CN112160033A - 靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用 - Google Patents
靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112160033A CN112160033A CN202010996282.0A CN202010996282A CN112160033A CN 112160033 A CN112160033 A CN 112160033A CN 202010996282 A CN202010996282 A CN 202010996282A CN 112160033 A CN112160033 A CN 112160033A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- brd4
- amino acid
- pentapeptide
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Structural Engineering (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了靶向BRD4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用,本发明的微阵列筛选方法,具有原料用量小、通量高、误差小的优点。基于高通量筛选的靶向BRD4‑BD1/BRD4‑BD2结构域的多肽具有高亲和力、高选择性的优点,以及这些多肽在检测或治疗癌症中的作用。所述多肽具有亲和力高、特异性强的特点。而且,本发明首创了运用“一珠一肽”技术筛选BRD4蛋白的高亲和力和高选择性的多肽序列。本发明可以快速建立一个没有任何“偏好性”且种类多样性的多肽化合物库,克服了传统筛选方法步骤繁琐、筛选实验速度慢和效率低的缺点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及靶向BRD4(Bromodomain-4)蛋白的抗肿瘤多肽及其应用,特别涉及靶向BRD4蛋白中的高亲和力多肽及其在抗癌与癌症检测中的应用。
背景技术:
乙酰化赖氨酸的“阅读器”——溴结构域蛋白(Bromodomain,BRDs),是一类能够特异性识别乙酰化赖氨酸的保守蛋白结构域,能够调控基因的表达与功能,已经被报道与多种疾病发生、发展密切相关。BRDs具有高度保守的约110个氨基酸的溴蛋白质功能结构域,包括4个α螺旋片层,形成疏水腔,识别乙酰化的赖氨酸。迄今为止,已发现61种独特的BRDs结构域。根据各BRDs蛋白功能的不同,它们可被划分为8大家族,每个BRDs家族包含不同的成员。大多数的BRDs蛋白都是转录共激活因子,其中,BET(Bromodomain andextraterminal)蛋白家族是一个特殊群体,其特点是N末端包含2个保守的Bromodomains(BD1和BD2),C末端包含1个ET(extra-terminal)结构域。BET家族的溴结构域蛋白已经成为一种重要的药物靶标而受到药物科研工作者的重视。
BRD4作为BET蛋白家族的重要成员之一,已被证实与多种疾病发生相关,包括各种癌症与炎症,是新型的药物靶标,BRD4的抑制剂药物也越来越受到科研界和临床的重视。随着对BRD4抑制剂研究的深入,人们发现作用于BRD4结构域蛋白的小分子抑制剂表现出了很好的抑制肿瘤细胞增殖的活性,且在抗炎、抗自身免疫等方面也表现出了较优的药理作用。但是,现有的BRD4小分子抑制剂存在一个共同的弱点——不能很好区分BRD4和它的同源蛋白,选择性较差,以及抑制剂的抗癌活性有待改进。且小分子药物存在选择性差和特异性低等问题,容易出现“脱靶”效应,易产生较强的毒副作用,进而限制了小分子药物在临床的大规模应用。因此,研发出亲和力高、特异性强的靶向BRD4的BD1和BD2结构域多肽,对获得BRD4的更佳选择性和活性的多肽抑制剂将具有十分重要的意义。
与有机小分子相比,多肽因其具有较大的分子量,在与蛋白质特异性结合位点相互作用时,能更大程度的避免“脱靶”效应,从而减低药物毒副作用,且多肽药物相对与小分子药物具有更高的生物相容性。因此,要研发出特异性识别并结合BRD4的相关癌症的治疗药物成为亟需解决的问题。
发明内容:
本发明目的在于提供一种具有选择性靶向BRD4-BD1/BRD4-BD2结构域的多肽。
本发明又一目的在于提供所述靶向BRD4-BD1/BRD4-BD2结构域的多肽在抗肿瘤的应用。
本发明又一目的在于提供上述靶向BRD4-BD1/BRD4-BD2结构域的高亲和力多肽筛选方法。所述方法是OBOC(One-bead-one-compound,一珠一化合物)筛选方法,包括筛选时设计的多肽数据库及多肽序列格式。
为达到上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明提供了一种多肽化合物库,包括五肽;所述五肽的氨基酸序列为NH2-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2。
本发明又提供了一种构建前面所述多肽化合物库的方法,包括以下步骤:
1)设计含有乙酰化赖氨酸的五肽;
2)合成五肽,所述五肽的氨基酸序列含有光剪切位点、第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸;
3)分离出单个阳性多肽珠;
4)剪切单个阳性多肽珠并测序;
5)构建成氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,并重复步骤3)至步骤4)进行二次筛选获得链状多肽,构建成多肽库;所述链状多肽为五肽。
根据本发明的实施例,步骤1)所述五肽的氨基酸序列为
NH2-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2。
K(Ac)选定在五肽的第三个位置,发明人经过大量靶点的筛选工作后,发现将功能位点K(Ac)放在第三个位置,可以减少两端的修饰对功能位点的影响,有利于后续实验的进行。
根据本发明的实施例,步骤1)所述乙酰化赖氨酸的五肽通式如图1。
其中,A)AA1,AA2,AA4和AA5分别代表常见的20种氨基酸;AA3就是乙酰化的赖氨酸;
B)目标五肽库的种类多样性=20×20×1×20×20=204;
C)聚乙二醇(9原子)(Polyethylene glycol,PEG)作为中间连接体(linker),提高生物兼容性;
D)精氨酸(R)是提高质谱的信号强度;
E)ANP是受光照裂解的连接体(photocleavable linker)(365nm:5-20分钟把多肽从树脂裂解下来);
F)TentaGel树脂是专门用来做合成OBOC多肽库的常用树脂,它在三氟乙酸中稳定,可根据需要加上不同的裂解连接体(cleavable linker);
G)N端是乙酰化的。
根据本发明的实施例,步骤2)通过全自动多肽合成仪通过分-聚-分策略,合成含有光剪切位点(ANP),且第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸的一珠一肽序列。将多肽库与标记了荧光染料的靶标蛋白孵育后,通过COPAS(Complex Object Parametric Analyzer andSorter)的分选系统,以荧光为信号分离出单个阳性多肽珠。
根据本发明的实施例,步骤3)分离使用COPAS分选系统。
根据本发明的实施例,步骤4)使用365nm光源剪切单个阳性多肽珠。
根据本发明的实施例,步骤5)构建成两个氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,并二次筛选;获得链状多肽;
根据本发明的实施例,所述链状多肽的碳端以酰胺基结尾,氮端以乙酰基结尾。
根据本发明的实施例,所述链状多肽通式为:
Ac-NH-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2;所述链状多肽碳端以酰胺基结尾,氮端以乙酰基结尾。
本发明又提供了靶向BRD4-BD1/BRD4-BD2结构域多肽的筛选方法,包括以下步骤:
1)设计含有乙酰化赖氨酸的五肽;
2)合成五肽,所述五肽的氨基酸序列含有光切断位点、第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸;
3)分离出单个阳性多肽珠;
4)剪切单个阳性多肽珠并测序;
5)构建成氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,用于再次筛选获得五肽;
6)通过光剪切获得链状多肽,通过结合力常数KD筛选出靶向BRD4-BD1或BRD4-BD2结构域的多肽。
根据本发明的实施例,步骤1)所述五肽的氨基酸序列为NH2-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2。
根据本发明的实施例,步骤1)所述乙酰化赖氨酸的五肽通式如图1。
其中,A)AA1,AA2,AA4和AA5分别代表常见的20种氨基酸;AA3就是乙酰化的赖氨酸;
B)目标五肽库的种类多样性=20×20×1×20×20=204;
C)聚乙二醇(9原子)(Polyethylene glycol,PEG)作为中间连接体(linker),提高生物兼容性;
D)精氨酸(R)是提高质谱的信号强度;
E)ANP是受光照裂解的连接体(photocleavable linker)(365nm:5-20分钟把多肽从树脂裂解下来);
F)TentaGel树脂是专门用来做合成OBOC多肽库的常用树脂,它在三氟乙酸中稳定,可根据需要加上不同的裂解连接体(cleavable linker);
G)N端是乙酰化的。
根据本发明的实施例,步骤2)通过全自动多肽合成仪通过分-聚-分策略,合成含有光剪切位点(ANP),且第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸的一珠一肽序列。将多肽库与标记了荧光染料的靶标蛋白孵育后,通过COPAS的分选系统,以荧光为信号分离出单个阳性多肽珠。
根据本发明的实施例,步骤3)分离使用COPAS分选系统。
根据本发明的实施例,步骤4)使用365nm光源剪切单个阳性多肽珠。
根据本发明的实施例,步骤5)构建成两个小氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,并二次筛选;获得链状多肽;
根据本发明的实施例,所述链状多肽的氮(N)端以乙酰基结尾,碳(C)端以酰胺基结尾。
根据本发明的实施例,所述链状多肽通式为:
Ac-NH-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2;其碳端以酰胺基结尾,氮端以乙酰基结尾。
根据本发明的实施例,所述多肽的氨基酸序列选自以下至少一种:Ac-KR-K(Ac)-VS、Ac-TG-K(Ac)-WS、Ac-IQ-K(Ac)-RP、Ac-LA-K(Ac)-SF、Ac-DP-K(Ac)-IT和Ac-AD-K(Ac)-DG,包含但不限于上述多肽序列的氨基端乙酰化、泛素化,生物素化修饰等多肽序列。
根据本发明的实施例,所述多肽的氨基酸序列选自以下至少一种:IQ-K(Ac)-RP、KR-K(Ac)-VS、TG-K(Ac)-WS、LA-K(Ac)-SF、DP-K(Ac)-IT、AD-K(Ac)-DG、WR-K(Ac)-PD、IT-K(Ac)-NL、YK-K(Ac)-PY、RH-K(Ac)-LK、GD-K(Ac)-LY、GV-K(Ac)-SR,包含但不限于上述多肽序列的氨基端乙酰化、泛素化,生物素化修饰等多肽序列。
本发明又一方面提供了前面任一所述的多肽在制备诊断或治疗BRD4蛋白介导疾病试剂中的应用。
根据本发明的实施例,所述BRD4为BRD4的BD1结构域或BRD4的BD2结构域。
根据本发明的实施例,所述疾病为肿瘤。
根据本发明的实施例,所述肿瘤为肝癌或肺癌。
本发明又一方面提供了一种药物靶向制剂,制剂的活性成分包括前面所述的多肽。
本发明又一方面提供了一种诊断或治疗肿瘤试剂,所述试剂包括前面所述的多肽。
根据本发明的实施例,所述肿瘤为肝癌、肺癌
根据本发明的实施例,还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明中所使用的OBOC筛选方法是一种高效且快速的筛选方式。OBOC筛选方法通过固相合成法在单个磁珠的各个位点合成或连接一种化合物,快速的建立一个没有任何“偏好性”且种类多样性的化合物库,再通过信号筛选从中筛选出具有目标生理活性的化合物。
本发明将OBOC方法运用在靶向BRD4蛋白的抗肿瘤多肽的筛选中,并在OBOC方法的基础上进行了一珠一化合物形式的优化。然而在运用过程中,发现存在以下问题:多肽主要是通过第三位的乙酰化赖氨酸与目标蛋白的识别并结合,若在磁珠上直接进行多肽合成,由于磁珠的空间位阻容易影响珠肽与目标蛋白的识别与结合,因此在中间引入聚乙二醇作为连接基团以减少空间位阻的影响;合成珠肽时为了减少氨基酸侧链基团对多肽合成的影响,因此在侧链上引入保护基团,筛选后为了结果准确性,需要用酸处理去掉多肽的侧脸保护基团,为防止酸处理的过程中多肽被强酸剪切,因此在TentaGel树脂中引入光切断位点保护多肽不被强酸剪切;通过一珠一化合物筛选方法分离得到单个阳性多肽珠,剪切后进行测序及质谱表征,为提高质谱的信号引入精氨酸,方便进行结果测定。
本发明的有益效果是:
本发明基于高通量筛选鉴定得到靶向BRD4-BD1/BRD4-BD2结构域的高亲和力、高选择性多肽,以及研究这些多肽在检测或治疗癌症中的作用。
本发明能够一次性合成一个巨大的多肽化合物库,克服了传统筛选方法步骤繁琐、筛选实验速度慢和效率低的缺点。而且本发明的“一珠一肽”的多肽序列形式为本发明首创。这种方法可以快速的建立一个没有任何“偏好性”且种类多样性的多肽化合物库。而不需要分别对化合物进行合成和分离纯化,通过此方法能够快速的筛选出于靶向BRD4-BD1/BRD4-BD2结构域的多肽序列,且在多肽序列形式上进行了一系列的优化。
附图说明
图1为乙酰化赖氨酸的五肽通式。
图2为以BRD4-BD2为靶标蛋白构建肽库筛选出的多肽序列直方图。A为第一次筛选所得的多肽序列直方图;B为第二次筛选所得的多肽序列直方图,根据A的结果重新构建氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库进行筛选所得;C为第三次筛选所得的多肽序列直方图。
图3为以BRD4-BD1为靶标蛋白构建肽库筛选出的多肽序列直方图。A为第一次筛选所得的多肽序列直方图;B为第二次筛选所得的多肽序列直方图,根据A的结果重新构建氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,进行筛选所得。
图4为通过OCTET测试多肽结合动力学常数的结果图,其中A-L分别是多肽Ac-KR-K(Ac)-VS、Ac-TG-K(Ac)-WS、Ac-IQ-K(Ac)-RP、Ac-LA-K(Ac)-SF、Ac-DP-K(Ac)-IT、Ac-AD-K(Ac)-DG、Ac-WR-K(Ac)-PD、Ac-IT-K(Ac)-NL、Ac-YK-K(Ac)-PY、Ac-RH-K(Ac)-LK、Ac-GD-K(Ac)-LY和Ac-GV-K(Ac)-SR。
图5为本发明筛选出的5肽的Pull-down实验结果,是不同多肽以及标记蛋白结合。
图6是多肽对非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌细胞Huh7的生长活性的影响,其中包含部分多肽对细胞的抑制率测定,A-F为12条多肽序列在Huh7和A549中的细胞毒性实验;G为tB1-2序列的半抑制率浓度测定;H为B2-1序列的半抑制率浓度测定;I为B1-2序列的半抑制率浓度测定。
图7为多肽在细胞中的荧光共定位实验结果图;其中罗丹明修饰的多肽(红色)在细胞内与BRD4结构域蛋白(绿色)有明显的重合。
具体实施方式
本发明在于提供一种靶向BRD4-BD1与BRD4-BD2结构域的多肽,所述多肽序列为IQ-K(Ac)-RP、KR-K(Ac)-VS、TG-K(Ac)-WS、LA-K(Ac)-SF、DP-K(Ac)-IT、AD-K(Ac)-DG、GD-K(Ac)-LY、WR-K(Ac)-PD、IT-K(Ac)-NL、YK-K(Ac)-PY、GV-K(Ac)-SR、RH-K(Ac)-LK,所述多肽含有乙酰化赖氨酸[K(Ac)]。以及上述任一多肽在制备BRD4蛋白介导的肿瘤治疗试剂中的应用。
本发明首先设计了在筛选过程前需要合成的多肽序列形式,在TentaGel树脂上连接上设计好的功能基团。
本发明中随机选取了20种L型天然氨基酸组成五肽化合物库;此化合物库为第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸,其他四位氨基酸为20种天然氨基酸随机排列组合的五肽序列,表示为NH2-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2,多肽序列种类多达204。
本发明首先使用全自动多肽合成仪,通过固相合成法将氨基酸连接到含有光切断位点的树脂珠上,采用“分-聚-分”策略,合成设计好的五肽化合物库。其次,本发明以Cy3、Cy5的NHS ester活性中间体对靶标蛋白进行染色,将标记了荧光的靶标蛋白与含有乙酰化赖氨酸的五肽化合物库孵育,构建筛选样本——一珠一化合物库。
本发明通过COPAS系统筛选出与荧光靶标蛋白结合的多肽树脂珠:当树脂珠上的多肽与靶标蛋白具有较强结合力时,被荧光标记的蛋白会附着于树脂珠上,使肽珠表面带有荧光,通过荧光信号进行分选。
本发明通过MALDI-TOF/TOF MS对筛选出的多肽序列进行测序,对测序结果进行分析统计后选出高频出现的氨基酸。再重新构建数个小的氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,进行随机组合筛选,再次通过分选系统将阳性结果分选出来,进行二次筛选。
本发明通过基于OCTET分析实验,获得了多肽与靶标蛋白之间的KD值,准确量化多肽与蛋白之间亲和力的大小,为细胞因子的检测提供了更为精准的数据。
本发明还通过细胞实验,进一步表征筛选得到多肽的抗肿瘤效果,确保多肽可作为由BRD4蛋白过量表达导致的肿瘤的候选治疗药物。
实施例1靶向BRD4-BD1结构域多肽
靶向BRD4-BD1结构域多肽,其核心氨基酸序列分别为:Ac-KR-K(Ac)-VS、Ac-TG-K(Ac)-WS、Ac-IQ-K(Ac)-RP、Ac-LA-K(Ac)-SF、Ac-DP-K(Ac)-IT和Ac-AD-K(Ac)-DG。
表1靶向BRD4-BD1结构域的多肽序列
多肽序号 | 多肽的氨基酸序列 |
B1-1 | Ac-KR-K(Ac)-VS(SEQ ID NO.:1) |
B1-2 | Ac-TG-K(Ac)-WS(SEQ ID NO.:2) |
B1-5 | Ac-IQ-K(Ac)-RP(SEQ ID NO.:3) |
B1-6 | Ac-LA-K(Ac)-SF(SEQ ID NO.:4) |
B1-7 | Ac-DP-K(Ac)-IT(SEQ ID NO.:5) |
B1-8 | Ac-AD-K(Ac)-DG(SEQ ID NO.:6) |
实施例2靶向BRD4-BD2结构域多肽
靶向BRD4-BD2结构与多肽,其核心氨基酸序列分别为:GD-K(Ac)-LY、WR-K(Ac)-PD、IT-K(Ac)-NL、YK-K(Ac)-PY、GV-K(Ac)-SR、RH-K(Ac)-LK。
所述多肽含有乙酰化赖氨酸K(Ac),且除第三位氨基酸外,其余位置的氨基酸为L型天然氨基酸。具体操作同实施例1。
表2靶向BRD4-BD2结构域的多肽序列
多肽序号 | 多肽的氨基酸序列 |
B2-1 | Ac-WR-K(Ac)-PD(SEQ ID NO.7) |
B2-2 | Ac-IT-K(Ac)-NL(SEQ ID NO.8) |
B2-3 | Ac-YK-K(Ac)-PY(SEQ ID NO.9) |
B2-4 | Ac-RH-K(Ac)-LK(SEQ ID NO.10) |
B2-5 | Ac-GD-K(Ac)-LY(SEQ ID NO.11) |
B2-6 | Ac-GV-K(Ac)-SR(SEQ ID NO.12) |
实施例3乙酰化赖氨酸多肽的筛选
(1)乙酰化赖氨酸多肽库的合成
本发明选取了20种L型天然氨基酸组成五肽化合物库;此化合物库为第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸,两端氨基酸为20种天然氨基酸排列组合的五肽序列,表示为NH2-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2,多肽序列种类多达204种。通过多肽自动合成仪进行多肽化合物库的合成,而后通过COPAS进行初步筛选及质谱测序后选出在每个位点出现频率较高的氨基酸,进一步构建多肽化合物库。对多肽化合物库进行筛选,得到具有较高亲和力的多肽序列并进行优化。利用全自动多肽合成仪Titan 357(AAPPTec)合成多肽库。通过“分-聚-分”的方法在TentaGel S NH2(90μm,0.29mmol/g,2.86×106Beads/g)树脂上合成所需多肽。
合成方法如下:
首先将树脂放置在聚合容器内(CV)用NMP(氮甲基吡咯烷酮)溶液溶胀2h;
抽干溶液,加入1eq Fmoc-Met(Fmoc基团保护NH2端的化合物),2eq TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯),5eq DIEA(二异丙基乙胺),反应30min后用NMP洗涤4次;
再加入含有20%哌啶的NMP溶液反应15min,重复两次,脱去保护基团(Fmoc),后用NMP和DCM溶液各洗4次。
将磁珠(树脂)彻底清洗干净后均分置20个反应容器内(RV)。在每个RV中加入一种氨基酸及4eq TBTU,8eq DIEA,反应4h后用NMP清洗4次,加入20%哌啶溶液脱保护30min,用NMP和DCM溶液各洗4次。
将所有树脂放置在CV中,混匀后再次均分置20个RV中重复上述步骤,直至合成完5肽。连接第三位氨基酸时,需连接乙酰化赖氨酸,因其为非天然氨基酸,因此需延长偶联时间。反应结束后将树脂转移至反应管中加入三氟乙酸-水-三异丙基硅烷(体积比是95:2.5:2.5)反应2h,过滤除去溶液用DCM,甲醇,水冲洗9遍后用乙醚洗三次,减压干燥树脂。
(2)蛋白表达纯化及蛋白标记
将转染BRD4-BD1重组质粒的大肠杆菌在5mL LB培养基在37℃,230rpm摇床中过夜培养,次日按照1:100的体积比例将大肠杆菌在200mL培养基中扩大培养,大肠杆菌的生长达到OD600=0.6~0.8,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,IPTG的工作浓度为0.1mM。加入IPTG后在16℃、230rpm的摇床中继续培养18~20h。
诱导表达结束后,培养基3500rpm下离心10~15min,弃去菌液上清,收集大肠杆菌沉淀。PBS重悬沉淀后,利用超声破碎细菌外壳,在4℃条件下,4000rpm转速离心30min,将含有蛋白的上清液加到含有Ni-NTA树脂的层析柱中,4℃下旋转反应1h。
先用20mM的咪唑PBS溶液大量冲洗柱中树脂,8~10遍后,加入2mL 250mM咪唑PBS溶液洗脱BRD4-BD1蛋白,重复6~8遍。最后用超滤管进行蛋白换液与浓缩,并测定蛋白浓度。得到纯蛋白溶液,后续用于蛋白标记。
本发明以Cy3的NHS ester活性中间体对靶标蛋白进行染色:将CyTM3monofunctional reacticve dye,溶解在100μL DMSO中,取1μL与200μg BRD4-BD1纯蛋白孵育,在室温下避光孵育1h。通过G50-Spin Column分子筛分离纯化染料标记蛋白,并通过SDS-PAGE进行表征。
(3)OBOC筛选
OBOC筛选实验中用分选仪器COPAS分离出目的多肽珠。COPAS系统主要是利用荧光信号的不同区别阳性和阴性的多肽珠。如果一些多肽结合蛋白很强,有荧光标记的蛋白就会被结合附着在肽珠的表面,从而使肽珠具有相应的荧光。一旦检测器检测到相应的荧光,分选系统就会分离出那个阳性的肽珠到96孔板上,供后续的实验分析。
为了进行筛选,将树脂转移到Alltech容器(8mL,配备过滤器)中,并在封闭溶液中预培养,该封闭溶液包含(0.05%NaN3、0.05%吐温-20和1%BSA),在PBS缓冲液(pH=7.3)中,在25℃的360°摇床上放置1h。后将液体排干,把用染料标记的蛋白添加到最终浓度为100nM的溶液中,并在4℃的360°摇瓶上孵育过夜。将液体排干,然后用封闭溶液将树脂洗涤三次,再用0.05%吐温-20在PBS缓冲液中依次洗涤三次。洗涤后,将珠子转移到COPAS Plus(Union Biometrica)的样品容器中,并用200mL PBS缓冲液(0.05%吐温20)稀释(pH=7.4)。之后会对树脂进行两次分选,阳性的珠子被直接分为96锥形孔板。
(4)多肽的剪切,质谱测序
用氩气吹扫96孔筛分珠板15min,然后在每孔中加入CNBr(10μL,0.5M,0.2N盐酸溶液)。经氩气/氮气吹扫15min后,将96孔板用薄膜密封,置于微波辐射下1min,所得溶液在45℃离心真空下浓缩2.5h。每孔分别加入2μL基质溶液(2mg CHCA,250μL DI H2O,250μLNH4H2PO4(1mM),500μL CH3CN,0.5μL TFA。将1μL混合物点在384孔MALDI板上,将得到的平板晾干15min。使用基质辅助激光解析飞行时间质谱(ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS)(Bruker公司),采集获得每条多肽的质谱,并识别质谱的母峰,获取MS/MS谱图以及进行半自动分析。
(5)多肽合成
筛选获得亲和力较好的多肽序列后,采用Fmoc固相合成法合成多肽化合物库的多肽。
树脂:Fmoc氨基酸:TBTU:DIEA的摩尔比是1:4:4:8。
实验步骤如下:
1.膨胀树脂:称取0.1g的Fmoc-Rink Amide树脂至反应器中(根据合成需要改变重量),加入约2-5mL的DMF,放置0.5~1h使树脂膨化。
2.脱Fmoc保护基团:抽滤去除管内溶剂,加入约2-3mL的20%哌啶/DMF溶液,旋转混匀器上反应1h。
3.冲洗:抽去反应器内的溶液,分别用DMF、DCM(二氯甲烷)、DMF冲洗,共冲洗9遍。
4.偶联氨基酸:预先准备好Fmoc-氨基酸、TBTU固体并混合,加入2-4mL的DMF溶剂,并加入DIEA充分混匀震荡溶解氨基酸和TBTU,并放置2~3min,再将混合溶液加至反应器中,旋转混匀器上反应2h。(针对Arg,Trp和非天然氨基酸,适当延长反应时间至3-4h)
5.冲洗:抽去反应器内的液体,分别用DMF、DCM、DMF冲洗,共冲洗9遍。
6.重复步骤2-5偶联其他氨基酸,直至完成最后一个氨基酸的偶联和脱保护。
7.完成最后一个氨基酸偶联和脱保护之后,在多肽的N端连接(Biotin)-GG(即生物素-甘氨酸-甘氨酸-),用于后续Pull down实验;在多肽的N端连接乙酰基,用于封闭氨基端,减少后续实验非特异性干扰。
8.剪切树脂:多肽用DMF、DCM分别冲洗三次后,用甲醇冲洗2~3次,室温放置让甲醇挥发干燥树脂。配制95%三氟乙酸(TFA)溶液(95%的TFA+2.5%三异丙基硅烷(TIS)+2.5%水)。根据产物的量加适量的95%TFA溶液(约1~2mL,不需要加太多)旋转混匀器上反应2-3h(若多肽中含有精氨酸时间延长至3-4h)。
9.冰乙醚沉淀多肽:将含有多肽的TFA溶液进行过滤,除去树脂固体,溶液转移至干净EP管内。用氮气吹去所有的TFA。加入8-10mL冰乙醚,放入-80℃中冷藏过夜,进一步沉淀析出所有的多肽。
10. 3500rpm离心10min,弃去上清乙醚,多肽沉淀在底部。再加入8-10mL冰乙醚重悬固体,同样的,在3500rpm下离心10min,重复两遍。弃去上清后,室温下挥干乙醚。
11.多肽合成结束后用LC-MS进行分子量鉴定,最后HPLC分离纯化。
多肽的动力学测试:
OCTET-Red系统(美国ForteBio公司)是基于生物膜干涉技术开发的一种仪器,用于使用光纤传感器实现自动、无标签、实时检测分子间的相互作用。简言之,此方法通过将链霉亲和素生物传感器(FortéBio,Fremont,USA)放置在微孔板中,并测量生物膜厚度(nm)随着时间(s)的变化。首先用动态缓冲液(1mM磷酸盐,15mM NaCl,0.1mg/ml BSA,0.002%Tween-20)冲洗传感器300s结果作为基线,然后传感器用含有生物素化的多肽200μL培养基固定600s,之后传感器在动态缓冲液中再清洗600s,将传感器暴露在一系列稀释的蛋白样品中,在同一分析中以200μL的体积运行。BSA作为阴性对照。
(6)Pull-down实验
选择步骤(5)中氮端带有生物素修饰的多肽,将过量的生物素化多肽添加到链霉亲和素琼脂糖树脂中,并在300μL PBS中培养2h。使用PBS和PBST(0.05%)洗涤树脂3-4次以除去游离的多肽。向已结合多肽的链霉亲和素琼脂糖树脂中加入染料标记蛋白,室温孵1h,重复孵育2次,以达到充分结合。使用PBS和PBST(0.05%)充分洗涤树脂后,加入30μL 1×蛋白上样缓冲液,在100℃下煮沸10min变性。通过SDS-page电泳实验,获得荧光凝胶电泳图像,荧光图像采用染料标记蛋白,为Cy3标记的BRD4-BD1。
实施例4抗肿瘤活性验证
(1)细胞毒性实验:
将肝癌细胞Huh7(来源于中科院细胞库),非小细胞肺癌细胞A549按照5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中,细胞贴壁培养后加入工作浓度为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、0μM的多肽继续培养24h,96孔板中每孔加入10μL MTT试剂,3h后加入SDS-Hcl溶解甲臜,用酶标仪测定570nm波长下的吸光度。处理数据计算多肽对抑制Huh7细胞的IC50值。
细胞抑制率(%)=OD(实验组-空白组)/OD(对照组-空白组)×100%。
(2)荧光共定位实验:
分别将肝癌细胞Huh7以及非小细胞肺癌细胞A549,分别按照3000个细胞/皿接种在共聚焦培养皿中,贴壁培养后,除去旧的培养基,加入含有20μM氨基端罗丹明修饰的多肽的DMEM培养基,DMSO作为阴性对照组,继续培养24h。除去培养基后,用PBS缓冲液清洗三遍,加入1mL 4%多聚甲醛溶液室温下孵育0.5h固定细胞。除去多聚甲醛溶液并用PBS缓冲液清洗三遍,再加入含有0.1%Triton的PBS缓冲液孵育10min破膜。除去Triton溶液并用PBS缓冲液清洗三遍,加入含Anti-BRD4抗体(1:1000,购于ABcam公司)的PBST溶液(含有1%BSA和0.1%Tween 20的PBS缓冲液),4℃摇床上孵育过夜。之后用PBS缓冲液清洗三遍,加入含荧光二抗(1:5000,购于CST公司)PBST缓冲液,室温摇床上避光孵育2h。之后用PBS缓冲液清洗三遍,加入含20μg/mL DAPI染料(购于Sigma公司)避光孵育3min,之后用PBS缓冲液清洗三遍,最后用抗荧光淬灭封片剂。用激光共聚焦显微镜对样本进行检测。
实施例5
一种诊断或治疗肿瘤试剂,包括GD-K(Ac)-LY、WR-K(Ac)-PD、IT-K(Ac)-NL、YK-K(Ac)-PY、GV-K(Ac)-SR、RH-K(Ac)-LK的至少一条多肽;所述肿瘤为肝癌和肺癌,还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学·深圳
<120> 靶向BRD4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Arg Lys Val Ser
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Thr Gly Lys Trp Ser
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Gln Lys Arg Pro
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Leu Ala Lys Ser Phe
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Asp Pro Lys Ile Thr
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ala Asp Lys Asp Gly
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Trp Arg Lys Pro Asp
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ile Thr Lys Asn Leu
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Tyr Lys Lys Pro Tyr
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Arg His Lys Leu Lys
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Gly Asp Lys Leu Tyr
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Gly Val Lys Ser Arg
1 5
Claims (10)
1.一种多肽化合物库,其特征在于,包括五肽;所述五肽的氨基酸序列为NH2-AA5-AA4-K(Ac)-AA2-AA1-CONH2;其中,K(Ac)为乙酰化赖氨酸。
2.一种构建权利要求1所述多肽化合物库的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)设计含有乙酰化赖氨酸的五肽;
2)合成五肽,所述五肽的氨基酸序列含有光剪切位点、第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸;
3)通过与标记了荧光的BRD4靶标蛋白结合,以荧光为分选信号进行筛选,分离出能与蛋白结合的单个阳性多肽珠;
4)剪切单个阳性多肽珠并测序;
5)构建成氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,并重复步骤3)至步骤4)进行二次筛选获得链状多肽,用于进一步实验确证。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤3)分离使用COPAS分选系统。
4.靶向BRD4-BD1/BRD4-BD2结构域多肽的筛选方法,包括以下步骤:
1)设计含有乙酰化赖氨酸的五肽;
2)固相合成五肽,所述五肽的氨基酸序列含有光剪切位点、第三位氨基酸为乙酰化赖氨酸;
3)分离出单个阳性多肽珠;
4)剪切单个阳性多肽珠并测序;
5)构建成氨基酸序列热图,合成集中组合多肽化合物库,用于再次筛选获得候选五肽;
6)合成步骤5)的候选五肽,通过动力学实验表征结合力常数KD筛选出靶向BRD4-BD1或BRD4-BD2结构域的高亲和力多肽。
5.根据权利要求4所述的筛选方法,其特征在于,步骤6)所述链状多肽的氮端(或N端)为乙酰基修饰,碳端(或C端)以酰胺基结尾。
6.靶向BRD4-BD1结构域多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列选自以下至少一种:Ac-KR-K(Ac)-VS、Ac-TG-K(Ac)-WS、Ac-IQ-K(Ac)-RP、Ac-LA-K(Ac)-SF、Ac-DP-K(Ac)-IT和Ac-AD-K(Ac)-DG,包含但不限于上述多肽序列的氨基端乙酰化、泛素化,生物素化修饰等多肽序列。
7.靶向BRD4-BD2结构域多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列选自以下至少一种:WR-K(Ac)-PD、IT-K(Ac)-NL、YK-K(Ac)-PY、RH-K(Ac)-LK、GD-K(Ac)-LY、GV-K(Ac)-SR,包含但不限于上述多肽序列的氨基端乙酰化、泛素化,生物素化修饰等多肽序列。
8.权利要求6-7任一所述的多肽在制备由BRD4蛋白导致的相关疾病的诊断或治疗试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述应用,其特征在于,所述BRD4为BRD4的BD1结构域蛋白或BRD4的BD2结构域蛋白。
10.一种药物靶向制剂,其特征在于,制剂的活性成分包括权利要求6-7任一所述的多肽。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010996282.0A CN112160033B (zh) | 2020-09-21 | 2020-09-21 | 靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010996282.0A CN112160033B (zh) | 2020-09-21 | 2020-09-21 | 靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112160033A true CN112160033A (zh) | 2021-01-01 |
CN112160033B CN112160033B (zh) | 2022-06-17 |
Family
ID=73862530
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010996282.0A Active CN112160033B (zh) | 2020-09-21 | 2020-09-21 | 靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112160033B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114452372A (zh) * | 2021-09-17 | 2022-05-10 | 厦门大学 | 一种具有抗癌作用的多肽组合物及其应用 |
CN114716508A (zh) * | 2022-04-12 | 2022-07-08 | 中山大学 | 靶向dat蛋白的多肽及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1386747A (zh) * | 2001-05-17 | 2002-12-25 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种多肽——组蛋白h4-10.01和编码这种多肽的多核苷酸 |
WO2007115180A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-11 | William Marsh Rice University | Fullerene assisted cell penetrating peptides |
US20120114670A1 (en) * | 2007-10-02 | 2012-05-10 | University Of Rochester | Methods and compositions related to synergistic responses to oncogenic mutations |
US20140044770A1 (en) * | 2012-07-18 | 2014-02-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and Methods for Modulating BRD4 Bioactivity |
JP2018115138A (ja) * | 2017-01-20 | 2018-07-26 | 富比積生物科技股▲分▼有限公司 | テトラペプチド−3 gekgまたはペンタペプチド−3 gekgfにより変形性関節症を治療するための新規用途 |
-
2020
- 2020-09-21 CN CN202010996282.0A patent/CN112160033B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1386747A (zh) * | 2001-05-17 | 2002-12-25 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种多肽——组蛋白h4-10.01和编码这种多肽的多核苷酸 |
WO2007115180A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-11 | William Marsh Rice University | Fullerene assisted cell penetrating peptides |
US20120114670A1 (en) * | 2007-10-02 | 2012-05-10 | University Of Rochester | Methods and compositions related to synergistic responses to oncogenic mutations |
US20140044770A1 (en) * | 2012-07-18 | 2014-02-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and Methods for Modulating BRD4 Bioactivity |
JP2018115138A (ja) * | 2017-01-20 | 2018-07-26 | 富比積生物科技股▲分▼有限公司 | テトラペプチド−3 gekgまたはペンタペプチド−3 gekgfにより変形性関節症を治療するための新規用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HIROAKI ITOH等: "Development of a high-throughput strategy for discovery of potent analogues of antibiotic lysocin E", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
SHAOYUN LI等: "High-throughput screening for identification of selective peptide-based BRD4 inhibitors and their application in anti-cancers and protein detection", 《第十一届全国化学生物学学术会议论文摘要》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114452372A (zh) * | 2021-09-17 | 2022-05-10 | 厦门大学 | 一种具有抗癌作用的多肽组合物及其应用 |
CN114452372B (zh) * | 2021-09-17 | 2024-01-02 | 厦门大学 | 一种具有抗癌作用的多肽组合物及其应用 |
CN114716508A (zh) * | 2022-04-12 | 2022-07-08 | 中山大学 | 靶向dat蛋白的多肽及其应用 |
CN114716508B (zh) * | 2022-04-12 | 2023-10-10 | 中山大学 | 靶向dat蛋白的多肽及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112160033B (zh) | 2022-06-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112160033B (zh) | 靶向brd4蛋白的抗肿瘤多肽及其应用 | |
RO112336B1 (ro) | Banca de biooligomeri, metoda de obtinere si metoda pentru determinarea unei secvente | |
JP2001501170A (ja) | タンパク質分解酵素の基質および阻害剤 | |
CN110511269B (zh) | 一种与muc4蛋白特异性结合的靶向多肽zp-16在制备药物中的用途 | |
JP2000500497A (ja) | コラーゲン様ペプトイド残基含有構造物 | |
US20190194358A1 (en) | Synthetic Antibodies | |
CN111233977A (zh) | 一种抑制破骨细胞分化的订书肽及其制备方法和应用 | |
US6878804B1 (en) | Synthesis of template-fixed β-hairpin loop mimetics | |
CN114053427A (zh) | 一种多肽靶向药物及其制备方法和应用 | |
CN111040020B (zh) | 一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用 | |
CN112480211B (zh) | 靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽及其应用 | |
Zhang et al. | Backbone‐Installed Split Intein‐Assisted Ligation for the Chemical Synthesis of Mirror‐Image Proteins | |
CN111393519B (zh) | 作为krasg12c/sos1抑制剂的新型订书肽及其用途 | |
WO2002090985A1 (fr) | Plateau a peptide immobilise et procede d'analyse de proteine cible au moyen de celui-ci | |
Vidal et al. | Solid‐phase synthesis and cellular localization of a C‐and/or N‐terminal labelled peptide | |
CN110804087B (zh) | 一种整合素αvβ3靶向的AIE荧光化合物及其制备与应用 | |
CN113307849A (zh) | 一种靶向肿瘤干细胞标志物cd133的订书肽及其应用 | |
Tapia et al. | Evaluating the coupling efficiency of phosphorylated amino acids for SPOT synthesis | |
CN112062829A (zh) | 依降钙素的制备方法 | |
CN112358531B (zh) | 靶向her2蛋白的多肽及其应用 | |
CN113616807B (zh) | 一种靶向线粒体的多肽及其制备方法与应用 | |
CN114891069A (zh) | 特异性靶向mCNα的二元环肽配体及其获得方法 | |
CN114716508B (zh) | 靶向dat蛋白的多肽及其应用 | |
CN114591400A (zh) | 一组靶向FoxM1-DBD多肽及其应用 | |
CN110981938A (zh) | 靶向grb2 sh2结合域的抗肿瘤多肽及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |