WO2019049837A1 - 観察装置 - Google Patents

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WO2019049837A1
WO2019049837A1 PCT/JP2018/032657 JP2018032657W WO2019049837A1 WO 2019049837 A1 WO2019049837 A1 WO 2019049837A1 JP 2018032657 W JP2018032657 W JP 2018032657W WO 2019049837 A1 WO2019049837 A1 WO 2019049837A1
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light
sample
objective lens
light source
illumination
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PCT/JP2018/032657
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Inventor
将人 土肥
Original Assignee
オリンパス株式会社
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Publication date
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    • G02B21/00—Microscopes
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    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
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    • G03B15/02—Illuminating scene
    • G03B15/03—Combinations of cameras with lighting apparatus; Flash units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/0088—Inverse microscopes

Definitions

  • the present invention relates to an observation device.
  • Patent Document 1 has a disadvantage that it can only cope with a culture container called a flask container, since the illumination light is irradiated into the culture container from the side of a transparent culture container.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and provides an observation apparatus which can correspond to containers of various shapes and can acquire a fine image in a narrow space.
  • One aspect of the present invention is an objective lens disposed below a sample container containing a sample and collecting light from the sample through the bottom of the sample container, and an optical path of illumination light to be incident on the objective lens Is disposed near the pupil position of the objective lens at or at a position conjugate with the pupil position, and the bottom portion is transmitted from below to make illumination light enter the sample container, and the light emission position and light emission range of the illumination light
  • a surface light source capable of changing the light emission pattern relating to the light emission axis in a direction intersecting the emission optical axis, and the light from the specimen generated by being irradiated with the illumination light from the surface light source and collected by the objective lens
  • Image pickup optical system for photographing under the sample container, brightness of the image acquired by the image pickup optical system with the light emission pattern of the surface light source and its light emission pattern, contrast, number of pixels and brightness Based at least one bright and early relationship with an observation device and a control unit which corrects the emission pattern of
  • the illumination light emitted upward from the surface light source below the sample container is transmitted through the bottom of the sample container to be applied to the sample, and the objective lens through the bottom of the sample container below the sample
  • the light from the sample collected by the light source is captured by the imaging optical system.
  • control unit controls the light emission pattern of the illumination light in the surface light source based on at least one of the brightness and contrast of the image acquired by the imaging optical system with the light emission pattern and the relationship between the number of pixels and the luminance.
  • the optical system further includes a phase modulation element disposed at a pupil position in the light path of the imaging optical system of the objective lens, and the control unit controls the phase of the light from the sample collected by the objective lens.
  • the light emission pattern of the surface light source may be corrected so as to be incident on the modulation element.
  • the phase modulation element may be a phase film that phase-modulates the light from the sample.
  • the phase modulation element may be a light reduction member that reduces the light from the sample so as not to allow the illumination light irradiated to the sample to pass through.
  • the reflective member which is arranged above the sample and reflects the illumination light from the surface light source toward the sample, and the imaging optical system is the illumination light reflected by the reflective member.
  • the light transmitted through the sample may be captured below the sample.
  • a light separation unit that separates the illumination light and the light from the sample is provided, and while the illumination light from the surface light source is irradiated to the sample through the objective lens, the objective lens It is good also as coaxial epi-illumination which picturizes the light from the sample which was condensed by this and separated from the illumination light by the light separation part by the image pickup optical system.
  • the space for causing the illumination light to enter the sample and the space for collecting the light from the sample can be made common, and a sample container with a small bottom can be used.
  • the light separation unit may be a half mirror.
  • the illumination light and the light from the sample can be separated according to the transmittance and the reflectance of the half mirror. Moreover, it can apply, also when using what kind of surface light source.
  • the light separation unit may be a polarization beam splitter.
  • the illumination beam and the light from the sample can be separated according to the polarization component by the polarization beam splitter. This is particularly effective when using a surface light source having a polarization characteristic such as a liquid crystal screen or a laser diode.
  • the light separation unit may be a dichroic mirror.
  • the illumination light and the light from the sample can be separated according to the wavelength by the dichroic mirror. It is particularly effective when observing fluorescence or luminescence.
  • the illumination light deflected by the light flux deflection unit can be efficiently irradiated to the sample by the objective lens.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it is effective in the ability to respond
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of an image having overexposed pixels and a dark area. It is a figure which shows an example of a low contrast image.
  • FIG. 7 is an entire configuration diagram in a case where a mirror is employed instead of the light separation unit in the observation device of FIG. 1.
  • the observation apparatus of FIG. 12 WHEREIN: It is a whole block diagram at the time of further providing a condensing lens and a reflection member.
  • the observation apparatus of FIG. 13 WHEREIN: It is a figure which shows an example of the optical path of illumination light at the time of changing the light emission area
  • FIG. 12 It is a whole block diagram at the time of further providing a condensing lens and a reflection member.
  • the observation apparatus of FIG. 13 WHEREIN: It is a figure which shows an example of the optical path of illumination light at the time of changing the light emission area
  • FIG. 12
  • 16 is a view showing an example of an optical path of observation light when the bottom of the sample container is inclined in the observation apparatus of FIG. 15; It is a figure which shows the relationship between the position of the light reception pixel of the X direction of an image pick-up element, and the all-pixels intensity detected by an image pick-up element. It is a top view which shows a mode that the incident position of the illumination light in the pupil of an objective lens is switched. It is a top view which shows a mode that the light emission pattern of a surface light source is switched to the circumferential direction.
  • FIG. 16 is an entire configuration diagram in a case where a phase film is adopted as a phase modulation element in the observation device of FIG. 15. It is a whole block diagram which shows the observation apparatus which concerns on 3rd Embodiment of this invention.
  • FIG. 27 is an entire configuration view of the observation apparatus of FIG. 26 further provided with a condenser lens.
  • FIG. 27 is an entire configuration view of the observation apparatus of FIG. 26 further including a light flux deflection unit such as a weak concave lens.
  • the observation apparatus 1 is, as shown in FIG. 1, arranged on the stage 5 on which the sample container 3 containing the sample S is mounted and below the stage 5, the observation light (light) from the sample S
  • the imaging optical system 11 for photographing the observation light from the sample S at the lower side of the sample container 3 and the recording operation device 13 such as a PC (Personal Computer) are provided.
  • the sample container 3 is, for example, a well container or a dish container made of an optically transparent material, and the bottom 3 a is configured to transmit light.
  • the symbol W indicates, for example, a solution such as a culture medium.
  • the stage 5 is made of an optically transparent material so that the sample container 3 can be mounted horizontally.
  • the objective lens 7 is disposed vertically below the sample S on the stage 5.
  • the objective lens 7 irradiates illumination light from the surface light source 9 to the sample S through the bottom 3 a of the sample container 3 while collecting observation light from the sample S through the bottom 3 a of the sample container 3 and the stage 5. It's supposed to shine.
  • the surface light source 9 is disposed at the pupil position in the light path of the illumination light of the objective lens 7.
  • a liquid crystal display in which a plurality of pixels are two-dimensionally arranged, or an LED array in which a plurality of minute LEDs (light emitting diode arrays) are two-dimensionally arranged can be used.
  • a liquid crystal display is illustrated as the surface light source 9, and a plurality of pixels are arranged in the X direction and the Y direction orthogonal to each other along the horizontal direction.
  • the surface light source 9 can change the light emission pattern regarding the light emission position and the light emission range of the illumination light in a direction crossing the emission optical axis.
  • the imaging optical system 11 separates the light path of the illumination light from the surface light source 9 and the light path of the observation light from the sample S, and the observation light separated from the light path of the illumination light by the light separation unit 15
  • An imaging lens 17 for forming an image, and an imaging device 19 such as a CCD (Charge Coupled Device) for imaging the observation light imaged by the imaging lens 17 are provided.
  • the light separating unit 15 for example, a half mirror, a polarization beam splitter, a dichroic mirror or the like is used.
  • a half mirror or a polarization beam splitter is used as the light separation unit 15 and transmits the illumination light from the surface light source 9 while the observation light from the sample S collected by the objective lens 7 Is reflected toward the imaging lens 17.
  • the recording operation device 13 includes an input unit 21 such as a keyboard for inputting an instruction by the user, a recording operation unit (control unit) 23 for recording data and performing arithmetic processing, and a monitor 25 for displaying an image or information.
  • an input unit 21 such as a keyboard for inputting an instruction by the user
  • a recording operation unit (control unit) 23 for recording data and performing arithmetic processing
  • a monitor 25 for displaying an image or information.
  • the recording operation unit 23 includes, for example, a central processing unit (CPU), a main storage unit such as a read only memory (ROM) and a random access memory (RAM), an auxiliary storage unit such as a hard disk drive (HDD), and a user.
  • CPU central processing unit
  • main storage unit such as a read only memory (ROM) and a random access memory (RAM)
  • auxiliary storage unit such as a hard disk drive (HDD)
  • An input unit for inputting an instruction an output unit for outputting data
  • an external interface not shown
  • Various programs are stored in the auxiliary storage unit, and the CPU reads the program from the auxiliary storage unit to the main storage unit such as the RAM and executes the program to realize various processing. There is.
  • the recording operation unit 23 processes the image information sent from the imaging device 19 or controls the light emission of the surface light source 9 by executing the program. Specifically, the recording operation unit 23 generates the light emission pattern of the surface light source 9 and at least one of the brightness and contrast of the image acquired by the imaging optical system 11 with the light emission pattern and the relationship between the number of pixels and the luminance. Based on this, the light emission pattern of the surface light source 9 is corrected.
  • the sample container 3 containing the sample S is mounted on the stage 5, and the recording / calculating device 13, for example, as shown in FIG.
  • the point-like illumination light is emitted in a light emission pattern in which one point is emitted and the position of the one point to be emitted is shifted in the X direction.
  • the spot-like illumination light emitted from one point of the surface light source 9 passes through the light separation unit 15 and is collected by the objective lens 7, passes through the stage 5 and the bottom 3 a of the sample container 3, and the sample S from below. Irradiated.
  • the observation light reflected on the sample S by being irradiated with the illumination light passes through the bottom 3 a of the sample container 3 and the stage 5 and is collected by the objective lens 7, and then reflected by the light separation unit 15.
  • An image is formed on the imaging surface of the imaging element 19 by the imaging lens 17. Thereby, the image information of the sample S is acquired in the imaging device 19 and is sent to the recording operation device 13.
  • the recording arithmetic unit 13 causes one point of the surface light source 9 to emit light, and the spot-like illumination light is emitted in a light emission pattern that shifts the position of one point to be emitted. Let out.
  • the spot-like illumination light emitted from one point of the surface light source 9 passes through the stage 5 and the bottom 3 a of the sample container 3 through the light separation unit 15 and the objective lens 7 and is applied to the sample S from below.
  • the observation light reflected by the sample S is transmitted through the bottom 3a of the sample container 3 and the stage 5 and is imaged on the imaging surface of the imaging device 19 by the imaging lens 17 through the objective lens 7 and the light separation unit 15. Ru. Then, the image information of the sample S acquired by the imaging device 19 is sent to the recording operation device 13.
  • the pupil eccentricity amount is calculated based on the light emission position and light emission range where each light amount distribution becomes maximum. Be done.
  • the light emission pattern of the surface light source 9 is adjusted by the recording operation unit 23 so that the illumination light is emitted from the light emission position and the light emission range where the light amount distribution is maximum based on the calculated pupil eccentricity. Thereby, a bright image of the sample S can be acquired.
  • illumination light is made to enter the container from the side by illuminating and photographing through the bottom 3a of the sample container 3 below the sample container 3.
  • the usable sample container does not have to be limited to the shape of the side as in the configuration, and the apparatus can be miniaturized as much as the optical system is not disposed above the sample S.
  • the recording operation unit 23 corrects the light emission pattern of the illumination light in the surface light source 9 based on the lightness of the image acquired by the imaging optical system 11 with the light emission pattern, so that the bright image of the specimen S You can get Therefore, it is possible to correspond to the sample container 3 of various shapes, and to obtain a fine image of the sample S in a narrow space such as an incubator.
  • the positions of a plurality of points continuous in the X direction or the Y direction may be shifted in the Y direction or the X direction.
  • the recording operation unit 23 uses the surface light source 9 based on the brightness of the image so that, for example, there are no overexposed pixels or dark areas on the image as shown in FIG. 4.
  • the light emission pattern of the surface light source 9 may be corrected based on the contrast of the image so that the contrast is not lost as shown in FIG.
  • the recording operation unit 23 generates the light emission pattern of the surface light source 9 based on the relationship between the number of pixels of the image and the signal luminance of the image information, for example, a histogram as shown in FIG. It is also possible to correct the The histogram shown in FIG. 6 indicates that overexposed pixels and dark areas are widely distributed, and the histogram shown in FIG. 7 indicates that there is no contrast. In either case of FIG. 6 and FIG. 7, the recording operation unit 23 may correct the light emission pattern of the surface light source 9 so that the relationship between the number of pixels and the signal luminance becomes an ideal curve.
  • the present embodiment can be modified as follows.
  • the light emission position and the light emission range of the surface light source 9 are divided into a plurality of, for example, four light emission areas L1, L2, L3, and L4, and each light emission area L1, L2, L3,
  • the barycentric position of one of the light emitting areas L1, L2, L3, L4 where the image obtained by the imaging optical system 11 is the brightest becomes the center of the entire light emitting area
  • the light emission pattern of the surface light source 9 may be corrected.
  • the entire circular region including the center of the surface light source 9 is made to emit light to focus (Step S1).
  • the circular arbitrary region is divided into four, for example, and the light emitting region L1 is caused to emit light, and the image information of the sample S is acquired (step S2).
  • the light emission area L2 is caused to emit light instead of the light emission area L1, and image information of the sample S is acquired (step S3).
  • light emission area L3 is caused to emit light instead of light emission area L2 to obtain image information of specimen S (step S4)
  • light emission area L4 is caused to emit light instead of light emission area L3, and image information on specimen S is obtained (Step S5).
  • step S6 it is determined by the recording operation unit 23 whether or not there is a difference in the incident light amount or the evaluation value of the observation light on the imaging surface of the imaging device 19 corresponding to each light emitting area L1, L2, L3, L4 (step S6) ). If there is no difference in the incident light quantity or the evaluation value, the light emitting areas L1, L2, L3 and L4 have no merit or demerit, so the recording operation unit 23 does not correct the light emission pattern of the area emitted in step S1. The image acquired by the element 19 is used as it is.
  • the evaluation value may increase as the amount of incident light increases.
  • the shift amount of the light emission pattern is calculated by the recording operation unit 23 (step S7).
  • numerical values in the respective light emitting regions L1, L2, L3 and L4 indicate incident light amounts or evaluation values.
  • the light emission area L1 and L2 side is a
  • the light emission area L3 and L4 side is b
  • the light emission area L1 and L3 side is A
  • the light emission area L2 and L4 side I say B.
  • the overall diameter of an arbitrary light emitting area in the surface light source 9 is taken as D pull .
  • the recording operation unit 23 calculates the shift amount ⁇ x in the X direction by the following equation (1). Further, the shift amount ⁇ y in the Y direction is calculated by the following equation (2).
  • the light emission pattern is corrected by the recording operation unit 23 so as to move the entire arbitrary light emission area of the surface light source 9 toward the light emission area L1 by ⁇ x and ⁇ y. Then, it illuminates with the light emission pattern after correction, and acquires the image of the sample S (step S8).
  • the shadowing method of the sample S is changed, and the brightness of the obtained image information is different. It can be easily seen that it is optimal to emit illumination light. Then, by shifting the light emission area of the surface light source 9 in the direction in which bright image information is obtained, a brighter image can be obtained. This is particularly effective when the number of specimens S is small at the initial stage of culture of specimens S such as cells or when it is desired to know the number of specimens S. In the present modification, the light emitting region is divided into four, but the number of divisions is not limited to this.
  • a mirror 27 is employed instead of the light separation unit 15, and illumination light emitted from the surface light source 9 is made to directly enter the objective lens 7. While irradiating the specimen S from below, the observation light from the specimen S collected by the objective lens 7 may be reflected by the mirror 27 and be incident on the imaging lens 17.
  • a condensing lens 29 for condensing the illumination light emitted from the surface light source 9 and entering the sample container 3 from the bottom 3a without passing through the objective lens 7;
  • a reflecting member 31 may be provided, which is disposed above S and has a reflecting surface 31 a that reflects illumination light incident into the sample container 3 by the condenser lens 29 toward the sample S.
  • the reflecting member 31 for example, a mirror, a lid of the sample container 3, or the like is used.
  • the condenser lens 29 and the surface light source 9 are disposed by shifting the position in the radial direction with respect to the optical axis of the objective lens 7 arranged vertically below the cell S. Illumination light is emitted toward the upper side of the sample S through the bottom 5a and the bottom 3a of the sample container 3 and reflected by the reflecting member 31 above the sample S, and the sample obliquely from above with respect to the optical axis of the objective lens 7 It may be incident on S. Then, the imaging optical system 11 may capture the observation light transmitted through the sample S below the sample S.
  • the surface light source 9 may be disposed in the vicinity of a position conjugate with the pupil position in the light path of the illumination light of the objective lens 7.
  • the observation device 41 according to the present embodiment includes a light shielding film (light reduction member, phase modulation element) 43 disposed at a pupil position in the light path of the imaging optical system 11 of the objective lens 7 as shown in FIG.
  • This embodiment is different from the first embodiment in that S is subjected to an epi-field dark field observation.
  • the same reference numerals are given to portions having the same configuration as the observation device 1 according to the first embodiment, and the description will be omitted.
  • the light shielding film 43 has a disk shape in which a light shielding portion 43a that shields light is formed at the center.
  • the light shielding film 43 has a positional relationship conjugate with the surface light source 9, and is arranged such that the light shielding portion 43 a is positioned on the optical axis of the imaging lens 17. As a result, the zero-order light of the observation light from the sample S that has entered the light shielding portion 43a is shielded.
  • a diaphragm 45 is disposed in front of the light shielding film 43.
  • the recording operation unit 23 performs the program so that the observation light from the sample S collected by the objective lens 7 is incident on the light shielding film 43 by the light emission pattern of the surface light source 9 and the light emission pattern of the imaging optical system
  • the light emission pattern of the surface light source 9 is corrected on the basis of at least one of the brightness and contrast of the image acquired by the step 11 and the relationship between the number of pixels and the luminance.
  • the observation device 41 configured as described above will be described.
  • the zero-order light is blocked by the light blocking portion 43a of the light blocking film 43 and the refracted or reflected light is An image is formed on the imaging surface of the imaging device 19 by the imaging lens 17. Thereby, the dark field observation of the sample S can be performed.
  • the observation light from the sample S The light is refracted at the bottom 3 a of the sample container 3, and the zero-order light does not enter the light shielding portion 43 a of the light shielding film 43.
  • plural points continuing in the Y direction of the surface light source 9 are caused to emit light simultaneously, and linear illumination light is emitted with a light emission pattern in which the positions of the plural points continuing in the Y direction are shifted in the X direction. Then, as shown in FIG. 17, the observation light is blocked by the light shielding portion 43a of the light shielding film 43 at a position in the X direction, so that the detection strength of the image pickup device 19 is reduced.
  • the light emission position in the X direction of the surface light source 9 which can make the zero-order light incident on the light shielding portion 43 a of the light shielding film 43 can be known.
  • the horizontal axis indicates the position of the light receiving pixel in the X direction of the imaging device 19, and the Y axis indicates the total pixel intensity detected by the imaging device 19.
  • the light emission range of the surface light source 9 can be known by the width in the X direction in which the detection intensity of the imaging device 19 is reduced.
  • the observation light is refracted at the bottom 3a, and the magnification of the light flux of the observation light with respect to the light flux of the illumination light changes.
  • the width of the light emitting region in the X direction in the surface light source 9 and the width in the X direction (magnification change amount) in which the detection intensity of the imaging device 19 decreases is 1: 1. If the width in the X direction in which the detection intensity of the imaging device 19 is reduced is larger than the width of the light emitting region in the X direction, the width of the light emitting region in the X direction in the surface light source 9 is reduced. If the width in the X direction in which the detection intensity of the imaging device 19 is reduced is smaller than the width of the light emission area, the recording operation unit 23 increases the width of the light emission area in the X direction in the surface light source 9. The light emission pattern of the light source 9 is corrected.
  • the surface light source 9 simultaneously emits a plurality of continuous points in the X direction, and emits linear illumination light in a light emission pattern in which the positions of the plurality of continuous points in the X direction are shifted in the Y direction.
  • the amount of light emission in the Y direction of the surface light source 9 and the correction amount of the light emission range can be known.
  • the zeroth-order light of the observation light is shielded by the light shielding portion 43a of the light shielding film 43. Dark field observation can be performed with high definition.
  • FIG. 18 illustrates the light emitting position of the surface light source 9 in the circumferential direction as shown in FIG. 19 so that the spot-like illumination light is sequentially incident along the outer periphery of the pupil of the objective lens 7 as shown in FIG. It may be taken as a measure.
  • FIG. 20 illustrates the relationship between the angle of the light emitting position around the central axis and the incident light amount or the evaluation value of the imaging device 19 when the light emitting position of the surface light source 9 is divided into 12 in the circumferential direction and switched.
  • ⁇ indicates the incident position of the illumination light in the pupil of the objective lens 7
  • ⁇ in FIG. 19 indicates the light emitting position of the surface light source 9.
  • the light emission position S2 to S5 is the light amount 10 or less
  • the shift amount (decentering amount) is 0.155 mm according to FIG. 22
  • BLn indicates the number of light emitting positions at which the black level is equal to or less than the black level.
  • the recording operation unit 23 when there is no light emission position that is lower than the black level, the recording operation unit 23 does not correct the light emission pattern of the surface light source 9 and uses the image acquired by the imaging device 19 as it is. And it is sufficient.
  • the number of light emitting positions which are equal to or less than the black level is eight or more, the shift amount can not be specified.
  • ⁇ indicates the incident position where the light quantity at the pupil of the objective lens 7 is larger than the black level
  • ⁇ indicates the incident position at the light level at the pupil of the objective lens 7 less than the black level.
  • the light shielding film 43 is described as an example of the phase modulation element. However, instead of this, for example, as shown in FIG. Good.
  • the phase film 47 shown in FIG. 25 is formed in, for example, a ring shape having a width in the radial direction.
  • the light emitting position and light emitting area of the surface light source 9 are determined by the recording operation unit 23 so that the observation light passes through the phase film 47, and the light emitting pattern of the surface light source 9 is illuminated so as to illuminate at the light emitting position and light emitting area. Should be corrected.
  • an image in which the direct light passing through the phase film 47 from the sample S and the diffracted light not passing through the phase film 47 are collected by the imaging lens 17 and the contrast of the light and dark contrasts on the imaging surface of the imaging device 19 It is imaged as Thus, phase difference observation of the sample S can be performed with high definition.
  • the observation apparatus 51 is disposed above the sample S and reflects the illumination light from the surface light source 9 toward the sample, and the imaging optical system of the objective lens 7
  • the second embodiment differs from the first and second embodiments in that a stop (light reduction member, phase modulation element) 45 disposed at a pupil position in the light path of the system 11 is provided.
  • the same reference numerals are given to portions having the same configuration as those of the observation devices 1 and 41 according to the first and second embodiments, and the description will be omitted.
  • the observation device 51 includes a half mirror or a polarization beam splitter as the light separation unit 15.
  • the recording operation unit 23 emits the light emission pattern of the surface light source 9 and the light emission of the surface light source 9 so that the observation light from the sample S collected by the objective lens 7 passes the diaphragm 45 by executing the program.
  • the light emission pattern of the surface light source 9 is corrected based on at least one of the brightness and contrast of the image acquired by the imaging optical system 11 in a pattern and the relationship between the number of pixels and the luminance.
  • the operation of the observation device 51 configured as described above will be described.
  • the illumination light emitted from the surface light source 9 is transmitted through the light separation unit 15 and condensed by the objective lens 7, transmitted through the stage 5 and the bottom 3 a of the sample container 3, and then reflected by the reflection surface 31 a of the reflection member 31.
  • the sample S is irradiated obliquely from above.
  • observation light of illumination light transmitted through the sample S is transmitted downward from above from the top of the bottom 3 a of the sample container 3 and the stage 5, collected by the objective lens 7, and reflected by the light separation unit 15.
  • the light passing through the diaphragm 45 is imaged on the imaging surface of the imaging device 19 by the imaging lens 17.
  • the illumination light is refracted and scattered according to the shape and refractive index of the sample S, or reduced in light according to the transmittance of the sample S, and becomes observation light on which the information of the sample S is loaded.
  • the light is collected and photographed by the image pickup device 19. Therefore, by appropriately setting the incident angle to the sample S, it is possible to form light and dark in the image of the sample S, and to obtain an easy-to-see image of a transparent subject such as a cell.
  • the recording operation unit 23 corrects the light emission pattern of the surface light source 9 so that the observation light from the sample S is reflected by the light separation unit 15 and passes through the diaphragm 45, thereby providing oblique illumination with high definition. It can be observed.
  • a space can be secured above the sample S to facilitate observation of the sample S such as transparent cells.
  • the present embodiment can be modified as follows.
  • it comprises a condenser lens 29 for condensing illumination light emitted from the surface light source 9 and entering the sample container 3 from the bottom 3a without passing through the objective lens 7;
  • the positions of the surface light source 9 and the condenser lens 29 may be shifted in the radial direction with respect to the optical axis of 7.
  • the surface light source 9 may be disposed in the vicinity of a position conjugate with the pupil position in the light path of the illumination light of the objective lens 7.
  • the phase film 47 is employed as the phase modulation element.
  • the recording operation unit 23 may correct the light emission pattern of the surface light source 9 so that the observation light from the sample S is reflected by the mirror 27 and passes through the phase film 47. In this way, by appropriately setting the incident angle to the sample S, it is possible to form light and dark in the image of the sample S and obtain an easy-to-see image of a transparent sample S such as a cell. Further, phase difference observation by transmissive illumination can be performed only by arranging the reflecting member 31 without arranging the light source above the sample container 3. Thus, a space can be secured above the sample S to facilitate observation of the sample S such as transparent cells.
  • a light beam deflection unit 49 such as a weak concave lens (field lens) may be provided to be incident on the objective lens 7.
  • the recording operation unit 23 emits the light emission pattern of the surface light source 9 and its light emission so that the observation light from the sample S is reflected by the light separation unit 15 and passes through the phase film 47.
  • the light emission pattern of the surface light source 9 may be corrected based on at least one of the brightness and contrast of the image acquired by the imaging optical system 11 in a pattern and the relationship between the number of pixels and the luminance. By doing this, the illumination light deflected by the light beam deflection unit 49 can be efficiently irradiated onto the sample S by the objective lens 7.

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Abstract

様々な形状の容器に対応でき、狭い空間内で標本の精細な画像を取得する。標本容器（３）の下方に配置され、標本（Ｓ）からの光を底部（３ａ）を介して集光する対物レンズ（７）と、対物レンズ（７）の照明光の光路における瞳位置に配置され、下方から底部（３ａ）を透過させて標本容器（３）内に照明光を入射させ、照明光の発光位置及び発光範囲に関する発光パターンを射出光軸に交差する方向に変更可能な面光源（９）と、面光源（９）からの照明光が照射されることにより発生し対物レンズ（７）により集光された標本（Ｓ）からの光を標本容器（３）の下方で撮影する撮像光学系（１１）と、面光源（９）の発光パターンとその発光パターンで撮像光学系（１１）により取得される画像の明るさ、コントラスト及び画素数と輝度との関係の少なくとも１つとに基づいて、面光源（９）の発光パターンを補正する記録演算部（２３）とを備える観察装置（１）を提供する。

Description

観察装置
　本発明は、観察装置に関する。
　従来、細胞の培養においては、細胞がコンフルエントになる都度にインキュベータから培養容器を取り出して、培養容器から細胞を剥がし、新たな培養容器に播種して培養する工程が繰り返される。しかしながら、この作業は、観察者が１日１～２回インキュベータ内の培養容器内の細胞を確認することにより行われなければならず、非常に煩わしいという問題がある。この問題に対し、インキュベータ内に設置して培養容器内部の細胞の培養状態を確認する観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２０１６－０７７２２６号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の観察装置は、透明な培養容器の側面から培養容器内に照明光を照射するため、フラスコ容器と呼ばれる培養容器にしか対応することができないという不都合がある。
　本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、様々な形状の容器に対応でき、かつ、狭い空間内で精細な画像を取得することができる観察装置を提供する。
　上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明の一態様は、標本を収容した標本容器の下方に配置され、前記標本からの光を前記標本容器の底部を介して集光する対物レンズと、該対物レンズに入射させる照明光の光路における該対物レンズの瞳位置、または、該瞳位置と共役な位置近傍に配置され、下方から前記底部を透過させて前記標本容器内に照明光を入射させ、該照明光の発光位置および発光範囲に関する発光パターンを射出光軸に交差する方向に変更可能な面光源と、該面光源からの前記照明光が照射されることにより発生し前記対物レンズにより集光された前記標本からの前記光を前記標本容器の下方において撮影する撮像光学系と、前記面光源の前記発光パターンとその発光パターンで前記撮像光学系により取得される画像の明るさ、コントラストおよび画素数と輝度との関係の少なくとも１つとに基づいて、前記面光源の前記発光パターンを補正する制御部とを備える観察装置である。
　本態様によれば、標本容器の下方において面光源から上方に向かって発せられた照明光が標本容器の底部を透過して標本に照射され、標本の下方において標本容器の底部を介して対物レンズにより集光された標本からの光が撮像光学系により撮影される。標本容器の底部を介して照明および撮影することで、側面から容器に照明光を入射させる構成のように使用可能な標本容器が側面の形状に制限されなくて済むとともに、標本の上方に光学系を配置しない分だけ装置を小型化することができる。
　この場合において、制御部により、面光源における照明光の発光パターンを、その発光パターンで撮像光学系により取得される画像の明るさ、コントラストおよび画素数と輝度との関係の少なくとも１つに基づいて補正することで、標本を高精細に撮影することができる。したがって、様々な形状の標本容器に対応でき、かつ、狭い空間内で標本の精細な画像を取得することができる。
　上記態様においては、前記対物レンズの前記撮像光学系の光路における瞳位置に配置された位相変調素子を備え、前記制御部が、前記対物レンズにより集光された前記標本からの前記光が前記位相変調素子に入射するように、前記面光源の前記発光パターンを補正することとしてもよい。
　このように構成することで、位相変調素子を通過した標本からの光を撮像光学系により撮影することができる。
　上記態様においては、前記位相変調素子が、前記標本からの前記光を位相変調する位相膜であってもよい。
　このように構成することで、位相膜により位相変調された標本からの光を撮像光学系により撮影して、明暗のコントラストをつけた標本の画像を取得することができる。これにより、透明な細胞等の標本を標識せずに高精細に観察することできる。
　上記態様においては、前記位相変調素子が、前記標本に照射された前記照明光を通過させないように前記標本からの前記光を減光する減光部材であってもよい。
　このように構成することで、照明光が照射された標本において発生する散乱光や回折光を撮像光学系により撮影して、コントラストの高い標本の画像を取得することができる。これにより、透明な細胞等の標本を標識せずに高精細に観察することができる。
　上記態様においては、前記標本の上方に配置され、前記面光源からの前記照明光を前記標本に向けて反射する反射部材を備え、前記撮像光学系が、前記反射部材により反射された前記照明光が前記標本を透過した前記光を前記標本の下方において撮影することとしてもよい。
　このように構成することで、標本容器の上方に光源を配置することなく反射部材を配置するだけで、透過照明することができる。これにより、標本の上方にスペースを確保して、透明な細胞等の標本を観察し易くすることができる。
　上記態様においては、前記照明光と前記標本からの前記光とを分離させる光分離部を備え、前記面光源からの前記照明光を前記対物レンズを介して前記標本に照射する一方、前記対物レンズにより集光されて前記光分離部により前記照明光から分離された前記標本からの前記光を前記撮像光学系により撮影する同軸落射照明が構成されることとしてもよい。
　このように構成することで、標本に照明光を入射させるスペースと標本からの光を集光するスペースを共通にすることができ、底部が小さい標本容器を用いることができる。
　上記態様においては、前記光分離部がハーフミラーであってもよい。
　このように構成することで、ハーフミラーの透過率および反射率に応じて、照明光と標本からの光とを分離させることができる。また、どのような面光源を使用する場合にも適用することができる。
　上記態様においては、前記光分離部が偏光ビームスプリッタであってもよい。
　このように構成することで、偏光ビームスプリッタにより、照明光と標本からの光とを偏光成分に応じて分離させることができる。面光源として液晶画面やレーザダイオードのように偏光特性があるものを用いる場合に特に有効である。
　上記態様においては、前記光分離部がダイクロイックミラーであってもよい。
　このように構成することで、ダイクロイックミラーにより、照明光と標本からの光とを波長に応じて分離させることができる。蛍光や発光を観察する場合に特に有効である。
　上記態様においては、前記面光源と前記対物レンズとの間に配置され、前記面光源から発せられた前記照明光の光束を前記対物レンズの光軸から離れる方向に偏向して該対物レンズに入射させる光束偏向部を備えることとしてもよい。
　このように構成することで、光束偏向部により偏向された照明光を対物レンズにより効率的に標本に照射することができる。
　本発明によれば、様々な形状の容器に対応でき、かつ、狭い空間内で標本の精細な画像を取得することができるという効果を奏する。
本発明の第１実施形態に係る観察装置を示す全体構成図である。 面光源の発光パターンの一例と、その発光パターンに対応する観察光の光量積算値の一例を示す図である。 面光源の発光パターンの他の一例と、その発光パターンに対応する観察光の光量積算値の一例を示す図である。 白とびしている画素や真っ暗な領域がある画像の一例を示す図である。 コントラストが低い画像の一例を示す図である。 白とびしている画素と真っ暗な領域とが広範囲に分布している画像における画素数と信号輝度との関係の一例を示すヒストグラムである。 コントラストが無い画像における画素数と信号輝度との関係の一例を示すヒストグラムである。 発光領域を４分割した面光源の発光面を示す平面図である。 本発明の第１実施形態の一変形例に係る観察装置により標本を観察する場合の工程を説明するフローチャートである。 面光源の各発光領域に対応する撮像素子の撮像面における観察光の入射光量または評価値の一例を示す図である。 面光源の発光領域をずらす様子を示す平面図である。 図１の観察装置において、光分離部に代えてミラーを採用した場合の全体構成図である。 図１２の観察装置において、集光レンズおよび反射部材をさらに備えた場合の全体構成図である。 図１３の観察装置において、面光源の発光領域を変更した場合の照明光の光路の一例を示す図である。 本発明の第２実施形態に係る観察装置を示す全体構成図である。 図１５の観察装置において、標本容器の底部が傾いている場合の観察光の光路の一例を示す図である。 撮像素子のＸ方向の受光画素の位置と撮像素子により検出される全画素強度との関係を示す図である。 対物レンズの瞳における照明光の入射位置を切り替えていく様子を示す平面図である。 面光源の発光パターンを周方向に切り替えていく様子を示す平面図である。 面光源の発光位置を周方向に１２分割して切り替えた場合の中心軸回りの発光位置の角度と撮像素子の入射光量または評価値との関係の一例を示す図である。 面光源の発光位置の番号、中心軸回りの角度、対応する撮像素子の入射光量の一例を示す図表である。 ブラックレベル以下の数と発光位置の偏心量との関係の一例を示す図表である。 ブラックレベル以下となる発光位置がない場合の対物レンズの瞳における照明光の入射位置の一例を示す図である。 ブラックレベル以下となる発光位置が８個以上のときの対物レンズの瞳における照明光の入射位置の一例を示す図である。 図１５の観察装置において、位相変調素子として位相膜を採用した場合の全体構成図である。 本発明の第３実施形態に係る観察装置を示す全体構成図である。 図２６の観察装置において、集光レンズをさらに備えた場合の全体構成図である。 図２６の観察装置において、弱い凹レンズ等の光束偏向部をさらに備えた場合の全体構成図である。 図２８の観察装置において、面光源の発光領域を変更した場合の照明光および観察光の光路の一例を示す図である。
〔第１実施形態〕
　本発明の第１実施形態に係る観察装置について図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る観察装置１は、図１に示すように、標本Ｓを収容した標本容器３を搭載するステージ５と、ステージ５の下方に配置され、標本Ｓからの観察光（光）を集光する対物レンズ７と、ステージ５の下方から上方に向かって照明光を射出し、下方から底部３ａを透過させて標本容器３内に入射させる面光源９と、対物レンズ７により集光された標本Ｓからの観察光を標本容器３の下方において撮影する撮像光学系１１と、ＰＣ（Personal　Computer）等の記録演算装置１３とを備えている。
　標本容器３は、例えば、光学的に透明な材質からなるウェル容器やディッシュ容器であり、底部３ａが光を透過するようになっている。符号Ｗは、例えば、培養培地等の溶液を示している。
　ステージ５は、光学的に透明な材質により形成され、標本容器３を水平に搭載することができるようになっている。
　対物レンズ７は、ステージ５上の標本Ｓの鉛直下方に配置されている。この対物レンズ７は、面光源９からの照明光を標本容器３の底部３ａを介して標本Ｓに照射する一方、標本Ｓからの観察光を標本容器３の底部３ａおよびステージ５を介して集光するようになっている。
　面光源９は、対物レンズ７の照明光の光路における瞳位置に配置されている。面光源９としては、例えば、複数の画素が２次元的に配列された液晶ディスプレイや、複数の微小ＬＥＤ（発光ダイオードアレイ）が２次元的に配列されたＬＥＤアレイを用いることができる。
　図１では、面光源９として液晶ディスプレイを例示しており、複数の画素が水平方向に沿う互いに直交するＸ方向およびＹ方向に配列されている。また、面光源９は、照明光の発光位置および発光範囲に関する発光パターンを射出光軸に交差する方向に変更することができるようになっている。
　撮像光学系１１は、面光源９からの照明光の光路と標本Ｓからの観察光の光路とを分離させる光分離部１５と、光分離部１５により照明光の光路から分離された観察光を結像させる結像レンズ１７と、結像レンズ１７により結像された観察光を撮影するＣＣＤ（Charge　Coupled　Device）等の撮像素子１９とを備えている。
　光分離部１５としては、例えば、ハーフミラー、偏光ビームスプリッタ－、ダイクロイックミラー等が用いられる。図１においては、光分離部１５として、例えば、ハーフミラーまたは偏光ビームスプリッタ－が用いられ、面光源９からの照明光を透過する一方、対物レンズ７により集光された標本Ｓからの観察光を結像レンズ１７に向けて反射するようになっている。
　記録演算装置１３は、ユーザが指示を入力するキーボード等の入力部２１と、データを記録したり演算処理したりする記録演算部（制御部）２３と、画像や情報を表示するモニタ２５とを備えている。
　記録演算部２３は、例えば、ＣＰＵ(Central　Processing　Unit）と、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）およびＲＡＭ（Random　Access　Memory）等の主記憶部と、ＨＤＤ（Hard　Disk　Drive）等の補助記憶部と、ユーザが指示を入力する入力部と、データを出力する出力部と、外部機器との間で種々のデータのやりとりを行う外部インタフェース等（いずれも図示略）を備えている。補助記憶部には各種プログラムが格納されており、ＣＰＵが補助記憶部からプログラムをＲＡＭ等の主記憶部に読み出して、そのプログラムを実行することにより、種々の処理が実現されるようになっている。
　そして、記録演算部２３は、プログラムの実行により、撮像素子１９から送られてくる画像情報を処理したり、面光源９の発光を制御したりするようになっている。具体的には、記録演算部２３は、面光源９の発光パターンと、その発光パターンで撮像光学系１１により取得される画像の明るさ、コントラストおよび画素数と輝度との関係の少なくとも１つとに基づいて、面光源９の発光パターンを補正するようになっている。
　このように構成された観察装置１の作用について、以下に説明する。
　本実施形態に係る観察装置１により標本Ｓを観察するには、標本Ｓを収容した標本容器３をステージ５に搭載し、記録演算装置１３により、例えば図２に示すように、面光源９の１点を発光させて、発光させる１点の位置をＸ方向にずらしていく発光パターンでスポット状の照明光を射出させる。
　面光源９の１点から射出されたスポット状の照明光は、光分離部１５を透過して対物レンズ７により集光され、ステージ５および標本容器３の底部３ａを透過して下方から標本Ｓに照射される。照明光が照射されることにより標本Ｓにおいて反射された観察光は、標本容器３の底部３ａおよびステージ５を透過して対物レンズ７により集光された後、光分離部１５により反射されて結像レンズ１７により撮像素子１９の撮像面上に結像される。これにより、撮像素子１９において標本Ｓの画像情報が取得され、記録演算装置１３に送られる。
　次に、記録演算装置１３により、例えば図３に示すように、面光源９の１点を発光させて、発光させる１点の位置をＹ方向にずらしていく発光パターンでスポット状の照明光を射出させる。
　面光源９の１点から射出されたスポット状の照明光は、光分離部１５および対物レンズ７を介してステージ５および標本容器３の底部３ａを透過して下方から標本Ｓに照射される。標本Ｓにおいて反射された観察光は、標本容器３の底部３ａおよびステージ５を透過して対物レンズ７および光分離部１５を介して結像レンズ１７により撮像素子１９の撮像面上に結像される。そして、撮像素子１９により取得された標本Ｓの画像情報が記録演算装置１３に送られる。
　次いで、記録演算部２３により、面光源９の１点を発光させた場合の発光パターンで撮像素子１９により撮影された観察光の図２に示すような光量分布と、面光源９の１点を発光させた場合の発光パターンで撮像素子１９により撮影された観察光の図３に示すような光量分布とから、それぞれの光量分布が最大になる発光位置および発光範囲に基づいて瞳偏心量が算出される。そして、記録演算部２３により、算出された瞳偏心量に基づいて、光量分布が最大になる発光位置および発光範囲から照明光を射出するよう、面光源９の発光パターンが調整される。これにより、標本Ｓの明るい画像を取得することができる。
　以上説明したように、本実施形態に係る観察装置１によれば、標本容器３の下方において、標本容器３の底部３ａを介して照明および撮影することで、側面から容器に照明光を入射させる構成のように使用可能な標本容器が側面の形状に制限されなくて済むとともに、標本Ｓの上方に光学系を配置しない分だけ装置を小型化することができる。
　この場合において、記録演算部２３により、面光源９における照明光の発光パターンを、その発光パターンで撮像光学系１１により取得される画像の明るさに基づいて補正することで、標本Ｓの明るい画像を取得することができる。したがって、様々な形状の標本容器３に対応でき、かつ、インキュベータのような狭い空間内で標本Ｓの精細な画像を取得することができる。
　なお、面光源９の１点から射出されたスポット状の照明光をＸ方向およびＹ方向にずらす方式に代えて、面光源９のＸ方向またはＹ方向のどちらかに連続する複数点を同時に発光させて、Ｘ方向またはＹ方向に連続する複数点の位置をＹ方向またはＸ方向にずらしていく方式でもよい。
　また、本実施形態においては、記録演算部２３が、例えば、図４に示すように画像上に白とびしている画素や真っ暗な領域が無いように、画像の明るさに基づいて面光源９の発光パターンを補正することとしてもよいし、図５に示すようにコントラストが無くならないように、画像のコントラストに基づいて面光源９の発光パターンを補正することとしてもよい。
　また、本実施形態においては、記録演算部２３が、画像の画素数と画像情報の信号輝度との関係、例えば、図６または図７に示すようなヒストグラムに基づいて、面光源９の発光パターンを補正することとしてもよい。図６に示すヒストグラムは、白とびしている画素と真っ暗な領域とが広範囲に分布していることを示し、図７に示すヒストグラムは、コントラストが無いことを示している。図６および図７のいずれの場合も、記録演算部２３が、それぞれ画素数と信号輝度との関係が理想曲線のようになるように面光源９の発光パターンを補正することとすればよい。
　本実施形態は以下のように変形することができる。
　一変形例としては、図８に示すように、面光源９の発光位置および発光範囲を複数、例えば４つの発光領域Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４に分割し、各発光領域Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４を順に切り替えながら択一的に発光させて、撮像光学系１１により取得される画像が最も明るくなるいずれかの発光領域Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４の重心位置が全発光領域の中心になるように、面光源９の発光パターンを補正することとしてもよい。
　本変形例により標本Ｓを観察する場合は、例えば、図９のフローチャートに示すように、まず、面光源９の中心部を含む円形状の任意の領域の全体を発光させ、フォーカスを合わせる（ステップＳ１）。次いで、その円形状の任意の領域を例えば４分割し、発光領域Ｌ１を発光させて、標本Ｓの画像情報を取得する（ステップＳ２）。次いで、発光領域Ｌ１に代えて発光領域Ｌ２を発光させ、標本Ｓの画像情報を取得する（ステップＳ３）。同様に、発光領域Ｌ２に代えて発光領域Ｌ３を発光させて標本Ｓの画像情報を取得し（ステップＳ４）、発光領域Ｌ３に代えて発光領域Ｌ４を発光させて標本Ｓの画像情報を取得する（ステップＳ５）。
　次に、記録演算部２３により、各発光領域Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４に対応する撮像素子１９の撮像面における観察光の入射光量または評価値に差があるか否かを判定する（ステップＳ６）。入射光量または評価値に差がない場合は、各発光領域Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４に優劣が無いので、記録演算部２３は、ステップＳ１で発光させた領域の発光パターンを補正せず、撮像素子１９により取得された画像をそのまま使う。評価値は、入射光量が多いほど値が大きくなるものとすればよい。
　一方、例えば、図１０に示すように、入射光量に差がある場合は、記録演算部２３により、発光パターンのシフト量が計算される（ステップＳ７）。図１０において、各発光領域Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４内の数値は入射光量または評価値を示している。例えば、面光源９における円形状の任意の領域全体の内、発光領域Ｌ１，Ｌ２側をａ、発光領域Ｌ３，Ｌ４側をｂ、発光領域Ｌ１，Ｌ３側をＡ、発光領域Ｌ２，Ｌ４側をＢとする。また、面光源９における任意の発光領域の全体の直径をＤｐｕｌｌとする。
　この場合、記録演算部２３により、Ｘ方向のシフト量Δｘは下式（１）によって算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
  
　また、Ｙ方向のシフト量Δｙは、下式（２）によって算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　例えば、Ｄｐｕｌｌ＝４ｍｍの場合、Ｘ方向のシフト量はΔｘ＝－０．３６３ｍｍ、Ｙ方向のシフト量はΔｙ＝０．９６ｍｍとなる。この場合、記録演算部２３により、図１１に示すように、面光源９における任意の発光領域の全体を発光領域Ｌ１側にΔｘおよびΔｙだけ移動させるように発光パターンを補正する。そして、補正後の発光パターンで照明し、標本Ｓの画像を取得する（ステップＳ８）。
　本変形例によれば、面光源９の発光パターンを変えて標本Ｓに対する照明角度を変えることで、標本Ｓにおける影の付き方が変わり、得られる画像情報の明るさが異なるので、どの角度で照明光を照射するのが最適かが容易に分かる。そして、明るい画像情報が得られる方向に面光源９の発光領域をずらすことで、より明るい画像を得ることができる。細胞等の標本Ｓの培養初期で標本Ｓの数が少ない場合や標本Ｓの数を知りたいときに特に有効である。本変形例においては発光領域を４分割することとしたが、分割数はこれに限定されるものではない。
　上記変形例においては、例えば、図１２に示すように、光分離部１５に代えてミラー２７を採用し、面光源９から射出された照明光を対物レンズ７に直接入射させて標本容器３の下方から標本Ｓに照射する一方、対物レンズ７により集光された標本Ｓからの観察光をミラー２７により反射して結像レンズ１７に入射させることとしてもよい。
　また、図１３および図１４に示すように、面光源９から射出された照明光を集光して対物レンズ７を介さずに底部３ａから標本容器３内に入射させる集光レンズ２９と、標本Ｓの上方に配置され、集光レンズ２９により標本容器３内に入射された照明光を標本Ｓに向けて反射する反射面３１ａを有する反射部材３１とを備えることとしてもよい。
　反射部材３１としては、例えば、ミラーや標本容器３の蓋等が用いられる。
　この場合、細胞Ｓの鉛直下方に配置された対物レンズ７の光軸に対して径方向に位置をずらして集光レンズ２９および面光源９を配置し、面光源９から集光レンズ２９、ステージ５および標本容器３の底部３ａを介して標本Ｓの上方に向けて照明光を射出して、標本Ｓの上方において反射部材３１により反射させ、対物レンズ７の光軸に対して斜め上方から標本Ｓに入射させることとすればよい。そして、撮像光学系１１が、標本Ｓを透過した観察光を標本Ｓの下方において撮影することとすればよい。面光源９は、対物レンズ７の照明光の光路における瞳位置と共役な位置近傍に配置することとすればよい。
　このようにすることで、標本Ｓへの照明光の入射角度を適切に設定することにより、標本Ｓの像に明暗を形成し、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができる。また、標本容器３の上方に光源を配置することなく反射部材３１を配置するだけで、透過照明することができる。これにより、標本Ｓの上方にスペースを確保して、透明な細胞等の標本Ｓを観察し易くすることができる。
〔第２実施形態〕
　次に、本発明の第２実施形態に係る観察装置について説明する。
　本実施形態に係る観察装置４１は、図１５に示すように、対物レンズ７の撮像光学系１１の光路における瞳位置に配置された遮光膜（減光部材、位相変調素子）４３を備え、標本Ｓを落射暗視野観察する点で第１実施形態と異なる。
　以下、第１実施形態に係る観察装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
　遮光膜４３は、中心に光を遮断する遮光部４３ａが形成された円板形状を有している。この遮光膜４３は、面光源９と共役な位置関係を有し、結像レンズ１７の光軸上に遮光部４３ａが位置するように配置されている。これにより、遮光部４３ａに入射した標本Ｓからの観察光の０次光が遮光されるようになっている。遮光膜４３の前段には絞り４５が配置されている。
　記録演算部２３は、プログラムの実行により、対物レンズ７により集光された標本Ｓからの観察光が遮光膜４３に入射するように、面光源９の発光パターンと、その発光パターンで撮像光学系１１により取得される画像の明るさ、コントラストおよび画素数と輝度との関係の少なくとも１つとに基づいて面光源９の発光パターンを補正するようになっている。
　このように構成された観察装置４１の作用について説明する。
　本実施形態に係る観察装置４１により標本Ｓを観察する場合は、標本Ｓからの観察光の内、０次光は遮光膜４３の遮光部４３ａにより遮光され、屈折したり反射したりした光が結像レンズ１７により撮像素子１９の撮像面に結像される。これにより、標本Ｓを暗視野観察することができる。
　この場合において、例えば、図１６に示すように、標本容器３の底部３ａが傾いていたり、底部３ａに反りがあったり底部３ａが楔形状を有していたりすると、標本Ｓからの観察光が標本容器３の底部３ａにおいて屈折し、０次光が遮光膜４３の遮光部４３ａに入射しなくなる。
　そこで、面光源９の例えばＹ方向に連続する複数点を同時に発光させて、発光させるＹ方向に連続する複数点の位置をＸ向にずらしていく発光パターンでライン状の照明光を射出させる。すると、図１７に示すように、Ｘ方向のある位置で、観察光が遮光膜４３の遮光部４３ａによって遮光されることによって撮像素子１９の検出強度が低下するので、検出強度が低下する位置により、０次光を遮光膜４３の遮光部４３ａに入射させることができる面光源９のＸ方向の発光位置が分かる。図１７において、横軸は撮像素子１９のＸ方向の受光画素の位置を示し、Ｙ軸は撮像素子１９により検出される全画素強度を示している。
　また、図１７において、撮像素子１９の検出強度が低下しているＸ方向の幅により、面光源９の発光範囲が分かる。この場合において、標本容器３の底部３ａに反りがあると、底部３ａにおいて観察光が屈折し、照明光の光束に対する観察光の光束の倍率が変化する。
　そこで、面光源９におけるＸ方向の発光領域の幅と撮像素子１９の検出強度が低下しているＸ方向の幅（倍率変化量）とが１対１になるように、例えば、面光源９におけるＸ方向の発光領域の幅に対して撮像素子１９の検出強度が低下しているＸ方向の幅が大きければ、面光源９におけるＸ方向の発光領域の幅を減少させ、面光源９におけるＸ方向の発光領域の幅に対して撮像素子１９の検出強度が低下しているＸ方向の幅が小さければ、面光源９におけるＸ方向の発光領域の幅を増大させるように、記録演算部２３により面光源９の発光パターンを補正する。
　同様にして、面光源９からＸ方向に連続する複数点を同時に発光させて、発光させるＸ方向に連続する複数点の位置をＹ向にずらしていく発光パターンでライン状の照明光を射出させ、撮像素子１９の検出強度が低下する位置および倍率変化量を特定することで、面光源９のＹ方向の発光位置および発光範囲の補正量が分かる。
　したがって、記録演算部２３により、面光源９のＸ，Ｙ方向の発光位置および発光範囲を補正することで、観察光の０次光を遮光膜４３の遮光部４３ａにより遮光して、標本Ｓを高精細に暗視野観察することができる。
　本実施形態は以下のように変形することができる。
　例えば、図１８に示すように対物レンズ７の瞳の外周に沿ってその内側にスポット状の照明光を順に入射させるように、図１９に示すように面光源９の発光位置を周方向に切り替えていくこととしてもよい。図２０は、面光源９の発光位置を周方向に１２分割して切り替えた場合の中心軸回りの発光位置の角度と撮像素子１９の入射光量または評価値との関係を例示している。図１８において、○は対物レンズ７の瞳における照明光の入射位置を示し、図１９において○は面光源９の発光位置を示している。
　図２０に示す例では、中心軸回りの角度が３０°、６０°、９０°、１２０°の発光位置から射出させた場合に撮像素子１９の入射光量または評価値が低下することから、その発光位置からの照明光が照射された場合の標本Ｓからの観察光が絞り４５により遮断されていることが分かる。
　例えば、図２１に示す例では、暗いと判断する上限（ブラックレベル）を光量１０とした場合に、光量１０以下となるのが発光位置Ｓ２～Ｓ５、遮断されている範囲はθ＝３０°～１２０°、遮断されている方向角度は（１２０－３０）／２＋３０＝７５°となっている。また、瞳径がφ４、瞳上の光源サイズがφ０．１のとき、ブラックレベル以下となる発光位置は４点なので、図２２よりシフト量（偏心量）は０．１５５ｍｍとなる。図２２において、ＢＬｎはブラックレベル以下となる発光位置の数を示している。
　なお、図２３に示すように、ブラックレベル以下となる発光位置がない場合は、記録演算部２３は、面光源９の発光パターンを補正せず、撮像素子１９により取得された画像をそのまま使うこととすればよい。一方、図２４に示すように、ブラックレベル以下となる発光位置が８個以上のときは、シフト量を特定できない。図２３，２４において、○は対物レンズ７の瞳における光量がブラックレベルよりも多い入射位置を示し、●は対物レンズ７の瞳における光量がブラックレベル以下の入射位置を示している。
　本実施形態においては、位相変調素子として遮光膜４３を例示して説明したが、これに代えて、例えば、図２５に示すように、観察光を位相変調する位相膜４７を採用することとしてもよい。図２５に示す位相膜４７は、例えば、径方向に幅を有するリング状に形成されている。
　この場合も観察光が位相膜４７を通過するように、記録演算部２３により面光源９の発光位置および発光領域を求めて、その発光位置および発光領域で照明するように面光源９の発光パターンを補正することとすればよい。この場合、標本Ｓからの位相膜４７を通過する直接光と位相膜４７を通過しない回折光とが結像レンズ１７により集光されて、撮像素子１９の撮像面に明暗のコントラストがついた像として結像される。これにより、標本Ｓを高精細に位相差観察することができる。
〔第３実施形態〕
　次に、本発明の第３実施形態に係る観察装置について説明する。
　本実施形態に係る観察装置５１は、図２６に示すように、標本Ｓの上方に配置され、面光源９からの照明光を標本に向けて反射する反射部材３１と、対物レンズ７の撮像光学系１１の光路における瞳位置に配置された絞り（減光部材、位相変調素子）４５とを備える点で第１，第２実施形態と異なる。
　以下、第１，第２実施形態に係る観察装置１，４１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。図２６に示す例では、観察装置５１は、光分離部１５としてハーフミラーまたは偏光ビームスプリッタを備えている。
　本実施形態においては、記録演算部２３は、プログラムの実行により、対物レンズ７により集光された標本Ｓからの観察光が絞り４５を通過するように、面光源９の発光パターンと、その発光パターンで撮像光学系１１により取得される画像の明るさ、コントラストおよび画素数と輝度との関係の少なくとも１つとに基づいて面光源９の発光パターンを補正するようになっている。
　このように構成された観察装置５１の作用について説明する。
　面光源９から発せられた照明光は、光分離部１５を透過して対物レンズ７により集光され、ステージ５および標本容器３の底部３ａを透過した後、反射部材３１の反射面３１ａにより反射されて、標本Ｓに対して斜め上方から照射される。
　そして、標本Ｓを透過した照明光の観察光が標本容器３の底部３ａおよびステージ５を上方から下方に向かって透過し、対物レンズ７により集光されて光分離部１５により反射される。光分離部１５により反射された観察光の内、絞り４５を通過した光は、結像レンズ１７により撮像素子１９の撮像面に結像される。
　この際、照明光は標本Ｓの形状や屈折率によって屈折、散乱され、あるいは、標本Ｓの透過率によって減光されることで、標本Ｓの情報を載せた観察光となって対物レンズ７により集光され、撮像素子１９によって撮影される。したがって、標本Ｓへの入射角度を適切に設定することにより、標本Ｓの像に明暗を形成することができ、細胞等の透明な被写体についても見やすい像を取得することができる。
　この場合において、記録演算部２３は、標本Ｓからの観察光が光分離部１５により反射されて絞り４５を通過するように面光源９の発光パターンを補正することで、高精細に偏斜照明観察することができる。また、標本Ｓの上方にスペースを確保して、透明な細胞等の標本Ｓを観察し易くすることができる。
　本実施形態は以下のように変形することができる。
　例えば、図２７に示すように、面光源９から射出された照明光を集光して、対物レンズ７を介さずに底部３ａから標本容器３内に入射させる集光レンズ２９を備え、対物レンズ７の光軸に対して径方向に面光源９および集光レンズ２９の位置をずらして配置することとしてもよい。本変形例においては、面光源９は、対物レンズ７の照明光の光路における瞳位置と共役な位置近傍に配置することとすればよい。図２７は、位相変調素子として位相膜４７を採用している。
　この場合、記録演算部２３は、標本Ｓからの観察光がミラー２７により反射されて位相膜４７を通過するように面光源９の発光パターンを補正することとすればよい。
　このようにすることで、標本Ｓへの入射角度を適切に設定することにより、標本Ｓの像に明暗を形成し、細胞等の透明な標本Ｓについても見やすい像を取得することができる。また、標本容器３の上方に光源を配置することなく反射部材３１を配置するだけで、透過照明による位相差観察することができる。これにより、標本Ｓの上方にスペースを確保して、透明な細胞等の標本Ｓを観察し易くすることができる。
　本実施形態においては、図２８に示すように、面光源９と対物レンズ７との間に配置され、面光源９から発せられた照明光の光束を対物レンズ７の光軸から離れる方向に偏向して対物レンズ７に入射させる、例えば弱い凹レンズ（フィールドレンズ）等の光束偏向部４９を備えることとしてもよい。
　この場合、記録演算部２３は、図２９に示すように、標本Ｓからの観察光が光分離部１５により反射されて位相膜４７を通過するように、面光源９の発光パターンと、その発光パターンで撮像光学系１１により取得される画像の明るさ、コントラストおよび画素数と輝度との関係の少なくとも１つとに基づいて面光源９の発光パターンを補正することとすればよい。
　このようにすることで、光束偏向部４９により偏向された照明光を対物レンズ７により効率的に標本Ｓに照射することができる。
　以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
　１，４１，５１　観察装置
　３　　　　　　　標本容器
　７　　　　　　　対物レンズ
　９　　　　　　　面光源
　１１　　　　　　撮像光学系
　１５　　　　　　光分離部
　２３　　　　　　記録演算部（制御部）
　３１　　　　　　反射部材
　４３　　　　　　遮光膜（減光部材、位相変調素子）
　４７　　　　　　位相膜（位相変調素子）
　４９　　　　　　光束偏向部
　Ｓ　　　　　　　標本
 

Claims (10)

  1. 　標本を収容した標本容器の下方に配置され、前記標本からの光を前記標本容器の底部を介して集光する対物レンズと、
    　該対物レンズに入射させる照明光の光路における該対物レンズの瞳位置、または、該瞳位置と共役な位置近傍に配置され、下方から前記底部を透過させて前記標本容器内に照明光を入射させ、該照明光の発光位置および発光範囲に関する発光パターンを射出光軸に交差する方向に変更可能な面光源と、
    　該面光源からの前記照明光が照射されることにより発生し前記対物レンズにより集光された前記標本からの前記光を前記標本容器の下方において撮影する撮像光学系と、
    　前記面光源の前記発光パターンとその発光パターンで前記撮像光学系により取得される画像の明るさ、コントラストおよび画素数と輝度との関係の少なくとも１つとに基づいて、前記面光源の前記発光パターンを補正する制御部とを備える観察装置。
  2. 　前記対物レンズの前記撮像光学系の光路における瞳位置に配置された位相変調素子を備え、
    　前記制御部が、前記対物レンズにより集光された前記標本からの前記光が前記位相変調素子に入射するように、前記面光源の前記発光パターンを補正する請求項１に記載の観察装置。
  3. 　前記位相変調素子が、前記標本からの前記光を位相変調する位相膜である請求項２に記載の観察装置。
  4. 　前記位相変調素子が、前記標本に照射された前記照明光を通過させないように前記標本からの前記光を減光する減光部材である請求項２に記載の観察装置。
  5. 　前記標本の上方に配置され、前記面光源からの前記照明光を前記標本に向けて反射する反射部材を備え、
    　前記撮像光学系が、前記反射部材により反射された前記照明光が前記標本を透過した前記光を前記標本の下方において撮影する請求項１から請求項４のいずれかに記載の観察装置。
  6. 　前記照明光と前記標本からの前記光とを分離させる光分離部を備え、
    　前記面光源からの前記照明光を前記対物レンズを介して前記標本に照射する一方、前記対物レンズにより集光されて前記光分離部により前記照明光から分離された前記標本からの前記光を前記撮像光学系により撮影する同軸落射照明が構成される請求項１から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
  7. 　前記光分離部がハーフミラーである請求項６に記載の観察装置。
  8. 　前記光分離部が偏光ビームスプリッタである請求項６に記載の観察装置。
  9. 　前記光分離部がダイクロイックミラーである請求項６に記載の観察装置。
  10. 　前記面光源と前記対物レンズとの間に配置され、前記面光源から発せられた前記照明光の光束を前記対物レンズの光軸から離れる方向に偏向して該対物レンズに入射させる光束偏向部を備える請求項６から請求項９のいずれかに記載の観察装置。
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