JPS638758B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はカテコール類の製造方法に関し、詳し
くは微生物を用いてベンゼン類からカテコール類
を製造する方法に関する。 カテコールの製造方法としては、モノフエノー
ル類を過酸化水素や過酢酸などの酸化剤を用いて
酸化する方法が工業的に行なわれている。しか
し、この方法はカテコール類の収率および選択率
が低い上に、酸化剤として過酸化物を使用するた
め、爆発の危険性がある。そのため、設備ならび
に運転上の危険防止対策を必要とするなど問題点
が多い。カテコールを製造する他の方法として
１，２，３−シクロヘキサントリオールを金属触
媒の存在下に脱水素する方法（特開昭56−169636
号）やフエノールをフエノラーゼの存在下分子状
酸素で酸化する方法が知られている。しかし、こ
れらの方法で用いる原料は安価なものでないため
実用性に劣るほか、フエノラーゼを使用する場合
は反応をカテコールの段階で停止させることが困
難であり、多量のキノンが生成するという問題点
がある。 一方、ベンゼンを原料として微生物によつて微
量のカテコールを検出した例はあるが、これはカ
テコールの製造法というよりは、代謝における中
間産物としてカテコールが生成するものであり、
その収量は非常に微量であり、実用性に劣るもの
であつた。 このような事情に鑑み、本発明者は安価に入手
できるベンゼン類を原料として微生物を用いてカ
テコールを効率よく製造する方法を開発すべく研
究を重ね、その過程においてシユードモナス属に
属する微生物の変異株を使用することによつて、
目的が達成できることを見出し、本発明を完成す
るに到つた。 本発明は、シユードモナス属に属する微生物
で、カテコール類の分解酵素が欠失もしくは低活
性化した変異株によりベンゼン類を酸化してカテ
コール類を生成せしめることを特徴とするカテコ
ール類の製造方法である。 本発明に用いる微生物はシユードモナス属に属
する微生物の変異株であり、親株としては種々の
菌株を使用しうる。 微生物の変異誘導は既知の方法によつて行なえ
ばよく、たとえば紫外線照射、Ｘ線照謝、γ線な
どの放射線照射、突然変異誘起剤による処理など
の方法を適用することができる。ここで突然変異
誘起剤としては、エチルメタンスルホネート、Ｎ
−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン、ジメチルサルフエート、２−アミノプリン、
アクリフラビン、アクリジンオレンジ、ヒドラジ
ン、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、塩化マ
ンガンなどがある。 また、変異株の分離方法についても既知の手法
を適用すればよく、変異処理した細胞を培養し、
形成されたコロニーについて変異の有無を検討す
る直接的な方法のほか、この方法を改良したレプ
リカ法、さらにはペニシリン等の抗生物質を使用
する濃縮法、特殊な基質を用いる自殺基質処理法
ならびにこれらを適宜組合せた方法などがある。 本発明では千葉県南部の土壌より分離したベン
ゼン資化性菌シユードモナス・エスピーBE−81
（FERM Ｐ−6969）（菌学的性質は下記のとおり
である。）を親株として変異処理して得た変異株
シユードモナス・エスピー136R−３（FERM Ｐ
−6970）が好適に用いられる。この変異株136R
−３はカテコール類の分解酵素が欠失もしくは低
活性化しているという特性を有している。本発明
では、このような特性を有する菌株であれば任意
に使用でき、シユードモナス属に属する他の親株
を用い、各種の変異誘導処理をして得られる変異
株も同様に使用することができる。さらに、上記
特性を有する菌株であれば自然界から分離された
菌株であつてもよい。 菌学的性質 １ 形態的性質 (1) 形、大きさ 桿菌、0.6〜0.8×0.9〜1.5μ (2) 多形性 なし (3) 運動性 あり 鞭毛 極鞭毛１〜３本 (4) 胞子 なし (5) グラム染色 陰性 (6) 抗酸性 なし ２ 培養的性質 (1) 肉汁寒天平板 生育良好、円形、表面平
滑、隆起あり、周辺全縁、内容均質、淡黄褐
色、湿光 (2) 肉汁寒天斜面 生育良好、糸状 (3) 肉汁液体 生育良好、白濁、被膜形成、沈
渣あり (4) 肉汁ゼラチン穿刺 生育良好、液化せず (5) リトマスミルク アルカリ性、リトマス還
元、不変 ３ 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元 あり (2) 脱窒反応 陰性 (3) MRテスト 陰性 (4) VPテスト 陰性 (5) インドールの生成 陰性 (6) 硫化水素の生成 なし (7) 澱粉加水分解能 なし (8) クエン酸の利用性 あり (9) アンモニウム塩、硝酸塩の利用性 あり (10) 色素の生成 キングＢ培地で水溶性螢光色
素生成 (11) ウレアーゼ 陽性 (12) オキシダーゼ 陽性 (13) カタラーゼ 陽性 (14) 生育温度（℃） 10〜40（最適25〜35） PH ５〜10（最適6.5〜8.5） (15) 酸素に対する態度 好気的 (16) Ｏ−Ｆテスト 酸化的 (17) 糖類からの酸およびガスの生成 別表参
照（ガスの生成なし）

【表】 本発明の方法に原料として用いるベンゼン類と
しては、上記変異株が酸化しうるものであればよ
く、ベンゼンのほかにアルキル基、置換アルキル
基、カルボキシル基、アルデヒド基、ハロゲン原
子などが導入された置換ベンゼン類などがあり、
これらの中では安価かつ安定的に入手できるベン
ゼン、トルエン、エチルベンゼンなどが好まし
い。 変異株の培養に際しては、ベンゼン類のほかに
他の炭素源を加えることができ、さらに窒素源、
無機塩類および変異株が必要とする場合には他の
栄養物質、補助的成分（PH調整剤、乳化剤、消泡
剤など）等通常の成分を加えた培地を用いて培養
する。カテコール生産方法については液体培養の
ほか、酵素活性を有する休止菌体を用いたり、固
定化菌体を用いるなど各種の方法を採用すること
ができる。培養条件、休止菌体反応条件、固定化
菌体反応条件についてもカテコール類が十分に生
成、蓄積する範囲内で選定すればよい。液体培養
の場合の一般的な培養条件としては、炭素源とし
てベンゼン類、コハク酸など、窒素源として塩化
アンモニウムなどのアンモニウム塩；硝酸ナトリ
ウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩；ペプトン、肉
エキスなどの窒素性有機物質など、さらに無機塩
類としてリン酸カリウム、硝酸マグネシウム、塩
化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸
カルシウムなどを含む培地を用いて温度24〜37
℃、PH5.0〜9.0で好気的条件下に行なえばよい。
休止菌体を用いる場合の反応条件は通常の条件で
よく、たとえば温度24〜37℃、PH5.0〜9.0で反応
せしめる。なお、ベンゼン類の濃度をあまり高く
すると、阻害が起こるので好ましくない。また、
固定化菌体を用いる場合、固定化方法としては包
括法、吸着法、マイクロカプセル法などいずれも
適用することができる。包括用担体としてはカラ
ギーナンなどの多糖類、ポリアクリルアミドなど
の合成高分子等があり、吸着用担体としては
DEAEセルロースなどがある。反応条件は休止菌
体反応の場合と同じである。 培養もしくは反応終了後、培養液もしくは反応
液からカテコール類を分離、精製するには既知の
方法を適用すればよい。 本発明に用いる変異株はカテコール類の分解酵
素が欠失もしくは低活性化しているため、ベンゼ
ン類から生成したカテコール類は分解されること
なく蓄積する。そのため、本発明の実施例では
3.12mg／mlという高収量を示し、カテコール類の
生産性は格段と向上したことが確められた。ま
た、固定化菌体を使用すれば連続生産が可能とな
り、本発明の実用性は一段と増大する。さらに、
本発明では原料として安価なベンゼン類を使用で
きるため、カテコール類を安価に製造することが
可能である。なお、カテコール誘導体を製造する
場合、カテコールを出発原料としないでベンゼン
誘導体を用いることができるので、カテコールの
水酸基の反応性に左右されることなく目的とする
誘導体を得ることができる。 本発明により得られるカテコール類は合成中間
体として有用であるほか、酸化防止剤、殺菌・消
毒剤、香料、現像薬、分析用試薬などとして有用
である。 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。 参考例 菌体の変異誘導処理と変異株の分離 (1) ベンゼンおよびコハク酸ナトリウムを含む培
地でシユードモナス・エスピーBE−81
（FERM Ｐ−6969）を30℃で12時間往復振と
うにより培養した。 (2) 次いで、遠心分離により集菌し、無菌水で洗
菌したのちＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（NTGと略記する。）を用い
て常法により変異処理を行なつた。 (3) 無菌水で洗菌した後、コハク酸を含む培地で
７時間培養した。 (4) 洗菌後、カテコールを含む培地にペニシリン
Ｇカリウムとシクロセリンを添加したもので30
℃、４時間ゆるやかに振とうした（ペニシリン
−シクロセリン濃縮）。 (5) 上記工程(4)を再び繰返す。 (6) 洗菌の後、コハク酸を含む培地で７時間培養
した。 (7) 洗菌の後、ブイヨン寒天平板上に塗布し、30
℃で２日間放置した。 (8) ブイヨン寒天平板上に生じたコロニーを滅菌
ビロードを用いて、カテコール寒天平板、コハ
ク酸寒天平板、ベンゼン＋コハク酸寒天平板に
付着させた。これらの寒天平板を30℃で２日間
放置後、カテコール寒天平板上で生育せず、コ
ハク酸寒天平板上には生育し、ベンゼン＋コハ
ク酸寒天平板上で生育しカテコール（フロログ
ルシン溶液を噴霧して検出）を生産するコロニ
ーをブイヨンスラントに移植して変異株を分離
した（レプリカ法）。 以上のようにしてカテコール生産変異株シユー
ドモナス・エスピー136R−３（FERM Ｐ−6970）
を得た。ベンゼン＋コハク酸培地で30℃、12時間
培養してカテコール生産性の比較をした結果を第
２表に示す。

【表】 実施例 １ ブイヨン液体培地で培養した変異株136R−３
（FERM Ｐ−6970）をベンゼン0.2％、リン酸二
ナトリウム（12水塩）1.5％、リン酸一カリウム
0.5％、塩安0.5％、硫酸マグネシウム0.02％、塩
化カルシウム0.005％、コハク酸ナトリウム1.0
％、コーン・ステイーブ・リカー0.05％を含むPH
7.0の培地50ml（500ml坂口コルベン）に植菌し、
30℃で12時間往復振とう培養を行なつた。その結
果、1.25mg／mlのカテコールが培地中に蓄積され
ていることが、４−アミノアンチピリン発色の
後、分光光度計による比色定量により確認され
た。 実施例 ２ ベンゼン0.1％、培地液量100mlにしたこと以外
は実施例１と同様にして30℃で８時時間振とう培
養を行なつた。続いて、遠心分離を行ない培地
100mlあたり140mgの生菌体を得た。 本生菌体25mgを含む50ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.3）５ml（100ml試験管）にベンゼン0.1％を添
加後、30℃で往復振とうする休止菌体反応を３時
間行なつた。その反応終了液中のカテコール濃度
を実施例１と同様にして比色定量した結果、1.38
mg／mlであつた（反応モル収率98％）。 実施例 ３ ベンゼン添加量を0.5％としたこと以外は実施
例２と同様にして休止菌体反応を行なつた結果、
3.12mg／mlのカテコール類の畜積が比色定量によ
り確認された。 続いて、遠心分離により菌体を除いた培養終了
液50mlから塩酸で酸性にした後、エーテルによる
抽出、硫酸ソーダによる脱水、エーテルの留去を
行なつた結果、139mgの淡褐色の針状結晶が得ら
れた（回収率89％）。本結晶の赤外部吸収スペク
トルはカテコール標品と完全に一致した。 実施例 ４ 実施例２と同様にして得た生菌体75mgを含む１
％食塩水５mlとＫ−カラギーナン３％を含む１％
食塩水10mlを37℃で混合し、これを0.3M塩化カ
リウム中に滴下すると、直径４mm程度（容量0.03
ml）の固定化菌体ビーズが得られる。この固定化
菌体を50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.3）で洗浄した
後、このビーズ10粒を同緩衝液１ml（20ml試験
管）に入れ、さらにベンゼン0.1％を添加後、30
℃で３時間往復振とうしたところ、0.75mg／mlの
カテコール蓄積が確認された。 本反応に用いた固定化菌体を別のリン酸緩衝液
１mlに移し、また同様ベンゼン0.1％を添加して
反応を行なつた。これを６回繰り返したが、６回
目の反応においても0.45mg／mlのカテコール蓄積
が認められた。 実施例 ５ 実施例２と同様にして得た生菌体500mgを、50
ｍＭリン酸緩衝液（PH7.3）であらかじめ洗浄し
たDEAE−セルロース２ｇ（乾燥重量換算）を懸
濁した同緩衝液50mlに添加し、30℃で１時間撹拌
の後、４℃で１夜放置した。これによりDEAE−
セルロース１ｇ乾燥重量あたり220mgの菌体が吸
着した（固定化率89％）。リン酸緩衝液で本固定
化菌体を洗浄した後、DEAE−セルロース乾燥重
量換算で50mgをリン酸緩衝液１mlに懸濁し、ベン
ゼン0.1％を添加して30℃で３時間往復振とうし
たところ1.23mg／mlのカテコール蓄積が認められ
た。 実施例 ６ 培地100ml当たりDEAE−セルロースを500mg添
加したこと以外は実施例２と同様にして８時間往
復振とう培養を行なつた。これによりカテコール
生産能力を有する菌体がDEAE−セルロースに吸
着された固定化菌体が得られた。 50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.3）で本固定化菌体
を洗浄した後、これをDEAE−セルロース乾燥重
量換算50mg、同緩衝液１mlに懸濁し、ベンゼン
0.1％を添加して30℃で３時間往復振とうするこ
とにより、1.30mg／mlのカテコール蓄積が認めら
れた。 実施例 ７ ベンゼンの代りにベンゼン誘導体を用いたこと
以外は実施例２と同様にしてカテコール誘導体を
製造した。なお、生成した物質の確認は薄層クロ
マトグラフイーまたは赤外部吸収スペクトルによ
り行なつた。下記の式において（ ）内に示した
数値は原料については培地中の濃度（％）を、生
成物については収量（mg／ml）を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス属に属する微生物で、カテコ
   ール類の分解酵素が欠失もしくは低活性化した変
   異株によりベンゼン類を酸化してカテコール類を
   生成せしめることを特徴とするカテコール類の製
   造方法。