AT402862B - Mikroskop zur untersuchung, messung und/oder abbildung von objekten geringer dimension mit erhöhter tiefenschärfe - Google Patents

Description

AT 402 862 B

Die Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskop zur Untersuchung, Messung und/oder Abbildung von Objekten geringer Dimension mit erhöhter Tiefenschärfe im Auf- und/oder Durchlicht, wobei zur Erzielung von scharfen Abbildungen aus mindestens zwei unterschiedlichen Tiefenebenen des Objektes dieses mit Licht aus mindestens zwei voneinander unterschiedlichen und voneinander beabstandeten Wellenlängenbändern beaufschlagt wird derart, daß die von der Mikroskopoptik erzeugten Bilder aus den mindestens zwei Tiefenebenen gleichzeitig in der selben Abbildungsebene des Mikroskops abgebildet werden

Es ist eine größere Zahl von Vorschlägen zur Verbesserung der Tiefenschärfe von optischen Systemen, insbesondere Mikroskopen, bekanntgeworden, und es sei dazu nur beispielhaft auf die DE-2 111 648 A und die DD-261 224 A, gemäß welcher eine Abtastung jeweils einer Bildebene aus einer Mehrzahl solcher Ebenen erfolgt und nach Speicherung eine zweidimensionale Bildwiedergabe erfolgt, auf die DE-42 04 268 A1, gemäß welcher verschiedene horizontale Ebenen der betrachteten Struktur sukzessive scharfgestellt und aufgenommen, diese Bilder zwischengespeichert, anschließend überlagert und wieder in den Strahlengang des Mikroskops eingeblendet werden, auf die US 3 846 009 A, gemäß welcher das zu untersuchende Objekt zur Erzielung von scharfen Abbildungen aus unterschiedlichen Objektebenen mit sichtbaren Licht unterschiedlicher Wellenlängen beleuchtet wird, auf die DE-2 712 837 C, welche den Einsatz eines achsnahen, einen hohen Transmissionskoeffizienten aufweisenden Filters vorschlägt, auf die WO 90/07723 A mit Anwendung eines Transmissionsgitters im Strahiengang oder auf die WO 92/18894 A mit einem neuartigen Beleuchtungssystem für ein hochempfindliches Mikroskop hingewiesen. Angeführt seien weiters die EP-A2 468 817 und die CH-600 359 A. Ebenfalls angeführt sei die US 4 652 093 A, welche einen ringförmigen Träger für Lichtquellen beschreibt.

Bei der DE-2 111 648 A, DD-261 224 A und der DE-42 04 268 A1 bestehen wesentliche Nachteile u.a. darin, daß einerseits eine Verbesserung der Tiefenschärfe nur bei Objekten realisiert werden kann, die sich während des Erfassungszeitraumes nicht verändern, andererseits eine mehrebenige Echtzeitbeobachtung des Objektes prinzipiell unmöglich ist. Ein weiterer Nachteil liegt in der schwer zu realisierenden erforderlichen mechanischen Stabilität.

Die Nachteile der US 3 846 009 liegen vor allem darin, daß die verwertbaren Wellenlängen ausschließlich im sichtbaren Bereich liegen, wodurch die Tiefenschärfe erheblich beschränkt bleibt. Die verwertbaren Wellenlängen werden weiters durch die Beschränkungen des Auges begrenzt und die Ergebnisse sind ausschließlich subjektiv.

Die durch ein Mikroskop zu betrachtenden Präparate haben immer eine bestimmte, endliche Dicke. Übliche Mikroskope haben jedoch mit steigender Vergrößerung sinkende, geringere Tiefenschärfe. Mit den üblichen Mikroskopen ist es ausschließlich möglich, nur eine bestimmte Schnittfläche zu einem jeweiligen Zeitpunkt in ausreichender Schärfe zu betrachten. Zur Betrachtung einer anderen Schnittfläche ist es erforderlich die Einstellung des Mikroskops zu verändern, wodurch es sehr schwierig ist, einen Gesamtbereich einer Mehrzahl von Tiefenlagen des Präparates auf einmal zu betrachten. Weiterhin können durch die Struktur des Objektes bedingte Interferenzen zu Interferenzlinien führen, die die Betrachtung des Objektes unmöglich machen können.

Die durch die Inhomogenität des Objektes entstehenden Beugungsphänomene können mittels des Mikroskopes abgebildet werden. Die beim Stand der Technik üblicherweise verwendeten Beleuchtungsarten haben folgende Nachteile: 1. Bei Verwendung einer Breitbandbeleuchtung (weißes Licht) nimmt die Tiefenschärfe mit zunehmender Vergrößerung rasch ab. 2. Im Falle monochromer Beleuchtung bekommt man einerseits eine entsprechend der verwendeten Wellenlämge geringe Tiefenschärfe, andererseits stark störende Interferenzlinien.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die vorangehend erläuterten Nachteile zu vermeiden und unter Einsatz zur Verfügung stehender, moderner Schmalbandbeleuchtungstechnik, kombiniert mit im UV, sichtbaren und/oder IR Bereich sensitiven Videosensor und/oder Bildwandler sowie nachgeschalteter Bildaufnahme- und/oder Bildverarbeitungseinrichtung und Bildwiedergabeeinrichtung ein hochinformatives System zu schaffen, das der Lichtmikroskopie neue und unerwartete Impulse zu verleihen imstande ist.

Dazu wurde das Phänomen genutzt, das zu beobachten ist, wenn ein zu untersuchendes Objekt mit mehreren monochromen bzw. schmalbandigen Lichtquellen beleuchtet wird, und das dazu führt, daß eine gemeinsame, gleichzeitig aus mehreren Ebenen verschiedener Tiefenlagen im Objekt stammende, scharfe zweidimensionale Abbildung des tiefenmäßig erfaßten Raumes erzielt wird.

Erfindungsgemäß ist beim eingangs genannten Mikroskop um das Objektiv und/öder unterhalb des Objekttisches mindestens ein, insbesondere ein an sich bekannter ringförmiger Lichtemitter-Trägerkörper vorgesehen, der mindestens zwei Gruppen von zum Objekt hin gerichteter, in ihrer Intensität regelbarer Schmalband-Lichtemitter, insbesondere LEDs oder Laserdioden aufweist, die gleichzeitig Licht von mindestens zwei voneinander unterschiedlichen, diskreten Wellenlängenbändern des UV, sichtbaren und/oder IR 2

AT 402 862 B

Bereiches aussenden, und daß in an sich bekannter Weise in der Abbiidungsebene des Mikroskops die Bildempfangsfläche eines Videosensors und/oder Bildumwandlers od.dgl. angeordnet ist, welchem bzw. welchen mindestens eine, bevorzugt rechnergestütze Bildaufnahme- und/oder Bildverarbeitungseinrichtung und eine Bildwiedergabeeinrichtung nachgeschaltet sind.

Bei einer gegebenen Mikroskopanordnung werden die Abbildungsebenen von kürzeren Wellenlängen näher zum Objektiv abgebildet als die längerer Wellenlängen.

Die einzelnen Beleuchtungswellenlängen oder Schmalband-Spektralbereiche müssen mindestens der Bandbreite entsprechende spektrale Abstände voneinander haben, um die Abbildungsschärfe in verschiedenen Tiefenebenen sichern zu können.

Dem augenblicklichen Stand der Entwicklung entsprechend ist es bevorzugt, monochromatisches bzw. schmalbandiges Licht des Ultraviolett-, sichtbaren- und/oder Infrarotbereich gemäß Anspruch 1 erfindungsgemäß einzusetzen, wobei z.B. UV-durchlässige CaF2-Optiken oder andere jeweils an die Art der gewählten Beleuchtung (Wellenlänge) angepaßte Optikmaterialien zum Einsatz gelangen.

Was den oben angesprochenen Abstand der Spektralbänder des einzusetzenden Lichtes voneinander betrifft, hat sich als durchaus akzeptable und zu hochwertig brauchbaren Ergebnissen führende Vorgehensweise erwiesen, die Maxima-Lagen der Intensitätskurven der verwendeten Wellenlängen so weit voneinander zu beabstanden, wie das jeweilige arithmetische Mittel der Summe von deren Halbwertsbreiten beträgt. Als Faustregel gilt also etwa, daß der kleinste Abstand der von den Lichtquellen zur Emission gelangenden Spektralbänder voneinander zumindest so groß sein soll wie die Breite eines Bandes.

In diesem Zusammenhang bezüglich scharfer Bandtrennung ist es günstig, von einem Bandabstand der Spektralbänder auszugehen, bei welchen sich diese, auf die Objektebene fallende Lichtenergie bezogen, um höchstens 20%, vorzugsweise um maximal 10%, überschneiden.

Was die Bandbreite der einzelnen Spektralbänder betrifft, so betragen die bevorzugten Werte derer Halbwertsbreiten jeweils 2 bis 25 nm, bevorzugt 2 bis 10 nm, insbesondere 3 bis 5 nm.

Es wurde beobachtet, daß zu geringe Spektralbandbreiten, z.B. im Bereich von 1 nm oder darunter zu störenden Interferenzen und "Speeckles" führen können.

An dieser Stelle sei bezüglich des mit Licht zweier bestimmter Wellenlängenbänder erreichbaren, maximalen Abstand zwischen zwei scharf abgebiideten Tiefenlagen des Objektes auf eine Faustregel verwiesen, die besagt, daß die erreichbare Tiefenschärfe dem Produkt von System-Vergrößerung und Spektralbandabstand direkt proportional ist, also z.B. bei 100-facher Vergrößerung und 20 nm Distanz zwischen den Spektralbändern der zur Objektbeleuchtung vorgesehenen Licht-Emitter der Abstand der beiden in einer einzigen Abbildungsebene gleichzeitig scharf abgebildenen Objektebenen voneinander etwa 2 um beträgt.

Um von Verschattungen und optischen Täuschungen freie, optimale Abbildungsqualitäten zu erreichen hat es sich als günstig erwiesen, daß die Spektralbänder des einzusetzenden Lichtes hinsichtlich ihrer räumlichen Homogenität jeweils optimiert sind. Für hohe Abbildungsqualitat, weil auf besonderen Schmalbandcharakter beruhend, ist der Einsatz von LED- und/oder Laser-Dioden- und/oder Gasentladungs-Strahlern günstig.

Mit einem etwa ringförmigen Lichtemitter-Trägerkörper ist z.B. der besondere Vorteil einer einfachen Basis für eine gleichmäßige, homogene Beleuchtung des Objektes gegeben sowie einer vollkommen problemlosen Umrüstung eines tiefenschärfeoptimierten Mikroskops in ein gewöhnliches Lichtmikroskop und umgekehrt.

Eine besonders einfache Lösung für die Beleuchtungseinrichtung für das erfindungsgemäßes Mikroskop ergibt sich dadurch, daß die jeweiligen Lichtemitter jeder Gruppe von Spektralbändern gleichmäßig voneinander beabstandet und auf einem Kreis, oder auf einer Mehrzahl ineinander konzentrischer Kreise, auf dem Trägerkörper bzw. in Ausnehmungen desselben angeordnet sind.

Zur Erhöhung des mit der erfindungsgemäßen Technik erzielbaren Informationsgehaltes ist weiters eine Steuereinrichtung zur Steuerung der von den Lichtemittern abgestrahlten Intensitäten des Lichts der einzelnen Wellenlängenbänder zur Angleichung aneinander und/oder Anpassung an die Spektralcharakteristik der übrigen Bestandteile des Gesamtsystems vorgesehen, sowie daß der Videosensor und/oder der Bildwandler, eine im jeweiligen Spektralbereich der Licht mindestens zweier unterschiedlicher, voneinander getrennter Spektralbänder produzierenden Lichtemitter gleichmäßige und/oder der Spektralcharakteristik der übrigen Bestandteile des Gesamtsystems anpassungssteuerbare Umwandlungs-Charakteristik aufweist.

Die von den einzelnen Komponenten bzw. vom Gesamtsystem generierten Bildpunktintensitäts-und/oder spektralen Übertragungsfehler können mittels, bevorzugt rechnergestützter, Steuereinrichtung ausgeglichen werden.

Eine große Zahl von Möglichkeiten der Objektdarstellung, eventuell gleich "life" und in Bewegung, eröffnet eine Vorgangsweise, bei der mittels der dem Videosensor und/oder Bildwandler zu- bzw. nachge- 3

Claims (5)

1. AT 402 862 B ordnetet Bildverarbeitungs-Einrichtung die gleichzeitig mittels Licht von einer Mehrzahl von voneinander isolierten Spektralbändern generierten Bilder aus einer entsprechenden Mehrzahl von Tiefeniagen des Objektes eines zu untersuchenden und/oder abzubildenden Objektes als dreidimensionale Abbildung desselben in die Bild-Wiedergabe- und/oder -Speicher-Einrichtung eingebracht und von derselben ausgegeben und/oder gespeichert werden. Eine derartige Methode ermöglicht z.B. eine scharfe, hochinformative Wiedergabe gerade stattfindender, biologischer Vorgänge in Zellen, wie z.B. Stoffwechselvorgänge, Zellorgan (Vakuolen-)bewegungen, Membrandeformationen u.dgl. Besonders bevorzugt, weil hochflexibel, ist ein durch die moderne Optoelektronik und Videotechnik ermöglichtes Verfahren der Bildauswertung, insbesondere in 3D-Form, wobei die Einzelbilder jeder der einem bestimmten Spektralband entsprechenden Ebenen in den verschiedenen Tiefenlagen des zu untersuchenden und/oder abzubildenden Objektes durch sequentielle Lichtbeaufschlagung bzw. Beleuchtung und/oder sequentielle Abtastung od. dgl. an der Aufnahme-Sensorfläche des Videosensors od. dgl. sequentiell einzeln aufgenommen und/oder gespeichert werden und diese Einzelbilder der verschiedenen Tiefenlage-Ebenen durch Bildverarbeitung zu einer räumlichen (3D) Ansicht an eine Bildwiedergabe-und/oder Bildspeicher-Einrichtung abgegeben wird. Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert. Es zeigen Fig. 1 ein Blockschema der Erfindung, Fig. 2 eine Seitenansicht einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung und die Fig. 3 und 4 ein Detail von deren Beleuchtungssystem. Die in Fig. 1 gezeigte schematische Anordnung besteht aus einem Lichtmikroskop (1), gekoppelt mit einem Mehrspektralband-Lichtstrahlersystem (2) für die Objektbeleuchtung und einem Videosensor und/oder Bildumwandler (3), wobei die Bildempfangsfläche (30) in der Abbildungsebene des Mikroskopes angeordnet ist. Dem Videosensor und/oder Bildumwandler (3) ist eine, bevorzugt rechnergestütze Bildaufnahme- (4) und/oder Bildverarbeitungseinrichtung (4) und eine Bildwiedergabeeinrichtung (4) nachgeschaltet. Das Mehrspektralband-Lichtstrahlersystem (2) sorgt für die homogene Beleuchtung des Objektes mit entweder einzelnen Wellenlängen, oder mit Schmalspektralband-Licht. Das vom Mikroskopes erzeugte vergrößerte Bild des wird auf die optische Fläche des Videosensors und/oder Bildwandlers (3) abgebildet. Das in elektrische Informationen umgewandelte Bild ist mittels eines Bildwiedergabesystems (4), also Bildmonitors, oder eines Bildverarbeitungssystems (4) mit Bildwiedergabesystem (4) darstellbar und kann mittels Bildaufnahmeeinrichtung (4) gespeichert oder aufgenommen werden. Die Stromversorgung ist mit (5) bezeichnet. Eine zentrale Steuereinheit (6) überwacht, steuert und regelt die einzelnen Funktionen und Komponenten des Systems. Die Seitenansicht der Fig. 2 zeigt schematisch das Mikroskop (1), das objektivseitig von einem ringförmigen Trägerkörper (20) mit auf ein zu untersuchendes Objekt (7) auf dem Mikroskoptisch (10) Licht zweier unterschiedlicher Spektralbänder emittierenden Lichtemittern, z.B. LED- oder LD-Strahlern (2, 2’), umgeben ist. Es ist dort ersichtlich, wie bei gleichzeitiger Beleuchtung des Objektes (7) mit monochromen Licht zweier unterschiedlicher Spektrallagen zwei tiefenlagemäßig unterschiedliche Ebenen (70, 71) im Objekt (7) "angesprochen" und gleichzeitig beide mit voller Schärfe auf die - jeweils fix eingestellten -Sensorebene (30) des Videosensors und/oder Bildwandlers (3) abgebildet werden. Fig. 3 zeigt den ringförmigen Beleuchtungs-Trägerkörper (20) von dessen Lichtemitterseite her. Es ist gut erkennbar, wie - hier auf einen einzigen Kreis - drei Gruppen von Lichtemittern (S1, S2, S3), z.B. LED-oder Laserdiodenstrahler mit drei unterschiedlichen Spektralband-Emissions-Charakteristiken jeweils gleichmäßig über den Kreisumfang verteilt angeordnet sind, womit eine vorteilhafte homogene Beleuchtung eines 2u untersuchenden Objektes für alle vorgesehenen Spektralbänder gewährleistet werden kann. Schließlich zeigt Fig. 4 einen Schnitt längs der Achse A-A aus Fig. 3 durch den ringförmigen Beleuchtungs-Trägerkörper (20). Patentansprüche 1. Mikroskop zur Untersuchung, Messung und/oder Abbildung von Objekten geringer Dimension mit erhöhter Tiefenschärfe im Auf- und/oder Durchlicht, wobei zur Erzielung von scharfen Abbildungen aus mindestens zwei unterschiedlichen Tiefenebenen (70, 71) des Objektes (7) dieses mit Licht aus mindestens zwei voneinander unterschiedlichen und voneinander beabstandeten Wellenlängenbändern beaufschlagt wird derart, daß die von der Mikroskopoptik erzeugten Bilder aus den mindestens zwei Tiefenebenen (70, 71) gleichzeitig in der selben Abbildungsebene des Mikroskops (1) abgebildet werden, dadurch gekennzeichnet, daß um das Objektiv und/oder unterhalb des Objekttisches (10) des Mikroskops (1) mindestens ein, insbesondere ein an sich bekannter ringförmiger Lichtemitter-Trägerkörper (20) vorgesehen ist, der mindestens zwei Gruppen von zum Objekt (7) hin gerichteter, in 4 AT 402 862 B ihrer Intensität regelbarer Schmalband-Lichtemitter (2', 2", S1, S2, S3), insbesondere LEDs oder Laserdioden aufweist, die gleichzeitig Licht von mindestens zwei voneinander unterschiedlichen, diskreten Wellenlängenbändern des UV, sichtbaren und/oder IR Bereiches aussenden, und daß in an sich bekannter Weise in der Abbildungsebene des Mikroskops (1) die Bildempfangsfläche (30) eines Videosensors (3) und/oder Bildumwandlers (3) od.dgl. angeordnet ist, welchem bzw. welchen mindestens eine, bevorzugt rechnergestütze Bildaufnahme- (4) und/oder Bildverarbeitungseinrichtung (4) und eine Bildwiedergabeeinrichtung (4) nachgeschaltet sind.
2. 2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweiligen Lichtemitter (2', 2", S1, S2, S3) gleichmäßig voneinander beabstandet auf dem ringförmigen Trägerkörper (20) angeordnet sind.
3. 3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweiligen Lichtemitter (2', 2", S1, S2, S3) in konzentrischen Kreisen auf dem Trägerkörper (20) und in Ausnehmungen desselben angeordnet sind.
4. 4. Mikroskop nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß weiters eine Steuereinrichtung (6) zur Steuerung der von den Lichtemittern (2', 2", S1, S2, S3) abgestrahlten Intensitäten des Lichts der einzelnen Wellenlängenbänder zur Angleichung aneinander und/oder Anpassung an die Spektralcharakteristik der übrigen Bestandteile des Gesamtsystems vorgesehen ist.
5. 5. Mikroskop nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Videosensor (3) und/oder der Bildwandler (3), eine im jeweiligen Spektralbereich der Licht mindestens zweier unterschiedlicher, voneinander getrennter Spektralbänder produzierenden Lichtemitter (2', 2", S1, S2, S3) gleichmäßige und/oder der Spektralcharakteristik der übrigen Bestandteile des Gesamtsystems anpassungssteuerbare Umwandlungs-Charakteristik aufweist. Hiezu 4 Blatt Zeichnungen 5