KR100488493B1

KR100488493B1 - 궁궁이로부터 분리한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는화합물 및 이를 포함하는 피부미백제

Info

Publication number: KR100488493B1
Application number: KR10-2002-0022036A
Authority: KR
Inventors: 이충환; 고영희; 오태광; 김진희; 백승화
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-04-22
Filing date: 2002-04-22
Publication date: 2005-05-11
Also published as: KR20030083851A

Abstract

본 발명은 궁궁이로부터 분리한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 화합물 및 이를 포함하는 피부미백제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 궁궁이(Angelica polymorpha) 지하부를 알콜로 추출한 추출액 중 크로로포름 가용부를 분리하여 젤여과크로마토그래피하여 단리된 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 신규 화합물과, 이러한 신규 화합물이 함유되어 있는 피부미백제에 관한 것이다.

Description

궁궁이로부터 분리한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 화합물 및 이를 포함하는 피부미백제{Melanin biosynthesis inhibiting compounds purified from Angelica polymorpha, and whitening compositions the same}

멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 타이로시네이즈 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성되어 진다. 이 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져, 최근에는 멜라닌 과잉생성을 예방하는 약제 개발이 활발히 진행되고 있다. 이미 미백효과제로서는 파라-메톡시페놀(p-metoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키거나 세포 본래의 기능을 손상시키는 등 부작용이 있는 경우도 있다. 한편, 멜라닌 생성 억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 저해활성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 따라서 소량으로도 멜라닌 생합성 저해활성을 나타내며, 멜라닌 생합성 저해를 나타내는 물질의 개발이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 멜라닌 생성 저해 활성을 가지는 물질을 천연물로부터 분리하는 연구를 하였고, 그 결과 궁궁이로부터 유효 활성물질을 추출 정제함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 궁궁이(Angelica polymorpha)로부터 분리된 멜라닌 생합성 저해활성을 나타내는 신규 화합물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 궁궁이(Angelica polymorpha)를 알콜 추출 및 젤여과크로마토그래피하여 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 화합물을 분리하는 방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 궁궁이(Angelica polymorpha) 추출물, 또는 궁궁이로부터 분리된 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 유효활성 성분으로 포함되어 있어 멜라닌 생합성 저해하는 피부미백제를 제공하는데 또다른 목적이 있다.

본 발명은 우수한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 그 특징으로 한다.

상기 화학식 1에서, R은 수소원자, , 또는 를 나타낸다.

또한, 본 발명은 궁궁이 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 유효성분으로 함유되어 있어 멜라닌 생합성을 저해하는 피부미백제를 또다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 우수한 멜라닌 생합성 저해 활성성분으로서의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과, 궁궁이 식물로부터 이러한 활성물질을 추출 분리하는 방법에 관한 것이다. 상기한 바대로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 신규 화합물로서 유기 합성방법으로 합성할 수 있고, 또는 본 발명의 방법에 따라 궁궁이로부터 추출 분리할 수도 있다.

궁궁이로부터 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 추출 분리하는 방법은 다음 단계를 포함한다: 1) 궁궁이(Angelica polymorpha)를 저급알콜로 추출하는 단계, 2) 상기 저급알콜 추출액을 크로로포름으로 진탕추출하여 크로로포름 가용부를 회수하는 단계, 3) 상기 크로로포름 가용부를 젤여과크로마토그래피하여 활성분획을 얻는 단계, 및 4) 상기 활성분획을 동결 건조하는 단계.

궁궁이 식물로부터 궁궁이 추출물 또는 활성물질의 분리과정을 그 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다. 먼저, 자생 또는 재배한 궁궁이를 채취하여 쇄절한다. 그리고, 100% 저급알콜으로 24 시간 환류추출하고 감압여과한 후, 그 여액을 20 ∼ 50 ℃ 온도에서 감압농축한다. 그런 다음, 농축된 알콜 추출액을 과량의 물에 현탁하여 분액여두에 넣은 후 과량의 크로로포름을 넣고 진탕추출한다. 상등액을 회수하여 40 ∼ 60 ℃ 온도에서 감압농축하여 크로로포름 가용부를 얻는다. 농축된 크로로포름 가용부를 소량의 메탄올에 용해한 후 젤여과크로마토그래피하여 활성 분액을 모은다. 이때, 크로마토그래피로는 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography), YMC 젤 ODS-A 칼럼 크로마토그래피(YMC gel column chromatography)를 수행하여 활성분액을 모은다. 그리고, 모아진 활성분액은 40 ∼ 60 ℃ 온도에서 감압농축하여 분말로 얻은 후 소량의 증류수에 용해한 후 동결건조한다.

상기한 추출 분리과정 중의 활성물질의 추적은 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) NRRL B-1049의 멜라닌 생성 저해활성의 측정에 기준을 두어 다음과 같이 행하였다. 먼저, 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) NRRL B-1049를 VDYA-한천배지(V-8 주스 200 ㎖, 포도당 2 g, 효모 추출물 2 g, 탄산칼슘 1 g, 한천 20 g, 증류수 800 ㎖, pH 7.2)에서 2 주간 배양시켜 포자를 생성시킨 후 멸균수로 포자현탁액을 만들었다. 0.2%의 효모 추출액을 첨가한 ISP 7번 배지에 포자현탁액 0.2 ㎖씩을 도포한 후 배지표면에 검체를 적신 종이판을 올리고 28 ℃에서 48 시간 배양 후 생성된 환의 크기로 멜라닌 생성 저해도를 판별하였다.

이상의 추출 분리공정에 의해 최종적으로 분리된 활성화합물은 멜라민 생성에 억제 효과가 있는 바, 따라서 본 발명은 궁궁이 식물의 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 함유된 피부미백제를 포함한다. 본 발명에서의 피부미백제는 의약품으로서 직접 사용하거나 또는 화장품, 식품 등에 함유되어 피부질환치료 및 피부 미백효과를 발현 또는 식품의 갈변을 방지하게 된다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 피부미백제를 의약품으로 사용하는 경우, 궁궁이 식물의 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 임상적으로 이용시에는 약학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 약학적 분야에서 통상적인 제제, 예를들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제; 또는 연고제 등의 다양한 제제로 제형화할 수 있다. 통상적인 담체를 상용하여 제조된 약학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를들면 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소적용할 수 있다. 본 발명의 궁궁이 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 투여량은 환자의 나이, 상태 등에 따라 차이가 있으나, 일반적으로 성인에게 1일에 10 ∼ 500 ㎎, 바람직하게는 50 ∼ 300 ㎎의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 1회 내지는 6회 분할투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부미백제를 화장품으로 사용하는 경우, 궁궁이 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 기초제품 화장료(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 오일, 바디 젤), 색조제품 화장료(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 화장료(샴푸, 린스, 헤어 콘디셔너, 헤어 젤) 등에 화장료의 건조중량에 대하여 0.05 ∼ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 궁궁이 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 각종 식료품의 건조중량에 대하여 0.05 ∼ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 미백효과를 가지는 식품을 제조할 수도 있다.

이와 같은 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 궁궁이 추출물의 제조

전국 각처의 산야지에서 채취한 궁궁이 2.4 kg를 쇄절하고 100% 메탄올로 24 시간 동안 환류추출하여 감압여과한 후 그 여액을 40 ℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 농축액을 2L의 증류수에 현탁하였다. 증류수에 현탁시킨 메탄올 추출물은 분액여두에서 2L의 크로로포름으로서 진탕추출하여 크로로포름 가용부를 추출하여 얻은 다음 다시 추출액을 50 ℃의 수조에서 감압농축하였다. 농축후 얻어진 엑기스는 엑기스 총량의 10배의 증류수로 3회 공비 농축하고 동량의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤, 동결 건조시켜 분말 상태의 궁궁이 추출물을 얻었다.

실시예 2 : 궁궁이 추출물로부터 활성화합물의 단리

상기 실시예 1에서 얻은 궁궁이 추출물 20 g을 메탄올 5 ㎖에 용해시킨 후 세파덱스 LH 젤 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 모았다. 상기 활성분획을 80% 메탄올을 용출용매로 이용하는 YMC 젤 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동건조하여 다음과 같은 활성물질(화학식 1a, 1b, 1c 및 1d)을 얻었다.

활성물질 각각에 대해서는 ESI-MS(electron spray ionization mass spectrometer), 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석하였고, 그 결과 다음과 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.

① 물질 성상 : 분말

② 분자량: 318

③ 분자식: C₁₇H₁₈O₆

④ 질량분석치(M+Na): 341(m/z)

또한, 듀트로 메탄올을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기 화학식 1a로 표시되는 화합물로 판명되었다[도 1a 및 도 1b 참조].

① 물질 성상 : 분말

② 분자량: 216

③ 분자식: C₁₂H₈O₄

④ 질량분석치(M+Na): 239(m/z)

또한, 듀트로 메탄올을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기 화학식 1b로 표시되는 화합물로 판명되었다[도 2a, 도 2b 참조].

① 물질 성상 : 분말

② 분자량: 286

③ 분자식: C₁₆H₁₄O₅

④ 질량분석치(M+Na): 309(m/z)

또한, 듀트로 메탄올을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기 화학식 1c로 표시되는 화합물로 판명되었다[도 3a, 도 3b 참조].

① 물질 성상 : 분말

② 분자량: 322

③ 분자식: C₁₆H₁₅ClO₅

④ 질량분석치(M+Na): 345(m/z)

또한, 듀트로 메탄올을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기 화학식 1d로 표시되는 화합물로 판명되었다[도 4a, 도 4b 참조].

실시예 3 : 물질의 역가

상기 실시예 1에서 얻은 궁궁이 추출물 및 실시예 2에 따른 궁궁이로부터 추출 분리된 활성 물질 각각에 대해서는 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) NRRL B-1049의 멜라닌 생성 저해 활성을 조사하였고, 그 결과 상기 활성물질은 페이퍼 디스크 당 30 ㎍의 농도에서 각각 25, 13, 15, 12 mm의 저해범위를 나타내었다.

스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) NRRL B-1049의 멜라닌저해 활성 비교

시 료	각 농도별 저해 환의 지름(mm)
시 료	10 ㎍	20 ㎍	30 ㎍
궁궁이 추출물	9	10	13
화학식 1a	12	20	25
화학식 1b	10	11	14
화학식 1c	12	13	15
화학식 1d	10	11	12
코지산	0	0	0
하이드로퀴논	10	19	25

상기 표 1에 따르면, 궁궁이 추출물 그리고 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 모두 멜라닌 생성 저해활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 정제의 제조

본 발명의 궁궁이 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

궁궁이 추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 옥수수 전분 113 mg, 무수에탄올 적량.

실시예 5 : 연고제의 제조

본 발명의 궁궁이 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

궁궁이 추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알콜 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량

실시예 6 : 주사제의 제조

본 발명의 궁궁이 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

궁궁이 추출물 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 물 2974 mg

실시예 7 : 화장료의 제조

본 발명의 궁궁이 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 에센스를 제조하였다.

[조성]

궁궁이 추출물 10.0 mg, 글리세린 3.0 mg, EDTA 0.05 mg, 벤조페논-9 0.04 mg, 카르복시비닐 폴리머 0.2 mg, 트리에탄올아민 0.18 mg, 옥시도테세스-25 0.6 mg, 글리세릴모노스테아레이트 1.0 mg, 방부제 0.01 mg, 향료 0.01 mg, 정제수 잔량

[독성 실험 결과]

본 발명이 궁궁이 식물로부터 얻은 추출물 및 활성물질은 천연물로서 독성에 대한 염려가 전혀 없다. 본 발명이 궁궁이로부터 얻은 추출물 및 활성물질에 대한 독성을 알아보기 위하여, 활성물질 1 ∼ 20 ㎎을 24 마리의 생쥐에게 복강내 투여하여 행동 관찰 후 24시간 생존 여부를 확인하였다. 그 결과 20 ㎎을 투여한 6 마리중 3 마리가 생존하고 나머지 3 마리는 희생당하였음을 알 수 있었다. 반면에, 20 ㎎ 미만의 용량을 투여한 생쥐의 경우는 모두 생존하였으며, 행동 관찰상 약물을 투여하지 않았던 생쥐와 비교하여 통계학상의 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과를 고려할 때, 생쥐에서 화학식 1의 화합물의 대략적인 반수가 생존할 독성 용량(TD₅₀)은 20 mg(1 mg/g)으로 판단된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 궁궁이 추출물 및 화학식 1로 표시되는 화합물은 멜라닌 생성을 억제하는 활성 성분으로서 피부미백제의 새로운 약제의 개발에 유용하다.

도 1a는 화학식 1a로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명(¹H-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 1b는 화학식 1a로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명(¹³C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고

도 2a는 화학식 1b로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명(¹H-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 2b는 화학식 1b로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명(¹³C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 3a는 화학식 1c로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명(¹H-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 3b는 화학식 1c로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명(¹³C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 4a는 화학식 1d로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명(¹H-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 4b는 화학식 1d로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명(¹³C-NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 , 또는 를 나타낸다.
다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 함유되어 있어 멜라닌 생합성을 저해하는 피부미백제.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 수소원자, , 또는 를 나타낸다.
궁궁이(Angelica polymorpha) 추출물이 유효성분으로 함유되어 있어 멜라민 생합성을 저해하는 피부미백제.
제 3 항에 있어서, 상기 추출물에는 다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 피부미백제.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 수소원자, , 또는 를 나타낸다.
1) 궁궁이(Angelica polymorpha)를 저급알콜로 추출하는 단계, 2) 상기 저급알콜 추출액을 크로로포름으로 진탕추출하여 크로로포름 가용부를 회수하는 단계, 3) 상기 크로로포름 가용부를 젤여과크로마토그래피하여 활성분획을 얻는 단계, 및 4) 상기 활성분획을 동결 건조하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 궁궁이 추출물의 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 젤여과크로마토그래피는 세파덱스 LH-20 젤 칼럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 gel column chromatography)와 YMC 젤 ODS-A 칼럼크로마토그래피(YMC gel ODS-A column chromatography)인 것을 특징으로 하는 제조방법.