KR100516204B1

KR100516204B1 - 이나무로부터 분리한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는유효활성물질 및 이를 포함하는 피부미백제

Info

Publication number: KR100516204B1
Application number: KR10-2003-0020857A
Authority: KR
Inventors: 이충환; 고영희; 오태광; 윤석란; 백승화
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2005-09-23
Also published as: KR20040085981A

Abstract

본 발명은 이나무로부터 분리한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 유효활성물질 및 이를 포함하는 피부미백제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 이나무(Idesia polcarpa) 지하부를 알콜로 추출한 추출액 중 에틸아세테이트 가용부를 분리하여 젤여과크로마토그래피하여 단리된 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 화합물과, 이러한 화합물이 함유되어 있는 피부미백제에 관한 것이다.

Description

이나무로부터 분리한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 유효활성물질 및 이를 포함하는 피부미백제{Melanin biosynthesis inhibiting compounds purified from Idesia polcarpa, and whitening compositions the same}

본 발명은 이나무로부터 분리한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 화합물 및 이를 포함하는 피부미백제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 이나무(Idesia polcarpa)를 알콜로 추출한 추출액 중 에틸아세테이트 가용부를 분리하여 젤여과크로마토그래피하여 단리된 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 신규 화합물과, 이러한 화합물이 함유되어 있는 피부미백제에 관한 것이다.

멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 타이로시네이즈 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성되어 진다. 이 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉 생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져, 최근에는 멜라닌 과잉생성을 예방하는 약제 개발이 활발히 진행되고 있다. 이미 미백효과제로서는 파라-메톡시페놀(p-metoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키거나 세포 본래의 기능을 손상시키는 등 부작용이 있는 경우도 있다. 한편, 멜라닌 생성 억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 저해활성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 따라서 소량으로도 멜라닌 생합성 저해활성을 나타내며, 멜라닌 생합성 저해를 나타내는 물질의 개발이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 멜라닌 생성 저해 활성을 가지는 물질을 천연물로부터 분리하는 연구를 하였고, 그 결과 이나무로부터 유효활성물질을 분리하고, 이 물질이 멜라닌 생합성 저해활성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 멜라닌 생합성 저해활성을 나타내는 이나무 추출물 및 이나무로부터 분리된 유효활성물질을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 이나무(Idesia polcarpa)을 알콜 추출 및 젤여과크로마토그래피하여 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 유효활성물질을 분리하는 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 이나무(Idesia polcarpa) 추출물, 또는 이나무로부터 분리된 유효활성물질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 포함된 피부미백제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 우수한 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 이나무(Idesia polcarpa) 추출물 및 이로부터 분리된 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 이나무 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 유효성분으로 함유되어 있어 멜라닌 생합성을 저해하는 피부미백제를 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 우수한 멜라닌 생합성 저해 활성성분으로서의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과, 이나무 식물로부터 이러한 활성물질을 추출 분리하는 방법에 관한 것이다. 상기한 바대로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화합물로서 유기 합성방법으로 합성할 수 있고, 또는 본 발명의 방법에 따라 이나무로부터 추출 분리할 수도 있다.

이나무로부터 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 추출 분리하는 방법은 다음 단계를 포함한다: 1) 이나무(Idesia polcarpa)를 저급알콜로 추출하는 단계, 2) 상기 저급알콜 추출액을 에틸아세테이트으로 진탕추출하여 에틸아세테이트 가용부를 회수하는 단계, 3) 상기 에틸아세테이트 가용부를 젤여과크로마토그래피하여 활성분획을 얻는 단계, 및 4) 상기 활성분획을 동결 건조하는 단계.

이나무 식물로부터 이나무 추출물 또는 활성물질의 분리과정을 그 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 자생 또는 재배한 이나무를 채취하여 쇄절한다. 그리고, 100% 저급알콜으로 24 시간 환류추출하고 감압여과한 후, 그 여액을 20 ∼ 50 ℃ 온도에서 감압농축한다. 그런 다음, 농축된 알콜 추출액을 과량의 물에 현탁하여 분액여두에 넣은 후 과량의 에틸아세테이트를 넣고 진탕추출한다. 상등액을 회수하여 40 ∼ 60 ℃ 온도에서 감압농축하여 에틸아세테이트 가용부를 얻는다. 농축된 에틸아세테이트 가용부를 소량의 메탄올에 용해한 후 젤여과크로마토그래피하여 활성 분액을 모은다. 이때 YMC 젤 ODS-A 칼럼 크로마토그래피(YMC gel column chromatography)를 수행하여 활성분액을 모은다. 그리고, 모아진 활성분액은 40 ∼ 60 ℃ 온도에서 감압농축하여 분말로 얻은 후 소량의 증류수에 용해한 후 동결건조한다.

상기한 추출 분리과정 중의 활성물질의 추적은 멜란-에이 셀(melan-a cell) 의 멜라닌 생성률의 측정과 웨스턴 블라팅(Western bolting) 실험을 통해 멜라닌 생성의 주 요인인 타이로시네이즈 단백질 형성을 저해하는 것을 기준으로 두어 다음과 같이 행하였다.

먼저, 멜란-에이 셀(melan-a cell)을 10% 혈청(Fetal Bovine Serum)이 첨가된 알피엠아이 1640(RPMI 1640) 배지에 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 ㎍/㎖를 첨가하고 사용하기 직전에 200 nM 티피에이(TPA, Pohrbol-12-myristate 13-acetate)를 첨가하여 배양한 후, 24 웰(24 well)에 1 ×10⁵cells/㎖로 분주한 뒤 24시간 후, 검체를 농도별로 3일을 처리한 후, 하루 더 배양하고 생성된 멜라닌 양을 대조구를 100%로 놓고 비교하여 판별하였다. 그 다음 웨스턴 블라팅 실험을 다음과 같이 실시하였다. 각 농도별로 처리한 셀을 모아서 셀 안에 있는 단백질을 전기영동 실시한 후, 전기영동한 젤을 피브이디에프(PVDF, polyvinylidene fluoride) 막에 옮긴 후, 타이노시네이즈에 특이적으로 부착하는 항체(antibody)를 넣어 반응시킨 후, 부착한 항체를 형광으로 발광하는 양을 필름에 현상하여 형성된 단백질의 밴드(band)의 크기를 비교하여 판별하였다. 웨스턴 블라팅 실험시 동일한 양이 로딩(loading) 되었는지 확인하기 위해 베타-액틴(β- actin) 항체를 사용하여 확인하였다.

이상의 추출 분리공정에 의해 최종적으로 분리된 활성화합물은 멜라닌 생성에 억제 효과가 있는 바, 따라서 본 발명은 이나무 식물의 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 함유된 피부미백제를 포함한다. 본 발명에서의 피부미백제는 의약품으로서 직접 사용하거나 또는 화장품, 식품 등에 함유되어 피부질환치료 및 피부 미백효과를 발현 또는 식품의 갈변을 방지하게 된다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 피부미백제를 의약품으로 사용하는 경우, 이나무 식물의 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 임상적으로 이용시에는 약학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 약학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제; 또는 연고제 등의 다양한 제제로 제형화할 수 있다. 통상적인 담체를 상용하여 제조된 약학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소적용할 수 있다.

본 발명의 이나무 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 투여량은 환자의 나이, 상태 등에 따라 차이가 있으나, 일반적으로 성인에게 1일에 10 ∼ 500 ㎎, 바람직하게는 50 ∼ 300 ㎎의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 1회 내지는 6회 분할투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부미백제를 화장품으로 사용하는 경우, 이나무 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 기초제품 화장료(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 오일, 바디 젤), 색조제품 화장료(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 화장료(샴푸, 린스, 헤어 콘디셔너, 헤어 젤) 등에 화장료의 건조중량에 대하여 0.05 ∼ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 이나무 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 각종 식료품의 건조중량에 대하여 0.05 ∼ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 미백효과를 가지는 식품을 제조할 수도 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 이나무 추출물의 제조

전국 각처의 산야지에서 채취한 이나무 2.4 kg를 쇄절하고 100% 메탄올로 24 시간 동안 환류추출하여 감압여과한 후 그 여액을 40 ℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 농축액을 2L의 증류수에 현탁하였다. 증류수에 현탁시킨 메탄올 추출물은 분액여두에서 2L의 에틸아세테이트로서 진탕추출하여 에틸아세테이트 가용부를 추출하여 얻은 다음 다시 추출액을 50 ℃의 수조에서 감압농축하였다. 농축후 얻어진 엑기스는 엑기스 총량의 10배의 증류수로 3회 공비 농축하고 동량의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤, 동결 건조시켜 분말 상태의 이나무 추출물을 얻었다.

실시예 2: 이나무 추출물로부터 활성물질의 단리

상기 실시예 1에서 얻은 이나무 추출물 20 g을 메탄올 5 ㎖에 용해시킨 후 YMC 젤 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 분리하고 감압건조기로 용매를 제거한 후 얻은 잔사(residue)를 냉동건조하여 다음과 같은 활성물질(화학식 1)을 얻었다.

활성물질에 대해서는 ESI-MS(electron spray ionization mass spectrometer), 핵자기 공명 스펙트럼 등의 방법을 이용하여 이화학적 특성을 분석하였고, 그 결과 다음과 같은 이화학적 특성을 갖는 것으로 확인되었다.

[화학식 1]

① 물질 성상 : 분말

② 분자량: 440

③ 분자식: C₂₀H₂₄O₁₁

④ 질량분석치(M+Na): 341(m/z)

또한, 듀트로 메탄올을 용매로 이용하여 측정한 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석결과, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로 판명되었다[도 1 및 도 2].

실시예 3: 활성물질의 역가

상기 실시예 1에서 얻은 이나무 추출물 및 실시예 2에 따른 이나무로부터 추출 분리된 활성 물질 각각에 대해서는 멜란-에이 셀(melan-a cell) 의 멜라닌 생성 양을 조사하였고, 그 결과 상기 활성물질은 20 ppm에서 48%, 10 ppm에서 59%, 5 ppm에서 71%의 멜라닌 양을 나타내었다[표 1]. 웨스턴 블라팅 결과 동일한 로딩 양에서 대조구와 비교하여 8 ppm에서 타이로시네이즈 단백질 밴드의 감소가 확인되었다[도 3].

멜란-에이 셀(melan-a cell) 의 멜라닌저해 활성 비교

시 료	멜란-에이 셀(melan-a cell) 멜라닌 양(%)
시 료	5 ppm	10 ppm	20 ppm
이나무 추출물	90	72	60
화학식 1	71	59	48
코지산	0	0	0
하이드로퀴논	70	88	-

상기 표 1과 도 3에 따르면, 이나무 추출물 그리고 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 모두 멜라닌 생성 저해활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 독성 실험

본 발명이 이나무 식물로부터 얻은 추출물 및 활성물질은 천연물로서 독성에 대한 염려가 전혀 없다. 본 발명이 이나무로부터 얻은 추출물 및 활성물질에 대한 독성을 알아보기 위하여, 활성물질 1 ∼ 20 ㎎을 24 마리의 생쥐에게 복강내 투여하여 행동 관찰 후 24시간 생존 여부를 확인하였다. 그 결과 20 ㎎을 투여한 6 마리중 3 마리가 생존하고 나머지 3 마리는 희생당하였음을 알 수 있었다. 반면에, 20 ㎎ 미만의 용량을 투여한 생쥐의 경우는 모두 생존하였으며, 행동 관찰상 약물을 투여하지 않았던 생쥐와 비교하여 통계학상의 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과를 고려할 때, 생쥐에서 화학식 1의 화합물의 대략적인 반수가 생존할 독성 용량(TD₅₀)은 20 mg(1 mg/g)으로 판단된다.

제조예 1: 정제의 제조

본 발명의 이나무 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

이나무 추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 옥수수 전분 113 mg, 무수에탄올 적량.

제조예 2: 연고제의 제조

본 발명의 이나무 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

이나무 추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알콜 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량

제조예 3: 주사제의 제조

본 발명의 이나무 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

이나무 추출물 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 물 2974 mg

제조예 4: 화장료의 제조

본 발명의 이나무 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 에센스를 제조하였다.

[조성]

이나무 추출물 10.0 mg, 글리세린 3.0 mg, EDTA 0.05 mg, 벤조페논-9 0.04 mg, 카르복시비닐 폴리머 0.2 mg, 트리에탄올아민 0.18 mg, 옥시도테세스-25 0.6 mg, 글리세릴모노스테아레이트 1.0 mg, 방부제 0.01 mg, 향료 0.01 mg, 정제수 잔량

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 이나무 추출물 및 활성물질은 멜라닌 생성을 억제하는 활성 성분으로서 피부미백제의 새로운 약제의 개발에 유용하다.

도 1은 화학식 1로 표시되는 화합물의 웨스턴 블라팅(Western bolting) 실험 결과를 나타낸 것이다.

Claims

이나무(Idesia polcarpa) 추출물이 유효성분으로 함유되어 있어 멜라닌 생합성을 저해하는 피부미백용 약제.
제 1 항에 있어서, 상기 추출물에는 다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 피부미백용 약제.

[화학식 1]
1) 이나무(Idesia polcarpa)를 저급알콜로 추출하는 단계, 2) 상기 저급알콜 추출액을 에틸아세테이트으로 진탕추출하여 에틸아세테이트 가용부를 회수하는 단계, 3) 상기 에틸아세테이트 가용부를 젤여과크로마토그래피하여 활성분획을 얻는 단계, 및 4) 상기 활성분획을 동결 건조하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 이나무로부터 유효활성물질의 분리방법.
제 3 항에 있어서, 상기 젤여과크로마토그래피는 YMC 젤 ODS-A 칼럼크로마토그래피(YMC gel ODS-A column chromatography)인 것을 특징으로 하는 분리방법.
이나무(Idesia polcarpa) 추출물이 유효성분으로 함유되어 있어 멜라닌 생합성을 저해하는 피부미백용 화장료.
제 5 항에 있어서, 상기 추출물에는 다음 화학식 1로 표시되는 화합물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 피부미백용 화장료.

[화학식 1]