JPWO2005052190A1 - ドーパミン産生ニューロン特異的マーカーLmx1a - Google Patents
ドーパミン産生ニューロン特異的マーカーLmx1a Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2005052190A1 JPWO2005052190A1 JP2005515811A JP2005515811A JPWO2005052190A1 JP WO2005052190 A1 JPWO2005052190 A1 JP WO2005052190A1 JP 2005515811 A JP2005515811 A JP 2005515811A JP 2005515811 A JP2005515811 A JP 2005515811A JP WO2005052190 A1 JPWO2005052190 A1 JP WO2005052190A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- gene
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9406—Neurotransmitters
- G01N33/9413—Dopamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Steering Control In Accordance With Driving Conditions (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
Abstract
Description
Millonig et al.(2000)Nature 403:764−769 Failli et al.(2002)Mechanisms of Development 118(1−2):225−228 Kitada et al.(2001)The 2001 meeting on Physiologycal Genomics and Rat Models Kitada et al.(2001)The 15th international mouse genome conference Kitada et al.(2000)第17回日本疾患モデル動物学会記録
<1>ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
以下の(1)〜(6)のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む方法。
(1)配列番号:13記載の塩基配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
<2>ポリヌクレオチドが、少なくとも15塩基長を有する、上記<1>記載の方法。
<3>以下の(1)〜(6)のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するための試薬。
(1)配列番号:13記載の塩基配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
<4>ポリヌクレオチドが、少なくとも15塩基長を有する、上記<3>記載の試薬。
<5>ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
下記(1)から(6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む、方法。
(1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
<6>一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、上記<5>記載の方法。
<7>下記(1)から(6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するための試薬。
(1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
<8>一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、上記<7>記載の試薬。
<9>ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
(a−1)配列番号:13記載の塩基配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(a−4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(b)Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHからなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
<10>さらに(c)DATおよびADH2から選択された一方の遺伝子若しくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、上記<9>記載の方法。
<11>(b)工程において、選択された遺伝子がLmx1b、Nurr1、またはEn1のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、上記<9>記載の方法。
<12>ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
(a−1)配列番号:13記載の塩基配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(a−4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(b)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
<13>ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列である、上記<9>乃至上記<12>記載の方法。
<14>上記<3>または上記<4>記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
<15>上記<3>または上記<4>記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
<16>ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
(a−1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(a−4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(b)Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHからなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
<17>さらに(c)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、上記<16>記載の方法。
<18>(b)工程において、選択された遺伝子がLmx1b、Nurr1、またはEn1のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、上記<16>記載の方法。
<19>ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
(a−1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(a−4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(b)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
<20>一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、上記<16>乃至上記<19>記載の方法。
<21>上記<7>または上記<8>記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
<22>上記<7>または上記<8>記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
<23>ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
(a)ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた後の前記細胞に、以下の(b−1)〜(b−6)に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを接触させて、Lmx1a遺伝子の転写産物を検出する工程
(b−1)配列番号:13記載の塩基配列
(b−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(b−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(b−4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(b−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(b−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(c)Lmx1a遺伝子の転写産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
<24>ポリヌクレオチドが少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列である、上記<23>記載の方法。
<25>ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
(a)ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた後の前記細胞に、下記(b−1)から(b−6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を接触させて、Lmx1a遺伝子翻訳産物を検出する工程、
(b−1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(b−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(b−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(b−4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(b−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(b−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(c)Lmx1a遺伝子の翻訳産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
<26>一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、上記<25>記載の方法。
本発明の「ドーパミン産生ニューロンマーカーポリヌクレオチドプローブ」は、増殖前及び増殖後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞、並びにドーパミン産生ニューロンを選択及び/または検出するマーカーとして使用されるものである。該ポリヌクレオチドは、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から成体におけるドーパミン産生ニューロンまで、全ての分化段階を通じて発現するLmx1a遺伝子の発現を検出できるものである。Lmx1a遺伝子の塩基配列は公知である。例えば、マウスLmx1aの配列は、Nature 403:764−769(2000)、Nature 420:563−573(2002)及びMech.Dev.118:225−228(2002)等の文献を参照することができ、GenBankにもAccession番号NM_033652として登録されている。またヒトLmx1aは、Gene 290:217−225(2002)に報告されている。ヒトLmx1aのゲノム配列はGenBank Accession番号AH011517として登録されており、6A変異体(GenBank Accession番号NM_177398)等のアイソフォームも報告されている。
また、同様にヒトについてもLmx1aの配列が知られており(配列番号:15、17)、ヒトLmx1aのmRNAに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドと縮重の関係を有するポリヌクレオチド、さらにはヒトLmx1a遺伝子(配列番号:15、17)に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブに含まれる。
本発明により、ドーパミン産生ニューロンの組織免疫染色等に利用することができる抗Lmx1a抗体が提供される。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFv)(Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−83;The Pharmacology of Monoclonal Antibody,Vol.113,Rosenburg and Moore ed.,Springer Verlag(1994)pp.269−315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al.(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:58−62;Paulus(1985)Behring Inst.Mitt.78:118−32;Millstein and Cuello(1983)Nature 305:537−9;Zimmermann(1986)Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.105:176−260;VanDijk et al.(1989)Int.J.Cancer 43:944−9)、並びに、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fv等の抗体断片が含まれる。さらに本発明の抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、GST、緑色蛍光蛋白質(GFP)等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることもできる。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。
本発明によりドーパミン産生ニューロンを選択的に検出する方法が提供された。分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞から成熟ドーパミン産生ニューロンを含む全ての分化段階のドーパミン産生ニューロンをLmx1aの発現を指標として検出することができる。本発明のポリヌクレオチドまたは抗体を用いたドーパミン産生ニューロンを検出する方法は、パーキンソン病等、ドーパミン産生ニューロンの脱落が関連する疾患の診断において使用することができる。ドーパミン産生ニューロンは、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体を用いて検出することができる。
例えば、前駆細胞と成熟ニューロンとの選別は、マーカーとしてLmx1aと、DATおよび/またはADH2とを組合せることにより実施することができる。Lmx1a遺伝子は上述の通り分裂前の前駆細胞から成熟ドーパミン産生ニューロンまでの分化において広範囲で発現が確認されている。一方、DAT、ADH2遺伝子は、後述する実施例に示す通りドーパミン産生ニューロンへ分化した後に発現する。したがって、Lmx1a遺伝子の発現を本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは本発明の抗体により検出するともに、Lmx1a遺伝子の発現が検出された細胞における、DAT遺伝子、ADH2遺伝子の一方または双方の発現を解析することにより、前駆細胞と成熟したニューロンとを区別して検出・選択を行うことができる。
(a)Lmx1a遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
(b)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
(a)Lmx1aのアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程
(b)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
(b)工程では、成熟ドーパミン産生ニューロンに分化した細胞であるかを検討するために、DATおよび/またはADH2遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づき検討する。
このDAT遺伝子の発現を転写産物に基づいて検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、DATmRNAを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたDAT検出用ポリヌクレオチドは、DATmRNAにハイブリダイズし得る(1)DATcDNA(配列番号39、41)に相補的な塩基配列からなるRNA、DNA、(2)DAT遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号:40、42に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA、RNA、(3)配列番号:39、41に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるDNA、RNAが挙げられる。一方、翻訳レベルでDAT遺伝子の発現を検出する場合には、DATと結合する抗体を用いる。DATと結合する抗体としては、(1)DATポリペプチド(配列番号:40または42)、(2)DATポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号:40または42)において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または(3)これら(1)または(2)のポリペプチドのうち少なくとも6アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHは、前駆細胞のうち、分裂停止後に発現する遺伝子群である。そのため、これら遺伝子の発現は、分裂停止後の前駆細胞を見分ける際に利用し得る。一方、Lmx1a遺伝子は、分裂停止前の増殖中の前駆細胞においても発現している。そのため、Lmx1a遺伝子を発現し、かつ(b)Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3またはTHが発現していない細胞を検出・選択することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のうちでも分裂停止前の増殖前駆細胞の検出・選択が可能となる。
(a)Lmx1a遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
(b)Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHからなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
(a)Lmx1a遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
(b)Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHからなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
(b)工程では、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のうち分裂停止後の前駆細胞を見分けるために、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHからなる群より選択される1または複数の遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づいて解析する。
これら(b)工程で使用し得るマーカー遺伝子のうち、Lmx1b、Nurr1、En1をマーカーとして選択することが好ましい。これら三つの遺伝子の発現は、分裂停止後直ちに検出することができることから、前駆細胞の分裂停止前後の細胞をより正確に区別して検出、選択することが可能となる。
上記においては、(a)Lmx1a遺伝子発現検出工程、(b)Lmx1b等のマーカー遺伝子発現検出工程の順で説明をしたが、本方法はこの順に制限されるものではない。
Lmx1a遺伝子発現の検出と、Lmx1b等のマーカー遺伝子発現検出を異なる標識等を用いて同時行ってもよい。また、Lmx1b等のマーカー遺伝子発現検出の後にLmx1a遺伝子発現の検出を行ってもよい。この場合、Lmx1b等のマーカー遺伝子発現が検出されなかった細胞群に対して、Lmx1a遺伝子を発現する群を選択することにより、増殖前駆細胞を選択することができる。
一例を示せば、先ず、Lmx1a遺伝子の発現を上述したプローブまたは抗体等を用いて検出し、ドーパミン産生ニューロンおよび前駆細胞を選択する。次いで、Lmx1a遺伝子発現を指標に選択された細胞群のうち、DAT遺伝子またはADH2遺伝子の発現をそれぞれのプローブまたは抗体等により検討する。ここで、DAT遺伝子またはADH2遺伝子の発現が検出された細胞は、成熟ドーパミン産生ニューロンとして検出・選択される。一方、DAT遺伝子またはADH2遺伝子の発現が検出されなかった細胞群は、さらにLmx1b等のマーカー遺伝子の発現を検討する。ここで、Lmx1b等のマーカー遺伝子の発現が検出された細胞は分裂停止後の前駆細胞であり、Lmx1b等のマーカー遺伝子の発現が検出されなかった細胞は分裂停止前増殖前駆細胞であると、識別することができる。なお、本発明におけるドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞の選択・検出方法は、ここで示した検出の順序には制限されることはなく、検出工程の順序は任意に決定することができる。
Lmx1aは比較的早い発生段階からドーパミン産生ニューロン特異的に発現するマーカーであるので、ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニングにおいて利用することも考えられる。即ち、適当な細胞試料に被験物質を作用させ、Lmx1aの発現を検出することにより、該被験物質にドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力があるかどうかを決定することができる。従って、本発明はLmx1aの発現を指標とするドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供するものである。Lmx1aの発現は、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗Lmx1a抗体のいずれかを用いて検出することができる。
Lmx1aの発現制御領域は、Lmx1aの遺伝子配列を利用してゲノムDNAから公知の方法によってクローニングすることができる。例えば、S1マッピング法のような転写開始点の特定方法(細胞工学 別冊8 新細胞工学実験プロトコール,東京大学医科学研究所制癌研究部編,秀潤社(1993)pp.362−374)が公知であり、利用できる。一般に、遺伝子の発現制御領域は、遺伝子の5’末端の15〜100bp、好ましくは30〜50bpをプローブDNAとして利用して、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによりクローニングすることができる。このようにして得られるクローンは、10kbp以上の5’非翻訳領域を含むものであるので、次にエキソヌクレアーゼ等により処理し短縮化または断片化する。最後に、短縮された発現制御領域の候補を含む配列部分をレポーター遺伝子を利用して、その発現の有無、強さ、制御等について評価し、Lmx1a発現制御領域の活性維持のための最小必要単位を決定することができる。
ホメオボックス遺伝子がコードする蛋白質では類似した60アミノ酸残基から成る配列が保存されている。この保存された領域はホメオドメインと呼ばれ、ホメオドメインをコードするDNA領域はホメオボックスと称される。ホメオドメインはヘリックス・ターン・ヘリックス構造をとるDNA結合ドメインを構成し、DNAの二本鎖の溝に入り込み特定の塩基配列に結合する。それによりホメオボックス遺伝子の産物は、他の遺伝子の転写を活性化または不活性化する転写因子として機能すると考えられている。一方、LIMドメインは6つのシステインと1つのヒスチジンの位置が保存された60アミノ酸残基からなる、Znフィンガーと類似した構造を示す。Znフィンガーと異なりDNA結合能は検出されておらず、蛋白質間の相互作用に関与していると考えられている。LIMドメインが、ホメオドメインと分子内結合することにより、ホメオドメインの機能を抑制し、活性化蛋白質がLIMドメインと結合することによりホメオドメインがDNA結合活性を示すようになると考えられている。
Lmx1a遺伝子は、LIMドメインを持つホメオボックス遺伝子であることから、in vivoにおいて活性化蛋白質と結合して他の遺伝子の転写を制御していると考えられる。従って、Lmx1aと結合する蛋白質は、ドーパミン産生ニューロンのin vivo、ex vivo及びin vitroにおける分化、成熟及び/または機能を制御するのに利用できる可能性がある。Lmx1aに対する結合蛋白質の同定においては、まず、Lmx1aと候補蛋白質とを接触させ、結合の有無を検定する。この際、Lmx1aを担体に固定することもできる。候補蛋白質は特に限定されるものではない。例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、海洋生物由来の天然成分、各種細胞の抽出物、公知化合物及びペプチド、植物由来の天然成分、生体組織抽出物、微生物の培養上清、並びにファージディスプレイ法等によりランダムに製造されたペプチド群(J.Mol.Biol.222:301−10(1991))が挙げられる。しかしながら、in vivoにおいて、実際にLmx1aと相互作用している蛋白質を探す上では、特にドーパミン産生ニューロンにおいて発現している蛋白質を候補蛋白質とすることが好ましい。また、結合の検出を容易にするために、候補蛋白質は標識しても良い。
本発明により、Lmx1aが増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から分裂停止後までの全ての分化段階を含むドーパミン産生ニューロンに発現されることが明らかにされた。その結果、Lmx1aは、ドーパミン産生ニューロンのin vivoにおける分化、成熟及び/または機能に関与していることが考えられた。従って、Lmx1a遺伝子の発現を阻害するものは、ドーパミン産生ニューロンのin vivo、ex vivo及びin vitroにおける分化、成熟及び/または機能を制御するのに利用できる可能性がある。遺伝子の発現を阻害し得るものとして、例えば、アンチセンス、リボザイム及び2本鎖RNA(small interfering RNA;siRNA)が挙げられる。従って、本発明はこのようなアンチセンス、リボザイム及び2本鎖RNAを提供するものである。
Lmx1a発現を抑制するために、siRNAは公知の方法により細胞に導入することができる。例えば、siRNAを構成する二本のRNA鎖を、一本鎖上にコードするDNAを設計し、該DNAを発現ベクターに組み込み、細胞を該発現ベクターで形質転換し、siRNAをヘアピン構造を有する二本鎖RNAとして細胞内で発現させることができる。トランスフェクションにより持続的にsiRNAを産生するプラスミド発現ベクターも設計されている(例えば、RNAi−Ready pSIREN Vector、RNAi−Ready pSIREN−RetroQ Vector(BD Biosciences Clontech))。
siRNAの塩基配列は、例えば、Ambion website(http:///www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)のコンピュータープログラムを用いて設計することができる。機能的siRNAをスクリーニングするためのキット(例えば、BD Knockout RNAi System(BD Biosciences Clontech))等も市販されており利用可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
[実施例1]ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子の単離及び配列解析
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子を単離するために、E12.5マウス中脳腹側領域を背腹方向にさらに二つの領域に切り分けて、ドーパミン産生ニューロンを含む最も腹側の領域に特異的に発現する遺伝子をサブトラクション(N−RDA)法により同定した。単離した断片の一つはLmx1aをコードするcDNA断片であった。Lmx1aは、LIMドメイン及びホメオドメインを含む蛋白質をコードしている。
1.N−RDA法
1−1.アダプターの調製
下記のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、100μMに調製した。
(ad2:ad2S+ad2A、ad3:ad3S+ad3A、ad4:ad4S+ad4A、ad5:ad5S+ad5A、ad13:ad13S+ad13A)
ad2S:cagctccacaacctacatcattccgt(配列番号:1)
ad2A:acggaatgatgt(配列番号:2)
ad3S:gtccatcttctctctgagactctggt(配列番号:3)
ad3A:accagagtctca(配列番号:4)
ad4S:ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt(配列番号:5)
ad4A:acacactcacag(配列番号:6)
ad5S:ccagcatcgagaatcagtgtgacagt(配列番号:7)
ad5A:actgtcacactg(配列番号:8)
ad13S:gtcgatgaacttcgactgtcgatcgt(配列番号:9)
ad13A:acgatcgacagt(配列番号:10)
1−2.cDNA合成
日本SLCより入手したマウス12.5日胚より中脳腹側を切り出し、さらに背腹方向に2つの領域に切り分けた。RNeasy mini kit(Qiagen)を用いて全RNAを調製し、cDNA synthesis kit(TAKARA)を用いて二本鎖cDNAを合成した。制限酵素RsaIで消化したのち、ad2を付加し、ad2Sをプライマーとして、15サイクルのPCRでcDNAを増幅した。増幅条件は72℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を15サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。N−RDAのPCRはすべて以下の反応液組成で行った。
1−3.Driverの作製
ad2Sで増幅したcDNAをさらに5サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を5サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。Qiaquick PCR purification kit(Qiagen)を用いてcDNAを精製し、RsaI消化した。1回のサブトラクションに3μgずつ使用した。
1−4.Testerの作製
ad2Sで増幅したcDNAをさらに5サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を5サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。Qiaquick PCR purification kit(Qiagen)を用いてcDNAを精製し、RsaI消化した。60ngのRsaI消化cDNAにad3を付加した。
1−5.サブトラクション1回目
上記3及び4で作製したTesterおよびDriverを混合し、エタノール沈殿した後に、1xPCR buffer 1μlに溶解した。98℃5分の後、1xPCR buffer+1M NaCl 1μlを加えた。さらに98℃5分の後、68℃で16時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたcDNAをad3Sをプライマーとして10サイクルのPCRで増幅した後(72℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を10サイクル行った)、Mung Bean Nuclease(TAKARA)で消化し、Qiaquick PCR purification kitで精製した。さらに13サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を13サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。
1−6.均一化
サブトラクション1回目で増幅したcDNA 8ngに2xPCR buffer 1μlを加えた。98℃5分の後、1xPCR buffer+1M NaCl 2μlを加えた。さらに98℃5分の後、68℃で16時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたcDNAをRsaIで消化し、Qiaquick PCR purification kitで精製した。これをad3Sをプライマーとして11サイクルのPCRで増幅した後(94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を11サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした)RsaIで消化し、ad4を付加した。
1−7.サブトラクション2回目
上記6でad4を付加したcDNA 20ngをTesterとして、上記3のDriverと混合し、さらに、上記5と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にRsaI消化したcDNAにad5を付加した。
1−8.サブトラクション3回目
上記7でad5を付加したcDNA 2ngをTesterとして、上記3のDriverと混合し、さらに、上記5と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にRsaI消化したcDNAにad13を付加した。
1−9.サブトラクション4回目
上記8でad13を付加したcDNA 2ngをTesterとして、上記3のDriverと混合し、以下、上記5と同様の方法でサブトラクションを行った。増幅したcDNAをpCRII(Invitrogen)にクローニングし、ABI3100シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を解析した。
1.Lmx1aがドーパミン産生ニューロンに発現することを確認するため、以下のプロトコールによりin situハイブリダイゼーションによるLmx1a、Lmx1b、Nurr1及びチロシンヒドロキシラーゼ(TH)のmRNAの発現解析を行った。Nurr1及びTHは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞において、分裂停止後に初めて発現が誘導されることが知られているマーカーである。また、Lmx1bは、増殖前駆細胞の段階では非常に低レベルで発現され、分裂停止後に高レベルに発現し始めることが知られている転写因子マーカーである。
まず、マウス12.5日胚を摘出し4%PFA/PBS(−)で4℃、2時間固定した後、20%ショ糖/PBS(−)で4℃、一晩置換し、OCTで包埋した。厚さ12μmの切片を作製し、スライドガラス上で乾燥させた後に4%PFAで室温30分間再固定した。PBSで洗浄した後、ハイブリダイゼーション(1μg/mlDIG化RNAプローブ、50%ホルムアミド、5xSSC,1%SDS,50μg/ml yeast RNA,50μg/ml Heparin)を68℃で40時間行った。その後、洗浄(50%ホルムアミド、5xSSC,1%SDS)を68℃で行い、RNase処理(0.05μg/ml RNase)を室温5分間行った。0.2xSSCで68℃の洗浄、1xTBSTで室温の洗浄ののち、ブロッキング(Blocking reagent:Roche)を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体(DAKO)を4℃で一晩反応させ、洗浄(1xTBST、2mM Levamisole)の後、NBT/BCIP(DAKO)を基質として発色させた。
抗Lmx1aポリクローナル抗体は、まず免疫に必要な抗原をLmx1aの271−307アミノ酸にあたるDNA領域とGSTをfusionさせたvectorをE.coli(JM109株)にTransformした後IPTGによって発現誘導して回収を行った。回収後、ウサギに免疫を行った後に採血し、その血清から免疫に用いたGST−Lmx1a抗原によるaffinity精製を行うことによって得られた。
マウス12.5日胚を摘出し4%PFA/PBS(−)で4℃、2時間固定したのち、20%ショ糖/PBS(−)で4℃、一晩置換し、OCTで包埋した。厚さ12μmの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で30分乾燥させ、PBS(−)で再び湿潤させた。その後、ブロッキング(ブロックエース)を室温、30分間行い、一次抗体を室温、1時間反応させた後、さらに4℃、一晩反応させた。0.1%Tween−20/PBS(−)で、室温、15分間の洗浄を3回行った。次に蛍光標識した2次抗体を室温、1時間反応させ、同様に洗浄を行った後、PBS(−)によって室温、10分間洗浄し、封入した。
その結果、in situハイブリダイゼーションと同様の発現パターンが認められた(図3及び4)。Lmx1a蛋白質は、E12.5中脳においてmRNAだけでなく蛋白質としても発現していることが明らかになった。TH及びEn1との二重染色の結果では、Lmx1aのこれらの蛋白質との同一細胞での共発現が確認され、発現領域も背−腹方向で完全に一致することが明らかになった(図3及び4)。TH及びEn1と比べLmx1aは脳質側にも発現が認められた。この領域は将来ドーパミンニューロンに分化する増殖前駆細胞が存在する領域(脳質領域(Ventricular Zone(VZ))である。
3.そこで、Lmx1aが増殖前駆細胞に発現することを確認するために、マウスE12.5中脳におけるBrdUの取込みとLmx1aの発現を免疫染色法により検出した。
マウスE12.5胎児を摘出する2時間前に妊娠マウスの腹腔へBrdU(sigma)を注入し(10mg/ml in 0.9% saline injected to give 50ug/g body weight)、増殖細胞のDNA中へBrdUを取り込ませた。通常の免疫染色と同様に切片を作成し、まず抗Lmx1a抗体を用いてLmx1aタンパクを検出した後、再固定(2%PFA、室温、30分)、塩酸処理を施し(2N HCl、37℃、30分)、引き続いて抗BrdU抗体を用いてBrdUを検出した。
その結果、VZ領域のLmx1a陽性細胞の多くでBrdUが取込まれていることが明らかになった(図5)。
4.出生後のマウスのドーパミン産生ニューロンにおけるLmx1a発現についても調べた。マウスE12.5胚に代えて、出生後7日目(P7)の中脳の切片を用い、比較するマーカーとしてドーパミン産生ニューロンマーカーDATを使用した以外、上記1.の方法によりLmx1aのマウスP7中脳における発現を検出した。DATは、ドーパミン産生ニューロンの成熟が進んで初めて発現することが知られているマーカーである。
その結果、DATの発現する領域でLmx1aが発現していることが明らかになった(図6)。
5.さらに、ヒトにおいてもLmx1aがドーパミン産生ニューロン特異的に発現するかについて、成体脳領域RNAを用いたRT−PCRを行うことにより調べた。
Clontech社より購入したヒト脳各種領域total RNA 1μgに対して、RNA PCR kit(TaKaRa)を用いてcDNA合成を行った。このうち10ng、1ng、0.1ng相当分のcDNAを鋳型に用いて以下の反応系でPCRを行った。
2分インキュベートした。N−RDAのPCRはすべて以下の反応液組成で行った。
94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で30秒の反応を37サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。
以下の配列のプライマーを使用した。
Human Lmx1a:TGAAGAAAGTCTCTGCAAGTCAGCCC(配列番号:11)/
CACCACCGTTTGTCTGAGCAGAGCTC(配列番号:12)
その結果、ヒトにおいてもLmx1aはドーパミン産生ニューロンの存在する中脳黒質領域に発現することが明らかになった(図7)。また、海馬等他の脳領域においてもマウスと同様の発現を示し、成体のドーパミン産生ニューロンにおいても発現が維持されていることが明らかになった。
以上の結果をもとにLmx1aのドーパミン産生ニューロンにおける発現のタイミングを他のドーパミン産生ニューロンマーカーと比較した(図8)。Lmx1aは、増殖中の前駆細胞の段階から分裂停止後も、さらには成体において発現が維持される。一方、公知のNurr1、En1、Ptx3及びTHは分裂停止後に初めて発現が誘導され、DAT及びADH2は発現が進んで初めて発現を開始する。Lmx1bは増殖前駆細胞でも発現が認められるが、非常に発現レベルが低く、分裂停止後に高レベルで発現する。このように公知のマーカーと発現パターンを異にするLmx1aは、ドーパミン産生ニューロンの検出において有用なマーカーとなる。
Claims (26)
- ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
以下の(1)〜(6)のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む方法。
(1)配列番号:13記載の塩基配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列 - ポリヌクレオチドが、少なくとも15塩基長を有する、請求項1記載の方法。
- 以下の(1)〜(6)のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するための試薬。
(1)配列番号:13記載の塩基配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列 - ポリヌクレオチドが、少なくとも15塩基長を有する、請求項3記載の試薬。
- ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
下記(1)から(6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む、方法。
(1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列 - 一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、請求項5記載の方法。
- 下記(1)から(6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するための試薬。
(1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列 - 一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、請求項7記載の試薬。
- ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
(a−1)配列番号:13記載の塩基配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(a−4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(b)Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHからなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。 - さらに(c)DATおよびADH2から選択された一方の遺伝子若しくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、請求項9記載の方法。
- (b)工程において、選択された遺伝子がLmx1b、Nurr1、またはEn1のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、請求項9記載の方法。
- ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
(a−1)配列番号:13記載の塩基配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(a−4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列(ヒト)からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(b)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。 - ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した15塩基を有する塩基配列である、請求項9乃至12記載の方法。
- 請求項3または4記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
- 請求項3または4記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
- ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
(a−1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(a−4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(b)Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3およびTHからなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。 - さらに(c)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、請求項16記載の方法。
- (b)工程において、選択された遺伝子がLmx1b、Nurr1、またはEn1のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、請求項16記載の方法。
- ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
(a)下記(a−1)から(a−6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
(a−1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(a−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(a−4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(a−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(a−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(b)DATおよびADH2から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。 - 一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、請求項16乃至19記載の方法。
- 請求項7または8記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
- 請求項7または8記載の試薬と、Lmx1b、Nurr1、En1、Ptx3、TH、DATおよびADH2からなる群より選択された1または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび/またはその前駆細胞を識別するためのキット。
- ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
(a)ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた後の前記細胞に、以下の(b−1)〜(b−6)に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを接触させて、Lmx1a遺伝子の転写産物を検出する工程
(b−1)配列番号:13記載の塩基配列
(b−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(b−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(b−4)配列番号:15または17記載の塩基配列
(b−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
(b−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
(c)Lmx1a遺伝子の転写産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。 - ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した15塩基を有する塩基配列である、請求項23記載の方法。
- ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
(a)ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた後の前記細胞に、下記(b−1)から(b−6)のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を接触させて、Lmx1a遺伝子翻訳産物を検出する工程、
(b−1)配列番号:14記載のアミノ酸配列
(b−2)配列番号:14記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(b−3)配列番号:13記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(b−4)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列
(b−5)配列番号:16または18記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
(b−6)配列番号:15または17記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
(c)Lmx1a遺伝子の翻訳産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。 - 一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した6アミノ酸残基を有する、請求項25記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003395493 | 2003-11-26 | ||
JP2003395493 | 2003-11-26 | ||
PCT/JP2004/017574 WO2005052190A1 (ja) | 2003-11-26 | 2004-11-26 | ドーパミン産生ニューロン特異的マーカーLmx1a |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2005052190A1 true JPWO2005052190A1 (ja) | 2007-12-06 |
JP4236270B2 JP4236270B2 (ja) | 2009-03-11 |
Family
ID=34631489
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005515811A Expired - Fee Related JP4236270B2 (ja) | 2003-11-26 | 2004-11-26 | ドーパミン産生ニューロン特異的マーカーLmx1a |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8187804B2 (ja) |
EP (1) | EP1712638B1 (ja) |
JP (1) | JP4236270B2 (ja) |
CN (1) | CN1906309B (ja) |
AT (1) | ATE433501T1 (ja) |
DE (1) | DE602004021509D1 (ja) |
WO (1) | WO2005052190A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004038018A1 (ja) | 2002-10-22 | 2004-05-06 | Eisai Co., Ltd. | 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 |
WO2004065599A1 (ja) * | 2003-01-24 | 2004-08-05 | Eisai Co., Ltd. | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー |
ES2557157T3 (es) | 2004-07-22 | 2016-01-22 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Marcador de célula precursora de neurona que produce la dopamina Lrp4/Corina |
EP1838841A2 (en) * | 2004-12-23 | 2007-10-03 | The Ludwig Institute for Cancer Research | Engineered dopamine neurons and uses thereof |
US20100203505A1 (en) * | 2005-08-18 | 2010-08-12 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | DOPAMINERGIC NEURON PROLIFERATIVE PROGENITOR CELL MARKER Msx1/2 |
CA2627593C (en) | 2005-08-18 | 2012-04-24 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | Dopaminergic neuron proliferative progenitor cell marker nato3 |
WO2007119759A1 (ja) | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー187a5 |
WO2011144901A1 (en) | 2010-05-20 | 2011-11-24 | The University Of Newcastle Upon Tyne | Expansion and directed differentiation of epidermal neural crest stem cells |
EP2635111B1 (en) * | 2010-11-05 | 2018-05-23 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Stabilized step function opsin proteins and methods of using the same |
EP2737057B1 (en) * | 2011-07-27 | 2018-10-24 | Kyoto University | Novel markers for dopaminergic neuron progenitor cells |
CN103275935B (zh) * | 2012-12-12 | 2015-09-23 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法 |
DK3042951T3 (en) | 2013-09-05 | 2019-04-15 | Univ Kyoto | UNKNOWN PROCEDURE FOR INducing DOPAMINE-PRODUCING NEURAL PRECURSOR CELLS |
EP3447130A4 (en) | 2016-04-22 | 2019-11-13 | Kyoto University | METHOD FOR PRODUCING DOPAMINE-PROPERING NEURAL PRESERVATOR CELLS |
JP2019106895A (ja) | 2017-12-15 | 2019-07-04 | インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ | 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法 |
CN117202914A (zh) * | 2021-04-21 | 2023-12-08 | 上海跃赛生物科技有限公司 | 一种质控和富集人多巴胺能神经前体细胞的方法 |
CN114716508B (zh) * | 2022-04-12 | 2023-10-10 | 中山大学 | 靶向dat蛋白的多肽及其应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2381065C (en) * | 2000-06-01 | 2007-06-05 | Japan Science And Technology Corporation | Method for enrichment and/or isolation of dopaminergic neurons |
US20020192194A1 (en) | 2000-12-05 | 2002-12-19 | Mcgrogan Michael | Production and use of dopaminergic cells to treat dopaminergic deficiencies |
AU2002355292A1 (en) * | 2001-07-26 | 2003-02-17 | Incyte Genomics, Inc. | Nucleic acid-associated proteins |
WO2004038018A1 (ja) | 2002-10-22 | 2004-05-06 | Eisai Co., Ltd. | 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 |
AU2003302457A1 (en) | 2002-11-28 | 2004-06-18 | Eisai Co., Ltd. | Mammalian prickle gene |
WO2004065599A1 (ja) | 2003-01-24 | 2004-08-05 | Eisai Co., Ltd. | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー |
EP1838841A2 (en) * | 2004-12-23 | 2007-10-03 | The Ludwig Institute for Cancer Research | Engineered dopamine neurons and uses thereof |
-
2004
- 2004-11-26 AT AT04819438T patent/ATE433501T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-11-26 JP JP2005515811A patent/JP4236270B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-26 US US10/580,989 patent/US8187804B2/en active Active
- 2004-11-26 WO PCT/JP2004/017574 patent/WO2005052190A1/ja active Application Filing
- 2004-11-26 EP EP04819438A patent/EP1712638B1/en active Active
- 2004-11-26 CN CN2004800410208A patent/CN1906309B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-26 DE DE602004021509T patent/DE602004021509D1/de active Active
-
2012
- 2012-01-17 US US13/352,241 patent/US8580523B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1712638A1 (en) | 2006-10-18 |
CN1906309B (zh) | 2011-12-14 |
JP4236270B2 (ja) | 2009-03-11 |
US20070254281A1 (en) | 2007-11-01 |
DE602004021509D1 (de) | 2009-07-23 |
WO2005052190A1 (ja) | 2005-06-09 |
US8187804B2 (en) | 2012-05-29 |
EP1712638A4 (en) | 2007-10-03 |
ATE433501T1 (de) | 2009-06-15 |
US8580523B2 (en) | 2013-11-12 |
CN1906309A (zh) | 2007-01-31 |
EP1712638B1 (en) | 2009-06-10 |
US20120178083A1 (en) | 2012-07-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8580523B2 (en) | Specific marker Lmx1a on dopaminergic neurons | |
US9994816B2 (en) | Lrp4/corin dopamine-producing neuron precursor cell marker | |
US8232052B2 (en) | Methods of selecting a dopaminergic neuron proliferative progenitor cells using Lrp4/Corin markers | |
JP4118877B2 (ja) | 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 | |
JP2008545402A (ja) | 神経変性疾患の診断及び治療ターゲットとしてのkcnn3 | |
JP2008508893A (ja) | 形質膜atpアーゼの診断及び治療への使用 | |
JP4618736B2 (ja) | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー | |
JP2008546379A (ja) | 神経変性疾患のための診断および治療の標的adarb2タンパク質 | |
JP4731487B2 (ja) | Corl1遺伝子を標的とした脊髄神経細胞の種類を識別する方法 | |
JP4717797B2 (ja) | Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー | |
JP4085117B2 (ja) | 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081210 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4236270 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111226 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111226 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121226 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131226 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |