JPWO2005085848A1

JPWO2005085848A1 - マイクロアレイ及びスポッティング装置

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Publication number: JPWO2005085848A1
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Inventors: 良一今中; 小太郎湊; 忠男杉浦
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Abstract

基板にプリグルーブを設け、前記少なくともプリグルーブ上にプローブＤＮＡ又は蛋白と接着性が良好な薄膜を設けた上で、前記プリグルーブの凸部または凹部にプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置して、液滴の表面張力及び／又は凹部の場合、凹溝の壁によってグルーブに直角方向の広がりを制限された状態でプリグルーブの接線方Ｉ川こ広がり、その状態でプローブＤＮＡ又は蛋白を前記基板上に固定させていることを特徴とするマイクロアレイディスク。

Description

本発明は、マイクロアレイおよびマイクロディスクの構成およびスポッティング装置に関する。

ＤＮＡマイクロアレイはスライドグラスなどの基板上に、数千個のＤＮＡプローブを固定したもので、蛍光分子等で標識した試料（ターゲット）を流し、ＤＮＡプローブとハイブリタイズさせて、ハイブリッド形成による蛍光発光の強弱を測定して、試料に含まれる遺伝子の発現量を推定するものである。
これによって、多数の遺伝子の発現を同時に網羅的に分析できることから、生命科学や薬学、農学の分野の研究開発に基盤的な標準的機器として普及している。たとえば、ある薬剤に反応するガン組織と反応しないガン組織からｍＲＮＡ（メッセンジャＲＮＡ）を抽出して、両者の発現量の差を全ヒト遺伝子の載ったＤＮＡマイクロアレイによって推定すれば、そのガン組織と薬剤に特異的な遺伝子発現が判明する。これを用いてその遺伝子をターゲットに発症機序の解明や創薬研究を効率的に実施することができる。
ポストゲノムシーケンスの時代に入って、遺伝子発現の網羅的計測の必要性は、いわゆるテーラメード医療や医学分野における臨床検査はもちろん、食品検査や生産品質管理などのニューバイオ産業に広がり、今後いわゆるＤＮＡマイクロアレイ市場はきわめて大きな拡大が予想されている。
主流となっている型式には、光リソグラフィ技術と固相法ＤＮＡ合成技術によりシリコン基板上にオリゴヌクレオチドを垂直に積み上げたアフィメトリックス型と、スライドグラス上にＤＮＡを貼り付けるいわゆるスタンフォード型の２つがある。前者はあらかじめ遺伝子を選択して発注設計製造依頼しなければならず高価であるが、後者は利用者が使用環境でスポットする遺伝子を自由に選べる利点がある。本発明において、プローブＤＮＡ（試料とハイブリダイゼイション後はＤＮＡスポットと呼ぶ）とは、前記したアフィメトリックス型と、スタンフォード型、あるいはその他の形式のプローブＤＮＡを意味するものである。
現在のＤＮＡマイクロアレイは、図１１に示すように、ガラス基板１１０上に、２次元格子状に配列されているＤＮＡスポット列１１１を、レーザ走査ないし映像計測手段によって蛍光を測定し画像化して読み取っている。２自由度の計測が必要で装置が複雑になり、また後処理として蛍光信号の補正や雑音軽減のための計算機画像解析処理が必要である。スライドグラスの代わりにビーズを使ったものや、多孔性の媒質を用いた装置もあるが、扱える遺伝子数がせいぜい数１００種類程度で網羅性にかける。
しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイを解析するためのスポッター、ハイブリダイゼイション、およびスキャナーからなるシステムは、定量性と感度の点において課題の多いものである。
現在の課題を箇条書にすると、
１．蛍光測定の感度が悪い
２．読み取りに時間がかかる
３．２次元走査による画像化が必要
４．操作性が悪い
５．１枚のガラス基板に配置するＤＮＡスポット数が十分でない（高々１万スポット）
６．試料の性質や実験条件を同時に記録することが困難で、試料に番号を付加し、データシートを別々に用いていた。
本発明の目的はＤＮＡマイクロアレイやスポッティング装置、プローブＤＮＡ作製装置の構造等を根本的に見直し、ＤＮＡスポットを効率よくスポッティングあるいは光化学反応により生成した後、安定して短時間のうちに読み取り、解析結果を得ることができ、構成がシンプルで、極めて効率が高い低価格のシステムを提供することにある。
現在Ｘ，Ｙの２次元格子状に配列されているＤＮＡマイクロアレイのスポットを１次元に配列させ、同時にガラス板を円盤形状に変更し、スポット位置を特定できるプリグルーブ、プリピット等の指標を設ける。このように構成した円盤状のプリグルーブにプローブＤＮＡをスポッティングし作成したＤＮＡマイクロディスクと、スポッティングするための装置を提供するための発明である。本発明は同じ発明者による特開２００４−３３３３３３に用いるＤＮＡマイクロアレイの基板に関し、特に基板にスポッティングあるいは光化学反応により生成する方法、および蛍光測定感度に優れた基板に関する発明である。

本発明は下記の発明に係る。
Ａ．基板にプリグルーブを設け、前記プリグルーブにプローブＤＮＡ又は蛋白と接着性が良好な薄膜を設けた上で、前記プリグルーブの凸部または凹部にプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置して、液滴の表面張力によってグルーブに垂直な方向の広がりを制限された状態でプリグルーブの接線方向に広がり、その状態でプローブＤＮＡ又は蛋白を基板上に結合させていることを特徴とするマイクロアレイディスク。
Ｂ．ディスク基板上のグルーブの凹部あるいは凸部に、プローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置するために、１）前記グルーブの位置を検出する機構、２）プローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を吐出できる機構により、グルーブ上にプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置することを特徴とするマイクロディスクを作成するためのスポッティング装置。
Ｃ．基板上に薄膜からなる層を少なくとも１層以上設け、基板側から波長λ１のレーザビームを照射し、プリグルーブの位置を検出するときには前記基板を照射したレーザビームの一部は透過し、前記基板上に配置されたＤＮＡ又は蛋白スポットを計測するために、検出波長λ２のレーザビームを基板の反対側から照射したときには、一部が反射することを特徴とするマイクロアレイディスク。
Ｄ．ディスク基板上のプリグルーブの凹部あるいは凸部に、プローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置するために、１）前記グルーブの位置を検出する機構、２）プローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を吐出できる機構により、プリグルーブ上にプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置することを特徴とするマイクロアレイディスクを作成するためのスポッティング装置において、液滴の吐出位置の制御、液滴の量の制御を行うため、液滴の位置を検出する光学測定部、マイクロアレイディスク上に設けたプリグルーブを検出し、液滴がプリグルーブ上にスポットを形成するようにするための制御部、ならびに機構部を有するスポッティング装置。
Ｅ．種類の異なるプローブＤＮＡ又は蛋白を効率よく基板上にスポッティングするため、プリグルーブとプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を吐出するインクジェット、液滴を滴下する吐出装置であるマイクロピペット、あるいは針状のツール、などの吐出器との相対位置を検出するとともに、複数の吐出器を設けた吐出ユニットを移動制御し、次々に異なる種類のプローブＤＮＡ又は蛋白をプリグルーブの所定の位置に配置するための機構部、光学測定部、制御部（サーボ部とも呼ぶ）を有するスポッティング装置。
Ｆ．マイクロディスク上のプリグルーブの凹部あるいは凸部にプローブＤＮＡを光化学反応により生成するため、プリグルーブの位置を示すアドレスを検出し、レーザビームを選択的に照射し、プローブＤＮＡを生成する方法。
Ｇ．基板にプリグルーブあるいはプリピットにより場所を特定できる。平面部を設け、少なくとも前記プリグルーブあるいは平面部にプローブＤＮＡと接着性が良好な薄膜を設けた上で、前記プリグルーブの凸部またはおよび凹部、あるいはプローブＤＮＡ格納部にオリゴヌクレオチドを光化学反応により創出するに際し、前記格納部の場所をプリグルーブあるいはプリピットにより構成したアドレス情報により特定し、前記特定した場所にレーザ光を照射し活性化した後、第１のモノマーを塗布し、前記モノマーの一方の光反応保護基にレーザ光を照射し、前記保護基を取り去り、その後に塗布した第２のモノマーを連結し、オリゴヌクレオチドを生成することを特徴とするプローブＤＮＡ作成装置。
Ｈ．マイクロディスク上に作製した複数の同一種類のプローブＤＮＡ又は蛋白の良否を判定し、少なくとも良品と判定されたプローブＤＮＡ又は蛋白のアドレス情報を保管することを特徴とするマイクロディスク。

図１は、本発明の一実施例であるスポッティング装置の概略構成を示す図である。
図２は、本発明のＤＮＡマイクロディスクの概略構成を示す図である。
図２ａは、本発明のＤＮＡマイクロディスクの一部を拡大したアドレス情報とＶマーク拡大図である。
図３は、本発明の一実施例であるスポッティング装置の制御部ブロック図を示す図である。
図４は、スポッティング時の反射光量分布変化を示すグラフである。
図５は複数のスポッティング液であるプローブＤＮＡ吐出口を有するスポッティング装置の概略図である。
図６はマルチスポッティング装置を示す概略図の側面図である。
図７はマルチスポッティング装置を示す概略図の上面図である。
図８はマルチスポッティング装置の制御部を示すブロック図である。
図９はインクジェットとスポッティング液のタンクを示す概略図である。
図１０はＤＮＡマイクロディスク上に設けた金の薄膜上に設けた金、ＳｉＯ_２膜上にできる電場強度の計算結果を示すグラフである。
図１１は従来のＤＮＡマイクロアレイ構成図である。
図１２はＤＮＡマイクロディスクプリグルーブ部の拡大図
図１３はプローブＤＮＡ作成装置ブロック図
図１４はプローブＤＮＡ作製装置制御ブロック図
図１５はプローブＤＮＡ作製装置波形図
図１６は読取装置のブロック図
図１７はＤＮＡマイクロディスクにおける読取ビームとサーボビームの配置図

符号の説明

１ＤＮＡマイクロディスク、２レーザ、３ビームエキスパンダ、４対物レンズ、４ａトラッキングアクチュエータ、４ｂフォーカシングアクチュエータ、５ビームスプリッタ、６レンズ、７光検出器、７ａ光検出器Ａ、７ｂ光検出器Ｂ、８インクジェット、９インクジェット吐出口、１０光検出器、１０ａ光検出器Ａ、１０ｂ光検出器Ｂ、１１スポッティング液供給チューブ、１２トラバースユニットＡ、１２−１トラバースユニットＢ、１２−２トラバースユニットＣ、１３トラバースモータＡ、１３−１トラバースモータＢ、１３−２トラバースモータＣ、１４ディスクモータ、
１５Ｖマーク検出器、２２中心穴、２３プリグルーブ、２４第１のデータ記録部、２５第２のデータ記録部、２６Ｖマーク、２６ａＶマークピットａ列、２６ｂＶマークピットｂ列、２７プリグルーブのアドレス情報、２８半径方向矢印、２９接線方向矢印、３０差動増幅器１、３１位相補償器１、３２駆動増幅器１、３３差動増幅器２、３４位相補償器２、
３５駆動増幅器２、３６ＣＰＵ、３７加算器、３８加算器出力、
３９ディスクモータ制御器、４１図４グラフ横軸ＤＮＡマイクロディスク回転時間経過、４２反射光量（図４グラフ縦軸）、４３スポッティング液吐出時点、４４スポッティング液吐出時点、４５反射光量低下期間、５１インクジェット、５２インクジェット吐出口、５３インクジェットユニット、５４インクジェットユニット移動方向、５５移送ギア、６１ディスクモータ移送装置、６２移送方向、７１マルチインクジェットロータリーテーブル、８１ロータリーテーブル回転制御装置、８２位相補償器３、８３駆動増幅器３、９０インクジェットＡ、９１タンク、９２接続シール、９３接続孔、９４吐出口、９５加圧室、９６加圧デバイス、９７液名表示部、１００図１０横軸：ＳｉＯ_２膜の膜厚［ｎｍ］、１０１図１０縦軸：基板表面上の電場強度、１０２波長５６３ｎｍの特性、１０３波長６５２ｎｍの特性、１０４波長５３２ｎｍの特性、１１０ガラス基板、１１１ＤＮＡスポット列、１１２アドレス１のプリグルーブ、
１１３アドレス１、１１４アドレス２のプリグルーブ、１１５アドレス２、１１６半径方向を示す矢印、１１７接線方向を示す矢印、１１８ＤＮＡマイクロディスク、１２０レーザ、１２１ビームエキスパンダ、１２２ビームスプリッタ、１２３対物レンズ、１２４トラッキングアクチュエータ、
１２５フォーカシングアクチュエータ、１２６レンズ、１２８光検出器、１２９トラバースユニット、１３０トラバースモータ、１３１ディスクモータ、１３２ターンテーブル、１４０プリアンプ、１４１デコーダ、
１４２ＣＰＵ、１４３照射パルス制御部、１４４Ｉ／Ｆインターフェース、１４５ＰＣパーソナルコンピュータ、１４６レーザパワー変調器、１４７サーボ部、１４８再生光パワー、１４９ピークパワー、
１５２ディスクモータ、１５３対物レンズ、１５３ａＸ方向、
１５３ｂＺ方向、１５４対物レンズアクチュエータ、１５４ａトラッキング素子、１５４ｂフォーカシング素子、１５５蛍光励起用光源（出力光波長λ１）、１５６コリメータレンズ１、
１５７サーボ用光源（出力光波長λ３）、１５８コリメータレンズ２、
１５９ハーフミラー、１６０ビームスプリッタ１、１６１集光レンズ１、１６２光学フィルタ、１６３蛍光読取検出器、１６４ビームスプリッタ２、１６５集光レンズ２、１６６サーボ誤差検出器、１６７シリンドリカルレンズ、１６８回折格子、１７０ＤＮＡスポット読取ビーム、１７１プリグルーブまたはＤＮＡスポット列、１７２サーボ用ビーム、１７３ＤＮＡスポット、１７４Ｘ方向を示す矢印

本発明においては現在２次元格子状に配列されているＤＮＡマイクロアレイのスポットを同心円状あるいはスパイラル状の１次元に配列させ、同時にガラス板を円盤形状に変更し、スポット位置を特定できる指標を設ける。具体的には、ガラスディスク上のプリグルーブおよび、あるいは指標を設けた場所に正確にスポッティングを行い、１次元方向に走査し、歪無くＤＮＡスポットを読み取ることができる。ＤＮＡマイクロディスクと、前記ＤＮＡマイクロディスクにプローブＤＮＡをスポッティングするための装置である。
さらに、ＤＮＡマイクロディスク上に記録可能なゾーンを設け、作成条件と測定結果、プリグルーブにより位置決めされスポッティングされたスポットの位置を示すアドレス情報とスポッティング液名との対応関係を、スポッティングしたＤＮＡマイクロディスク上に記録する。これによって、従来ガラス板と作成時のデータが別に保管されていたのを一体的に保存でき、”操作性、信頼性”とセキュリティが向上する。このための具体的制作方法を提供するためのものである。
以下本発明の実施をするための最良の形態を具体的に示した実施例について図面とともに記載する。
以下、図１、図２、図３を用いて本発明における第１の実施例の概略構成を図示する。尚、蛋白等を用いることもできるが、以下、主にＤＮＡを用いた説明を行う。
図１は、図２に示したＤＮＡマイクロディスクにプローブＤＮＡをスポッティングするための装置の構成を示すブロック図、図２はＤＮＡマイクロディスクを示す図面である。
図１において、１はＤＮＡマイクロディスクで、２３のプリグルーブを有している。そして１４のディスクモータにより、回転制御される。８は前記基板にプローブＤＮＡを吐出するための吐出装置で、実施例ではインクジェットを用いている。インクジェットの代わりにマイクロピペットあるいはペン先のようなツールを用いることも可能である。前記インクジェットの位置を検出するためインクジェット吐出口に対して一定の位置に置かれた光検出器１０（１０ａ、１０ｂの受光素子を有する）が設けられている。なお、スポッティングされてプリグルーブ上に固定されるＤＮＡスポットの形状に関し、接線方向と直角の幅方向の大きさの比は、接線方向が大きく、２倍以上になることが実験により確かめられている。
プローブＤＮＡの液（スポッティング液）はインクジェットに設けられたタンクから、あるいは、１１のスポッティング液供給チューブにより供給される。スポッティング液はプローブＤＮＡ、蛋白などを水、その他の媒体（アルコールなど）に溶解した液である。このスポッティング液はプリグルーブの凸部または凹部の両方あるいはいずれか一方に配置することができる。
２はレーザであり、出射したレーザビームは３のエキスパンダあるいはコリメータレンズにより平行光に変換され、５のビームスプリッタを経て４の対物レンズにより１のＤＮＡマイクロディスク上のプリグルーブ２３に焦点を結ぶ。前記プリグルーブ２３から反射した光は４の対物レンズ、５のビームスプリッタを経て、６のレンズにより、７ａ，７ｂの２分割セルを有する光検出器７に前記プリグルーブのファーフィールド像が形成され、７ａ，７ｂの光検出器の差動信号により、４の対物レンズから出射したビームスポットと、２３のプリグルーブの相対位置が検出できる。
また２３のプリグルーブの透過光は１０ａ，１０ｂの２つの光検出器からなる光検出器１０に入射する。そして、光検出器１０ａ，１０ｂの差動信号は、９のインクジェット吐出口とプリグルーブの相対位置を示す。１２はトラバースユニットＡであり、インクジェット８、光検出器１０、および、２のレーザ、３のビームエキスパンダ、４の対物レンズ、４ａ，４ｂのアクチュエータ、５のビームスプリッタ、６のレンズ、７の光検出器から構成される光学測定部および機構部は、トラバースユニットＡとして一体に構成され、１３のトラバースモータＡにより１のＤＮＡマイクロディスクの半径方向に可動制御される。
４の対物レンズをＤＮＡマイクロディスクの半径方向に位置を移動制御し、２３のプリグルーブに対物レンズから出射したレーザビームを追従させるための制御部をトラッキングサーボと呼び、８のインクジェットの位置を１０の光検出器により検出し、プリグルーブ２３上にインクジェットから吐出される液を配置する制御部を、トラバースサーボと呼ぶ。
図２において、ＤＮＡマイクロディスク１には、ディスクモータにより回転させるための中心穴２２と、凹凸状のプリグルーブ２３が設けられている。プリグルーブを作成する方法としては、ガラス基板を選択的にエッチングし作成することができる。また、プリグルーブの凸部を印刷により設けることもでき、印刷により作成した場合は、印刷のインクが付着しない基板上に、ＤＮＡスポットを配置する。もちろん樹脂を用い、ＣＤ等の光ディスクと同様な方法を用い、インジェクションモールドにより作成することも可能である。またプリグルーブを接線方向に切断して、プリピットとし、プリグルーブの代わりに用いることもできる。
プローブＤＮＡをスポッティングする表面上に、必要により例えばＳｉＯ_２あるいは金などの、レーザビームを照射したときに蛍光を発しない薄膜を設ける。さらにＳｉＯ_２あるいは金などの薄膜上にプローブＤＮＡと接着性が良好な薄膜を形成する。この後者の薄膜はスポッティングするプローブＤＮＡとの密着を促進し、プローブＤＮＡの液滴がその表面張力、及び／又は凹部にスポッティングされた場合は凹溝の壁の存在によりプリグループ上に存在し、時間の経過によりプローブＤＮＡを溶解している液体が蒸発して最終的にプローブＤＮＡはプリグループ上に固定される。このような薄膜の例としては例えば、ポリ−Ｌ−リシン（Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ：ＰＬＬと略記）水溶液で処理することで形成される薄膜などを代表例として挙げることができるが、これに限定されるものではなく３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳと略記）水溶液等を挙げることができる。あるいは、末端をビオチン化したＤＮＡをプローブＤＮＡに用いることができ、この場合には基板表面にアビジンを固定しておくことでアビジン−ビオチン間の特異的結合形成能によってＤＮＡを基板に固定することができる。また、基板の表面だけに薄膜を設けると、温度湿度環境の変化により基板が反ることがあるので、基板の両面に対称に薄膜を設けた方が好ましい。このときも、基板面から入射したレーザビームが基板を透過するように薄膜を設けるのが好ましい。
プリグルーブの位置を示すためのアドレス情報をプリグルーブに附加している。図２においてプリグルーブを同心円状あるいはスパイラル状に作成し、２７に示すように同心円のプリグルーブの一部分を切断し、プリグルーブのある部分とない部分を設け、プリグルーブの位置を示すアドレス情報とした。またＤＮＡマイクロディスクの最外周部、あるいは内周部に２６のＶマークと称する回転位置を示すマークを設けた。図２ａは図２の一部を拡大して示したアドレス情報とＶマーク拡大図である。実際のプリグルーブは円周に沿っているため、扇型になるが、ここでは簡単のため直線として示した。なお図２との対応関係は同じ番号を与え、示している。
このように構成したＤＮＡマイクロディスク上に、次に述べるスポッティングによるＤＮＡスポットを設けたものもＤＮＡマイクロディスクと呼ぶ。
次に、Ｖマークの構成を詳細に述べる。図２ａにおいて、このＶマーク２６は、プリグルーブの回転方向の角度を示しており、本実施例では、Ｖマーク２６の間の回転方向の角度にプリグルーブのアドレス情報を示すプリピット列（２６ａ、２６ｂ…）を設けた。このようにＶマークを設けることにより、アドレス情報のディスク円周上の位置を検出することが容易になる。例えば２６ａを起点０度とすると、２６ｂは円周上の０．５度の位置を示す指標となるわけである。
このように、Ｖマークがディスク上の回転角度を表す絶対番地を構成することになるわけである。例えば半径方向に４ビットを表すプリピット列（２６ａ、２６ｂ…）を構成し、それらを用いて、角度を番地に対応させた。なお図２ａの２８の矢印はＤＮＡマイクロディスクの半径方向を、矢印２９は接線方向を示している。２７のプリグルーブのアドレス情報は半径方向に複数本配置されるプリグルーブの半径方向の位置を示すアドレス情報を示している。（例えば最外周を１番目のプリグルーブとし、内周方向に２，３，４となる４ビットの番地を与える）アドレス情報、角度情報を記録する時には、よく知られた変調方法、例えばＦＭ変調、位相変調、を用いる。Ｖマークの示す角度情報は、図６に示すＶマーク検出器１５により読み取られ、プリグルーブの位置情報は、プリグルーブを走査する対物レンズ４の出射光ビームにより読み取られる。この間の時間軸上での時間ズレが存在する時には、もちろんスポッティング装置のＣＰＵ３６により補正される。
また図２において、２４の第１のデータ記録部はスポッティング時に、あるいはスポッティング終了時に、スポッティング液をデータ記録に用いるために濃淡マークが生成できるインク等にする。そしてこのインク等により作製されたスポットの位置、大きさ、位相などを変化させ情報を記録するためのものである。そして、ＤＮＡスポットを作成する時の条件などの情報を、ＤＮＡスポットを基板上に設けるときに、情報により変調された記録スポットの列を作成し記録する。
特に、スポッティングする位置を示すアドレス情報と、スポッティング液に名称との対応関係を記録することが、有効である。
このときに用いることのできる変調方法としては、記録スポットを２値信号からなる情報信号に応じて、記録スポットの位置を変化させる方法、あるいは情報信号に応じて、記録スポットの周期を変化させる方法などを用いることが可能である。また記録スポットを構成する材料としては、有機材料あるいは、無機材料などから作られたインク等を使用できる。
また、言うまでもないが、スポッティングする位置を示すＤＮＡマイクロアレイ基板上のアドレス情報と、スポッティング液の名称の対応関係は、別のメモリーに記録し、ＤＮＡマイクロアレイ基板に付属させることもできる。この時にはＤＮＡマイクロアレイ基板にバーコードなどにより、識別情報を設け、メモリーとの関係付けをメモリーに記録すればよい。
この第１の記録部分とは別に第２の記録可能部２５を基板上に設け、ＤＮＡスポットの読取を行った後に、読み取られたＤＮＡスポットの有する情報データを追記することも可能にした。
記録可能部分には、従来から記録可能光ディスクに用いられている色素あるいは、金属薄膜を基板上に蒸着あるいはスパッタ手段により形成することができる。第２のデータ記録部はプリグルーブ上に設け、かつ前記プリグルーブに番地情報を設け、他の部分と識別を容易にすることが望ましい。このデータ記録部に、スポッティングする位置を示すアドレス情報と、スポッティング液に名称との対応関係を記録することももちろん可能であり、そのときには、スポッティング中に取得された情報を、一時的に別のメモリーに記憶させ、スポッティングが終了後にまとめて記録することも可能である。
次に動作について、図２のＤＮＡマイクロディスク、図３のスポッティング装置制御部ブロック図、および図４のスポッティング時の反射光量分布変化を示すグラフを用いて説明する。
図１、図３において、４の対物レンズから出射したレーザビームは、４ａのトラッキングアクチュエータにより１のＤＮＡマイクロディスク上のプリグルーブ２３を追従する。このため、７の光検出器を二分割した７ａ、７ｂの光検出器の出力差は３０の差動増幅器１の出力として得られ、３１の位相補償器１によりトラッキングサーボ部の応答を適正化し、３２の駆動増幅器１により４ａのトラッキングアクチュエータを位置制御する。また４の対物レンズからの出射する光の一部は、１のＤＮＡマイクロディスクを透過し、１０ａの光検出器、１０ｂからなる光検出器１０により検出され、その差は３３の差動増幅器２により出力される。３３の出力は３４の位相補償器２によりトラバースサーボ部の応答を適正化し、３５の駆動増幅器１により、１３のトラバースモータＡを駆動制御し、１３のトラバースユニットＡを位置制御する。この結果、９のインクジェット吐出口の位置は常に２３のプリグルーブと対向する位置に追従するように制御され、インクジェットから吐出する液は２３のプリグルーブ上に吐出し配置される。
インクジェットから吐出されプリグルーブ上に付着した液滴を４の対物レンズから出射されたビームスポットにより照射する。そしてプリグルーブおよび付着した液滴により反射され、７の光検出器により検出される。図４はこのときの様子を示すグラフである。図４のグラフの横軸はＤＮＡマイクロディスクの回転位置を示し、縦軸は光検出器７により検出される反射光量を示す。
図４は液滴がプリグルーブ上に付着した時に、液滴により反射光量が著しく低下することを示している。これは図４における４５の矢印（反射光量低下部を示す）により示される。
液滴が吐出され、プリグルーブ上に付着した時点を光検出器７により検出可能である。実施例では、光検出器７の出力を３７の加算器により検出し、その加算器出力３８はＣＰＵ３６に供給され、液滴が付着したかどうか、また付着した位置を７の光検出器の出力により測定できる。インクジェットの吐出位置精度は±３０μｍ程度であるので、プリグルーブの半径方向のピッチ（トラックピッチと呼ぶ）を３０μｍとした時には、前記した光検出器７の出力を測定することにより１３のトラバースユニットＡの位置を制御し、液滴がプリグルーブ上に配置されるように制御可能である。またプリグルーブの接線方向の位置精度に関しては、インクジェットの取り付け位置を調整することにより最適位置に調整できる。
次にインクジェットの取り付け位置調整方法に関し、図１と図３を用い具体的に説明する。図１においてレーザから出射したレーザ光は、対物レンズを経て２３のプリグルーブ上に焦点を結ぶ。このとき９のインクジェット噴射口からスポッティング液を吐出する。
このときの様子を図４に示す。図４において、１のＤＮＡマイクロディスクを回転させ８のインクジェットからスポッティング液滴を４３、４４に示すスポッティング液吐出時点において、吐出させ、プリグルーブ２３から反射し対物レンズを経由して７の光検出器に戻る光量を、反射光量をグラフの縦軸４２にプロットした。横軸は時間経過をＤＮＡマイクロディスク回転時間経過４１として示す。
液滴がプリグルーブ上に付着すると、図４において、４５の反射光量低下期間に示すように、プリグルーブから反射し対物レンズを経由して７の光検出器に戻る光量が約１／１０となることがわかる。７の光検出器により２３のプリグルーブから反射した光量分布を測定し、２３のプリグルーブの中心に吐出した液滴が配置されるように、８のインクジェットの位置を調整する。調整はインクジェットからの吐出を何回か繰り返して行い、最適の位置に調整する。
７の光検出器の出力は３０の差動増幅器により光量分布を測定し、３７の加算器の出力を、３６のＣＰＵに供給することにより光量を測定し、１３のトラバースユニットＡの位置を制御しながら行う。
なお１４のディスクモータは１のＤＮＡマイクロディスクを回転駆動する。
尚、４の対物レンズは、４ｂの対物レンズアクチュエータにより、ＤＮＡマイクロディスクに対して垂直方向に可動させることができ、１のＤＮＡマイクロディスクと４の対物レンズの距離を検出し、一定に制御するフォーカス制御部（図示せず）を構成することも可能である。このときには、４の対物レンズと１のＤＮＡマイクロディスクの相対位置を検出し、検出した位置が一定となるように４の対物レンズの位置（ＤＮＡマイクロディスクに対して垂直方向）を４ｂのフォーカシングアクチュエータにより駆動制御する。
次に図５を用い、インクジェットとスポッティング液を保有したタンク（インクジェットに含む）を、複数収納したインクジェットユニット５３を１２−１のトラバースユニットＢに載置し、複数種類のプローブＤＮＡの液滴を順次インクジェット５１から吐出し、ＤＮＡマイクロディスク上のプリグルーブに配置する方法を説明する。
ここで、インクジェットを複数個設けたインクジェットユニット５３を図５に示す１２−１のトラバースユニットＢに載置し、インクジェットユニットはトラバースユニットＢに対して５５の移送ギアにより移動可能にした。この時、５１のインクジェットを複数個設け、各々のインクジェットに各々異なる成分を有するプローブＤＮＡの液が吐出できるようにしている。そして各インクジェットからプローブＤＮＡを含む液をスポッティング可能に構成した。そして１０の光検出器とインクジェットユニットに設けられたインクジェットの吐出口５２は常に同じ位置関係を保つように、１２−１のトラバースユニットＢに対してインクジェットユニット５３を５４のインクジェットユニット移動方向に示す方向に移動制御する。
図６，７はスポッティング装置の別の一実施例を示す構成図である。図６は側面からみた構成図、図７は上面からみた構成図である。図６において、図１との共通点が多いため、図１において使用した番号はそのまま同じものを使用している。
最初に大まかな動作について述べる。１のＤＮＡマイクロディスクのプリグルーブ２３上にプローブＤＮＡの液滴をインクジェットから吐出して、液滴をプリグルーブ状に配置するため、ＤＮＡマイクロディスクを回転させる。同時にインクジェットが複数個取り付けられたロータリーテーブルを回転させ、所望のインクジェットがプリグルーブ上の指定した位置になるように、ＤＮＡマイクロディスクの位置を６２の移送方向に変位させる。プリグルーブ上の指定した位置にインクジェットが来た時、インクジェットから液滴が吐出され、プリグルーブ上に配置される。
次に詳細な動作について説明する。
図６において６０以上の番号を有するものは、図１の構成に対して新たに附加したものである。
６１はディスクモータ１４を６２の移送方向に移送するディスクモータ移送装置である。もちろん１４のディスクモータにクランプされている１のＤＮＡマイクロディスクは、１４のディスクモータと一体に移送される。
４の対物レンズから出射したレーザビームは２３のプリグルーブにより回折され、その反射光のファーフィールドパターンが７の光検出器により受光される。７ａ、７ｂの光検出器の差動信号は、前記したレーザビームが１のＤＮＡマイクロディスク上に形成するスポットとプリグルーブの相対位置を示すので、差動信号が０になるように４ａのトラッキングアクチュエータと１３−２のトラバースモータＣを制御し、前記ビームスポットが２３のプリグルーブを追従するように動作する。１２−２のトラバースユニットＣは図５に示した１２−１のトラバースユニットＢとは異なり、インクジェットと光検出器１０が７１のマルチインクジェットロータリーテーブルに取り付けられている。
４の対物レンズから出射したレーザビームは２３のプリグルーブにより回折され、そのファーフィールドパターンが１０の光検出器により受光される。
１０ａ，１０ｂの光検出器の差動信号は、前記したレーザビームが１のＤＮＡマイクロディスク上に形成するスポットと、プリグルーブの相対位置を示すので、６１のディスクモータ移送装置を制御し、インクジェット９の吐出口が２３のプリグルーブ上に位置するように追従制御する。
つまり対物レンズを出射したレーザビームスポットは、４ａのトラッキングアクチュエータおよび１３−２のトラバースモータＣによりプリグルーブを追従し、ＤＮＡマイクロディスクの位置は、インクジェットの吐出口の位置に追従するわけである。インクジェットからスポッティング液を吐出するタイミングは１４のＶマーク検出器の出力およびプリグルーブに設けたプリグルーブの場所を特定するアドレス情報２７を、７の光検出器の出力から読み取って行う。Ｖマーク検出器１５としては、例えばフォトカップラー、レーザビームをＶマークピット列に沿って半径方向に走査する光ヘッド等を用いることができる。フォトカップラーを用いた時には、光を基板の一方から照射し、基板を透過した光をもう一方の光検出器により受光し、Ｖマークを読み取る。
走査光ヘッドを用いた時には、光ヘッドからレーザビームをＶマークに走査しながら照射し、基板を透過した光を別の光検出器により受光し、Ｖマークを読み取る。なお、走査方向は図２の２８に示す半径方向である。走査方法は、レーザビームを照射するためのレンズの位置を変位させることにより行う。Ｖマークを走査し位置を検出すれば、ＤＮＡマイクロディスクとレーザ光の相対速度が０に近くなってもプリグルーブの位置情報を読み取ることが可能となる。
このように制御した上で、図７における７１のマルチインクジェットロータリーテーブルに載置されたインクジェット８が、１のＤＮＡマイクロディスク上のプリグルーブに正確に液滴を、吐出し、配置する。７１のマルチインクジェットロータリーテーブルの回転は図８のロータリーテーブル回転制御装置８３により回転制御される。なお図示していないが、インクジェットから液滴を吐出するための制御信号は、図８のＣＰＵ３６が、前記したＶマーク検出器１５の出力およびプリグルーブに設けたプリグルーブの場所を特定するアドレス情報を、７の光検出器により受け取り、インクジェットの吐出タイミングを制御する。また１３−２のトラバースモータＣは、３１の位相補償器１の出力を８１の位相補償器、８２の駆動増幅器３を経由した駆動信号により制御される。
図９に図７のマルチスポッティング装置を用いるインクジェットの構造を示した。９１はスポッティング液としてプローブＤＮＡを貯蔵するタンク、９０はインクジェットＡであり、接続孔９３により、９１のタンクに挿入し、接続される。
なお９２は接続シール、９４は吐出口、９５は９６の加圧デバイスの圧力を受け、９４の吐出口からスポッティング液を吐出するための加圧室である。
インクジェットのタンクにはタンクに有するスポッティング液の種類を表示するバーコード等の液名表示部９７が設けてある。
プリグルーブ上の規定の位置にスポッティングする時には、必ず前記バーコード９７を読み取り、プリグルーブ上のアドレス情報とともに表示部９７が表示した情報をメモリーに記録する。プリグルーブのアドレス情報は、図３の３８の加算器出力を用いて読み取ることもできる。もちろん、図６のＶマーク検出器の出力からＤＮＡマイクロディスク上のスポッティング位置を検出することも可能としている。このメモリーの内容は最終的には、ＤＮＡマイクロディスク上の記録領域（図２の領域２４あるいは２５）に転記し、スポッティングが終了したＤＮＡマイクロディスク上のどの位置に、どのようなスポッティング液が配置されているかを、知ることができるようにしてある。
以上のごとく構成することにより、基板上のプリグルーブの位置を検出し、スポッティング液としてプローブＤＮＡをプリグルーブ上にスポッティングすることが可能となり、基板上の予め決められたアドレス情報をもつ位置にプローブＤＮＡを設けることが出来、かつプリグルーブによりプローブＤＮＡが基板上に広がることを規制できるため、プローブＤＮＡを高密度で配置することが可能になった。図１ではプリグルーブの凸の部分にスポッティング液を配置しているが、プリグルーブの凹の部分に配置してもよい。この場合には、スポッティングされたスポッティング液はプリグルーブの凹の部分に沿って配置される。
また、プリグルーブには予め番地情報２７を附加させることができるため、プローブＤＮＡを正確に示すことができる。
なお以上の実施例においては、プローブＤＮＡをスポッティングする時には、基板上のプリグルーブの位置を検出するため基板側から例えば波長７８０ｎｍのレーザビームを２のレーザより照射し、透過したレーザビームを用いて、基板上のプリグルーブ２３の位置を検出し、前記したごとく位置決めを行う。基板に薄膜を設けたときには、基板側から照射したレーザビームが基板を透過する波長をもつレーザを選択し、使用する。
基板上のＤＮＡプローブに試験試料であるｃＤＮＡを塗布し、プローブＤＮＡとハイブリダイゼイション反応が生じた後、生成されたＤＮＡスポットに含まれる蛍光を検出する時には、例えば波長約６５０ｎｍ，約５３０ｎｍ，約４００ｎｍのレーザビームを基板上より照射し、その反射光を用いる。このため、基板上にはＳｉＯ_２、金などの層を設けている。実施例においては基板上に金の層を設けその上にＳｉＯ_２層を作製している。金の代わりにＰｔなど、またＳｉＯ_２の代わりに同等な性質をもった無機材料、有機材料を使用することも可能である。
基板上に設けた金、ＳｉＯ_２の薄膜の機能について説明する。図１０において、横軸１００はＳｉＯ_２膜の膜厚［ｎｍ］を示し、縦軸１０１は基板表面上の電場強度のポリカーボネート基板のみの場合に対する比を示し、金、ＳｉＯ_２の薄膜を設けたときと、何も設けなかったときの比較値をあらわした。１０２は波長５６３ｎｍのレーザ光を、１０３は波長６５２ｎｍ、１０４は波長５３２ｎｍのレーザ光を用いた時の特性である。
図１０では、金の薄膜の上にＳｉＯ_２の薄膜を配置した。金の膜厚を５０ｎｍとした時ＳｉＯ_２膜上にできる電場強度比を、ＳｉＯ_２膜の厚さを変化させて計算した結果を図１０の縦軸に示したものである。
この結果、例えばＳｉＯ_２の膜厚７０ｎｍにおいて、縦軸の強度比が５倍になっている事がわかる。これは前記した膜構造にしたとき、膜の形成した面から５３２ｎｍの波長の光を照射したときの反射光量が５倍になることを示すわけである。
図１０のグラフにおいては、金の薄膜の厚さを５０ｎｍとした時、ＳｉＯ_２膜厚を７０ｎｍとすることにより、ＳｉＯ_２表面の電場が薄膜の無い時に比べ約５倍になることがわかる。このように基板表面に薄膜を設け、レーザ光を照射したときに、電場を大きくするように構成することにより、蛍光体を含んだＤＮＡスポットにレーザビームを照射しその反射光を観測すれば、光量が増加し、反射光のＳ／Ｎが向上する効果が得られる。
基板にスポッティングする場合においては、スポッティングする基板表面に微小な油脂成分等の汚れを取り除くことが重要である。そのため、スポッティングする直前にプリグルーブを照射するレーザビームの出力を増大させることにより、基板表面の温度を上昇させ、汚れ成分を取り除くことができる。
このために、位置検出用のレーザビームを用いることが可能であるが、別のレーザを準備し、スポッティングに先立って基板表面の温度を一時的に上昇させた後、スポッティングを行うこともできる。
基板としては円盤状とした実施例を用いて説明したが、円盤状ではなく、長方形などの形状でも適用可能である。もちろんプリグルーブを円周状ではなく、直線状の線分を集合させた形状でも利用可能である。
またインクジェットの位置を検出するために、インクジェットに直接光検出器を取り付けることもできる。もちろん光を用いた位置検出方法以外の方法、例えば磁気検出を用いることも可能である。スポッティング液としては、ｃＤＮＡなどのプローブＤＮＡを用いた実施例により説明したが、スポッティング液としては、蛋白など、液状のものであれば、何にでも適用できる。
また本発明の基板は、プローブＤＮＡとして、オリゴＤＮＡを光化学反応を用いて作製するときの基板としても使用することができる。
ここで簡単に本発明の基板を用いて、光化学反応により用いて作製するプローブＤＮＡの説明を行う。
周知のように、ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド（ヌクレオチドという）の重合体である。このヌクレオチドはデオキシリボースにリン酸、及び、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、の４種類の塩基の中の１つが結合した化合物である。たとえば２つのヌクレオチド、今これらの一つを［Ｘ］、もう一つを［Ｙ］とし、［Ｘ］の中のデオキシリボースの５’炭素原子と［Ｙ］の中のデオキシリボースの３’炭素原子が、間にリン酸をはさんでエステル結合を形成することでつながることができる。
ヌクレオチドは、２つの末端を持っているが、この１つの端を５’炭素、もう１つの端を３’炭素と結ばれており、ヌクレオチド間の結合は５’炭素と３’炭素の間だけでつくられ、５’炭素間、あるいは３’炭素間では結合が起きない。
そして結合をくりかえすことで、理論的には無限の数のヌクレオチドを直鎖状に結合することができる。そして、各ヌクレオチドにはＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔの４種類の塩基のうち１つが含まれるため、ＤＮＡの中ではこの塩基の並ぶ順番を指定することが出来、これがＤＮＡの塩基配列となる。ここでは簡単のためこれらを、Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔと呼ぶ。このＤＮＡを基板上に作成したものをプローブＤＮＡと呼ぶ。
プローブＤＮＡを図２のＤＮＡマイクロディスク上に生成するに際し、ＤＮＡマイクロディスク上に記録可能なゾーンを設け、作成条件と測定結果、プリグルーブあるいはプリピットにより位置決めされプローブＤＮＡの格納位置を示すアドレス情報と、プローブＤＮＡとの対応関係を、ＤＮＡマイクロディスク上に記録する。これによって、従来ガラス板と作成時のデータが別に保管されていたのを一体的に保存でき、操作性、信頼性とセキュリティが向上する。このための具体的作成方法を提供するためのものである。
以下本発明の実施をするための最良の形態を具体的に示した１実施例について図面とともに記載する。
以下、図１２，図１３を用いて、本発明における第１の実施例の概略構成を図示する。図１１はＤＮＡマイクロディスクのプリグルーブとその位置を示すアドレスの部分を拡大して示した図面である。また、図１３はプローブＤＮＡを作成ための装置の構成を示すブロック図である
ここでは図１２に示したＤＮＡマイクロディスク１１８上のアドレス１（１１３）を有するプリグルーブ１１２にＡ−Ｃ−Ｇ−Ｔという塩基配列の４つのヌクレオチドから出来たオリゴヌクレオチドを、生成する。そして、１１５のアドレス２が示すプリグルーブ１１４にＧ−Ａ−Ｔ−Ｃの配列を持つオリゴヌクレオチドをＤＮＡマイクロディスク上につくる場合を例にとり説明する。
すでに説明したように、Ａが３’末端側で、Ｔが５’末端側だとする。ＤＮＡの化学合成では３’末端側から始めて、その５’末端に順次ヌクレオチドを一つずつ付加していき、その際に付加するヌクレオチドの種類をコントロールすることで目的の塩基配列のＤＮＡを合成する。例えばＡから開始する場合を説明する。このヌクレオチドの５’末端には別の化学基を結合させて他のヌクレオチドの３’末端と反応できないようにしておく。このような化学基をここでは保護基と呼ぶ。この最初のＡのヌクレオチドをその３’末端で、基板上の樹脂に共有結合させておく。なお、３’末端をビオチン化したＤＮＡをプローブＤＮＡに用いることができ、この場合にはＤＮＡマイクロディスク１１１の表面にアビジンを固定しておくことでアビジン−ビオチン間の特異的結合形成能によってＤＮＡを基板に固定することもできる。
この最初のＡのヌクレオチドをその３’末端で固定する方法としては、次の方法もある。まずこのＤＮＡマイクロディスクの表面に光化学的に活性化する物質を設ける。
あるいは、このＤＮＡマイクロディスクの表面にレーザ光を照射したときに発生する電場を大きくするため、例えば金の層、ＳｉＯ_２の層を設けその上に前記した光化学的に活性化する物質を設けることもできる。
まずこのＤＮＡマイクロディスク基板の表面に光化学的に活性化する物質、光照射によって乖離し、その後にＯＨ−基が残存する性質を持つ保護基によって端末されたモノマー（モノヌクレオチド）を設け、これを重合させて一端を基板表面に固定した状態のオリゴヌクレオチド（鎖長の短いポリマー）を合成する。次に基板表面に選択的にレーザ光を照射して保護基を外してＯＨ−基を生成した後、モノヌクレオチド溶液を、例えばスピンコートにより塗布すると化学反応が起こり、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が光をあてた部分に結合する。モノマーとしては、感光性保護基で５’ヒドロキシルを光保護された３’−Ｏ−活性化ホスホルアミダイトヌクレオチドを例示することができる。光保護されたモノヌクレオチドおよびその合成法については、ＷＯ１９９７／０３９１５１（特開２０００−５０８５４２）に詳述されている。また、感光性保護基としては、オルトニトロベンジル基を例示することができる。
つまり、基板表面に選択的にレーザ光を照射後、ヌクレオチド溶液を加えると化学反応が起こり、ヌクレオチドが光をあてた部分に結合する活性化層をもつように構成する。たとえば、光を照射した部分にＯＨ−基が生成されるようにし、その後スピンコートにより塗布したモノマーと結合するようにする。
本発明では、基板上に、プリグルーブあるいはプリピットにより構成したアドレス情報により特定可能な格納部を設け指定した格納部において光化学反応を行う。そのため、前記アドレス情報を読み取り格納部にレーザ光を選択的に照射するわけである。
この格納部は、プリグルーブの凹部、あるいは凸部、あるいはプリピットにより特定可能な領域なら平面でもサッカースタジアムのような形状をした凹ピット、凸ピットなどの形状などを用いる。またその寸法は幅が１μｍ以上、長さが１μｍ以上とすることがレーザビームスポットの大きさとの関係で好ましいが、これに限定するものではなく、プローブＤＮＡが格納できる寸法に設定している。
このようにアドレス情報を読み取りレーザビームスポットを格納部であるプリグルーブなどにトラッキングした後、ＤＮＡマイクロディスク表面の任意の格納部に選択的に光を照射する。そこでまず、アドレス１にレーザ光をあててからＡヌクレオチドを加える。このＡヌクレオチドの末端は保護基で保護している。Ａヌクレオチドの溶液をスピンコートにより基板上に塗布する。ただし、その保護基は光化学的に不安定なものを使う。つまりレーザ光をあてると脱保護の反応が起きるというものである。このＡヌクレオチドがアドレス１のプリグルーブ１１２の表面に結合したら、洗浄液を基板にスピンコートにより塗布し、未反応のＡヌクレオチドを取り除く。
つぎにアドレス２のプリグルーブ１１４に光を照射してここを活性化し、末端に保護基をもったＧヌクレオチドを反応させこれをそこに配置する。ここまででアドレス１のプリグルーブ１１２にＡが、アドレス２のプリグルーブ１１４にＧが結合したＤＮＡマイクロディスクができたわけである。つぎに、アドレス１のプリグルーブ１１２にレーザ光を照射するとＡヌクレオチドの保護基がとれるためその後、Ｃヌクレオチドを付加する。アドレス２のプリグルーブ１１４にレーザ光を照射しＧヌクレオチドの脱保護をしてＡヌクレオチドを付加する。その後は同じことを繰り返せば、アドレス１のプリグルーブ１１２にＡ−Ｃ−Ｇ−Ｔ、アドレス２のプリグルーブ１１４にＧ−Ａ−Ｔ−ＣのオリゴＤＮＡを有するＤＮＡマイクロディスクが完成する。なお１１８のＤＮＡマイクロディスクは便宜上直線的に書かれているが、実際は円盤状であり、プリグルーブは、１１７の接線方向に同心円あるいはスパイラル状に作製してある。そしてこの同心円あるいはスパイラル状のプリグルーブは半径方向に複数本（例えばトラックピッチ２μｍから２０μｍ程度で数１０００本以上）ディスク上に整列している。
この特定のプリグルーブにレーザ光を照射する方法を図１３のブロック図を用いて説明する。
図１３はプローブＤＮＡ作製装置のブロック図である。１１８はＤＮＡマイクロディスクで、アドレス１のプリグルーブ１１２、アドレス２のプリグルーブ１１４が設けられている。このプローブＤＮＡ作製装置においては、プローブＤＮＡの格納部としてプリグルーブを用いている。
１１８のＤＮＡマイクロディスクは１３１のモータに１３２のターンテーブルを介して乗せられており、ディスクモータ１３１により回転制御される。１２０はレーザであり、１２１のビームエキスパンダにより平行光に変換され、１２２のビームスプリッタを経て、１２３の対物レンズにより焦点を１１３のアドレス１のプリグルーブ１１２上に結ぶ。このため、対物レンズ１２３は１２５のフォーカシングアクチュエータ、１２４のトラッキングアクチュエータ、および１３０のトラバースモータにより制御され、１１３のアドレス１を有するプリグルーブ１１２上に焦点を結ぶように制御される。制御のために、対物レンズは１１３のアドレス１を対物レンズが集光した１１８のＤＮＡマイクロディスクからの反射光を１２６のレンズをへて１２８の光検出器により検出し、１１３のアドレス１が読み取られ、位置制御される。最初レーザビームのパワーは保護基を照射した時も影響を与えないよう低パワーに調整され、ビームスポットが１１２のアドレス１のプリグルーブを追従する。そして、アドレス１のプリグルーブ１１２が検出されたときに保護基を除去するため、レーザパワーを高出力にする。つまり、レーザビームがアドレス１のプリグルーブ１１２を走査する期間のみ、レーザパワーを高出力に設定する。
図１４はプローブＤＮＡ作製装置のブロック図である。１２０のレーザは１４６のレーザパワー変調器によりレーザパワーが変調される。１２８の光検出器の出力は１４０のプリアンプにより光出力が電流に変換され、プリグルーブ１１２のアドレス１の情報が検出され、デコーダ１４１により復調され、１４２のＣＰＵ（コントローラ）に送られる。プリグルーブ１１２の位置が読み取られた後、前記プリグルーブ上において行う光化学反応に適合したレーザパワーが、ＣＰＵ１４２により演算され、１４３の照射パルス制御部により出力される。そして、１４６のレーザパワー変調器を経由して、１２０のレーザの出力レーザパワー、出力パルス幅、等が制御され、レーザの光出力がプリグルーブ１１２を照射する。１２０のレーザから出力されるレーザパワーは、光化学反応に適した値になるようにパルス幅、パルスピーク値が制御されるが、ＤＮＡマイクロディスクとレーザビームスポットとの相対速度により、パワーを変える必要があるため、１４７のサーボ部より１３１のディスクモータの回転数情報が、ＣＰＵ１４２に入力され、パワー制御のための情報として使用される。例えば光化学反応に大きなレーザパワーが必要なときは、相対速度を低下させ、対象のプリグルーブ上に大きな光エネルギー（プリグルーブ上に与えられた光エネルギーの積分値）を与えることができる。１４７のサーボ部は１２３の対物レンズの出射光ビームをＤＮＡマイクロディスクのプリグルーブ上に、フォーカシング、トラッキングするため動作も行う。
なお１４５のＰＣはプローブＤＮＡ作製装置をコントロールするためのパソコンであり、インターフェース（Ｉ／Ｆ）１４４を介して、プローブＤＮＡ作製装置全体の動作をコントロールする。例えば、ＤＮＡマイクロディスク上のアドレス情報により特定できるプリグルーブの総数は、１００万カ所以上とすることが可能であり、プローブＤＮＡ作製装置内部のＣＰＵ１４２だけではどのアドレスにどのようなＤＮＡを生成するかをコントロール出来ないため、外部のパソコンによる制御が必要になる。
図１５に動作波形図を示す。１４１は読み取られたアドレス情報の１例を示す。１２０のレーザの光出力は、再生光パワー１４８によりアドレス情報を読み取り、特定のアドレスを有するプリグルーブに、１４９のピークパワーを持つレーザ光を照射する。
特にプリグルーブ上において光化学反応を生じさせるときには、光エネルギーの積分値が重要であり、照射レーザパワーのはじめのパルス幅を大きくし、その後パルス幅をちいさくすることにより、プリグルーブ上に設けた光保護基に対する適切な反応エネルギーを与えることができる。
このように、ＤＮＡマイクロディスク表面の任意の微小な部位（プリグルーブ）に光を当てるトラッキングサーボ技術と、光の照射で脱保護反応が起きる保護基を持ったヌクレオチドを用いたＤＮＡ合成反応により、「オリゴＤＮＡマイクロディスク」の作製が可能になる。レーザ波長については、３５０ｎｍ程度が脱保護基のためには好適であることが分かっている。また複数のレーザ波長を選択して用いることにより、光化学反応にたいする働きを変えることも可能である。例えば、光保護基やモノマーの性質を波長依存性の強いものにすることにより、モノマーの反応を波長を変えることにより選択的に行うことができる。最終的に作製されたプローブＤＮＡはレーザビームを走査することにより、プローブＤＮＡが正常に作製されたものかどうか判別できる。判別する方法としては、プローブＤＮＡを走査し、正常に動作するプローブＤＮＡと反射率、色、等を比較し、行うことが可能である。
そして、同じ種類のプローブＤＮＡを複数個作製しておき、正常なものを判別し、管理することができる。そして最終的にはカスタマーはその最終的に正常とされたプローブＤＮＡを管理データより知り、そのアドレス情報を持つプローブＤＮＡだけを使用することができるわけである。管理する方法としては、正常に作製できたプローブＤＮＡの存在するアドレス情報をＤＮＡマイクロディスク上に保管することにより可能としている。これは記録できるゾーンをＤＮＡマイクロディスクに備えているので、その箇所に情報を保管する。
最後に以上のように作製した基板上のプローブＤＮＡを用い、ｍＲＮＡの解析を行うときの方法については、公知のＤＮＡチップと同じプロセスにより、検査対象試料とハイブリダイゼイションさせ、塩基結合させた後、プローブＤＮＡに検査用レーザビームを照射し、蛍光を観測しておこなう。この時、本発明のＤＮＡマイクロディスクを用いたときには、ＤＮＡスポットを１次元に走査可能であるので、高速に検査を行うことができる。プリグルーブ上にプローブＤＮＡを配置したので、塩基結合したプローブＤＮＡ（ＤＮＡスポットと呼ぶ）の検出Ｓ／Ｎを向上させることが出来、そのための光学測定部と、サーボ部を備えることにより、塩基結合計測の高速化と操作性の向上および低価格化を実現する。そして制御部を構成する光学測定部をＤＮＡスポットの読取光学測定部と独立に設け、サーボ誤差を検出するためのビームスポットがＤＮＡスポットに含まれる蛍光体を劣化させないようにできた。また、ＤＮＡマイクロアレイの読み取りビーム光の位置制御を、サーボ機構を用いて精度良く行い、フォーカス、トラッキング方向の誤差を無くし、正確に走査することが実現できた。
また、読取レーザビームによる蛍光体の退色を防止し、ＤＮＡスポットの読取Ｓ／Ｎを向上させるため、読取レーザ光を高周波（例えば１００−５００ＭＨｚ）で振幅変調することも可能である。このように変調することにより、基板上において、照射エネルギーの蓄積が少なくなることが分かっており、退色を防止できる。
以下本発明のＤＮＡマイクロディスクを計測するための最良の形態を具体的に示した実施例について、図面とともに記載する。
以下、図１６，図２を用いて、本発明における計測の実施例の概略構成を図示する。
図１６は、図２に示したＤＮＡマイクロディスクを読み取る装置の構成を示すブロック図、図２はＤＮＡマイクロディスクである。
図１６において、１はＤＮＡマイクロディスクで、１５２のディスクモータにより、回転制御される。１５３は対物レンズで、ＤＮＡマイクロディスク上に形成されたＤＮＡスポットにレーザビームを集光し、反射した光を集める。１５３の対物レンズは、１５４の対物レンズアクチュエータ、フォーカス素子１５４ａトラッキング素子１５４ｂ、により、ＤＮＡマイクロディスクの基板に対して垂直方向（１５３ｂのＺ方向）と、ＤＮＡスポット列にレーザビーム先を追従させるトラッキング方向（１５３ａのＸ方向）、に可動させることができる。
１５５は蛍光励起用光源（出力光波長λ１）で、この場合、６５０ｎｍの波長のレーザを用いている。１５６はコリメータレンズ１で、１５５のレーザの出力光を平行光、あるいは規定の角度をもった発散光に変換し、１５９のハーフミラー、１６０のビームスプリッタ１を経由して、１５３の対物レンズにより、１のＤＮＡマイクロディスク上に焦点を結ぶ。規定の角度をもった発散光に変換する理由は、焦点を結んだ時のビームスポットの大きさを、ＤＮＡスポットの大きさと同程度にするためである。またこのとき波長λ１の光源から出射する光束は対物レンズに入射する前に開口制限が設け、対物レンズのＮＡを実質的に小さくなるようにしてもいい。
この開口制限は、図１４において、１５６のコリメータレンズの出射側に設けることができる。例えば対物レンズのＮＡとして０．６のものを用いた時でも、波長λ１の光に対しては、ＮＡが０．５で、波長λ３のサーボ用の光に対しては、０．６となるようにした。このようにすることにより、サーボ誤差検出感度を高くでき、かつＤＮＡスポット読取ビーム径を大きくできる。
１５７はサーボ用光源（出力光波長λ３）であり、１５８のコリメータレンズ２，１５９のハーフミラーを経て、１６０のビームスプリッタ１を経由して、１５３の対物レンズにより１のＤＮＡマイクロディスク上に焦点を結ぶ。ＤＮＡマイクロディスクで反射された反射光は、１５３の対物レンズ、１６０のビームスプリッタ１を経て、１６４のビームスプリッタ２により、１６５の集光レンズ２を経て、１６６のサーボ誤差検出器上に導かれる。
一方、１５３の対物レンズにより、１のＤＮＡマイクロディスク上に集光した１５５の蛍光励起用光源（出力光波長λ１）の出力光は、１のＤＮＡマイクロディスク上のＤＮＡスポットに含まれる蛍光体を励起し、励起された波長λ２の光は１５３の対物レンズにより集められ、１６０，１６４のビームスプリッタを経て、１６１の集光レンズ１で集光された後、１６２の光学フィルタにより、励起された光の波長λ２だけが選択されて１６３の蛍光読取検出器に導かれる。この時、１６０，１６４のビームスプリッタ１，２は波長λ１のレーザで励起されたＤＮＡスポット中の蛍光体の発光波長λ２を通過させ、１４のビームスプリッタはサーボ用光源の出力波長λ３の光を反射し、１６２の光学フィルタは波長λ２だけを透過させるように構成している。１６７のサーボ用光源の出力光は１６８のコリメータレンズ２により平行光に変換される。
そしてこのスポットの形状は、１６７のシリンドリカルレンズにより、１５３の対物レンズで集光された時に、焦点前後において、集光したスポットの形状が変化する。すなわち、１６６のサーボ誤差検出器上において、真円から楕円に変化する。この変化を１６６の光検出器を４分割したサーボ誤差検出器により、測定する。検出器の中央にほぼ真円の状態にＤＮＡマイクロディスクから反射したビームが投影された時に、１５３の対物レンズが合焦点になったことを示す。同時に、サーボ用光源の出力光は、１６８の回折格子により、１のＤＮＡマイクロディスク上のＤＮＡスポットあるいはプリグループ上に図１７に示すように、対物レンズ１５３を出射した光ビームＳ１，Ｓ２，Ｓ３が形成される。このうちＳ１，Ｓ３で示した光ビームは、１６６のサーボ誤差検出器のＤ１，Ｄ２により受光し、その出力の差がトラッキング誤差となる。
図１７はＤＮＡマイクロディスクと読取レーザビームおよびサーボ用レーザビームが形成するビームスポットの相対関係を示す原理図である。
図１７において、１７１はプリグループでＰ１，Ｐ２，Ｐ３で示している。プリグループの巾は１〜１００μｍ、高さは０．１〜１０μｍの凸または凹、プリグループの間隔は１〜１５０μｍ程度に設定する。１７１のプリグルーブ上に１７３のＤＮＡスポットが形成されている。１７２はサーボ用ビームであり、１７１のプリグルーブＰ２を照射した状態を示している。
サーボビームＳ１が図１４に示すサーボ誤差検出器Ｄ１に、Ｓ２はＤ３に、Ｓ３はＤ２に照射する。
１７０はＤＮＡスポット読取ビーム（波長λ１）であり、１７３のＤＮＡスポットを照射し、１７３のＤＮＡスポットに含まれる蛍光体を励起し、波長λ１による波長λ２の励起光は、図１６の蛍光読取検出器１６３により読み取られる。サーボ用光源（波長λ３）から形成されるサーボビームはＤＮＡスポットを照射するが、ＤＮＡスポットの蛍光体を励起できる波長にならないよう設定している（例えば７８０ｎｍ）ので、ＤＮＡスポットを退色させることはない。

以上のように構成した本発明は、次に述べる効果を奏することができる。
ＤＮＡマイクロディスク上のプリグルーブにプローブＤＮＡを正確にスポッティングしたＤＮＡマイクロディスクを使用した場合は、読取ビームを１次元方向に走査すればよいので、読取速度を早くできる。そのため、ＤＮＡスポットを１回だけ走査すれば読取が完了し、従来の２次元走査による画像化を不要にした。
さらに、基板にプリグルーブを設けたＤＮＡマイクロディスクを用いたため、基板上に従来より多くのＤＮＡスポットを設けることができ、例えば１０万スポット以上のＤＮＡスポットを有するＤＮＡマイクロディスクを作ることができる。基板上に金などの薄膜を設け、その上にＳｉＯ_２などの薄膜を設けたため、基板上にレーザを照射したとき、その反射光量が大きくなり、ＤＮＡマイクロディスク上のＤＮＡスポットを検出する時のＳ／Ｎが大きくとれる。
また基板材料として樹脂を用いることが出来、全体システムを安価に構成できる。樹脂を基板材料に用いた時でも、基板の両面に対称に薄膜を設けたため、ハイブリダイゼイション時にも基板の反りが最小に抑圧できる。
スポッティング時に、スポッティング液を１種類ずつ別のタンクに収納し、前記タンクにスポッティング液の種類、名前等を表示する表示部を設けたので、スポッティング時に間違った液をスポッティングすることがない。
高速でスポッティングするため、１枚のＤＮＡマイクロディスクにロータリーテーブルを複数個組み合わせて、スポッティングできるため、１つ当たりのスポッティング時間が節約でき、スポッティングの時間が減少した。
ＤＮＡマイクロディスク上のプリグルーブにおいて、プローブＤＮＡを光化学反応により合成する際には、レーザビームスポットを指定したアドレスを有するプリグルーブにレーザビームを照射することにより、合成を行うことが出来、この時、レーザ光の制御のみにより可能であるので、従来のようなマスクを使用する必要がない。また、レーザビームを制御することにより、毎回異なるプローブＤＮＡを作製でき、カスタムＤＮＡチップを簡単に作製できる。
なお本発明では、基板上に、アドレス情報により特定が出来るプリグルーブを設けた実施例により説明したが、プリグルーブの代わりにアドレス情報により特定が出来る格納部であれば平面部、あるいは凹面部、凸面部を用いることも可能である。つまり、アドレス情報を有するプリピットにより特定可能な格納部を設け、指定した格納部において光化学反応を行う。そのため、前記アドレス情報を読み取り格納部にレーザ光を選択的に照射するわけである。
この格納部は、プリグルーブの凹部、あるいは凸部、あるいはプリピットにより特定可能な領域なら平面でもサッカースタジアムのような形状をした凹ピット、凸ピットなどの形状なども用いることができる。またその寸法は幅が１μｍ以上、長さが１μｍ以上とすることが現在のレーザビームスポットの大きさとの関係で好ましいが、これに限定するものではなく、プローブＤＮＡが格納できる寸法に設定できればどのような寸法に設定しても良い。
ＤＮＡマイクロディスクあるいはＤＮＡマイクロアレイのＤＮＡスポットを照射するレーザビームを、サーボ用のレーザビームと読取用のレーザビームの両方をもたせることにより、ＤＮＡスポット上に正確に読取用レーザビームを位置決めでき、ＤＮＡスポットの蛍光体を効率よく励起でき、蛍光測定の感度を向上させた。もちろん、ＤＮＡマイクロスポットを配置する基板のそりなど変形、またＤＮＡスポットの配置位置のずれがあってもサーボにより、スポットの正確な位置が検出でき、読取ビームが正確にスポットを照射するようにできた。また、読取ビームを高周波で変調することにより、蛍光体の退色を防止し、従来よりも大きな読取レーザピークパワーを照射できるようになった。
特に、マイクロディスク基板を使用した場合は、読取ビームを１次元方向に走査すればよいので、読取速度を早くできる。そのため、ＤＮＡスポットを１回だけ走査すれば読取が完了し、従来の２次元走査による画像化を不要にした。

Claims

基板にプリグルーブを設け、前記少なくともプリグルーブ上にプローブＤＮＡ又は蛋白と接着性が良好な薄膜を設けた上で、前記プリグルーブの凸部または凹部にプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置して、液滴の表面張力及び／又は凹部の場合、凹溝の壁によってグルーブに直角方向の広がりを制限された状態でプリグルーブの接線方向に広がり、その状態でプローブＤＮＡ又は蛋白を前記基板上に固定させていることを特徴とするマイクロアレイディスク。
前記基板にプリグルーブを設け、前記プリグルーブの凸部または凹部に前記プリグルーブの番地情報を設けたことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイディスク。
前記基板上には液滴をスパイラル状、あるいは同心円状に配置することを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイディスク。
前記基板上に回転位相を示すマークを設けたことを特徴とする請求項３記載のマイクロアレイディスク。
前記マイクロアレイディスクにおけるプローブＤＮＡ又は蛋白の設置領域について、そのプリグルーブ上の接線方向の長さがそれに垂直な方向の幅に対して２倍以上であることを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイディスク。
基板上に反射膜を設け、前記反射膜上に前記基板の屈折率より小さく、空気の屈折率よりも大きな光透過膜を少なくとも１層以上設け、前記基板上にプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴をスポッティングしたことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイディスク。
前記基板上に薄膜からなる層を少なくとも１層以上設け、基板側から波長λ１のレーザビームを照射し、プリグルーブの位置を検出するときには前記基板を前記照射したレーザビームの一部は透過し、前記基板上に配置された液滴を計測するために、検出波長λ２のレーザビームを基板の反対側から照射したときには、一部が反射することを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイディスク。
前記基板上のプリグルーブの凸部または凹部に、プローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置するために、１）前記プリグルーブの位置を検出する機構、２）プローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を吐出できる機構により、プリグルーブ上にプローブＤＮＡ又は蛋白を含む液滴を配置することを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイディスクを作成するためのスポッティング装置。
前記プリグルーブに対物レンズを経由してレーザ光を照射し、反射光を第１の光検出器により受光し、前記対物レンズの出射光が前記プリグルーブに追従するように前記対物レンズの位置を制御可能にしたトラッキングサーボを構成したうえ、前記プリグルーブにプローブＤＮＡ又は蛋白を含むスポッティング液を吐出する装置を設け、前記吐出装置の吐出口と前記プリグルーブの相対位置を検出するために、前記プリグルーブを透過した光を検出する第２の、少なくとも２分割セルを有する光検出器を設け、前記第２の光検出器の２分割セルの各出力の差を得るための差動増幅器出力を用い、前記トラッキングサーボを構成する光学ブロックと、前記吐出装置と第２の光検出器を一体に移動制御するトラバースユニットモータを駆動制御し、前記吐出装置から吐出するスポッティング液を前記プリグルーブ上に配置することを特徴とする請求項８記載のスポッティング装置。
プローブＤＮＡ又は蛋白を含むスポッティング液を入れたタンクに前記スポッティング液の名前を読み取るための標識を設け、スポッティング時にスポッティング装置により前記標識を読み取り、前記スポッティング液をアドレス情報を有するプリグルーブ上に、スポッティングし、前記標識および前記アドレス情報の対応関係をスポッティングしたディスク上に記録したことを特徴とする請求項８記載のスポッティング装置。