JPS645010B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ある種の疾病時に患者の血中に発現
する種々の有害物質と特異的に結合し抗体として
作用するγ―グロブリンが固定化されたカラムの
製造法に関するものであり、さらに詳しくは、上
記γ―グロブリンを担体に担持固定化し、これを
ラクトース、マンノース、シユークロース、グル
コースのいずれか一種の糖の存在下に凍結乾燥し
てカラムに充填するか、カラムに充填してからラ
クトース、マンノース、シユークロース、グルコ
ースのいずれか一種の糖の存在下に凍結乾燥した
後、エチレンオキサイドガスにより滅菌すること
により長期保存安定性を有するγ―グロブリン固
定化カラムの製造法に関する。 近年になつて、ある種の疾病時には患者の血中
に種々の有害物質が多量に発現し、これらの有害
物質を特異的に除去すれば疾病の治療に役立つこ
とが認められ、例えば、特開昭53−136379号公報
などに見られるように、これら有害物質を除去す
る装置を開発する試みがなされるようになつてき
た。 しかし、これらの装置の開発の初期の目的が、
有害物質を除去するためにどのような有害物質捕
捉剤をどのように担持させて使用するかを知るこ
とであつたゝめ、これらの有害物質除去装置の滅
菌方法については、特開昭54−143588号公報の従
来技術の説明の部分になされているように、今だ
充分に研究が進んでいないのが現状である。 このような滅菌方法としては、例えば、前記特
開昭54−143588号公報の発明のように、無菌化さ
れた担体樹脂に、過除菌化された酵素を無菌操
作で担持させる方法、あるいは、トランス・アメ
リカン・ソサエテイ・アーテイフイシヤル・イン
ターナル・オーガンズ（Trans.Amer.Soc.Artif.
Int.Organs.），18 54―59（1972）に見られるよ
うに、通常の手段により無菌化を考慮することな
く組立てた固定化カラムの下部もしくは上下両端
部に滅菌された除菌フイルターを付属する方法等
が行われていた。 しかしながら、前者の滅菌方法では、装置の組
立て作業が繁雑であり、また後者の方法では、固
定化カラム自体が滅菌されておらず、疾病患者の
体液を体外環流させて固定化カラムに通し治療す
ることができるほど充分に安全性が確保されてい
るとは云い難いものであつた。 さらに、上述の滅菌された固定化カラムは、い
ずれも乾燥されたものではなく、長期保存の点で
不安があつた。一般に、乾燥され滅菌された抗体
固定化カラムについての提案は、今迄になされて
おらず、当然ながらγ―グロブリンに関して、本
発明のような提案は全く無いのが現状であつた。 このように、疾病患者の体液を体外環流させて
抗体固定化カラムに通し、特異的に有害物質を除
去することにより、真に医療に役立てるために
は、安全かつ効率的に治療に用い得る滅菌カラム
が望まれる時代になつてきたにも拘らず、所望の
カラムが得られなかつたのは、変性しやすい蛋白
物質〔例えば、抗体（特にγ―グロブリン）、酵
素等〕を担体に担持固定したカラムという特殊性
のため、カラム組立後の滅菌が困難であつたこと
による。本発明者らは、固定化カラムの保存、輸
送等に有利な乾燥された滅菌カラムを提供するこ
とを目的として鋭意研究開発を進めた結果、商業
ベースのカラムの組立てを可能とする本発明を完
成するに至つた。 すなわち、本発明は、γ―グロブリンを担体に
担持固定化し、これをラクトース、マンノース、
シユークロース、グルコースのいずれか一種の糖
の存在下に凍結乾燥してカラムに充填するか、カ
ラムに充填してからラクトース、マンノース、シ
ユークロース、グルコースのいずれか一種の糖の
存在下に凍結乾燥した後、エチレンオキサイドガ
スにより滅菌することを特徴とするγ―グロブリ
ン固定化カラムの製造法に係り、治療を目的とし
て、体外環流により、抗体（特にγ―グロブリ
ン）の特異性を利用して、患者の血中もしくは体
液中から病因物質のみを除去する医療器具を提供
するものである。 以下、本発明のγ―グロブリン固定化カラムの
製造法について、さらに詳しく説明する。 本発明において、γ―グロブリンとは、ある種
の癌患者、自己免疫疾患の患者の血中に正常の値
を越え出現する蛋白に対し、生物化学的親和力を
もつて特異的に結合できる能力を有する抗体の中
で特にγ―グロブリンに属するものをいう。この
具体的な例としては、肝癌、肺癌等の際に患者の
血中および腹水中に発現するα―フエトプロテイ
ンやフエリチンを除くための抗ヒト―α―フエト
プロテイン―γ―グロブリン、抗ヒトフエリチン
―γ―グロブリン、肝炎の患者の血中のHBs（肝
炎ウイルス）を除去するための抗HBsウイルス
抗原γ―グロブリン、自己免疫病の患者の血中に
存在する抗核抗体（免疫複合体）を除くための抗
核。 抗体に対する抗―抗核抗体のγ―グロブリン、
重症筋無力症の患者のアセチンコリンセプターに
対する抗体を除くための特異的γ―グロブリン等
が挙げられる。これ以外にも疾病に関与する蛋白
は数多く見出されているし、また、今後共見出さ
れる可能性があり、これらの蛋白（病因物質）を
除去する目的で作成した特異的γ―グロブリンで
あれば、本発明の方法を同様にして用いることは
可能である。 次に本発明で用いる抗体（特にγ―グロブリ
ン）を作成する方法を述べる。抗体は、通常の生
化学的手段（生化学講座１ タンパク質の化学１
日本化学会編、東京化学同人出版参照）を用い
得られる。 例えば、患者の血中もしくは体液中より採取し
てきた抗原蛋白（例えば、α―フエトプロテイ
ン、フエリチンなど）を生化学的精製法にしたが
つてそれぞれ純度良く精製し、次いで該精製蛋白
を抗原として異種の動物（例えば、山羊、羊、
馬、ウサギ等）に各種アジユバント（例えば、フ
ロイントの完全アジユバント等）と共に免疫感作
を行なつて抗血清を得る。この抗血清より通常の
生化学的手段である硫安沈澱分画、イオン交換ク
ロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラ
フイー等により精製して得られるγ―グロブリン
分画を用いる。除去する蛋白（病因物質）によ
り、それに特異的なγ―グロブリンを用いること
は云うまでもない。 次いで本発明で用いる担持固定化用の担体樹脂
について述べる。抗体や酵素等の蛋白を担持固定
化するために通常使用されている樹脂であれば、
どのような種類のものでも使用できる。具体的に
はポリアクリルアミド系樹脂、デキストラン架橋
樹脂、セルロース、多孔性シリカビーズ等が挙げ
られる。 特に特異的に病因物質等の蛋白を患者の血中よ
り除去するためには、除去に関係のない蛋白や物
質等の非特異的な吸着がないこと、また、カラム
容量を最小限にし、体外に取出す血液体液量をで
きる限り少なくし患者への負担を少なくするた
め、多孔性であり、しかもリガンドであるγ―グ
ロブリンの単位容積当りの担持固定化容量が高い
こと、さらに、保存時および使用時に分解等がな
く、担持時の化学安定性が優れ、さらに加えて環
流速度を充分に保持できる機械的流体力学特性に
優れていることが要求され、これらの要請からア
ガロース樹脂およびアガロース架橋樹脂等のアガ
ロース系樹脂が、特に固定化用の担体樹脂として
好ましく、形状としては粒状体のものが好まし
い。 次いで上記γ―グロブリンと担体樹脂との結合
は、いわゆる公知の方法である物理吸着、イオン
結合、包括性、共有結合法等を用いて行なう。特
に好ましい結合方法は、滅菌時の安定性、長期の
安定性の点から共有結合法である。すなわち、担
体樹脂に存在するカルボキシル基、アミノ基、水
酸基、ハロゲン基等の官能基の反応性を利用し、
グルタールアルデヒド等の２官能性架橋剤、カル
ボジイミド、臭化シアン、ウツドワード試薬、ジ
アゾ化剤等のカツプリング剤を用い、γ―グロブ
リンの持つ反応性基である水酸基、アミノ基、カ
ルボキシル基、チオール基等と化学的に共有結合
を行なう。γ―グロブリンの担体樹脂に対する担
持量は特に制限はないが、γ―グロブリンで５
mg／c.c.〜100mg／c.c.（γ―グロブリン量／樹脂量）
が好ましい。 次いで、γ―グロブリンを担持固定化した担体
の凍結乾燥について説明する。 凍結乾燥が可能な樹脂を担体として用いる場合
（例えば、ポリアクリルアミド樹脂等）は、γ―
グロブリンを担持固定化した状態で、水溶液中に
て凍結し、減圧真空乾燥を行なえばよい。 しかし、担体として好ましいアガロース系樹脂
を担持固定化用担体として用いる際には、その
まゝの状態で水溶液中にて凍結乾燥を行なうと、
凍結の際に、水の凍結により、樹脂内外部の構造
に破壊が生じ、再膨潤の際、多孔性がもとにもど
らず、容量の減少をきたすばかりか、交率の著し
い低下を起こす。 従来より、アガロース系樹脂を用いた固定化カ
ラムの凍結乾燥の際にデキストラン―ラクトース
を使い、上記現象を防止する方法は知られていた
（フアルマシア フアインケミカル社のパンフレ
ツト参照）。しかしながら、本発明が医療用器具
を目的としているため、前述の効率低下も問題で
あるが、水溶液中にて凍結乾燥が可能な樹脂を用
いた場合も、安全性は勿論のこと、再膨潤に要す
る時間および滅菌効率、さらには長期の保存時の
安定性が極めて大切である。 これらの点を考え合せ検討を行なつたところ、
水溶液から直接凍結乾燥を行なつた場合や、ラク
トースーデキストランの存在下で凍結乾燥を行な
つた場合に比べ、下記の糖を単独で、ある濃度条
件で用いた方が、再膨潤時間の短縮が図れるばか
りか、長期保存にも安定であり、さらに驚くべき
ことに、アガロース系樹脂を担体樹脂として用い
た場合でさえ効率の低下がおさえられることが判
明した。 すなわち、このような好ましい凍結乾燥法は、
ラクトース、マンノース、シユークロース、グル
コースのいずれか一種の糖の１〜20％の水溶液中
にて凍結乾燥を行なうものであり、特に好ましく
は、グルコースの５〜15％の水溶液中にて凍結乾
燥を行なうものである。 なお、各種蛋白や菌体の保存のため、凍結乾燥
を行なう際、各種糖水溶液を用いることは知られ
ているが（凍結・乾燥と保護物質 東京大学出版
会発行1972年）、本発明のような目的でγ―グロ
ブリンを担持固定してある固定化カラムの凍結乾
燥に糖を単独で用いた例は、本発明以外には皆無
である。 次に、医療用カラムとしての本発明のカラム
は、必要量のγ―グロブリン固定化樹脂を上記方
法によりあらかじめ凍結乾燥し、所定のカラム容
器につめた後、エチレンオキサイドガス滅菌操作
を行なうか、あるいは、所望の容器に溶液状態で
充填し、充分に凍結用糖水溶液にて洗浄置換を行
なつた後、容器に入れたまゝで凍結乾燥し、次い
でエチレンオキサイドガス滅菌を行なう方法のい
ずれかの方法を用いて製造する。さらに滅菌は、
カラムを市販のエチレンオキサイド滅菌用バツク
等滅菌保持の可能な適当な容器もしくは包装に封
入して行なう。 次いで、本発明で云うエチレンオキサイドガス
滅菌方法について述べる。 γ―グロブリンを担持してなる固定化カラム樹
脂を水溶液中に懸濁した状態で滅菌を行なえば、
使用の際にそのまゝの状態で使えるという利点が
ある。しかし、滅菌法としては、熱もしくはγ線
照射による滅菌法に限られてしまう。本発明者ら
も実際にこれらの滅菌法を検討したが、蛋白であ
るγ―グロブリンの変性および担体樹脂の分解を
招き、滅菌はできたものゝ使用に供するに至らな
かつた。本発明者らは、鋭意研究を行ない、前記
の如くカラムを乾燥状態にすることによつて、熱
やγ線照射以外の方法で滅菌を行なうことを企
て、この問題を解決することに成功した。 すなわち、前記方法によつて得た抗体固定化カ
ラムを、前記方法により凍結乾燥して乾燥状態の
γ―グロブリン固定化樹脂を得る。次いでエチレ
ンオキサイドガスを用いて滅菌を行なうことによ
り、保存時の安定性にも優れた乾燥され滅菌され
たγ―グロブリン固定化カラムを得ることができ
た。 同様な乾燥状態で、熱滅菌、γ線滅菌を試みた
が、水中懸濁の場合と同様に、γ―グロブリンの
変性を招き、滅菌はできたが使用することはでき
なかつた。 本発明による滅菌を行なつたカラムは、滅菌済
であるばかりか乾燥状態であるため、従来の水懸
濁状態のカラムのように、運搬時の液モレ、樹脂
等の機械的破損等も起らず、長期の保存にも極め
て安定である等、医療器具として今迄にない優れ
た特性を有しているものである。 このようにして作成された本発明のカラムは、
ある種疾病時の患者の血中もしくは体液中に正常
の値を越え発現する病因物質を、該物質の抗体
（特にγ―グロブリン）に特異的に結合せしめて
除去するため、体外環流にセツトして使用する極
めて有用な医療器具となる。 以上説明したとおり、本発明により得られる滅
菌されたγ―グロブリン固定カラムは、乾燥状態
であるため、保存に関しても、運搬に関しても、
従来のカラムに比較し、液モレおよび破損等を起
さず安全であり、また、滅菌状態であるため、長
期保存にも極めて安定であり、さらに保存条件も
容易であるという優れた特徴を有し、しかも医療
用として最も大切な安全性が確保されているもの
である。また、製造法としても、カラム組立て後
に滅菌を行なうため、特に繁雑な組立て操作を必
要としないという利点もあり、従来法にない極め
て優れた方法である。 以下、本発明の実施例を挙げて説明する。 実施例 １ 肝癌患者の腹水より、通常の生化学的手法であ
る硫安分画およびイオン交換樹脂クロマトグラフ
イーで粗精製して得たα分画を、正常人抗血清で
吸収操作を２度行ない、α―フエトプロテインの
精製を行なつた（純度90％）。このα―フエトプ
ロテインにはアルブミンおよびトランスフエリン
が混入していたゝめ、ConAカラムおよび抗トラ
ンスフエリン血清で再吸収を行ない、純度99％
（デイスク電気泳動70％アクリルアミドゲルPH
8.3）のα―フエトプロテインを得た。このよう
にして得たα―フエトプロテインを完全にフロイ
ントのアジユバントを併用し、α―フエトプロテ
インとして１回１mgづつ羊の背部に７〜15日間隔
で４〜５回投与し、抗人―α―フエトプロテイン
抗血清（羊）を得た。 このようにして得た抗血清より硫安分画および
DEAE―イオン交換クロマトグラフイー操作を行
ない、抗体としてγG分画を得た。該γG分画は、
オクタロニー法（免疫２次元拡散法）により満足
すべき特異性および刀価を有していた。 次いで該γG分画４ｇ（Ｅ１％ 280＝14.3）を常法
にしたがい200c.c.のアガロース架橋樹脂である市
販のセフアロースCL―4B（フアルマシア・フア
インケミカル社製）に結合せしめた。すなわち、
200c.c.のセフアロースCL―4Bを蒸留水でよく洗
浄した後、200mlの水に懸濁し、12ｇの臭化シア
ンを加え撹拌する。2N水酸化ナトリウム水溶液
を用いてPHを10〜11に保ち８分間反応させ、セフ
アロースCL―4Bを活性化させる。次いで、冷
0.1M炭酸水素ナトリウム２ですばやく洗浄後、
吸引過を行ない、続いて0.5Mの塩化ナトリウ
ムを含む0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液（PH
8.3）200mlに懸濁し、４ｇのγG分画を加えて４
℃でゆつくり撹拌しながら16時間反応させる。反
応終了後、0.1NのNaClを含む0.1M炭酸水素ナト
リウム緩衝液１で洗浄し、続いて1M―エタノ
ールアミン水溶液（PH９）に再懸濁させ、室温で
ゆつくり撹拌させながら反応を２時間行なう。次
いで、0.1MのNaClを含む0.1M炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液１で再度洗浄し、さらに、酢酸緩衝液
0.1MPH4.01で洗浄し、再び上記炭酸水素ナト
リウム緩衝液１で洗浄する。次いで、8M尿素
（500ml）で洗浄し、生理食塩水２で最終的に洗
浄を行なつた。このようにして抗体を結合した樹
脂は、生理食塩水の中に懸濁して保存した。 本固定化樹脂を図面に示すような両端に500メ
ツシユナイロンフイルターを配置してなる容量50
c.c.のアクリル樹脂の容器に充填し、抗体固定化樹
脂カラムを得た。 該カラムの構造を図面に基づいてさらに詳しく
説明すると、円筒容器１内に抗体固定化樹脂２が
充填され、該円筒容器１の両端開口部にフイルタ
ー３，３′が被せられ、さらにその上から液流出
入口を有するシリコーン製キヤツプ４，４′が嵌
着されたものである。 次いで、該カラムを８％グルコース水溶液500
c.c.を通し置換した後、凍結を行ない、真空状態で
乾燥を行なつた。 次に該カラムを滅菌バツク中に封入し、35％エ
チレンオキサイドガスで40℃、５時間処理し、空
気置換１時間を行なつて、滅菌、乾燥された抗体
固定化カラムＡを得た。 実施例 ２ ヒトフエリチンの精製は、新津らの方法にした
がい（医学のあゆみ95巻第１号12頁）行なつた。
抗血清は0.1mgのフエリチンを完全フロイントの
アジユバントと共に家兎に数度免疫し、１ケ月半
後に全採血を行なつて得た。 次いで、実施例１と同様な方法で精製したγG
分画１ｇを、100mlのアガロース樹脂であるセフ
アロース6B（フアルマシア・フアインケミカル社
製）に臭化シアンを用い常法で結合させ、固定化
樹脂を得た。 次いで、該固定化樹脂を容器に充填し、10％マ
ンノース水溶液で置換した後、凍結乾燥を行なつ
た。 次に該カラムを滅菌バツク中に封入し、35％エ
チレンオキサイドガス40℃で滅菌を行ない、抗フ
エリチン抗体固定化カラムＢを得た。 比較例 １ 実施例１の方法と同様にして抗ヒトα―フエト
プロテイン抗体固定化樹脂を作成した。該樹脂を
生理食塩水でよく洗浄した後、50c.c.の耐熱性樹脂
製カラム（ポリカーボネート製につめ、120℃オ
ートクレーブにて20分間、湿熱滅菌を行なつた。
該カラムをＣとして後述の試験に供した。 比較例 ２ 実施例２の方法と同様にして抗ヒト―フエリチ
ン抗体固定化樹脂を作成した。該樹脂を生理食塩
水でよく洗浄した後、50c.c.のポリスチレン製カラ
ムにつめ、2.5Mradのγ線を照射して滅菌を行な
つた。このカラムをＤとし、後述の試験に供し
た。 比較例 ３ 実施例１の方法で抗ヒト―α―フエトプロテイ
ン抗体固定化樹脂を作成した。該樹脂を50c.c.のカ
ラムにつめ、生理食塩水でよく洗浄を行なつた。
このカラムＥは凍結乾燥および滅菌操作を行なう
ことなく、後述の試験に供した。 比較例 ４ 実施例１の方法で抗ヒト―α―フエトプロテイ
ン抗体固定化樹脂を作成した。該樹脂を50c.c.のカ
ラムにつめ、滅菌済生理食塩水および除菌滅菌済
蒸留水でよく洗浄し、次いで、そのまゝ凍結乾燥
を行ない、カラムＦとして後述の試験に供した。 比較例 ５ 実施例２の方法で抗ヒト―フエリチン抗体固定
化樹脂を作成した。該樹脂を50c.c.のカラムにつ
め、生理食塩水でよく洗浄を行なつた。このカラ
ムＧは凍結乾燥おおよび滅菌操作を行なうことな
く、後述の試験に供した。 実施例 ３ 実施例１と同様の方法で抗ヒト―α―フエトプ
ロテイン抗体固定化樹脂を得た。該樹脂を50c.c.の
カラムに充填した後、生理食塩水で洗浄し、次い
で10％―ラクトース水溶液で充分置換洗浄を行な
つた後、凍結乾燥を行ない、滅菌バツクに封入
後、35％エチレンオキサイドガスにて滅菌を行な
つた。該カラムをＨとして、後述の試験に供し
た。 実施例 ４ 実施例２と同様の方法で抗ヒト―フエリチン抗
体固定化樹脂を得た。該樹脂を50c.c.のカラムに充
填した後、生理食塩水で洗浄し、次いで、５％―
シユークロース水溶液で充填置換した後、凍結乾
燥を行ない、滅菌バツクに封入後、エチレンオキ
サイドガスにて滅菌を行なつた。該カラムをと
し、後述の試験に供した。 比較例 ６ （この方法は、実験と応用アフイニテイ―クロ
マトグラフイー千畑等著 講談社版によつた。） 乾燥アクリルアミドゲル（Biogel―ｐ―60Bio
Rab社製）を一夜水中で膨潤後、あらかじめ50
℃，60分間加熱しておいた6M抱水ヒドラジン水
溶液を等量の膨潤ゲル懸濁液に加え、50℃で一夜
反応させた。得られた誘導体ゲルを0.1M塩化ナ
トリウム溶液でよく洗浄した。 このようにして得られたアクリルアミドゲル―
ヒドラジド誘導体200mgを、0.1M塩化ナトリウム
含有の0.3N塩酸100mlでよく洗浄し、100mlの
0.3N塩酸で洗浄した。次いで、0.3N塩酸30ml中
に懸濁し、４℃で1M亜硝酸ナトリウム２mlを加
えた。氷水中20分間反応後、アシルアジド誘導体
を集し、次いで、直ちに0.3N塩酸水溶液、
0.1Mスルフアミン酸および冷水の順で洗浄した。 このようにして得たアシルアジド誘導体を
0.1M硼酸ナトリウムに溶解し、１％抗ヒト―α
―フエトプロテイン抗体溶液12ml（４℃）に加
え、撹拌しながら２時間反応した後、1Mアンモ
ニア水溶液および1M塩化アンモニウム４mlを加
え２時間反応させた。 次いで、得られた固定化抗体樹脂を２つのカラ
ムに別々に充填し、その一本は0.2M塩化ナトリ
ウムでよく洗浄後、該カラムをＪとし試験に供し
た。 実施例 ５ 次いで上記をう一本のカラムを生理食塩水で良
く洗浄し、10％グルコース水溶液で充分置換した
後、凍結乾燥を行ない、35％エチレンオキサイド
ガスにて滅菌を行ない、カラムＫとして後述の試
験に供した。 比較例 ７ アガロース樹脂セフアロース6B（フアルマシ
ア、フアインケミカル社製）50ｇを、よく蒸留水
で洗浄した後、50mlの１，４―ブタンジオール
ジグリシジルエーテルと100mgの水素化硼素ナト
リウムを含む0.6M NaOH50mlを加え、室温で８
時間振盪反応させた。次いでグラスフイルターに
移し、水でよく洗浄し、活性化樹脂を得た。 1M炭酸ナトリウム（PH11.5）50mlに抗ヒト―
フエリチン抗体１ｇを溶解し、その溶液に上記活
性化樹脂50mlを加え、25℃で振盪しながら16時間
反応させた。次いで1Mエタノールアミン水溶液
中に移し、室温静置で１夜反応を行なつた。次い
で、生理食塩水でよく洗浄し、50c.c.カラムに充填
しカラムＬを得た。 実施例 ６ 比較例６と同様にして得たカラムを８％グルコ
ース水溶液で充分置換した後、凍結乾燥を行な
い、次いで、35％エチレンオキサイドガスにて滅
菌しカラムＭを得た。 試験例 以上の実施例、比較例で得たＡ〜Ｍのカラムを
用いて、効率の試験、再膨潤時間の試験、無菌試
験および保存による効率への影響試験をそれぞれ
行なつた。以下にその試験方法と結果を示す。 試験方法 １ 効率の試験 標準のα―フエトプロテインおよびフエリチン
を含む生理食塩水を一定量カラムに通じ、次い
で、よく生理食塩水でカラムを洗浄した後、
0.1Mグリシン―塩酸バツフアー（PH2.8）で溶出
し、順次溶出部分を1Mグリシン―水酸化ナトリ
ウムバツフアー（PH11.5）で中和し、吸着したα
―フエトプロテインおよびフエリチンの量の測定
を行なつた。測定はLowy法、およびEIA法
〔Hibi等の方法Gann69 67〜75（1978）に従う〕
を用いて、チヤージ溶液、素通り溶液、溶出溶液
をそれぞれ測定し、効率を算出した。 効率＝各カラムの吸着量／ＥまたはＧのカラムの吸着
量×100 で示す。 ２ 再膨潤時間および容積の試験 目盛付のガラス試験管に凍結乾燥滅菌を行なう
前と等量の抗体固定化樹脂を計りとり、生理食塩
水を加え、再膨潤に要する時間および最終の容積
を測定した。再膨潤度は以下の式で算出した。 再膨潤度＝ 再膨潤後の容積（懸濁状態）／凍結乾燥滅菌処理前の
容積（懸濁状態）×100 ３ 無菌テスト 日本薬局法の無菌試験に準拠した。結果は、菌
数０（−），１〜100（＋），100＜（）で表示した。 ４ 保存試験 無菌試験および効率試験において、以下の２通
りの試験を行なつた。 温度 4℃ １ケ月 ３ケ月 ６ケ月 12ケ月 温度25℃ 〃 〃 〃 〃 効率は１）の場合と同様に、ＥまたはＧのカラ
ムの吸着量との比で算出した。 上記試験の結果を表１にまとめて示す。

【表】

【表】 実施例 ７ 肝炎の患者の血清よりＢ型肝炎ウイルス
（HBs）を得た。HBs抗原に対する抗体は実施例
１と同様の方法で作成し、精製を行ないγ―グロ
ブリン分画を得た。 該γ―グロブリンの固定化のための担体として
は、市販のプロモシアン活性化セフアロース4B
（フアルマシア フアインケミカル社製）を用い、
この樹脂１c.c.当りに10mgのγ―グロブリンを担持
した。HBs抗原陽性血清を用い、効率テストを
行なつた後、１c.c.のカラム容器に充填し、10％グ
ルコース水溶液で充分に洗浄、置換後、凍結乾燥
し、エチレンオキサイドガス滅菌を行なつた。 上記のようにして得られたカラムは、α―フエ
トプロテインの抗体およびフエリチンの抗体を固
定してなるカラムの場合と同様に、凍結乾燥およ
び滅菌による効率低下も未滅菌に比してわずか２
％であり、また、一度使用した後に滅菌を行なつ
たにもかゝわらず、無菌状態であり、安全が保証
できた。なお、25℃で６ケ月保存したカラムの効
率は95％を保持し、無菌状態であつた。 実施例 ８ 重症筋無力症患者の血中に抗アセチルコリン受
容体抗体があり、病因と密接な関係を持つことが
知られている。アセチルコリン受容体を用いて、
患者の血中より該受容体抗体を特異的に得た。次
いで、該受容体抗体のFabに対する抗体を得るた
めに、前述の「生化学実験講座１タンパク質の化
学１」（日本生化学会編 東京化学同人出版）を
参照し酵素分解および精製を行ない、精製アセチ
ルコリン受容体抗体のFabフラクシヨンを得、次
いで、このFabフラクシヨンを用いて実施例１の
方法と同様な方法で抗血清を取得し、該抗血清よ
りγ―グロブリン分画を得た。次いで、該γ―グ
ロブリン分画を正常の人血清で吸収し、非吸収性
のγ―グロブリン分画を得た。該γ―グロブリン
分画を比較例７と同様の方法で活性化した活性化
セフアロース6Bに担持固定化せしめ、重症筋無
力症の治療用カラムを作成した。 上記方法で作成したカラムを用い、重症筋無力
症の血漿を用い効率を測定し、次いで、７％マン
ノース水溶液で充分洗浄、置換を行なつた後、凍
結乾燥およびエチレンオキサイドガスにて滅菌を
行なつた。 該滅菌カラムは実施例７と同様に、効率低下も
未滅菌に比較して５％であり、無菌テストも合格
であつた。なお、25℃、３ケ月保存後の効率保持
率は94％で、ほとんど変化なく、無菌状態であつ
た。 以上の実施例、比較例で明らかなように、本発
明の方法で得られた、乾燥された滅菌された抗体
固定化樹脂カラムは、未滅菌状態のカラムに比し
ても充分の活性を有し、しかも滅菌され乾燥状態
であるため、長期の保存にも安定であり、その上
医療器具製品として極めて重要な安全性が保証さ
れている。本発明により、今後、この種類の生体
蛋白固定化カラムを医療器具として実用的に用い
る道が開かれるものと思われる。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明のカラム構造の一例を示す断面図
である。 １…円筒容器、２…抗体固定化樹脂、３，３′
…フイルター、４，４′…シリコーン製キヤツプ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ γ―グロブリンを担体に担持固定化し、これ
   をラクトース、マンノース、シユークロース、グ
   ルコースのいずれか一種の糖の存在下に凍結乾燥
   してカラムに充填するか、カラムに充填してから
   ラクトース、マンノース、シユークロース、グル
   コースのいずれか一種の糖の存在下に凍結乾燥し
   た後、エチレンオキサイドガスにより滅菌するこ
   とを特徴とするγ―グロブリン固定化カラムの製
   造法。