CN114716508B - 靶向dat蛋白的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶向DAT蛋白的多肽及其应用，为克服现有的DAT非多肽类有机合成小分子药物与靶蛋白亲和力能力有限等不足，本发明基于“一珠一化合物(One Bead One Compound，OBOC)”的原则筛选了靶向DAT蛋白的高亲和力、高选择性的多肽，该多肽的氨基酸序列为IYRDYN,YRDNWN,LYGHKP,LKHWES,TTEHPA,WHDAET中的至少一种，所述靶向DAT蛋白的多肽可用于诊断帕金森病；同时，所述靶向DAT蛋白的多肽在低浓度时对多巴胺能神经元细胞的生长增殖具有促进作用，有望用于治疗帕金森病。

Description

靶向DAT蛋白的多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶向DAT蛋白的多肽及其应用。
背景技术
帕金森病是一种以静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡障碍为主要特征且缓慢进展的中枢神经系统退行性疾病。而多巴胺转运体蛋白(DAT)属于SLA3C6家族的钠离子依赖性跨膜转运蛋白，主要作用是将突触间隙中的多巴胺重摄取进突触前膜中，对于维持突触间隙中的多巴胺的浓度起着重要的作用。
有研究表明，多巴胺能神经毒素MPP+等物质是通过DAT进入神经元的，且早期PD病人的DAT水平明显降低。因此，DAT是常用的多巴胺能神经元示踪靶点。目前，帕金森病的早期诊断主要借助医学显像技术，包括突触后的多巴胺(DA)受体显像和突触前的多巴胺转运蛋白(DAT)显像，其中DAT显像比DA显像能更早更及时地反馈多巴胺能系统的变化。因此，选择一种好的DAT检测方法对PD的早期诊断和治疗具有重要的意义。
目前，国内外以DAT为靶点研究仅限于非多肽类的有机合成小分子，而且这些小分子药物存在着水溶性差、与靶蛋白亲和力能力有限等缺点，很大程度的限制了小分子的应用价值。同时，当前针对DAT多肽类药物的研究非常有限，而多肽具有水溶性好，药理活性强、生物相容性好等优势，相比于小分子药物更有优势。由于针对疾病相关分子靶点的活性化合物的识别是早期药物发现中的一项非常重要的任务，且高通量筛选活性先导药物是实现这一目的的重要方法。因此，构建以DAT蛋白为靶点的高效药物筛选方法，快速发现亲和力高、特异性强的靶向多肽类药物，并从中开发能有效诊断或治疗PD的药物具有非常重要的研究意义与社会价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供靶向DAT蛋白的多肽，所述多肽与DAT蛋白具有高亲和力、高选择性，可应用于诊断和/或治疗帕金森病。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了靶向DAT蛋白的多肽，所述的多肽包括SEQ ID NO:1～6所示的六种多肽中的至少一种。
SEQ ID NO:1～6对应的氨基酸序列分别为IYRDYN,YRDNWN,LYGHKP,LKHWES,TTEHPA,WHDAET(编号分别为C2、C3、C4、C5、C6、C9)。
本发明还提供了靶向DAT蛋白的多肽在制备诊断和/或治疗帕金森病的产品中的应用，所述靶向DAT蛋白的多肽包括SEQ ID NO:1～6所示的六种多肽中的至少一种。
优选地，所述靶向DAT蛋白的多肽包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示的多肽中的至少一种。
研究表明，多肽(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6)在细胞中也能够靶向DAT蛋白，进一步说明其能够靶向细胞上的DAT蛋白而实现帕金森病的诊断或治疗。
优选地，所述产品包括但不限于药品、食品、保健品、检测试剂、试剂盒。
本发明还提供了一种用于诊断帕金森病的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1～6所示的六种多肽中的至少一种。
本发明还提供了一种用于治疗帕金森病的药物，所述药物包括SEQ ID NO:1～6所示的六种多肽中的至少一种。
优选地，所述的试剂盒或药物中，所述多肽选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6所示的多肽中的至少一种。
优选地，所述用于治疗帕金森病的药物中，还包括能与SEQ ID NO:1～6所示的任意一种或多种多肽起协同增效作用的其他帕金森病药物。
进一步地，其他帕金森病药物包括天然药物、化学药物或生物药物。
优选地，所述用于治疗帕金森病的药物中，还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述辅料包括常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。
本发明还提供了所述靶向DAT蛋白的多肽的筛选方法，即首先利用“分列-聚合”策略和多肽固相合成法构建六肽化合物库，然后所得的六肽化合物库与DAT蛋白孵育，筛选具有特异性结合DAT蛋白的六肽。
本发明通过多肽固相合成法与“分-聚”策略的辅助构建OBOC化合物库，其包含了204条不同序列的六肽，用于筛选靶向DAT的结合多肽。然后通过OBOC高通量筛选，快速识别与鉴定与DAT相互作用的高亲和力多肽序列，并通过体外细胞实验进一步表征多肽与DAT蛋白的结合，确证本发明中保护的多肽可作为靶向DAT蛋白帕金森病诊断试剂或治疗药物。
优选地，所述DAT蛋白标记有His标记。
优选地，采用化学染色方法筛选具有特异性结合DAT蛋白的六肽。
优选地，所述六肽库的合成方法包括以下步骤：
S1：将树脂与ANP(3-氨基-3(2-硝基苯基)丙酸)、O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、二异丙基乙胺(DIEA)混合进行偶联反应，反应后清洗；
S2：往步骤S1中清洗后的树脂中再加入Fmoc-R(L型精氨酸)、TBTU、DIEA混合进行偶联反应，反应后清洗；
S3：对步骤S2清洗后的树脂进行脱保护，再加入Fmoc-PEG、TBTU、DIEA混合进行偶联反应，反应后清洗；
S4：对步骤S3中清洗后的树脂均分后再加入Fmoc-氨基酸、TBTU、DIEA混合进行偶联反应，反应后清洗；
S5：将步骤S4中清洗后的树脂全部混合，然后重复步骤S4，直至第六个Fmoc-氨基酸完成偶联反应；然后加入三氟乙酸-水-三异丙基硅烷，多虑、清洗和干燥后即得。
本发明提供的靶向DAT蛋白的多肽的筛选方法，相比于普通的小分子化合物库，OBOC多肽库数量以及种类更为丰富，为发现活性药物提供更大的可能性，并且不需要对化合物单独合成纯化，克服了传统筛选方法步骤繁琐、筛选速度慢和效率低的缺点，具有效率高、样本含量大、成本低廉的特点。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
为克服现有的DAT非多肽类有机合成小分子药物与靶蛋白亲和力能力有限等不足，本发明基于“一珠一化合物(One Bead One Compound，OBOC)”的原则筛选了靶向DAT蛋白的高亲和力、高选择性的多肽，该多肽的氨基酸序列为IYRDYN,YRDNWN,LYGHKP,LKHWES,TTEHPA,WHDAET中的至少一种，所述靶向DAT蛋白的多肽可用于诊断帕金森病；同时，所述靶向DAT蛋白的多肽在低浓度时对多巴胺能神经元细胞的生长增殖具有促进作用，有望用于治疗帕金森病。
附图说明
图1为通过OBOC方法筛选得到阳性多肽的实验图；
图2为靶向DAT蛋白的多肽C4的HPLC图；
图3为靶向DAT蛋白的多肽C4的质谱图；
图4为靶向DAT蛋白的多肽C5的HPLC图；
图5为靶向DAT蛋白的多肽C5的质谱图；
图6为靶向DAT蛋白的多肽C9的HPLC图；
图7为靶向DAT蛋白的多肽C9的质谱图；
图8为Rhodamine修饰的靶向DAT蛋白的多肽C4的HPLC图；
图9为Rhodamine修饰的靶向DAT蛋白的多肽C4的质谱图；
图10为Rhodamine修饰的靶向DAT蛋白的多肽C5的HPLC图；
图11为Rhodamine修饰的靶向DAT蛋白的多肽C5的质谱图；
图12为Rhodamine修饰的靶向DAT蛋白的多肽C9的HPLC图；
图13为Rhodamine修饰的靶向DAT蛋白的多肽C9的质谱图；
图14为人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞在不同浓度的靶向DAT蛋白的多肽C4下的存活率图；
图15为人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞在不同浓度的靶向DAT蛋白的多肽C5下的存活率图；
图16为人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞在不同浓度的靶向DAT蛋白的多肽C9下的存活率图；
图17为Rhodamine修饰的靶向DAT蛋白的多肽与DAT蛋白在细胞中的荧光共定位实验结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1靶向DAT蛋白的抗肿瘤多肽的筛选
1、六肽库的合成
利用全自动多肽合成仪Titan 357(AAPPTEC)合成六肽长度的磷酸化酪氨酸多肽化合物库，六肽库的结构通式为：AA6AA5AA4AA3AA2AA1-PEG-R-ANP，(AA代表任一种L型天然氨基酸，R为L型精氨酸，ANP为3-氨基-3(2-硝基苯基)丙酸)。所述六肽库的通过“分列-聚合”的方法在TentaGel S-NH2树脂上以Fmoc固相法合成，具体如下：
(1)首先称取一定量(1g)的树脂放置在聚合容器内(CV)，用4mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液溶胀30min，抽干溶液后加入4倍当量ANP，4倍当量的O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和4倍当量的二异丙基乙胺(DIEA)，避光反应2h后用NMP洗涤4次；抽干溶液后再加入4倍当量Fmoc-R，4倍当量的TBTU和4倍当量的DIEA，避光反应2h后用NMP洗涤4次；再加入4mL含有20％哌啶的NMP溶液反应30min，脱保护，再分别用NMP和二氯甲烷(DCM)溶液各洗4次；抽干溶液后再加入4倍当量Fmoc-PEG，4倍当量的TBTU和4倍当量的DIEA，避光反应2h后用NMP洗涤4次；再加入4mL含有20％哌啶的NMP溶液反应30min，脱保护，再分别用NMP和二氯甲烷(DCM)溶液各洗4次。
(2)将树脂清洗干净后均分至20个反应容器内(RV)，再向RV反应器中加入相对于树脂4倍当量的Fmoc-氨基酸以及4倍当量的TBTU与8倍当量的DIEA，20个RV反应器中各自加入不同的氨基酸(20种天然氨基酸)进行耦联反应。反应4h后，用NMP清洗4次，加入4mL含20％哌啶的NMP溶液脱保护30min，再分别用NMP和DCM溶液各洗4次；以上操作全程避光操作。
(3)再将RV反应器中的树脂转移并合并在CV反应器中，混匀后再次均分至20个RV中并重复步骤(2)的耦联反应过程，继续重复多次直至6个氨基酸耦联结束。反应结束后将树脂转移至反应管中，并加入4mL三氟乙酸-水-三异丙基硅烷(95:2.5:2.5,v/v/v)反应2h，过滤除去溶液，依次用DCM、甲醇、水冲洗9遍后用乙醚洗三次，减压干燥树脂，即得六肽库树脂。
2、蛋白表达纯化
将转染重组质粒(DAT；三羊开肽公司)的大肠杆菌接种于5mL的LB培养基中，并置于37℃，230rpm摇床中过夜培养，次日按照1:100的比例将大肠杆菌接种在200mL培养基中扩大培养，当大肠杆菌生长达至OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达(IPTG的工作浓度为0.5mM)，加入IPTG后在20℃，230rpm摇床中继续培养16h。
诱导表达结束后，将培养基于4500rpm下离心10～15min，弃去菌液上清，收集大肠杆菌沉淀，PBS重悬沉淀后，利用超声破碎细菌外壳，然后在4℃条件下以4000rpm的转速离心45min，将含有蛋白的上清液加到含有Ni-NTA树脂(His标签纯化树脂)的层析柱中，4℃下旋转反应2h。
先用含20mM咪唑的PBS溶液大量冲洗柱中树脂，冲洗8～10遍后再加入2mL含250mM咪唑的PBS溶液洗脱目标蛋白，重复6遍。最后用超滤管进行蛋白换液与浓缩，并测定蛋白浓度(需要的蛋白浓度为100nM)，获得DAT蛋白用于后续的高通量筛选。
3、一珠一化合物(OBOC)磁珠筛选
OBOC筛选实验主要是利用化学染色的方法区别阳性和阴性的多肽珠。如果多肽与蛋白间有高亲和力，带His标记的蛋白与多肽结合并附着在肽珠的表面，然后与偶连碱性磷酸酶(AP)的His抗体结合，碱性磷酸酶可以将BCIP水解成吲哚化合物，而吲哚化合物在空气中二聚形成靛蓝并附着在肽珠上，从而使肽珠产生相应的颜色，最后将分离出阳性的肽珠转移到96孔板上，供后续的实验分析。
具体方法为：将合成的六肽库树脂转移到Bio-Spin柱(0.8mL)中，然后用HBST缓冲液洗3遍，并置于封闭溶液(含0.05％NaN3和0.1％BSA的PBS溶液)中在25℃、360°摇床上封闭培养1h。然后将液体排干，再加入HBST缓冲液(含1％(w/v)BSA)，并加入His-Tag蛋白(终浓度为100nM)，在4℃、360°摇床上孵育过夜。再将液体排干，用His-AP缓冲液将树脂洗涤两次，并向柱中加入0.8mL Anti His-AP缓冲液【含有1μL Anti His-AP(1mg/mL)】，轻轻混合后在4℃下孵育20分钟。再将液体排干，分别用400μL的His-AP缓冲液、400μL的HBST缓冲液和400μL的AP底物缓冲液洗涤树脂两次。之后将树脂转移到35mm的培养皿中，加入1.5mLAP底物缓冲液，60μL 25×NBT/BCIP染色液(先加NBT混匀后再加BCIP)孵育30-45分钟。再加入2mL 0.1M HCl终止反应。最后将树脂转移回Bio-Spin柱中，用水洗涤树脂九次，并在显微镜下用微量移液管手动从中挑选出阳性树脂珠子至于96孔板中。
4、阳性多肽剪切与质谱测序
在96孔板的每孔中加入10μL超纯水，然后将96孔板用薄膜密封，置于365nm紫外下辐射15min，将所得溶液置于45℃离心真空下浓缩2.5h；每孔分别加入7μL含4％α-氰-4-羟基肉桂(CHCA)的乙腈/水(1:1)溶液和7μL含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(1:1)溶液，得到混合物。取2.5μL混合物点在384孔MALDI板上，将得到的平板晾干15min，然后使用Bruker公司的ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF仪器的FlexControl软件，通过自动采集方法获得每条多肽的质谱。在FlexAnalysis软件中手动识别每个质谱的母峰，并将其复制到FlexControl中的数据表中，以自动获取MS/MS谱图。最后用PEAKS软件对肽序列进行半自动分析，筛选得到靶向DAT蛋白的亲和力多肽(如图1所示)，多肽C2、C3、C4、C5、C6、C9的HPLC结果和质谱结果分别如图2-13所示；多肽C2、C3、C4、C5、C6、C9的序列如表1所示：
表1 亲和力多肽序列
编号 多肽序列
C2 IYRDYN(SEQ ID NO:1)
C3 YRDNWN(SEQ ID NO:2)
C4 LYGHKP(SEQ ID NO:3)
C5 LKHWES(SEQ ID NO:4)
C6 TTEHPA(SEQ ID NO:5)
C9 WHDAET(SEQ ID NO:6)
5、合成筛选到的多肽
通过多肽的固相合成方法，取100mg Rink Amide-AM树脂，用2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，抽干溶液后，按上文筛选得到的多肽序列，加入4倍当量Fmoc氨基酸，4倍当量的O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和4倍当量的二异丙基乙胺(DIEA)，常温反应2h后用DMF和DCM各洗涤3次，再加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液反应30min，脱保护，再分别用DMF和二氯甲烷(DCM)溶液各洗4次，上述操作重复六次，直到第六个氨基酸合成完成。
所得多肽用DMF、DCM分别冲洗三次，再用甲醇冲洗2-3次，室温放置让甲醇挥发干燥树脂。配制95％三氟乙酸(TFA)溶液(95％的TFA+2.5％三异丙基硅烷(TIS)+2.5％水)。加1.5mL的95％TFA溶液，旋转混匀器上反应2h。将含有多肽的TFA溶液进行过滤，除去树脂固体，溶液转移至干净EP管内。用氮气吹去所有的TFA。加入8-10mL冰乙醚，放入-80℃中冷藏过夜，进一步沉淀析出所有的多肽。3500rpm离心10min，弃去上清乙醚，多肽沉淀在底部。再加入8-10mL冰乙醚重悬固体，同样的，在3500rpm下离心10min，重复两遍。弃去上清后，室温下挥干乙醚多肽合成结束后用LC-MS进行分子量鉴定，最后HPLC分离纯化。
实施例2细胞毒性试验
将人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y按照5000/孔的密度接种在96孔板中，当细胞贴壁培养后，分别加入10μL含500μM、100μM、20μM、4μM、0.8μM多肽(C4,C5,C9)的DMEM培养基溶液，并使多肽的最终工作浓度为50μM、10μM、2μM、0.4μM、0.08μM，继续培养24h，然后往96孔板中每孔加入10μLMTT试剂，继续培养4h后再向96孔板中每孔加入100μL 10％SDS试剂，继续培养4h后用酶标仪测定570nm波长下的吸光度，并计算细胞存活率：细胞存活率＝OD实验组/OD对照组，其中，对照组为加入0μM多肽的细胞培养组。
结果如图(图14-16)所示，多肽C4,C5,C9对人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的生长增殖没有抑制作用，并且随着多肽浓度的降低对生长增殖有促进作用。
实施例3荧光共定位实验
1、罗丹明修饰多肽
通过多肽的固相合成方法，取100mg Rink Amide-AM树脂，用2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶胀30min，抽干溶液后，按上文筛选得到的多肽序列，加入4倍当量Fmoc氨基酸，4倍当量的O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和4倍当量的二异丙基乙胺(DIEA)，常温反应2h后用DMF和DCM各洗涤3次，再加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液反应30min，脱保护，再分别用DMF和二氯甲烷(DCM)溶液各洗4次，上述操作重复六次，直到第六个氨基酸合成完成。
所得多肽再加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液反应30min，脱保护，再分别用DMF和二氯甲烷(DCM)溶液各洗4次，抽干溶液后，加入4倍当量Fmoc-甘氨酸，4倍当量的O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和4倍当量的二异丙基乙胺(DIEA)，常温反应2h后用DMF和DCM各洗涤3次，重复一次；再加入2mL含有20％哌啶的DMF溶液反应30min，脱保护，再分别用DMF和二氯甲烷(DCM)溶液各洗4次，加入2倍当量5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5-TAMRA-SE)，4倍当量的O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和4倍当量的二异丙基乙胺(DIEA)，常温避光反应4h。
所得多肽用DMF、DCM分别冲洗三次，再用甲醇冲洗2-3次，室温放置让甲醇挥发干燥树脂。配制95％三氟乙酸(TFA)溶液(95％的TFA+2.5％三异丙基硅烷(TIS)+2.5％水)。加1.5mL的95％TFA溶液，旋转混匀器上反应2h。将含有多肽的TFA溶液进行过滤，除去树脂固体，溶液转移至干净EP管内。用氮气吹去所有的TFA。加入8-10mL冰乙醚，放入-80℃中冷藏过夜，进一步沉淀析出所有的多肽。3500rpm离心10min，弃去上清乙醚，多肽沉淀在底部。再加入8-10mL冰乙醚重悬固体，同样的，在3500rpm下离心10min，重复两遍。弃去上清后，室温下挥干乙醚多肽合成结束后用LC-MS进行分子量鉴定，最后HPLC分离纯化，以上步骤全程避光操作。
2、荧光共定位实验
将SHSY5Y细胞按照30000个细胞/皿的浓度接种在共聚焦培养皿中，贴壁培养后，除去旧的培养基，加入含有50μM氨基端Rhodamine(罗丹明)修饰多肽(C4,C5,C9)的DMEM培养基溶液，并以DMSO作为阴性对照组，继续培养24h。除去培养基后，用PBS缓冲液清洗三遍，再加入1mL4％多聚甲醛溶液，室温下孵育10min固定细胞。除去多聚甲醛溶液并用PBS缓冲液清洗三遍，再加入1mL含有0.1％Triton的PBS缓冲液孵育10min破膜。除去Triton溶液并用PBS缓冲液清洗三遍，再加入含Anti-DAT抗体(1:500，购于BOSTER公司)的PBST溶液(含有1％BSA和0.1％Tween 20的PBS缓冲液)，4℃摇床上孵育过夜。之后用PBS缓冲液清洗三遍，再加入含荧光二抗(1：5000，购于CST公司)的PBST缓冲液，室温摇床上避光孵育2h。之后用PBS缓冲液清洗三遍，再加入1mL含20μg/mL的DAPI染料(购于Sigma公司)避光孵育3min，之后用PBS缓冲液清洗三遍，最后利用抗荧光淬灭封片剂，用激光共聚焦显微镜对样本进行检测。
结果如图17所示，Rhodamin修饰多肽(红光)在细胞上与DAT蛋白(绿光)有明显的重合，表明多肽(C4,C5,C9)在细胞中也能够靶向DAT蛋白，进一步说明多肽(C4,C5,C9)能够靶向细胞上的DAT蛋白而实现帕金森病的诊断或治疗。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 靶向DAT蛋白的多肽及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> C2(人工序列)
<400> 1
Ile Tyr Arg Asp Tyr Asn
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> C3(人工序列)
<400> 2
Tyr Arg Asp Asn Trp Asn
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> C4(人工序列)
<400> 3
Leu Tyr Gly His Lys Pro
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> C5(人工序列)
<400> 4
Leu Lys His Trp Glu Ser
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> C6(人工序列)
<400> 5
Thr Thr Glu His Pro Ala
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> C9(人工序列)
<400> 6
Trp His Asp Ala Glu Thr
1 5

Claims (5)

1.靶向DAT蛋白的多肽，其特征在于，所述的多肽包括SEQ ID NO:1～6所示的六种多肽中的至少一种。
2.靶向DAT蛋白的多肽在制备诊断帕金森病的产品中的应用，其特征在于，所述靶向DAT蛋白的多肽包括SEQ ID NO:1～6所示的六种多肽中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶向DAT蛋白的多肽包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示的多肽中的至少一种。
4.一种用于诊断帕金森病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1～6所示的六种多肽中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的一种用于诊断帕金森病的试剂盒，其特征在于，所述的多肽选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示的多肽中的至少一种。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1286264A (zh) * 2000-08-15 2001-03-07 中国科学院上海生物化学研究所 胰岛素原相关肽对多巴胺转运蛋白的作用及相关疾病治疗
CN1906309A (zh) * 2003-11-26 2007-01-31 卫材株式会社 特异于产生多巴胺的神经元的标记物Lmx1a
CN102666845A (zh) * 2009-10-16 2012-09-12 不列颠哥伦比亚大学 磷酸酶和张力蛋白同系物（pten）抑制剂组合物，用途以及方法
CN112160033A (zh) * 2020-09-21 2021-01-01 中山大学·深圳 靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用
CN112480211A (zh) * 2020-11-27 2021-03-12 中山大学·深圳 靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2732032B1 (en) * 2011-07-12 2016-05-11 The University of British Columbia Neuroprotective peptides that inhibit interaction between palmitoyl acyl transferase zinc- finger dhhc type containing 17 (zd17) and c-jun n-terminal kinase (jnk)

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1286264A (zh) * 2000-08-15 2001-03-07 中国科学院上海生物化学研究所 胰岛素原相关肽对多巴胺转运蛋白的作用及相关疾病治疗
CN1906309A (zh) * 2003-11-26 2007-01-31 卫材株式会社 特异于产生多巴胺的神经元的标记物Lmx1a
CN102666845A (zh) * 2009-10-16 2012-09-12 不列颠哥伦比亚大学 磷酸酶和张力蛋白同系物（pten）抑制剂组合物，用途以及方法
CN104740614A (zh) * 2009-10-16 2015-07-01 不列颠哥伦比亚大学 磷酸酶和张力蛋白同系物(pten)抑制剂组合物,用途以及方法
CN112160033A (zh) * 2020-09-21 2021-01-01 中山大学·深圳 靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用
CN112480211A (zh) * 2020-11-27 2021-03-12 中山大学·深圳 靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
贾向前.多肽修饰的协同性脂质体在肿瘤成像及靶向给药中的应用研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑.2017,(第10期),参见第1-2页摘要，第9-18页第一章. *
韩秋菊.新生血管亲和性多肽的筛选及功能化脂质体的肿瘤靶向研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑.2017,(第10期),参见第1-2页摘要，第12-19页第一章. *

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