KR102670238B1 - 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물인 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및 스테아르산(Stearic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물은 멜라닌 생성과정의 타이로시나제의 활성을 억제하여 멜라닌 침착을 억제하는 효과가 있으므로, 피부 미백용 분야에 널리 활용될 수 있다.

Description

타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물 {Composition for skin whitening containing compound having tyrosinase inhibitory activity}
본 발명은 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
피부는 물리적, 화학적인 외부의 자극으로부터 1차적으로 체내를 보호하는 기능을 갖는다. 피부에 존재하는 멜라닌(melanin)은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 자외선 등 외부 환경으로부터 신체를 보호하며, 환경에 대한 세포의 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질로 알려져 있다. 반면, 멜라닌의 과잉생산은 기미, 주근깨, 검버섯 등을 생성하고 피부노화를 촉진시키고 피부암 유발과도 관련이 있다고 보고되고 있다.
피부 미백과 밀접한 관련이 있는 색소 침착(pigmentation)은 피부 표피 기저층에 있는 멜라닌 세포(melanocyte)에서 일어난다. 색소 침착은 티로시나아제(tyrosinase)의 활성에 의하여 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있는데 주로 자외선, 염증, DNA 손상, 활성산소에 의하여 과색소 침착(hyperpigmentation)이 유도된다.
멜라닌의 주요한 기능은 이러한 유해라디칼을 제거하여 이에 의한 손상으로부터 피부를 보호하는 것이다. 따라서 멜라닌의 양이 많다는 것은 물리적 또는 화학적 독성 물질로부터 피부를 보호할 수 있는 효과적인 대응 체계를 가지고 있다는 것을 의미한다. 이러한 멜라닌의 생성을 촉진하는 요인으로서는 햇빛, 자외선 뿐만 아니라 에스트로겐 또는 프로스타글라딘 등이 있다. 멜라닌의 생합성은 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)의 멜라노좀(melanosome)에서 타이로시네이즈(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein-1), DCT(dopachrome tautomerase) 등 특이적인 효소의 연속적 산화 반응에 의해서 일어나는데, 그 중 멜라닌 합성의 주요 효소인 타이로시네이즈 활성 저해 실험이 멜라닌 중합체 억제제 개발의 초기 단계에서 채택되고 있다. 그러나 타이로시네이즈에 의한 산화 반응 이외에 피부 속 멜라닌의 생성 경로에 영향을 미치는 인자 중에는 Advanced glycation end products(AGEs) 반응 혹은 non-enzymatic glycation 반응이 있다. 당화 반응(glycation)은 당과 단백질의 비효소적인 반응으로 환원당의 카르보닐기(carbonyl)와 단백질의 유리 아미노기인 리신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)과 반응하여 초기 당화 생성물인 시프 염기(schiff base)를 형성하고 이렇게 형성된 화합물들이 계속적으로 재배열 교차 결합 등의 일련 반응을 통하여 갈색의 화합물(Browning)인 비가역적 최종당화산물 (Advanced glycation end products, AGEs)을 생성하는 반응이다.
기미 주근깨 또는 색소 침착 등과 같은 피부 색소 이상 침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생된 과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시켜 주기 위해서, 이전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합 사용하여 왔는데, 이들은 불충분한 미백효과 피부에 대한 안전성 문제 화장료에 배합시 제형 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.
화학 합성 화합물에 대한 부작용을 최소화하기 위하여, 미백 활성을 갖는 천연 추출물에 대한 많은 연구들이 있었다.
한국공개특허 제2021-0108911호는 로즈마리 이온성 액체 추출물을 포함하는 항산화 또는 미백용 조성물을 개시하였고, 한국등록특허 제2198589호는 바위돌꽃, 바위손, 맨드라미 및 쑥 혼합추출물과 피톨(phytol)의 복합물을 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물을 개시하였으며, 한국공개특허 제2020-045355호는 무레스즈메 뿌리 추출물을 함유하는 미백용 화장료 조성물을 개시하였다.
본 발명자들은 그동안 많이 연구되던 식물 이외 곤충으로부터 피부 미백활성을 갖는 소재를 탐색하던 중 지네로부터 분리한 화합물이 타이로시나제 저해 활성을 갖는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피부 부작용을 유발하지 않으며, 타이로시나제 저해 활성이 우수한 피부 미백용 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및 스테아르산(Stearic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 유래 화합물은 멜라닌 생성과정의 타이로시나제의 활성을 억제하여 멜라닌 침착을 억제하는 효과가 있으므로, 피부 미백용 분야에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 지네 주정 추출물로부터 순차적으로 각 용매별 분획물을 수득하는 공정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 지네 증류수 추출물로부터 순차적으로 각 용매별 분획물을 수득하는 공정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 지네 주정 100% 추출물 클로로포름 분획층의 GC/MS 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 지네 주정 100% 추출물 에틸아세테이트 분획층의 GC/MS 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 지네 증류수 추출물 헥산 분획층의 GC/MS 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 지네 증류수 추출물의 클로로포름 분획층의 GC/MS 그래프이다.
본 발명에서는 잠재력은 있지만, 아직까지 널리 활용되고 있지 않은 지네(Scolopendra subspinipes mutilans)로부터 신규 생리활성물질을 갖는 화합물을 분리할 수 있음을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 지네를 주정 및 증류수로 각각 추출한 다음, 지네 추출물을 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시키고, 각 분획층을 GC/MC로 주요성분을 분석하고, 주요 화합물들의 생리활성을 평가하였다. 그 결과 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및 스테아르산(Stearic acid)이 타이로시나제 저해 활성이 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및 스테아르산(Stearic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물인 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및 스테아르산(Stearic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물은 약학용, 화장료 또는 건강기능식품용으로 활용 가능하다.
상기 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 약학용 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 함유하는 약학용 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
상기 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 화장료 조성물은 피부 등에 사용할 수 있고, 피부 미백 효과를 위하여 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및/또는 스테아르산(Stearic acid)의 함량은 용도, 적용 형태, 사용 목적 및 소망하는 효과에 따라서 적절히 조절 가능하며, 함량 대비 효과를 고려하여, 예컨대 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 99.9 중량% 이내에서 사용할 수 있다.
본 발명의 피부 미백용 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 경피에 도포에 의한 국부 투여 (Topical application) 방식으로 적용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 피부 및 두피에 경피적으로 적용되고, 기초 화장품, 가슴 및 둔부 전용 크림, 메이크업 화장품, 바디 제품, 면도용 제품, 모발 제품 등을 포함한 모든 화장품 제품의 제조에 사용 가능한 조성물을 의미하는 것으로, 경구제, 스프레이, 현탁액, 유액, 크림, 젤, 폼 등의 형태로 제제화된 것일 수 있으나 그 형태에 특별한 제한이 없다.
또한, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양 크림, 마사지크림, 아이크림, 아이 에센스, 에센스, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디 크림, 보디 에센스, 보디 세정제, 자외선 차단 크림, 염모제, 샴푸, 린스, 치약, 구강 청정제, 로션, 연고, 젤, 크림, 패치 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것을 포함한다.
상기 타이로시나제 저해 활성을 갖는 화합물을 포함하는 건강기능식품 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 본 발명의 피부 미백용 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상의 제품화 및 제제화에 사용 가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 향료, 색소, 살균제, 산화 방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 부형제, 희석제, 무기염류 및 합성 고분자 물질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 종류와 함량은 최종 산물의 용도 및 사용 목적에 따라 적절하게 조절할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 지네 주정100% 추출물 제조
지네(438.55 g)를 믹서(Green-mix; DA5500)로 분쇄하고, 분쇄된 지네에 주정 1 L를 넣고, 실온에서 72시간동안 교반 추출하였다. 다음으로 추출물을 여과 후 감압농축(Rotary vacuum evaporator; EYELA)하여 각 주정 추출물 40.276 g (수율 9.18%)을 얻었다. 이 주정 100% 추출물을 n-Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, n-butanol 및 증류수로 순차 분획을 실시하고, n-Hexane(18.93g), Chloroform(3.67g), Ethyl acetate(0.67g), n-butanol(7.58g) 및 증류수(8.21g)의 분획물을 얻었다 (도 1 참조).
실시예 2: 지네 증류수 추출물 제조
지네(150 g)를 믹서(Green-mix; DA5500)로 분쇄하고, 분쇄된 지네에 증류수 1 L를 넣고, 실온에서 72시간동안 교반 추출하였다. 다음으로 추출물을 여과 후 감압농축(Rotary vacuum evaporator; EYELA)하여 각 증류수 추출물 5.337 g (수율 3.56%)을 얻었다. 이 증류수 추출물을 n-Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, n-butanol 및 증류수로 순차 분획을 실시하고, n-Hexane(0.45g), Chloroform(1.47g), Ethyl acetate(0.17g), n-butanol(2.01g) 및 증류수(2.37g)의 분획물을 얻었다 (도 2 참조).
실시예 3: 추출물 성분 분석
실시예 1에서 획득한 주정 100% 추출물 분획물 및 실시예 2에서 획득한 증류수 추출물 분획물의 성분을 분석하기 위해 각 시료는 메탄올에 녹이고 마이크로 필터(0.45 um)를 이용하여 전처리 하였다. 시료 분석은 GC/MS 장비(450GC-240MS, Varian)를 이용하여 다음과 같은 조건으로 진행하였다. 컬럼은 VF-5ms(30mm × 0.25mm × 0.25mm), 이동 기체로는 He 1 mL/min, 주입온도는 280 ℃, 오븐 50~300 ℃, 주입 부피 1 uL, 주입모드는 스플릿 비율(Split ratio) 30:1 조건에서 성분분석을 하였으며 MSD(Mass Selective Detector)에서 질량 범위 28~550, 수집 모드(acquisition mode)는 스캔모드(scan mode) 조건으로 성분들을 정성 분석 하였다.
지네 주정 100% 추출물 클로로포름 분획층의 GC/MS 결과는 표 1 및 도 3, 지네 주정 100% 추출물 에틸아세테이트 분획층의 GC/MS 결과는 표 2 및 도 4에 나타내었다.
No. R.T.1) (min) Compound M.F.2) Area % Total3)
1 45.334 6-Amino-3H-quinazolin-4-one C8H7N3O 1.784e+6 7.254
2 46.053 Isophthalic acid, 2,3-dichlorophenyl propyl ester C17H14Cl2O4 371593 1.511
3 57.853 6-Octadecenoic acid C18H34O2 411762 1.675
4 72.489 Oleic anhydride C36H66O3 283045 1.151
5 81.645 Cholesterol C27H46O 673813 2.740
1)Retention time 2)Molecular formula 3)Peak area %
No. R.T.1) (min) Compound M.F.2) Area % Total3)
1 38.153 4-Hydroxyphenylacetic acid C8H8O3 672426 2.000
2 38.383 Gallacetophenone C8H8O4 582576 1.733
3 45.375 5-phenylthiazole C9H7NS 4.506e+6 13.401
4 81.646 Cholesterol C27H46O 1.265e+6 3.761
1)Retention time 2)Molecular formula 3)Peak area %
또한, 지네 증류수 추출물 헥산 분획층의 GC/MS 결과는 표 3 및 도 5, 지네 증류수 추출물 클로로포름 분획층의 GC/MS 결과는 표 4 및 도 6에 나타내었다.
No. R.T.1) (min) Compound M.F.2) Area % Total3)
1 41.943 7-Amino-4-methylcoumarin C10H9NO2 44549 0.217
2 45.339 6-Amino-3H-quinazolin-4-one C8H7N3O 194870 0.949
3 46.053 6-methoxy-2-methyl-4H-benzo[d][1,3]oxazin-4-one C10H9NO3 50949 0.248
4 52.419 Methyl pentadecanoate C16H32O2 96985 0.472
5 53.417 Stearic acid C18H36O2 33456 0.163
6 57.819 6,9,12,15-Docosatetraenoic acid, methyl ester C23H38O2 403342 1.963
7 58.613 2-Monoolein C21H40O4 158785 0.773
1)Retention time 2)Molecular formula 3)Peak area %
No. R.T.1) (min) Compound M.F.2) Area % Total3)
1 43.805 Uric acid C5H4N4O3 15981 0.083
2 45.337 6-Amino-3H-quinazolin-4-one C8H7N3O 312509 1.615
3 46.055 Isophthalic acid, 2,3-dichlorophenyl propyl ester C17H14Cl2O4 55746 0.288
4 52.402 Methyl pentadecanoate C16H32O2 30982 0.160
5 53.419 Stearic acid C18H36O2 22291 0.115
6 58.615 2,3-Dihydroxypropyl elaidate C21H40O4 75382 0.390
1)Retention time 2)Molecular formula 3)Peak area %
실험예 1: GC/MS 분석에서 선별한 4종의 성분에 대한 In vitro tyrosinase 활성 저해 평가
타이로시나제는 인체 내 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서, 이 효소의 활성 저해는 멜라닌 생성을 저해하는 결과를 나타낸다. 본 실험예에서는 시험관 내에서 시험시료, 정제된 타이로시나제 및 기질인 타이로신을 반응시켜 타이로시나제 활성 저해에 대한 시험시료의 효과를 평가하였다.
GC/MS로 분석하여 찾은 성분 시료(10⁴mg/L)중 타이로시나제 활성이 알려져 있지 않으면서, 수율이 높은 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및 스테아르산(Stearic acid) 4종의 화합물을 Methanol에 녹이고, 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 uL, 시료액 20 uL, 머쉬룸 타이로시나제액(1500 U/mL) 20 uL를 순서대로 넣었다. 이 액에 1.5 mM 타이로신액 40uL를 넣고 37 ℃에서 10분 동안 반응시킨 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 활성저해율이 50%일 때의 시료 농도(IC50)를 적절한 프로그램을 이용하여 산출 후, 시료액 대신 시료를 녹인 용매를 사용하여 공시료 액으로 하여 보정하고 그 결과를 표 5에 나타내었다. 양성대조군으로는 Ascorbic acid를 사용하여 그 결과를 표 6에 나타내고, 비교하였다.
시료 Tyrosinase 활성 저해율(%)
10²(mg/L) 10³(mg/L) 10⁴(mg/L)
Oleic anhydride 23.97 30.84 66.02
stearic acid 10.53 17.40 30.12
4-Hydroxyphenylacetic acid 2.63 62.95 82.31
7-Amino-4-methylcoumarin 10.53 64.67 72.12
Ascorbic acid 농도(mg/L) 125 250 500 1000
저해율(%) 2.11 6.66 23.23 73.99
표 5로부터, 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid) 및 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin)는 타이로시나제 활성 저해능이 우수하고, 스테아르산(Stearic acid)은 상기 3종의 화합물 보다는 효과가 낮지만, 타이로시나제 활성 저해능이 있다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 타이로시나제 저해 활성을 갖는 올레산 무수물(Oleic Anhydride), 4-하이드록시페닐아세틱산(4-Hydoroxyphenylacetic acid), 7-아미노-4-메틸쿠마린(7-Amino-4-methylcoumarin) 및 스테아르산(Stearic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 지네(centipede)에서 유래된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물임을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물임을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
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