JPWO2003064668A1 - 新規微生物、その産生物及びその利用 - Google Patents

Abstract

本発明は、良好なメラニン生成抑制作用を有する（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドを産生する新規な微生物エンテロバクター エスピー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ２０株および同菌株により産生されるα−Ｌ−ラムノピラノシド化合物を提供する。本発明に係る新規微生物は、土壌より分離されたグラム陰性の桿菌であり、極鞭毛により運動性を有する。好気的条件下、培養温度は１０〜３７℃、培地のｐＨは約５〜９、通常１〜７日程度培養することにより産生されるα−Ｌ−ラムノピラノシド化合物は、安全性が高く、安定な美白剤として有用である。

Description

技術分野
本発明はチロシナーゼ阻害活性に基づくメラニン産生抑制作用を有し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス、肝斑等の予防および改善に有効な新規化合物（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドを産生する能力を有する新規微生物、並びに同微生物が産生するチロシナーゼ阻害活性に基づくメラニン産生抑制作用を有し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス、肝斑等の予防および改善に有効な新規化合物、及びこれを含有する皮膚外用薬、殊に美白剤に関するものである。
背景技術
皮膚の色素沈着には、シミやソバカス等から肝斑等の皮膚病によるものまで様々なものがある。これらの作用機序としては、一般的に日焼けやホルモン異常等により、表皮細胞に存在する細胞メラノサイトにおいて生成された色素メラニンが隣接細胞に拡散・沈着するものと考えられている。このメラノサイトでのメラニン生成の第一段階である酵素チロシナーゼの生成を抑制すること、あるいは酵素チロシナーゼを直接阻害することがメラニン色素産生の抑制に重要である。従来より用いられてきたコウジ酸やアルブチンは、本作用を有する代表的な薬剤である。また、酵素チロシナーゼの作用により生じたドーパやドーパキノンから酵素的または非酵素的酸化作用でメラニンが生成するが、その過程を阻害することもメラニン生成の抑制に有効である。その代表的な薬剤として、アスコルビン酸、ハイドロキノン等がある。
しかしながら、従来の薬剤では必ずしも充分な効果が得られていないのが実情である。化粧料あるいは皮膚外用剤の原料として、今なお安全性が高く、良好なメラニン産生抑制作用を有する美白剤の創製が望まれている。
発明の開示
本発明者らは、天然に存在する多くの微生物が産生する物質につき、鋭意検討した結果、エンテロバクター属に属する新種の微生物が、優れたチロシナーゼ阻害活性及びメラニン産生抑制作用を有する物質を産生することを見出した。そして、該微生物の培養物から新規な（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシド（以下、化合物（Ｉ）と略記する）を単離することに成功した。次いで、この化合物（Ｉ）が優れた色素沈着の予防および改善効果を有し、本化合物を配合することにより良好な美白効果を発揮する安全性の高い美白剤が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、第一に、メラニン産生抑制作用を有し、美白剤として有用な（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドまたはその塩、第二に、これを含有する皮膚外用剤、特に美白剤、第三に、（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドを産生する能力を有する新規微生物エンテロバクター エスピー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ２０株に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明につき詳述する。
本発明に係る新規微生物は、土壌より分離されたエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌であり、次の菌学的性状を有する。
１）形態的性質
本菌株は、グラム陰性の桿菌であり、極鞭毛により運動性を有する。細胞の大きさは０．８〜１．１×１．０〜２．２μｍである。胞子の形成は認められない。
２）培養的性質
肉汁寒天培地上で、薄黄茶色のコロニーを形成する。コロニーは円形で表面はスムースである。肉汁液体培養では、培地表面に皮膜を形成し、培地全体が混濁した。肉汁ゼラチン穿刺培養で、ゼラチンの液化は認められなかった。リトマスミルクでの培養では、１週間培養後、凝固およびペプトン化は認められなかった。
３）生理学的性質
Ｂ２０株の生理的性質（１）
先ず、本菌株の生理的特性等について、表１にまとめて示す。

Ｂ２０株の生理的性質（２）
次に、各種糖類からの酸産生の特性について、表２としてまとめて示す。

Ｂ２０株の生理的性質（３）
炭素源の資化性について、表３として、まとめて示す。

以上の微生物学的性質をまとめると、本菌株はグラム陰性の通性嫌気性桿菌で運動性を有する。生育温度範囲は１０〜３７℃で、硝酸塩の還元、脱窒反応、ＭＲ試験、クエン酸の利用性、カタラーゼ試験が陽性である。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ガラクトース、マルトース、トレハロース、ラクトース、サリシン、グリセリン、セロビオースより酸を産生し、ＯＦテストの結果は発酵型である。一方、ＶＰ試験、インドールの生成、硫化水素の生成、ウレアーゼ、オキシダーゼ試験、アルギニン分解反応の結果は陰性である。
上記の性質に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジィ（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９８９）及びその他の文献によって検索した結果、本菌株はエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌であると判断し、エンテロバクター・エスピー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ２０株と命名した。
なお、本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００１年１２月２５日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８６６６号として寄託され、２００２年１２月２６日にブダペスト条約に基づく寄託への移管請求をし、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６６号として受託されている。また、微生物は人工的に又は自然に変異を容易に起こすので、本発明において用いられるエンテロバクター・エスピー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ２０株には、天然から分離された微生物の他に、これに紫外線、Ｘ線、化学薬剤などで人工的に変異させた変異株のみならず天然変異株をも包含するものであることはいうまでもない。
次に、エンテロバクター・エスピー Ｂ２０株を培養して本発明化合物（Ｉ）を産生する方法について説明する。
すなわち、本発明化合物（Ｉ）またはその塩は、エンテロバクター属に属し、本発明化合物（Ｉ）の生産能を有する微生物、例えばエンテロバクター・エスピーＢ２０ＦＥＲＭＰ−１８６６６号菌株またはその変異株を培養することによって得られる。培養は一般微生物の培養方法に準じて行われる。
培養に用いられる培地としては、エンテロバクター属に属し、本発明化合物（Ｉ）の生産能を有する微生物、例えば、エンテロバクター・エスピーＢ２０株が利用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる。培地に添加する栄養物として公知のものを使用できる。培地の組成は、例えば炭素源としてはＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、マンノース、ラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、トレハロース、サリシン、デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物油等が挙げられる。窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進物質または消泡剤を添加することもできる。
培養条件としては好気的条件下で培養するのが一般的に有利で、培養温度は１０〜３７℃（上記生理学的性質の記載参照）の範囲、好ましくは２０〜３２℃付近で行われる。培地のｐＨは約５〜９、好ましくは約５〜８の範囲に調整すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定されるが、通常１〜７日程度、好ましくは２〜５日程度である。
培養物より目的とする本発明物質を単離するには、微生物が産生する代謝産物に用いる通常の抽出、精製の手段が適宜利用できる。例えば培養物質中の該物質は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養液に酢酸エチル等の水と混和しない有機溶剤を加えて抽出する。また、培養液を適宜坦体に接触させ、濾液中の生産物質を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該物質を抽出することができる。例えば、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ−２０、ダイヤイオンＣＨＰ−２０、又はダイヤイオンＳＰ−９００のような多孔性吸着樹脂に接触させて該物質を吸着させる。次いでメタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル等の有機溶媒と水の混合液を用いて該物質を溶出させる。このときの有機溶媒の混合比率を低濃度より段階的に又は連続的に高濃度まで上げていくことにより、該物質を含む画分を得ることができる。酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する場合には、培養濾液にこれらの溶媒を加え、良く振とうし、該物質を抽出する。次に、上記の各操作法を用いて得た該物質含有画分は、シリカゲル、ＯＤＳ等を用いたカラムクロマトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、ＯＤＳを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の定法により、さらに純粋に分離精製することができる。すなわち、メラニン産生抑制活性を指標として、適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差等を利用する一般の生理活性物質の製造に用いられる手段によって、分離、精製される。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、又は任意の順序に組合せ、反復して適用できる。
本発明化合物（Ｉ）は、酸と塩を形成する。酸とは無機酸又は有機酸であり、具体的には塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸もしくはリン酸等との無機酸、又はギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸若しくはエタンスルホン酸等との酸付加塩が挙げられる。また、本発明には本発明化合物（Ｉ）またはその塩の水和物、各種溶媒和物、互変異性体及び不斉炭素に基づく立体異性体などの関連物質の全てが含まれる。さらに本発明化合物（Ｉ）またはその塩は結晶多形を有する場合もあり、本発明にはこれらの結晶形も全て含まれる。
本発明の皮膚外用剤は、常法により、化粧料、医薬部外品、医薬品などのあらゆる形態に調製することができる。その具体例としては、例えば、クリーム、乳液、化粧水、ファンデーション、パック、ローション、ゲル、溶液、スティックなどの形態を挙げることができる。
本発明の皮膚外用剤は、本発明化合物（Ｉ）またはその塩を皮膚外用剤全量中、０．００００１〜１０重量％、特に０．００１〜１重量％の量で含有するのが好ましい。０．００００１重量％未満では皮膚美白効果に乏しく、１０重量％を超えて配合しても効果の増加は望めない。
本発明の皮膚外用剤は、本発明化合物（Ｉ）またはその塩に加えて、通常の化粧料、医薬部外品、医薬品などに用いられる各種任意成分、例えば、油剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、顔料、粉体、ｐＨ調整剤、薬効成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、香料などを適宜配合することができる。
（実施例）
以下、実施例にて具体的に本発明化合物（Ｉ）の産生について説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
グルコース１０ｇ、ポテトスターチ２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、炭酸カルシウム４ｇ、蒸留水１Ｌを含む培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。ベネット寒天培地に良く生育させたエンテロバクター・エスピーＢ２０株を掻き取って接種し、２８℃、２２０回転／分の条件で３日間振とう培養し、種培養液とした。次にグリセロール４０ｇ、コーンスティープリカー３０ｇ、硝酸ナトリウム４ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ、蒸留水１Ｌを含む培地（ｐＨ５．５）を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。この培地２００本に前記種培養液を３ｍｌずつ接種し、２８℃、２２０回転／分の条件で５日間、振とう培養を行った。
このようにして得られた培養液２０Ｌをシャープレス型遠心機で菌体と培養上清に分離した。上清をｐＨ７に調整した後に酢酸エチル１０Ｌにて抽出した。一方、菌体は８０％アセトン水２０Ｌを添加し、３時間攪拌を行った。これに珪藻土を加えて吸引ろ過し、得られたアセトン溶液を減圧下で濃縮しアセトンを留去した。この濃縮液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を濃縮乾固した。次に、菌体と上清から得た酢酸エチル抽出物（８．４ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，７０−２３０ ｍｅｓｈ ＡＳＴＭ，Ｍｅｒｃｋ）に供し、クロロホルム−メタノール（１００：１， ２０：１， １０：１）で順次溶出した。メラニン産生抑制物質が含まれる活性分画を濃縮乾固して、粗物質（１．２ｇ）を得た。この粉末をＯａｓｉｓＨＬＢ固相抽出カートリッジ６ｇ／３５ｃｃに通塔し、蒸留水（７０ｍｌ）及び５０％メタノール（７０ｍｌ）で洗浄後、１００％メタノール（７０ｍｌ）にて活性物質を溶出し、濃縮乾固して活性粉末（５１７ｍｇ）を得た。この粉末をＨＰＬＣ（Ｓｅｎｓｙｕ Ｐａｃｋ Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ；２０ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）に供し、アセトニトリル−水（３０：７０）で溶出し、活性を有するピークを分取し、この分画を濃縮乾固して、下式、化１式で示される（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドを白色粉末（１１０ｍｇ）として得た。
即ち、本発明化合物（Ｉ）は、

で表されるグリコシドである。
上記化１式で表される本発明化合物（Ｉ）の物理化学的性質は、以下に示す通りである。
色及び形状：白色粉末
旋光度：［α］_Ｄ ^２５−１４２°（ｃ ０．１， メタノール）
分子式： Ｃ_１５Ｈ_１７Ｏ_５Ｎ
高分解能ＦＡＢマススペクトラム：
Ｆｏｕｎｄ ２９２．１１８７（Ｍ＋Ｈ）⁻
Ｃａｌｃｄ ２９２．１１８５（Ｍ＋Ｈ）^＋
紫外可視吸収スペクトラム（λ_ｍａｘ ^ＭｅＯＨｎｍ（ε））： ２１０（１５，０００），２２１（１５，０００），２８１（２６，０００）
赤外吸収スペクトラム（ν_ｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１）：図１に示す通り
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラム（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：図２に示す通り
^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラム（１００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：図３に示す通り
実施例２
本発明化合物（Ｉ）のマッシュルーム由来チロシナーゼに対する阻害活性、Ｂ１６メラノーマ由来チロシナーゼに対する阻害活性、及びＢ１６メラノーマのメラニン産生能に対する抑制効果を以下の方法で確認した。
マッシュルーム由来チロシナーゼに対する阻害活性測定法
マッシュルーム由来チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を２０Ｕ／ｍｌになるように０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶解した。Ｌ−ｄｏｐａを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で０．３ｍｇ／ｍｌに調整した。９６穴プレートにＬ−ｄｏｐａ液３０μｌと種々の濃度の本発明化合物（Ｉ）溶液３０μｌを入れ、手早くマッシュルーム由来チロシナーゼ液３０μｌを混合した。２５℃で１０分間インキュベート後、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。
Ｂ１６メラノーマ由来チロシナーゼに対する阻害活性測定法
液体窒素中に凍結保存した約２．０×１０^５／アンプルのＢ１６メラノーマ細胞株を３７℃の水浴中で溶解し、ただちに１０ｍｌの培地中に懸濁した。８００ｒｐｍ、５分間遠心を行い、その上清を捨て、新しい１０ｍｌの培地を添加して細胞を懸濁した。再度同じ条件で遠心を行い、その上清を捨て新しい培地で懸濁した。
この細胞を約４．０×１０^５ずつ７５ｃｍ^２のフラスコに播種した。３７℃、５％ＣＯ_２下で２〜３日ごとに培地を交換しながら一週間培養を続けた。サブコンフルエント状態になった細胞の培地を捨て、ＰＢＳ（−）で培養細胞表面を洗った後、０．２５％トリプシンを用いて細胞をはがした。血清入り培地を入れてトリプシンの反応を止め、ピペッティングにて細胞をほぐしてから遠心チューブに細胞懸濁液を移した。８００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清を捨て、新しい培地に細胞を懸濁した。血球計算盤を用いて細胞数を求めた。
この細胞５×１０^５個を１７５ｃｍ^２のフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で５日間培養を行った。コンフルエントになったところで培養培地を捨て、細胞表面をＰＢＳ（−）で洗った後、０．２５％トリプシンを用いて細胞をはがし、血清入り培地を入れてトリプシンの反応を止めた。ピペッティングにより細胞をほぐし、５０ｍｌのコニカルチューブに細胞懸濁液を集め、８００ｒｐｍ、５分間遠心を行った。上清を捨て、ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁し、再度ＰＢＳ（−）で洗った。０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し直して、氷中でホモジナイザーを使って細胞をつぶした。１．５ｍｌのサンプルチューブに等量づつ細胞液を分注し、４℃、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心した。上清を集めて氷中で使用時まで保存した（粗酵素液）。
Ｌ−ｄｏｐａを０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）で０．８ｍｇ／ｍｌに調製した。Ｌ−ｄｏｐａ液０．２５ｍｌ、種々の濃度の本発明化合物（Ｉ）溶液０．２５ｍｌ、粗酵素液０．５ｍｌを加え、手早く混合して、２５℃で２時間インキュベート後、４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。
Ｂ１６メラノーマのメラニン産生能に対する抑制活性測定法
液体窒素中に凍結保存した約２．０×１０^５／アンプルのＢ１６メラノーマ細胞株を３７℃の水浴中で溶解し、ただちに１０ｍｌの培地中に懸濁した。８００ｒｐｍ、５分間遠心を行い、その上清を捨て、新しい１０ｍｌの培地を添加して細胞を懸濁した。再度同じ条件で遠心を行い、その上清を捨て新しい培地で懸濁した。
この細胞を約４．０×１０^５ずつ７５ｃｍ^２のフラスコに播種した。３７℃、５％ＣＯ_２下で２〜３日ごとに培地を交換しながら一週間培養を続けた。サブコンフルエント状態になった細胞の培地を捨て、ＰＢＳ（−）で培養細胞表面を洗った後、０．２５％トリプシンを用いて細胞をはがした。血清入り培地を入れてトリプシンの反応を止め、ピペッティングにて細胞をほぐしてから遠心チューブに細胞懸濁液を移した。８００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清を捨て、新しい培地（フェノールレッドを含まない）に細胞を懸濁した。血球計算盤を用いて細胞数を求めた。
２×１０^５個／ｍｌになるように細胞液を培地（フェノールレッドを含まない）で希釈し、９６穴プレートに１００μｌずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ_２下で１日培養を行った。種々の濃度の本発明化合物（Ｉ）溶液を培地（フェノールレッドを含まない）で調製し、９６穴プレートに１００μｌずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ_２下で５日間培養し、下記方法にて評価を行った。
（評価方法）
１．細胞外メラニン量
培地を泡立てないように１５０μｌ／ｗｅｌｌずつアッセイプレートに移し、マイクロプレートリーダーにてＯＤ４５０を測定した。
２．細胞内メラニン量
細胞の入っているプレートを反転し残っている培地を捨てた。０．１Ｎ ＮａＯＨ−０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００を１５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、ピペッティングで溶解した。１００μｌ／ｗｅｌｌずつアッセイプレートに移し、マイクロプレートリーダーにてＯＤ４５０を測定した。
３．タンパク量
アッセイプレートに１５６μｌずつ蒸留水を入れ、細胞内メラニン量の測定において溶解した細胞液の残りのうち４μｌずつをこれに添加した。Ｂｉｏ−ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｄｉｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎを４０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、２分間振とうした。５分間放置後、マイクロプレートリーダーにてＯＤ５９０を測定した。
それぞれの測定結果は、表４にまとめて示す。本発明化合物（Ｉ）は、良好なチロシナーゼ阻害活性並びにメラニン産生抑制作用を有していた。また、これらの美白作用が明らかに認められる濃度において、顕微鏡下での細胞の形態変化、細胞数の増殖及び細胞の蛋白量への影響は認められなかった。

実施例３
本発明化合物（Ｉ）の美白効果を以下の方法で測定した。
被験者２０名を夏期の午前１１時から午後１時まで、２日間にわたり太陽光に計４時間晒した。晒された被験者の上腕内側部皮膚を対象として、太陽光に晒された日から５日後に、下記表５および表６に示す処方で調製した水相、アルコール相を混合して可溶化して調製した各試料を朝夕１回づつ４週間塗布した。

４週間経過後に、各被験者について、美白効果を判定した。なお、効果の判定は、下記の基準に従って行った。
◎：被験者のうち著効および有効の示す割合が８０％以上の場合
○：被験者のうち著効および有効の示す割合が５０〜８０％の場合
△：被験者のうち著効および有効の示す割合が３０〜５０％の場合
×：被験者のうち著効および有効の示す割合が３０％未満の場合
判定の結果は、下記の表７に示す。

表７に示す如く、本発明化合物（Ｉ）を含有する組成物には、対照に使用した薬剤に比較して、より少ない用量で同等〜優れたメラニン色素沈着防止作用が認められた。なお、本発明化合物投与群においては、被験者に、紅斑や浮腫等の皮膚の異常は認められず、また、本発明化合物投与に起因すると考えられる副作用等も全く認められなかった。
実施例４
本発明化合物（Ｉ）について、下記表８、９および１０に示す成分からなる３種類の処方を混合して乳液を調製した。

成分Ａを加熱溶解し、８０℃に保持する。別に８０℃に加熱溶解した成分Ｂを成分Ａに加え、十分混合する。撹拌しながら冷却を行い、５０℃にて成分Ｃを加え、乳液を得た。
実施例５
本発明物質について、下記表１１に示す処方の化粧水を調製した。

全成分を室温にて撹拌、混合して均一な溶液とし、ｐＨ５．５に調整して化粧水を得た。
実施例６
本発明化合物（Ｉ）について下記表１２に示す処方のクリームを調製した。

精製水にプロピレングリコールを加え、加熱して７０℃に保つ（水相）。他の成分を混合し、加熱融解して７０℃に保つ（油相）。水相に油相を加え、予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化してクリームを得た。
実施例４〜６で得られた皮膚外用剤はいずれも美白効果試験において効果が認められた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、良好なメラニン産生抑制作用を有する（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドを産生する新規な菌株が提供される。また、この菌株（変異株を含む）により産生される（Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドは、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカスおよび肝斑などの淡色化および美白に優れた効果を有すると共に安全性にも優れ良好な美白剤となることが期待される化合物である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明化合物の赤外吸収スペクトラム（ν_ｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１）を示す。
図２は、本発明化合物^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを示す。
図３は、本発明化合物^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示す。

Claims (4)

1. （Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドまたはその塩。
2. （Ｅ）−４−（２−イソシアノビニル）フェニル α−Ｌ−ラムノピラノシドまたはその塩を含有する皮膚外用剤。
3. 美白剤である請求項２記載の皮膚外用剤。
4. エンテロバクター・エスピー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ２０株。

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