. Die Lichtquellen 36 sind datentechnisch mit der Steuereinrichtung 16 über eine elektrische Leitung verbunden, so dass die Steuereinrichtung 16 die Lichtquellen 36 einzeln ein- und ausschalten kann, sowie die Abgabe von Strahlung in den einzelnen Wellenlängenbereichen steuern kann. Auf diese Weise können beliebige Beleuchtungsmuster erzeugt werden. In einer vereinfachten Ausführungsform kann Steuereinrichtung 16 die Lichtquellen 36 lediglich in Spalten ein- oder ausschalten, so dass nur streifen- oder gitterförmige Beleuchtungsmuster möglich sind.
Die Lichtquellen 36 werden mithilfe der Zoomoptik 24 und dem Objektiv 26 derart in ein Objektfeld des Objekts 18 abgebildet, dass sich dort eine Anordnung der Lichtquellen 36 in Form eines Arrays ergibt. Auch Pixel des Sensors 34 sind in einem Array angeordnet, welche durch die Zoomoptik 24 und das Objektiv 26 in das Objektfeld des Objekts 18 projiziert angesehen werden kann. Diese Projektionen der Lichtquellen 36 und der Pixel des Sensors 34 überlappen, so dass jeder Lichtquelle 36 ein Pixel des Sensors 34 zugeordnet ist. Auf diese Weise ist eine rasterfreie Abbildung des Objekts 18 möglich, d.h. das Objekt 18 muss nicht bewegt werden, obwohl es mit unterschiedlichen Beleuchtungszuständen, die einem Abrastern entsprechend beleuchtet und darin abgebildet werden kann.
Ausführungsformen der Beleuchtungseinrichtung 112, 212, 312 werden nun im Zusammenhang mit der 2a bis 2c diskutiert. Der Aufbau des Mikroskops 10 der 2a bis 2c ist identisch zum Aufbau gemäß 1, abgesehen von der Beleuchtungseinrichtung 12. Der Übersichtlichkeit halber ist die Verbindung der Lichtquellen 36 mit der Steuereinrichtung 16 in den 2a bis 2c nicht eingezeichnet. Die Beleuchtungseinrichtungen 112, 212, 312 können anstatt der Beleuchtungseinrichtung 12 verwendet werden.
Die Beleuchtungseinrichtung 112 der 2a weist ebenso eine Vielzahl von Lichtquellen 36 und weiter eine erste Linse 140, eine zweite Linse 142, ein Lochblendenarray 144 und die Beleuchtungsoptik 38 auf. Die erste Linse 140 und die zweite Linse 142 sind derart angeordnet, dass sie die Lichtquellen 36 jeweils punktförmig auf eine in dem Lochblendenarray 144 vorgesehene entsprechende Öffnung abbildet. Die Beleuchtungsoptik 38 hat eine Brennweite, die mit dem Abstand zwischen dem Lochblendenarray 144 und der Beleuchtungsoptik 38 übereinstimmt, so dass die Beleuchtungsstrahlung 20 wieder parallelisiert ist. Die erste Linse 140, die zweite Linse 142 und das Lochblendenarray 144 dienen dazu, punktförmige Beleuchtungsquellen bereitzustellen. Auf diese Weisen können Lichtquellen 36 verwendet werden, die selbst nicht punktförmig sind, sondern eine gewisse Ausdehnung besitzen.
Die Beleuchtungseinrichtung 212, wie sie in 2b gezeigt ist, umfasst eine Vielzahl von Lichtquellen 36, ein Mikrolinsenarray 246, das Lochblendenarray 144 und die Beleuchtungsoptik 38. Das Mikrolinsenarray 246 umfasst eine Vielzahl von Mikrolinsen, welche entsprechend der Lichtquellen 36 angeordnet sind. Auch die Löcher des Lochblendenarrays 144 sind entsprechend den Lichtquellen 36 und den Linsen des Mikrolinsenarrays 246 angeordnet. Die Linsen des Mikrolinsenarrays 246 dienen dazu, die Lichtquellen 36 auf die Löcher des Lochblendenarrays 144 zu fokussieren. Die Brennweite der Beleuchtungsoptik 38 ist wieder derart, dass sie dem Abstand zwischen dem Lochblendenarray 144 und der Beleuchtungsoptik 38 entspricht, so dass die Beleuchtungsstrahlung 20 nach Durchgang durch die Beleuchtungsoptik 38 wieder parallelisiert ist. Das Mikrolinsenarray 246 erfüllt insbesondere die gleiche Aufgabe wie die erste Linse 140 und die zweite Linse 142 der in 2a gezeigten Ausführungsform der Beleuchtungseinrichtung 112.
Die Beleuchtungseinrichtung 312 umfasst eine Vielzahl von Lichtquellen 36, eine Streuscheibe 348 und die Beleuchtungsoptik 38. Die Streuscheibe 348 streut das von den Lichtquellen 36 stammende Licht diffus, so dass im Objektfeld eine homogene Intensitätsverteilung der Beleuchtung erreicht werden kann.
Die Abstände zwischen einzelnen Lichtquellen 36 und die jeweilige Ausführungsform der Beleuchtungseinrichtungen 12, 112, 212, 312 ist derart, dass die Projektion der Lichtquellen 36 in das Objektfeld eine regelmäßige, mindestens annähernd homogene Beleuchtung des Objekts 18 bewirkt. Beispielsweise lassen sich Lichtquellen 36, die eine große Ausdehnung besitzen, mittels der ersten Linse 140 und er zweiten Linse 142 oder mittels des Mikrolinsenarrays 246 derart auf das Lochblendenarray 144 abbilden, dass die Abbildung des Lochblendenarrays 144 in das Objektfeld zu stark überlappenden Beleuchtungskegeln der einzelnen Lichtquellen 36 führt. Somit ist eine mindestens annähernd homogene Beleuchtung des Objekts 18 erreicht.
Die Steuereinrichtung 16 teilt die Lichtquellen 36 in Gruppen ein, wie dies in den 3a bis 3g beispielhaft dargestellt ist. Beispielsweise, wie in 3a gezeigt, teilt die Steuereinrichtung 16 die Lichtquellen 36 in zwei Gruppen 50a, 50b ein, wobei die zu der ersten Gruppe 50a gehörenden Lichtquellen 36 mit „1“ bezeichnet sind und die zu der zweiten Gruppe 50b gehörenden Lichtquellen 36 mit „2“ bezeichnet sind. Die Lichtquellen 36 jeder Gruppe 50a, 50b sind derart angeordnet, dass Lichtquellen 36 innerhalb einer Gruppe unmittelbar aneinander angrenzen. Durch die Abbildung der Lichtquellen 36 in das Objektfeld grenzen benachbarte Lichtquellen 36 auch in dem Objektfeld unmittelbar aneinander, so dass Lichtquellen 36 einer Gruppe eine regelmäßige, insbesondere homogene Beleuchtung, von Ausschnitten des Objektfelds erzeugen. Es wird z. B. in 3a eine streifenförmige Beleuchtung des Objekts 18 für jedes Einzelbild bereitgestellt.
Die Steuereinrichtung 16 schaltet zuerst alle Lichtquellen 36 an, die zu der ersten Gruppe 50a gehören, und veranlasst die Detektionseinrichtung 14, ein Einzelbild des Objekts 18 zu erzeugen. Im Anschluss daran werden die Lichtquellen 36 der ersten Gruppe 50a ausgeschaltet und die Lichtquellen 36 der zweiten Gruppe 50b eingeschaltet, und die Steuereinreichung 16 bewirkt, dass die Detektionseinrichtung 14 ein weiteres Einzelbild des Objekts 18 aufnimmt. Nun werden von der Steuereinrichtung 16 die Einzelbilder miteinander verrechnet, um ein Bild des Objekts 18 mit erhöhter Tiefendiskriminierung zu erzeugen. Dabei kann die Lage der für jedes Einzelbild eingeschalteten Lichtquellen 36 zur Berechnung verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform wird das Bild ohne Berücksichtigung, welche der Lichtquellen 36 bei dem jeweiligen Einzelbild eingeschaltet waren, berechnet. Dies erfolgt beispielsweise mit folgender Formel:
I_f gibt das Gesamtbild an, I_i die Einzelbilder und N die Anzahl der Einzelbilder; in dem Beispiel von 2a ist N gleich zwei. Die Einzelbilder I_i werden summiert, was ein gewöhnliches Weitfeldbild ohne optischen Schnitt erzeugt. Dann werden die Einzelbilder I_i miteinander multipliziert, was einem logischen „UND“ entspricht. Das Ergebnis wird normiert, beispielsweise mit der N-ten Wurzel. Auf diese Weise werden die schwach modulierten Anteile ermittelt, was dem außerfokalen Anteil der Strahlung, die nicht oder nur schwach mit der Beleuchtung moduliert wird, entspricht. Die Subtraktion dieses Bilds von der oben beschriebenen Gesamtsumme führt zu einem optischen Schnitt, so dass das Gesamtbild I_f eine bessere Tiefendiskriminierung hat.
Eine weitere mögliche Einteilung der Lichtquellen 36 in Gruppen ist in 3b gezeigt. Hier sind die Lichtquellen 36 in drei Gruppen 50a, 50b, 50c eingeteilt, wobei jede Gruppe eine streifenförmige Beleuchtung des Objekts 18 bereitstellt. Auch hier sind wieder Lichtquellen 36 innerhalb einer Gruppe unmittelbar aneinander angrenzend angeordnet, so dass im Objektfeld eine homogene Beleuchtung bereitgestellt werden kann. Die zu der ersten Gruppe 50a gehörenden Lichtquellen 36 sind mit „1“ bezeichnet, die zur zweiten Gruppe 50b gehörenden Lichtquellen 36 mit „2“ und die zur dritten Gruppe 50c gehörenden Lichtquellen 36 mit „3“. Mit der in 3a und 3b gezeigten Einteilung der Lichtquellen 36 in Gruppen wird eine Beleuchtung des Objekts 18 erreicht, die der Situation entspricht, in der das Objekt 18 aus einer homogenen Lichtquelle 36 beleuchtet wird, durch die ein streifenförmiges Gitter gezogen wird.
Eine andere Variante der Einteilung der Lichtquellen 36 in Gruppen ist in 3c exemplarisch dargestellt. Hier sind die Lichtquellen 36 statistisch auf zwei Gruppen 50a, 50b verteilt, wobei wieder die zu der ersten Gruppe 50a gehörenden Lichtquellen 36 mit „1“ bezeichnet sind und die zu der zweiten Gruppe 50b gehörenden Lichtquellen 36 mit „2“. Das Objekt 18 wird dadurch quasi-stochastisch beleuchtet. Mit dieser Variante kann eine Speckle-Beleuchtung, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, imitiert werden, wobei, wenn alle Lichtquellen 36 der beiden Gruppen eingeschaltet werden, das Objekt 18 auch homogen beleuchtet wurde. Dies wäre bei einer herkömmlichen Speckle-Beleuchtung nur schwer realisierbar.
Eine weitere Form der Einteilung der Lichtquellen 36 in Gruppen zeigt 3d. Hier werden alle Lichtquellen 36 der ersten Gruppe 50a zugeteilt und die zweite Gruppe 50b umfasst Lichtquellen 36, die zufällig aus den Lichtquellen 36 der ersten Gruppe 50a ausgewählt werden. Diese Lichtquellen 36, die sowohl der ersten Gruppe 50a als auch der zweiten Gruppe 50b zugeteilt sind, werden mit „12“ bezeichnet, die nur der ersten Gruppe 50 zugeordnet sind mit „1“. In dieser Ausführungsform kann eine aus dem Stand der Technik bekannte Beleuchtung imitiert werden, bei der das Objekt 18 zunächst homogen beleuchtet wird und anschließend mit einer Speckle-Beleuchtung.
3e zeigt eine Einteilung in Gruppen, bei der die Lichtquellen 36 ausgebildet sind, Strahlung in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu erzeugen. Leuchten die Lichtquellen 36 mit dem ersten Wellenlängenbereich, so werden sie mit „1“ und „2“ bezeichnet, im zweiten Wellenlängenbereich mit „a“ und „b“. Für jeden Wellenlängenbereich werden die Lichtquellen 36 jeweils in Gruppen eingeteilt; in der in 3e gezeigten Ausführungsform jeweils in zwei Gruppen 50a, 50b. In dieser Ausführungsform werden die Lichtquellen 36 derart eingeteilt, dass die Lichtquellen 36 streifenförmig entweder Strahlung im ersten Wellenlängenbereich (1) oder Strahlung im zweiten Wellenlängenbereich (a) gleichzeitig aussenden und dann ein Einzelbild aufgenommen wird. In dem anschließenden Schritt wird der Wellenlängenbereich der einzelnen Lichtquellen 36 vertauscht und wieder ein Einzelbild aufgenommen. Auf diese Weise sendet jede Lichtquelle 36 zu einem Zeitpunkt/Einzelbild nur Licht eines Wellenlängenbereichs aus.
In einer anderen Ausführungsform zur Einteilung der Lichtquellen 36 in Gruppen, wie sie in 3f gezeigt ist, werden die Lichtquellen 36 je Wellenlängenbereich in vier Gruppen 50a, 50b, 50c, 50d eingeteilt. In dem ersten Wellenlängenbereich werden die Gruppen mit „1“, „2“, „3“, „4“ bezeichnet und in dem zweiten Wellenlängenbereich mit „a“, „b“, „c“, „d“. Das erste Einzelbild wird mit einer Beleuchtung aufgenommen, bei der die Lichtquellen 36, die mit „1“ und „a“ bezeichnet sind, eingeschaltet sind, das zweite Einzelbild mit den Lichtquellen 36 mit „2“ und „b“, ein drittes Einzelbild mit Lichtquellen 36 mit „3“ und „c“ und ein viertes Einzelbild, bei dem die Lichtquellen 36 eingeschaltet sind, die mit „4“ und „d“ bezeichnet sind. Zwischen zwei eingeschalteten Lichtquellen 36 befindet sich somit immer eine Reihe von Lichtquellen 36, die nicht eingeschaltet sind. Auf diese Weise lässt sich Crosstalk bei der Detektion zwischen den einzelnen Wellenlängenbereichen vermeiden.
Eine weitere Ausführungsform zur Einteilung der Lichtquellen 36 in Gruppen ist in 3g gezeigt. Hier wird nur ein Teil der Lichtquellen 36 in Gruppen eingeteilt. Dies geschieht beispielsweise wie folgt. Zunächst wird ein vorläufiges Bild des Objekts 18 aufgenommen, bei dem alle Lichtquellen 36 eingeschaltet sind. Dann wird in dem vorläufigen Bild ein Interessensbereich bestimmt, in welchem beispielsweise abzubildende Strukturen in dem Objekt 18 vorhanden sind. Daran anschließend werden diejenigen Lichtquellen 36 ausgewählt, die für die Beleuchtung des im Interessensbereich entsprechenden Ausschnitts des Objekts 18 entsprechen. Diese Lichtquellen 36 werden dann wie beispielsweise zuvor ausgeführt in Gruppen eingeteilt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1556728 B1 [0003]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Daryl Lim et al., „Wide-field fluorescence sectioning with hybrid speckle and uniform-illumination microscopy“, 15. August 2008, Vol. 33, Nr. 16, Optical Letters [0004]
L. H. Schäfer et al., „Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach“, Vol. 216, Pt 2, November 2004, Seiten 165 bis 174 [0005]
Journal of Microscopy, und G. Danuser and C. Waterman-Storer, “Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics”, Annu. Rev. Biophys, Biomol., Struct., 2006, 35:361–87 [0005]

Claims

Mikroskop zur Abbildung eines Objekts (18) in einem Objektfeld, umfassend – eine Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312) zur Weitfeldbeleuchtung des Objekts (18), wobei die Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312) eine Vielzahl von Lichtquellen (36) aufweist, – eine Detektionseinrichtung (14) zur Aufnahme eines Weitfeldbilds des Objekts (18), und – eine Steuereinrichtung (16) zur Steuerung der Detektionseinrichtung (14) und der Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312), dadurch gekennzeichnet, dass – die Steuereinrichtung (16) die Lichtquellen (36) in mindestens zwei Gruppen (50a, 50b) einteilt, wobei die Lichtquellen (36) aller Gruppen zusammen das Objektfeld lückenlos füllen, – wobei die Steuereinrichtung (16) für jede Gruppe (50a, 50b) alle Lichtquellen (36) dieser Gruppe (50) einschaltet, die Detektionseinrichtung (14) veranlasst, ein Einzelbild des Objekts (18) aufzunehmen, die Lichtquellen (36) dieser Gruppe (50a, 50b) ausschaltet, und so alle Gruppen durchschaltet sowie mehrere Einzelbilder erzeugt, – wobei die Steuereinrichtung (16) aus den erzeugten Einzelbildern ein Bild des Objekts (18) erzeugt.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) mindestens einer der Gruppen (50a, 50b) in dem Objektfeld unmittelbar aneinander angrenzen.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Lichtquellen (36) mindestens einer der Gruppen (50a, 50b) in dem Objektfeld Lücken bestehen.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) einer ersten Gruppe (50a) in dem Objektfeld unmittelbar zueinander benachbart sind und die Lichtquellen (36) einer zweiten Gruppe (50b) eine Teilmenge der Lichtquellen (36) der ersten Gruppe (50a) bilden.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass – die Lichtquellen (36) jeweils ausgebildet sind, Strahlung mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu erzeugen, – wobei die Steuereinrichtung (16) die Lichtquellen (36) zur Abgabe von Strahlung mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen ansteuert, und – wobei die Steuereinrichtung (16) für jeden Wellenlängenbereich einen Satz von Gruppen (50a, 50b) vorsieht, wobei die Lichtquellen (36) eines Satzes das Objektfeld lückenlos füllen und sich die Sätze von Gruppen (50a, 50b) unterscheiden.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) aller Gruppen zusammen die Gesamtzahl der Lichtquellen (36) sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) aller Gruppen ein Teil aller Lichtquellen (36) der Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312) sind.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) in Spalten angeordnet sind, wobei die Lichtquellen (36) lediglich in Spalten ein- und ausschaltbar sind.
Mikroskopieverfahren zur Abbildung eines Objekts (18) in einem Objektfeld, umfassend die Schritte: a) Beleuchten des Objekts (18) im Weitfeld mit einer Beleuchtungseinrichtung (12, 112, 212, 312), welche eine Vielzahl von Lichtquellen (36) aufweist, gekennzeichnet, durch b) Einteilen der Lichtquellen (36) in mindestens zwei Gruppen (50a, 50b), wobei die Lichtquellen (36) aller Gruppen zusammen das Objektfeld lückenlos füllen, c) Einschalten aller Lichtquellen (36) einer Gruppe (50a, 50b), Erzeugen eines Einzelbilds des Objekts (18) für diese Gruppe (50a, 50b) im Weitfeld und Ausschalten der Lichtquellen (36) dieser Gruppe (50a, 50b), d) Wiederholen des Schritts c) für jede Gruppe und e) Erzeugen eines Bilds des Objektfelds aus den Einzelbildern.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) mindestens einer der Gruppen (50a, 50b) das Objektfeld in Form eines Gitters oder mindestens eines Streifens beleuchten.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) mindestens einer der Gruppen (50a, 50b) das Objektfeld quasi-stochastisch beleuchten.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) einer ersten Gruppe (50a) derart ausgewählt werden, dass ihre Lichtquellen (36) das Objekt (18) homogen beleuchten, und dass die Lichtquellen (36) einer zweiten Gruppe (50b) aus den Lichtquellen (36) der ersten Gruppe (50a) quasi-stochastisch ausgewählt werden.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass je Lichtquelle (36) Strahlung mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen erzeugt wird, wobei für jeden Wellenlängenbereich einen Satz von Gruppen (50a, 50b) vorgesehen wird, wobei die Lichtquellen (36) eines Satzes das Objektfeld lückenlos füllen und sich die Sätze von Gruppen (50a, 50b) unterscheiden.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen (36) aller Gruppen der Gesamtzahl der Lichtquellen (36) entsprechen.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst ein vorläufiges Bild aufgenommen wird, bei dem alle Lichtquellen (36) eingeschaltet sind, und anschließend die Lichtquellen (36) derart in Gruppen (50a, 50b) eingeteilt werden, dass die Lichtquellen (36) aller Gruppen lediglich einen Teilbereich des Objekts (18) beleuchten.