KR20210105752A

KR20210105752A - 안트라닐산을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20210105752A
Application number: KR1020200020632A
Authority: KR
Inventors: 남상집; 임경민
Original assignee: 주식회사 이투바이오
Priority date: 2020-02-19
Filing date: 2020-02-19
Publication date: 2021-08-27
Also published as: KR102349785B1

Abstract

본 발명은 천연물 유래로서 안전하면서도, 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 피부의 색소침착을 예방, 완화, 개선 및 치료하는 효과를 갖는 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 유도체 또는 이성질체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물, 안트라닐산 생성능을 갖는 신규한 균주 및 이를 이용한 안트라닐산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

안트라닐산을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물 {Composition for skin whitening comprising anthranilic acid as active ingredient}

본 발명은 안트라닐산을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물, 안트라닐산 생성능을 갖는 신규한 균주 및 이를 이용한 안트라닐산의 제조방법에 관한 것이다. 　보다 상세하게는 남극 해양퇴적토에서 분리한 미생물로부터 유래된 안트라닐산을 유효성분으로 하여 독성이 낮으며 탁월한 미백 효과를 나타내어, 피부색소침착의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이나 피부색소침착의 예방, 개선, 또는 완화용 화장료 조성물로서 유용한 피부 미백용 조성물 및 안트라닐산 생성에 유용한 균주와 이를 이용한 제조방법에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하고 기미, 잡티들이 생성되는 현상에는 여러 요인들이 관여하는데, 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께, 카로티노이드, 빌리루빈 등 여러 인자들이 복합적으로 관여되어 있다. 이중에서도 가장 중요한 인자는 인체 내의 멜라노사이트에서 여러 효소들이 작용하여 생성되게 되는 멜라닌 색소다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스, 자외선 등과 같은 생리적 요인 및 환경적 요인 등이 영향을 미친다고 알려져 있다.

　　사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)에서 생성이 되는데 이 멜라노사이트에는 티로시나제 등의 효소가 존재하며, 이들이 함께 작용하여, 생체 내에 항상 존재하는 티로신(tyrosine)이라는 아미노산을 기질로 중합화 산화반응을 함으로 흑갈색의 색소인 멜라닌을 형성하게 된다. 이렇게 형성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 여기서 멜라닌은 핵 주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다. 생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고 다만 케라티노사이트가 노화되어 제 기능을 다하고 표피에서 떨어져나갈 때 케라티노사이트와 함께 피부로부터 제거된다. 하지만 멜라닌이 필요 이상으로 과다하게 생성되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소침착증을 유발한다. 이에 따라 멜라닌의 과도한 생성을 막아 피부에서 색소 침착을 억제하기 위한 미백제에 대한 연구가 이루어졌으며, 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등과 같은 티로시나제 활성을 저해하는 억제제들, 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 A등을 비롯하여 대표적인 항산화제인 비타민 C 및 이들의 유도체 등이 보고되었다.

　　그러나 상기와 같은 기존의 미백 물질들은 그 효능이 약하거나 세포 독성 등을 동반하는 경우가 많아 안전하고 미백 효능이 높은 천연물을 발굴하고자 하는 노력이 계속되고 있다.

　본 발명자들은 효과적인 멜라닌 합성 저해 효과를 나타내는 물질을 발굴하고자 예의 노력하였고, 그 결과, 해양퇴적토에서 분리한 미생물 중 해양 방선균(Marine Streptomyces, SCO-736) 및 해양 바실러스(Marine Bacillus, SNA408)로부터 안트라닐산을 생산해내었으며, 이러한 안트라닐산이 멜라닌 합성을 효과적으로 저해할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

　따라서 본 발명의 하나의 목적은, 안트라닐산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주, 또는 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주를 이용하는 안트라닐산 제조 방법 및 안트라닐산을 생산할 수 있는 상기 균주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 피부 미백용 조성물은 유효성분으로서, 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 또는 유도체를 포함한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 또는 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제 조성물, 건강기능식품, 또는 의약외품 조성물일 수 있으며, 이들은 용액, 연고, 외용연고, 크림, 에센스, 폼, 화장수, 영양화장수, 유연수, 유연화장수, 팩, 유액, 메이크업베이스, 비누, 세정료, 입욕제, 선크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 파운데이션, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명에서 "피부 미백"은 예컨대 기미, 주근깨, 검버섯 및 잡티 등의 예방 또는 개선이 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 피부에서의 색소침착을 예방 또는 개선, 치료하는 모든 활성을 포함한다.

상기 "안트라닐산"는 다음과 같은 화학식 1로 표시되는 물질이며, 2-아미노벤조산 또는 2-아미노벤조익액시드(2-aminobenzoic acid)라는 명칭으로도 불린다.

[화학식 1]

상기 "안트라닐산"은 구입한 것, 미생물에서 분리한 것, 합성한 것 등을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 미생물에서 추출, 분리한 것, 더욱 바람직하게는 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 또는 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로부터 추출 및 분리한 것일 수 있다. 상기 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 또는 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주는(기탁번호: KCTC14116BP) 안트라닐 생성능을 가지는 균주로서, 본 발명자에 의해 본 발명에서 최초로 안트라닐 생성능이 있음이 확인된 균주이다. 본 발명에 따른 미백용 조성물은 유효 성분인 안트라닐산을, 안트라닐산을 포함하는 상기 균주의 추출물 또는 분획물의 형태로 포함할 수 있다.

상기 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 또는 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로부터 안트라닐산을 추출하는 방법은 공지의 미생물 추출방법을 제한없이 사용할 수 있다. 또한 추출시 사용되는 추출용매도 미생물의 특성에 따라 당업계에 공지된 용매를 적절히 선택하여 추출할 수 있으나, 유기용매, 구체적으로 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 및 디클로로메탄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 유기용매로 추출될 수 있으며, 에틸아세테이트 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 상기 추출물의 분획물은 유효성분인 안트라닐산을 다량 수득할 수 있는 분획 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 물과 알코올(예를 들어 탄소수 1-3의 저급 알코올)의 혼합용매로 분획된 분획물, 더욱 바람직하게는 물/메탄올 분획물일 수 있다. 또한, 상기 분획물은 상기 추출물을 메탄올 20, 40, 50, 60, 70, 80 또는 100 (v/v)% 용액으로 추가로 분획하여 얻어진 소분획물일 수 있다. 상기 분획물 및/또는 소분획물은 화학식 1을 비롯하여 유용한 이차대사산물을 함유하여 우수한 미백 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 이하에서 별도의 설명이 없는 한, 유효(활성)성분으로서 상기 화학식 1의 안트라닐산뿐 아니라, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 이성질체(바람직하게, 광학 이성질체) 또는 유도체가 모두 포함되며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 유효성분인 “안트라닐산”은 염, 특히 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 염을 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 용어 “약학적으로 허용되는 염”은, 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 안트라닐산의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.

또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분으로, 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 수화물 등의 용매화물, 및 가능한 유도체와 이성질체, 바람직하게, 광학 이성질체를 제한 없이 포함한다. 상기 안트라닐산의 수화물, 용매화물, 유도체 및 이성질체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 안트라닐산으로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "안트라닐산", 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 이성질체(바람직하게, 광학 이성질체) 또는 유도체는 멜라닌 생성을 저해할 수 있다. 상기 "멜라닌 생성 저해"는 피부에서 멜라닌 합성을 억제하는 것, 생성된 멜라닌의 분해를 촉진하는 것과 같이 피부에서 멜라닌의 함량을 낮추고, 색소의 침착을 억제하는 기전을 모두 포함할 수 있다.

상기 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 용매화물, 이성질체(바람직하게, 광학 이성질체) 또는 유도체는 멜라닌 생성을 저해하여 피부에 대한 탁월한 미백 효능을 나타내므로, 피부의 색소 침착 및 이와 관련된 질환, 예를 들어 주근깨, 기미, 자외선 노출 후 과다 색소 침착, 염증 후 과다 색소 침착, 노인흑색점, 갈색반점 또는 검버섯 등과 같은 질환을 예방, 개선, 완화 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 상기 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 용매화물, 이성질체(바람직하게, 광학 이성질체) 또는 유도체의 유효량은 피부 미백용 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 피부 미백용 조성물이 피부의 과다 색소 침착에 따른 피부과적 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 용매화물, 이성질체(바람직하게, 광학 이성질체) 또는 유도체를 포함할 수 있을 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 피부 미백용 조성물에는 안트라닐산, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 이성질체(바람직하게, 광학 이성질체) 또는 유도체를 상기 피부 미백용 조성물 총 중량 기준으로 0.0001 ~ 15 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 ~ 5 중량%를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 미백용 조성물에 안트라닐산이 이를 포함하는 추출물 및/또는 분획물 형태로 포함되는 경우, 상기 피부 미백용 조성물 총 중량 기준으로 0.001 ~ 50 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 30 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 10 중량%, 더 더욱 바람직하게는 1 ~ 5 중량% 포함할 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람 직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

바람직하게, 본 발명에 따른 피부 미백용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 본 실시예의 피부 미백용 화장료 조성물은 상기 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 유도체 또는 이성질체 이외에 미용학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 등이 있으나, 이에 제한되지 않으며, 화장료 조성물에 적용 가능한 공지된 모든 물질이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 스킨, 로션, 에센스, 크림, 마사지 크림, 팩, 메이크업 베이스, 비비크림, 파운데이션, 파우더, 클렌징 폼, 클렌징 크림 및 클렌징 워터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형으로 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 공지된 모든 제 형으로 형성될 수 있다. 한편, 상기와 같은 제형을 가지는 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물이 페이스트, 크림 또는 겔 상태로 형성될 경우에는 동물성유, 식물성유, 확스, 파라핀, 전분, 트라가칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등을 더 포함할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물이 용액 또는 유탁액 형태로 형성될 경우에는 용매, 용해화제, 유탁화제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매, 용해화제, 유탁화제로는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이 트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 포함할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물이 현탁액 형태로 형성될 경우에는 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등의 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 검 등을 더 포함할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물이 클렌징 폼, 클렌징 크림 또는 클렌징 워터일 경우에는 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메칠타우레이트, 사르코시네이트계 화합물, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세라이드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 유도체 또는 이성질체를 포함하는 피부 미백용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 피부 미백용 약학적 조성물은 단독 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합된 형태로 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 공지의 경구투여 또는 비경구투여 제제의 제형일 수 있다. 이에 따라, 본 실시예의 피부 미백용 약학 조성물은 상기 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 유도체 또는 이성질체 이외에 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제, 부형제 및/또는 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 피부 미백용 약학적 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 또는 비경구 투여(복강내, 직장, 정맥, 근육 또는 피하 주사, 또는 경피 투여)에 의해 투여될 수 있다. 이때, 비경구 경로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소 도포가 가장 바람직할 수 있다. 본 발명에 따른 피부 미백용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명에 따른 피부 미백용 약학 조성물은 0.1 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 피부 미백용 약학적 조성물의 비경구 경로 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 외용제의 경우 1 일당 1.0 ~ 3.0 ml를 1회 내지 수회로 나누어 도포할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 구체적인 일 실시예에서, 안트라닐산은 동일 농도의 알부틴과 비교시, 약 37% 높은 저해 활성도를 보였으며 특히 저농도에서 약 45%의 매우 높은 멜라닌 생성 저해 활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 유효성분으로서 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 유도체 또는 이성질체를 포함하는 피부 미백용 조성물은 탁월한 멜라닌 생성 저해 활성을 나타내어 미백용 제제 또는 화장품에 유용하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 안트라닐산 생성능을 갖는 신규한 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 안트라닐산 생산 균주(기탁번호: KCTC14116BP)에 관한 것이다. 본 발명의 "바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주"는 추출물에 안트라닐산을 생성할 수 있는 미생물로, 바람직하게는 남극 해양퇴적토로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명에서는 상기 균주가 안트라닐산 생산능을 가지고 있기 때문에 상기 균주를 배양한 배양물, 이의 추출물 및/또는 분획물로부터 안트라닐산을 분리 및/또는 정제하여 상기 화학식 1의 안트라닐산을 수득할 수 있는 특징이 있음을 규명하였다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 안트라닐산을 수득할 수 있는 신규 균주를 선발하기 위하여, 남극, 코스타리카 및 포항 해양퇴적토 시료에서 퇴적도를 채집하여 건조한 후, 이를 멸균한 해수에 현탁하여 희석한 후 배양하여 생성된 균주를 다시 접종하여 순수한 균주를 분리 및 선별하여, 안트라닐산 생산활성을 보이는 균주를 선별하였다.

본 발명에 따른 균주를 16S rRNA 염기서열을 통해 분석한 결과, 서열번호 6의 16S rRNA 염기서열을 가지는 새로운 유전학적 성질의 균주로 동정할 수 있었고, 상기 균주를 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주로 명명하고, 2020년 01월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC, Korean Collection for Type Cultures; 전라북도 정읍시 입신길 181 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)) 소재) 에 기탁하여 KCTC14116BP를 부여받았다.

본 발명에서 선별한 균주는 상기한 본 발명에 따른 미백용 조성물의 유효성분으로 포함되는 안트라닐산을 제조하는데 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 포함하는 배양물, 이의 건조물 또는 농축물, 또는 상기 배양물, 이의 건조물 또는 농축물을 포함하는 안트라닐산 제조용 조성물에 관한 것이다.

상기 배양물은 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 (기탁번호: KCTC14116BP)균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주와 함께 배양 배지를 포함할 수 있다. 배양 배지는 상기 균주를 배양하게 위하여 공지의 적절한 배지를 선택할 수 있으나, 유용한 이차대사산물의 생산에 최적 조건을 제공하기 위하여, 배양 배지는 마린 브로스(Marine broth (BD)), SYP 등일 수 있다. 상기 마린 브로스(Marine broth)의 배지 형태는 고체배지와 액체배지 모두 가능하며, 바람직하게는 액체배지일 수 있다. 배양물을 얻기 위한 배양기간은 유효한 이차대사 산물의 생산이 활발한 약 4일 이상, 바람직하게는 4 내지 20일, 보다 바람직하게는 6 내지 15일로 하는 것이 좋다.

상기 마린 브로스의 배지는 녹말(Soluble starch), 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone), 해양 소금(sea salt)을 사용한다. 고체배지 같은 경우는 400mL 기준으로 녹말(Soluble starch) 4g, 효모 추출물(Yeast extract) 1.6g, 펩톤(Peptone) 0.3g, 한천 (Agar) 7.2g, 해양 소금(sea salt) 13.9g에 증류수(Distilled water) 400 mL을 추가한다. 액체배지 같은 경우는 4L 기준으로 녹말(Soluble starch) 40g, 효모 추출물(Yeast extract) 16g, 펩톤(Peptone) 8g, 해양 소금(sea salt) 139g에 증류수 (Distilled water) 4L을 추가한다

본 발명에서 상기 건조물과 농축물은 배양물을 통상적인 방법으로 건조 또는 농축하여 얻어진 것을 의미한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 이용한 안트라닐산 제조 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 방법은,

a) 상기한 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 포함하는 조성물에 추출 용매를 가하여 추출물을 얻는 단계; 및

b) 상기 단계 a)에서 얻어진 추출물을 분리 및 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 단계 a)에서 사용되는 추출 용매는 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주에서 안트라닐산을 추출할 수 있는 용매라면 제한없이 공지의 용매에서 적절히 선택할 수 있으나, 유기용매, 예를 들어, 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 및 디클로로메탄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 유기용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 에틸아세테이트일 수 있다.

상기 추출은 초임계추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법, 또는 셀라이트 또는 폴리스틸렌 또는 폴리아마드 흡착수지를 이용하는 방법으로 대체 가능하나 이에 한정하지 않는다. 추출 시의 용매량이나 추출 온도는 당업자가 적절히 변경할 수 있으나, 추출 시 용매를 배양액 분량의 1 내지 3 부피 배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 상온에서 추출하는 것이 바람직하다. 추출 회수는 1 내지 3회인 것이 바람직하며, 감압건조는 회전진공농축기(Rotary Vacuum Evaporator)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 감압건조 시 온도는 20 ~ 40 ℃인 것이 바람직하고 30℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

추가적으로, 본 발명에 따른 안트라닐산 제조 방법은 상기 추출 용매를 가하여 추출물을 수득하는 단계 전에, 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 배양하여 상기 균주를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 안트라닐산 제조 방법은 상기 추출 용매를 가하여 추출물을 수득한 후, 상기 추출물에서 추출 용매, 바람직하게 유기 용매를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 유기용매의 제거는 당 분야에서 공지된 방법을 제한 없이 사용하여 수행할 수 있다.

상기 단계 b)의 분리 정제방법은 공지의 방법을 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

상기 "크로마토그래피"는 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 플래시크로마그래피(TLC), 역상 액체크로마토그래피일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 물 및 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 전개 용매로 사용하여 수행될 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 수득방법에 의해 피부 미백용 조성물의 유효성분으로서 유용한 안트라닐산을 용이하게 수득할 수 있다.

이상 본 명세서에 기재된 수치값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 미백용 조성물에 포함되는 안트라닐산은 천연물 유래이므로 안전한 물질이며, 멜라닌 생성을 효과적으로 억제함으로써 피부의 색소침착을 예방, 치료 또는 개선할 수 있어 미백용 약학적 제제 또는 화장품 개발을 위한 조성물의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 해양퇴적토로부터 분리한 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 아종 아데스시아쿠스 SCO-736 균주의 마린(Marine) 고체배지에서의 형태를 나타내는 사진이다.
도 2는 해양퇴적토로부터 분리한 바실러스속(Bacillus sp.) SNA408 균주의 마린(Marine) 고체배지에서의 형태를 나타내는 사진이다.
도 3은 안트라닐산의 농도 의존적 멜라닌 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 배양한 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)의 추출물의 크로마토그램 중 UV 254 nm에서 안트라닐산의 머무름 시간을 나타낸다.
도 5a-c는 실시예 2에서 분리, 정제하여 수득된 화합물이 안트라닐산인지를 동정한 그래프이다. 도 5a는 ¹H NMR 결과, 도 5b는 [M+H]=138, 도 5c는 자외선 스펙트럼 결과를 각각 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 이하 실시예에서 사용되는 용어 2-아미노벤조산 또는 2-아미노벤조익액시드는 안트라닐을 다르게 지칭하는 명칭이다.

실시예 1. 균주 선별 및 동정

1-1: 퇴적토 내 균주 분리

남극 해양퇴적토 시료에서 채집된 퇴적토는 클린벤치에서 건조 후, 건조물을 멸균된 해수에 현탁하여 1/2으로 희석한 뒤 마린브로스(Marine broth) 고체배지에 접종하고, 27℃에서 배양하면서 생성된 단일 균주를 마린 브로스 (Marine broth) 고체배지에 다시 접종하여 순수한 균주를 분리 및 선별하였다.

순수 분리된 SCO-736 균주는 도 1과 같이 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주들과 같은 형태적 양상이 관찰되었다.

　1-2: 균주의 동정

실시예 1-1에서 분리된 균주의 종 동정을 위해 마린브로스(Marine broth) 액체배지에서 4일 동안 27℃에서 배양된 균주 1ml을 취하여 “Tissue Genomic DNA Isolation kit”(Cosmogenetech co, Ltd.. Seoul, South Korea)를 이용하여 제조회사 프로토콜에 의하여 genomic DNA를 추출하였다. 종 분석을 위해 16S rRNA 유전자 증폭을 518F 및 805R 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.

종류	서열 (5’ -> 3)	서열번호
518F	CCAGCAGCCGCGGTAATAC	1
27F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	2
805R	GACTACCAGGGTATCTAATC	3
1492R	TACGGYTACCTTGTTACGACTT	4

PCR 산물은 “PCR purification kit” (Cosmogenetech co, Ltd.. Seoul, South Korea)을 이용하여 정제 후, capillary electrophoresis(Applied Biosystems 3730XL)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. SCO-736 균주로부터 얻어진 16S rRNA 유전자 염기서열을 GenBank/EMBL/DDBJ 데이터베이스의 BLAST 서치를 활용하여 이전에 보고된 균주들의 정보와 비교하였다. 그 결과 SCO-736 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 Streptomyces gougerotii strain NBRC 13043, Streptomyces rutgersensis strain NBRC 12819 및　Streptomyces gougerotii strain NBRC 3198, Streptomyces diastaticus strain NBRC 3714 균주들과 100% 상동성을 나타냈으며, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 SCO-736 균주는 Streptomyces 속에 속하는 스트렙토마이세스 디아스타티쿠스 아종 아데스시아쿠스 균주로 판단되었다. Streptomyces gougerotii는 strepomyces속에 속하고 항생물질인 gougerotin을 생산하는 특징을 가진다.

상기 스트렙토마이세스 속 SCO-736 균주의 16S rRNA genes 염기서열을 표 2에 나타내었다 (서열번호 5):

서열번호 5

GGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGA
TTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACC
GGATATGACCGTCCATCGCATGGTGGATGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAGTTG
GTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC
CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAT
GACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAAC
TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCT
TGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAG
ATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGAT
ACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACT
AGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGC
TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTA
CCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCG
TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTG
GTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATG
TCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGG
TCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGT
GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCC
CTTGTGGGGAGGGAGCTGTC

1-3: 퇴적토 내 균주 분리

코스타리카 해양퇴적토 시료에서 채집된 퇴적토는 클린벤치에서 건조 후, 건조물을 멸균된 해수에 현탁하여 1/2으로 희석한 뒤 마린 브로스(Marine broth) 고체배지에 접종하고, 27℃에서 배양하면서 생성된 단일 균주를 마린 브로스(Marine broth) 고체배지에 다시 접종하여 순수한 균주를 분리 및 선별하였다.

순수 분리된 SNA408 균주는 도 2와 같이 바실러스 속에 속하는 균주들과 같은 형태적 양상이 관찰되었다.

1-4: 균주의 동정

실시예 1-3에서 분리된 균주의 종 동정을 위해 마린브로스 (Marine broth) 액체배지에서 4일 동안 27℃에서 배양된 균주 1ml을 취하여 “Tissue Genomic DNA Isolation kit” (Cosmogenetech co, Ltd.. Seoul, South Korea)를 이용하여 제조회사 프로토콜에 의하여 genomic DNA를 추출하였다. 종 분석을 위해 16S rRNA 유전자 증폭을 27F 및 1492R 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열은 상기 표 1에 나타내었다.

PCR 산물은 “PCR purification kit” (Cosmogenetech co, Ltd.. Seoul, South Korea)을 이용하여 정제 후, capillary electrophoresis (Applied Biosystems 3730XL)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

SNA408 균주로부터 얻어진 16S rRNA 유전자 염기서열을 GenBank/EMBL/DDBJ 데이터베이스의 BLAST 서치를 활용하여 이전에 보고된 균주들의 정보와 비교하였다. 그 결과 SNA408 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 Bacillus berkeleyi strain KMM 6244 균주와 99% 상동성을 나타냈으며, 본 발명의 Bacillus 속 SNA408 균주는 Bacillus 속에 속하는 균주로 판단되었다.

상기 Bacillus 속 SNA408 균주의 16S rRNA genes 염기서열을 표 3에 나타내었다 (서열번호 6):

서열번호 6

TATACATGCAGTCGAGCGGATCAATGGGGAGCTTGCTCCCCTGAGATCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAA
CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATACTGACCACCACATGGTGGAAAGTTG
AAAGATGGCTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGA
CGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
AGGGAATCTTCGGCAATGGGCGAAAGCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCT
GTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG
TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTCTT
AAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGCCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTACTGGAGAGGAGAGTG
GAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGCCAGTAACTG
ACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGT
GTTGGGGGGTTCCACCCTCAGTGCTGACGTTAACACATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACT
CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTC
TTGACATCCTTCGCTACTTCTAGAGATAGAAGGTTCCCCTTCGGGGGACGAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA
GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCAC
TCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC
ACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCAAAACCGCGAGGTTGAGCGAATCCCATAAAGCCATTCTCAGTTCGG
ATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCC
GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAACCAGCC
GCCGAATGTGATTCGG

실시예 2. 안트라닐산 분리 정제

남극 해양퇴적토 시료에서 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주를 분리하여 사용하였으며, 이로부터 2-아미노벤조익액시드(안트라닐산)를 분리 정제하였다.

구체적으로, 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주를 2.5L 배양 용기에 해수가 포함된 1리터 배양액(10 g/L 전분, 2 g/L 효모 추출물, 4 g/L 펩톤)에 7일 동안 27℃, 130 rpm 조건에서 배양하였다. 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주 배양액에 에틸아세테이트 1L를 넣어 두 층을 분리하고 이로부터 에틸아세테이트 층을 얻었다. 이후 에틸아세테이트 층으로부터 진공회전 농축기를 이용하여 유기 용매를 제거하고 이의 추출물을 얻었다.

상기 에텔아세테이트 추출물(3.4 g)은 물 및 메탄올 혼합용매로 분획하되, 메탄올의 농도를 20 내지100%로 단계적 구배에 따르는 C-18 실리카를 이용한 역상 칼럼 크로마토그래피로 분획하였다. 그 중 80% MeOH 로 분획한 첫 번째 분획에서 유기 용매를 제거하였으며, 그 잔류물들은 3ml 메탄올에 녹이고, 그 용액에 대한 고성능 액체 크로마토그래피를 수행하여 최종적으로 순수한 2-아미노벤조익액시드(안트라닐산)를 획득하였다.

사용한 고성능 액체 크로마토그래피의 조건은 다음과 같다.

Phenomenex Luna C-18 (2), 250×10.0 mm

2.0 mL/분, 5 mm, 100 Å, UV = 254 nm, 아세토나이트릴 (CH₃CN) : 물(H₂O) = 30 : 70

상기와 같은 방법에 따라 2-아미노벤조익액시드(8.3 mg)를 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주로부터 머무름 시간 11분에 분리하였다.

실시예 3. 안트라닐산의 멜라닌 생성 저해능 측정

안트라닐산의 멜라닌생성 저해 활성은 Lee 등(2013)(J Invest Dermatol. Lee CS, Park M, Han J, Lee JH, Bae IH, Choi H, Son ED, Park YH, Lim KM. 133, 4, 1063-1071)의 방법을 이용하여 측정하였다. B16 멜라노마 세포 (ATCC, USA)를 1 x 10⁴cells/well로 48 웰 플레이트에 300 μL씩 분주한 후에 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하였으며, 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지(ATCC, USA)를 사용하였다. 멜라닌 생성 촉진 자극원인 Alpha-MSH(0.1 uM, Sigma-Aldrich, USA)와 DMSO에 용해시켜 10, 25 및 50ppm 농도로 제조한 2-아미노벤조익액시드를 동시에 섞은 배지를 제조하였다. 양성대조군으로는 알부틴 25ppm을 사용하였다. 분주된 웰 내의 배지를 제거한 후에 제조된 배지를 웰 당 450μL씩 넣어주었다. 72 시간 후 배지를 완전히 제거하고, 1N NaOH 를 웰 당 200μL씩 넣어준 후 60℃에서 1시간 동안 배양하여 세포로부터 멜라닌을 용해시켰다. 용해된 멜라닌 시료 100μL를 96 웰 플레이트에 옮겨 담고 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 차이로부터 멜라닌 생성 저해도는 다음 수학식 1과 같이 산출하였다.

[수학식 1]

멜라닌생성 저해도(%) = 1 - (ODS-ODc)/(ODm-ODc)×100

(ODS: 시험물질과 alpha-MSH를 처리한 시료의 흡광도

ODm: alpha-MSH만 처리한 시료의 흡광도

ODc: 시험물질, alpha-MSH를 처리하지 않은 음성대조군(1N NaOH 100 μL)의 흡광도)

멜라닌 생성 저해도 측정 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 안트라닐산은 10ppm, 25ppm, 50ppm 으로 농도가 증가할수록 멜라닌 생성 저해 효과가 감소하는 경향을 보였다. 동일 농도인 25ppm 에서는 양성대조군인 알부틴과 비교하여 약 37% 높은 저해 활성도를 보였으며 특히 저농도인 10ppm에서 약 45%의 매우 높은 멜라닌 생성 저해 활성을 나타내었다.

상기와 같은 결과에 따라, 안트라닐산은 저농도에서도 멜라닌 생성 저해 활성이 매우 우수하며, 멜라닌 생성 저해를 통해 피부 색소 침착과 관련된 다양한 질병 및 상태에 적용 가능함을 확인하였다.

실시예 4. 스트렙토마이세스속( Streptomyces sp. ) SCO-736 균주 및 바실러스( Bacillus sp. ) SNA408 균주 추출물의 중의 안트라닐산 존재 확인

스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주 추출물의 중의 안트라닐산 존재 확인을 위해 다음의 방법에 따라 시험하였다. 실시예 2에 기재된 방법에 따라 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주의 에틸아세테이트 추출물을 준비하였다. 상기 에틸아세테이트 추출물의 최종 농도를 5mg/ml가 되게 한 후 10ul를 HPLC(Agilent 1100 0.7ml/ml phenomex 4.6 x150 mm, gradient condtion 0분 95:5=물:아세토나이트릴, 12분 0:100=물 아세토나이트릴)에 주입하고, 자외선파장 254nm로 확인하였다. 그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주의 에틸아세테이트 추출물 머무름 시간 7.5분에서 안트라닐산의 피크존재를 확인하여, 이들 추출물이 안트라닐산을 다량 함유하고 있는 것을 확인하였다.

실시예 5. 화합물의 동정

상기 실시예 2에서 분리 및 정제된 화합물이 안트라닐산인지 여부를 확인하고자, NMR, LC-MS 및 자외선 스펙트럼(IR)을 사용하여 동정하고 그 결과를 각각 도 5a, 5b 및 5c에 나타내었다.

그 결과, ¹H NMR에서 6.0ppm에서 8.0ppm 사이에 벤젠고리를 포함하고 있는 것을 알 수 있으며, 커플링 패턴을 통해 1,2 치환기를 포함함을 알 수 있었으며, 질량으로는 [M+H]가 138인 것을 확인 할 수 있었고 따라서 분자량이 137인 천연물이며, 최종적으로 자외선 자료 비교 분석을 통해 안트라닐산임을 확인하였다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC14116BP

수탁일자 : 20200123

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Composition for skin whitening comprising anthranilic acid as active ingredient <130> DPP20194075KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 518F primer <400> 1 ccagcagccg cggtaatac 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 805R primer <400> 3 gactaccagg gtatctaatc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 4 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 5 <211> 1442 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA genes of Streptomyces sp. SCO-736 <400> 5 ggtttgatca tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga 60 tgaagccctt cggggtggat tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct 120 gcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg atatgaccgt ccatcgcatg 180 gtggatggtg taaagctccg gcggtgcagg atgagcccgc ggcctatcag ctagttggtg 240 aggtagtggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact 300 gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg 360 gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct 420 ttcagcaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg 480 ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag 540 ctcgtaggcg gcttgtcacg tcggttgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcagt 600 cgatacgggc aggctagagt tcggtagggg agatcggaat tcctggtgta gcggtgaaat 660 gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc tctgggccga tactgacgct 720 gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780 ggtgggcact aggtgtgggc aacattccac gttgtccgtg ccgcagctaa cgcattaagt 840 gccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900 caagcggcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac 960 atacaccgga aagcatcaga gatggtgccc cccttgtggt cggtgtacag gtggtgcatg 1020 gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080 tcccgtgttg ccagcaggcc cttgtggtgc tggggactca cgggagaccg ccggggtcaa 1140 ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtcttg ggctgcacac 1200 gtgctacaat ggccggtaca atgagctgcg ataccgtgag gtggagcgaa tctcaaaaag 1260 ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat gaagtcggag tcgctagtaa 1320 tcgcagatca gcattgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380 gtcacgaaag tcggtaacac ccgaagccgg tggcccaacc cccttgtggg gagggagctg 1440 tc 1442 <210> 6 <211> 1438 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA genes of Bacillus sp. SNA408 <400> 6 tatacatgca gtcgagcgga tcaatgggga gcttgctccc ctgagatcag cggcggacgg 60 gtgagtaaca cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120 ataccggata atactgacca ccacatggtg gaaagttgaa agatggcttc ggctatcact 180 tacagatggg cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta agggctcacc aaggcgacga 240 tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300 tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatgggcgaa agcctgaccg agcaacgccg 360 cgtgagcgat gaaggccttc gggtcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt 420 tcgaacaggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480 cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg 540 caggcggtct cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gccattggaa 600 actgggggac ttgagtactg gagaggagag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660 agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gccagtaact gacgctgagg 720 cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780 agtgctaggt gttggggggt tccaccctca gtgctgacgt taacacatta agcactccgc 840 ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcag 900 tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatccttc 960 gctacttcta gagatagaag gttccccttc gggggacgaa gtgacaggtg gtgcatggtt 1020 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc 1080 ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140 gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200 gatggtacaa agggcagcaa aaccgcgagg ttgagcgaat cccataaagc cattctcagt 1260 tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagccggaat tgctagtaat cgcggatcag 1320 catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380 tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttggaaccag ccgccgaatg tgattcgg 1438

Claims

하기 화학식 1을 갖는 안트라닐산, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 또는 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물:
[화학식 1]

.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 안트라닐산 생성능을 갖는 스트렙토마이세스 및 바실러스 속 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 상기 균주의 배양물로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 피부 미백용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 균주는 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408(기탁번호: KCTC14116BP) 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 피부 미백용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 상기 균주의 배양물을 추출용매로 추출하여 추출물을 수득하고, 물 및 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 전개 용매로 사용하여 상기 추출물을 크로마토그래피 분리 및 정제한 분획물로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주의 추출물 또는 분획물 형태로 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 것인, 피부 미백용 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 추출물은 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 및 디클로로메탄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매의 추출물인 것인, 피부 미백용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올인, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 안트라닐산, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 또는 유도체를 상기 피부 미백용 조성물 총 중량 기준으로 0.0001 ~ 15 중량% 포함하는 것인, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라노마 세포의 멜라닌 생성을 저해하는 것인, 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제 조성물, 건강기능식품, 또는 의약외품 조성물인 것인, 피부 미백용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인, 피부 미백용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 색소 침착 예방, 완화 또는 개선용 화장료 조성물인, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 연고, 외용연고, 크림, 에센스, 폼, 화장수, 영양화장수, 유연수, 유연화장수, 팩, 유액, 메이크업베이스, 비누, 세정료, 입욕제, 선크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 파운데이션, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 가지는 것인, 피부 미백용 조성물.
안트라닐산 생성능을 갖는 바실러스(Bacillus sp.) SNA408(기탁번호: KCTC14116BP) 균주.
제14항에 있어서, 상기 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)는 서열번호 6의 16 rRNA 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으부터　선택되는 균주를 포함하는 배양물, 이의 건조물 또는 농축물, 또는 상기 배양물, 이의 건조물 또는 농축물을 포함하는 안트라닐산 제조용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 배양물은 상기 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으부터　선택되는 균주 및 배양 배지를 포함하는 것인, 안트라닐산 제조용 조성물.
제17항에 있어서, 상기 배양물은 상기 스트렙토마이세스속(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으부터　선택되는 균주를 배양 배지에서 4 내지 20일 배양시켜 수득된 것인, 안트라닐산 제조용 조성물.
스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 이용한 안트라닐산 제조 방법.
제19항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 것인, 안트라닐산 제조 방법:
a) 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 포함하는 안트라닐산 제조용 조성물에 추출 용매를 가하여 추출물을 얻는 단계; 및
b) 상기 단계 a)에서 얻어진 추출물을 분리 및 정제하는 단계.
제20항에 있어서, 상기 추출 용매는 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 및 디클로로메탄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매인 것인, 제조방법.
제20항에 있어서, 상기 분리 및 정제하는 단계는 크로마토그래피를 사용하여 수행되는 것인, 제조방법.
제22항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 물 및 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 전개 용매로 사용하여 수행되는 것인, 제조방법.
제23항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올인, 제조방법.
제20항에 있어서, 상기 단계 a) 전에 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.) SCO-736 균주(기탁번호:KCTC13805BP) 및 바실러스(Bacillus sp.) SNA408 균주(기탁번호: KCTC14116BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주를 배양 배지에 배양시켜 안트라닐산 제조용 조성물을 얻는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.