JPS6379040A - 蛍光測定器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に、蛍光測定器の分野に関し。

特に、蛍光測定器の安定性および精度を高める基準シス
テムに関する。

（従来の技術およびその問題点） 生物学研究においては１人体に存在する様々な化学物質
、ホルモン、酵素などを極微量含むサンプルの分析また
は定量（ａｓｓａｙ）がしばしば有用である。従来は、
放射性同位体を用い放射標識免疫検定法とよばれる方法
で分析または定量を行っていた。また１分析または定量
は蛍光測定器を用いでも行われていた。放射標識免疫検
定法は、興味の対象である標的分子やタンパク質に標識
をつけるため、　Ｒ１（放射性同位体）を利用する。す
なわち、放射性同位体は興味の対象である分子またはタ
ンパク質に、公知の標識プロセスにより貼付される。興
味の対象である分子またはタンパク質（以下、標的とい
う）のサンプル中の量は２所定時間内にサンプル内で生
じた放射現象の回数を数えることによって推定すること
ができる。この種の分析または定量における困難な点は
、放射性同位体には寿命がある点である。放射性同位体
は時間がたつにつれ、放射活性を失うため、この寿命を
監視しなければならない。このため、放射活性の弱くな
った同位体を用いて行った分析または定量の効果は減じ
られる。さらに、それらの放射性サンプルや未使用の放
射性同位体を２社会に危険を加えないように処分するこ
とは困難であり１．かつ費用がかかる。

蛍光測定器を用いる分析またｉよ定量では、蛍光体と呼
ばれる蛍光染料を用いる。それは、励起光によって、使
用される個々の蛍光体の励起帯域で。

励起され、蛍光現象を示すまたは光を発生する。

この蛍光体は、放射性同位体で（票的に標識をつけるの
と同様の方法で標的に標識をつけるために用いられる。

今後“サンプル”という用語を用いるときは、蛍光体で
標識づけした興味の対象であるサンプル分子のことをさ
すと理解されたい。一方。

時々、染料という用語を標識づけしたサンプル分子の同
義語として用いることもある。

このような蛍光測定器による分析または定量は。

放射性同位体を用いないため、放射標識免疫検定法より
も、大いに望ましい。しかしながら、極微量の標的がサ
ンプル内にあるときに、この蛍光測定器による分析また
は定量では問題が生じる。その問題は今まで、雑音によ
って測定結果の質を落とさないように蛍光測定器システ
ムそのものを十分に安定化することができなかった点に
あった。

つまり、サンプル濃度の変化以外のシステム内の変化が
、システムが計算した測定結果に及ぼす影響を除去する
ことは困難または不可能とされてきた。これらの変化は
、中和するか除去するかしない限り、システム計算によ
る測定結果の精度を狂わせる。

典型的には、蛍光測定器型定量による興味の対象である
サンプル濃度には、非常に低濃度の興味の対象である生
物学的実体の濃度が含まれる。例えば、　１ｏ−８から
１０−１　ｆｆのサンプル濃度は珍しくない。蛍光体を
用いたこのような低濃度のサンプル濃度の定量には、用
いられている蛍光体の励起帯域の波長をもつ放射を発生
する非常に強烈な光源を使う必要がある。さらに、蛍光
体が出す光は。

効率的に集められて量子化されなければならない。

また、放出光検出器の感度の経時変化や、温度変化のシ
ステムに対する影響は、正確な結果を導くために除去し
なければならない。

所望の最終結果は、相対蛍光強度と呼ぶ数である。この
数は、サンプル濃度を表し、比で表現する。この比は、
放出蛍光強度を蛍光体の励起に用いる光源から出る光の
強度で割って計算する。このため、放出蛍光強度を検出
するためにある光検出器を用い、励起光強度を検出する
ためにそれと同じか別の光検出器を用いる必要がある。

この２種の強度を表す２つの信号に対して次に、相対蛍
光強度を求めるために割り算が行われることになる。

放出蛍光の強度と励起光強度を表す信号を発生させるた
めの２つのシステムまたは一般的方法が従来技術におい
て発展した。第１のそのようなシステムを第１図に示す
。この型のシステムでは。

連続光源５０１と単独の検出器５０２が用いられた。

２つの光路が単独の検出器５０２に対して用いられる。

第１の光路は、サンプル光路で、光源からサンプル５０
３までを励起光路５０４に沿って、第１のビームスプリ
ッタおよびチョッパを通って進行する励起光を含む。サ
ンプル５０３から放出された蛍光は第２のビームスプリ
ンタ５０８を通って検出器５０２に向かう。第２の光路
は、検出器５０２までの基準光路５０５である。この光
路上の光は、光源５０１から第１のビームスプリッタ５
０６へ進み、そこで光の一部が基準通路５０５に沿って
下方へ向かう。

サンプル容器付近で、光は２枚の鏡で向きを変えられて
、チョッパ５０７を通る。次にこの光は、第２のビーム
スプリンタ５０８に進み、そこで一部の光が検出器５０
２の表面に向かって向きを変えられる。チョッパ５０７
は、光源５０１から出て、励起光路５０４および基準光
路５０５に沿って進行する連続光線を時間的に交互配置
された２個の光パルス列になるように切るのに役立つ。

この交互配置の結果、パルスがサンプルを照らし、蛍光
５０９を放出させる。この突発現象が検出され、その強
さを表す信号が生成され、スイッチ５１０によってチャ
ンネル１上に切り換えて送られる。この一連の現象に続
いて、基準光路５０５に沿って進んだ光パルスが検出器
５０２に到達し、電気信号に変換され、チャンネル２上
に切り換えて送られる。チャンネル１．２の２種の信号
の除算を行い、相対蛍光指数（以下ＲＦＩと呼ぶことが
ある）を求めることができる。

第１図のシステムにはいくつかの困難な点がある。第１
に、ランプの寿命を短縮し、またサンプルを加熱し、そ
のため蛍光放出特性を変化させるような散逸させられる
べき大量の熱を発生させることなく、光源から適正な波
長の強度の高い光を得ることは困難である。たとえ実際
的変化がおこらなくても、サンプルを加熱するとサンプ
ル濃度に見かけ上の変化が起こり得る。さらに、基準チ
ャンネルを通って方向転換することにより、真人な量の
励起光のエネルギーが失われる。とりわけ。

チョッパが励起光路を遮断し基準光路に沿った光のみを
通すときに１パルスおきにパルスが完全に失われる。こ
のことにより、サンプルが励起される全時間と比較した
光が点灯している全時間の点からみて、励起効率が低い
ことが説明される。

そのような困難を避けるため、第２図のシステムが発展
した。第２図のシステムは単一のパルス化光源５２１を
用いたが、光検出器は１個ではなく２個用いた。第１の
光検出器５２２は、サンプル５２３から放出された蛍光
の強度を検出する。第２の光検出器５２４は各励起光パ
ルスの光強度を検出する。

各励起光パルスの光エネルギーの一部を第２の光検出器
５２４に方向転換するため、ビームスプリンタ５２５が
用いられた。

第２図のシステムは、第１図の改良型を表している。ま
ず、励起に最良の波長をもつ光の生成に十分な高温レベ
ルにまで、光源の黒体温度を上げることによって、高強
度パルスが生成できることを、パルス化光源は意味して
いる。これはパルス化した仕方で行われるため、大量の
熱は生成されず、サンプルの加熱は最小限におさえられ
、熱放散の問題は軽減され、光源の寿命が延びる。全パ
ルスが励起に用いられるため、励起効率が改善される。

しかしながら、第２図のシステムが第１図の改良型であ
る一方、第２図のシステムで新たに＠題が生まれた。主
として、これらの難題は、サンプル濃度以外のシステム
内の変化によって、計算されたＲＦＩに誤差がでる可能
性に関係する。例えば。

第２図のシステムでは、２台の検出器の特性がそのドリ
フト特性において適合することが重要である。もし２周
囲の環境の温度変化やエージングプロセスのために、単
一のパルスの応答において２個の検出器の応答が、相対
的に変化すると、実際に変化がないのに、　ＲＰＩの誤
差や、サンプル濃度の見かけ上の変化となって表れる。

従って、前記の問題を解決できるような蛍光測定器シス
テムが必要となってきた。即ち、１０１から１０−１３
の範囲の蛍光体モル濃度のサンプル濃度を求めるため、
最小誤差で安定したＲＦＩを計算することができるシス
テムが要望されている。

（問題点を解決するための手段） 本発明は蛍光測定器の基準システムの安定性と精度を改
良した基準システムである。本基準システムはサンプル
内の標的の濃度変化以外の蛍光測定器システム内の多様
な変化の影響を中和する。

本発明の蛍光測定器は、蛍光染料により標識付けされた
分析または定量すべき物質を、該物質上に投影される像
の幾何学的配列を制限するためにマスクされた複数の高
い強度の光パルスによって励起するための光学装置、お
よび、該染料から放出された蛍光を検出するための、そ
して存在する染料の量の変化以外のシステム中の変化の
影響を最小にするように放出される光の量を定量化する
ための基準装置を備えている。

本発明測定器の他の実施態様では３前記光学装置が、蛍
光染料の変動量を光のパルスにより励起するための手段
を備えており、前記基準装置が。

前記励起パルスに応じて該染料から放出さ−れる蛍光を
検出するための手段、および、該染料から放出される蛍
光の量を定量化して結果とするための。

そして存在する該染料の量の変化以外のシステム中の全
ての変化の影響を該結果から除去するための手段を備え
ている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記励起のた
めの手段が、前記染料の励起帯域中のエネルギーを有す
る前記光パルスを放出することのできる高い強度のフラ
ッシュランプを備えている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記染料を、
一方の寸法が他方よりも長い幾何学的配列の限られた空
間内に収容するための手段をさらに備えている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記収容する
ための手段が、前記励起光を受け入れるための透明窓部
と、前記染料から構成される装置を前記検出のための手
段の方向に逃がすための透明窓部とを備えている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記フランシ
ュランプがアークを備えており、前記染料上の該アーク
の像を空間的に積分または統合するための手段をさらに
備えている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記収容する
ための手段が、前記検出のための手段に向かう散乱励起
光の伝達を邪魔するための手段をさらに備えている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記定量化の
ための手段が、前記励起光パルスと時間的に交互配置さ
れた基準光パルスを発生するための第２の手段、光を検
出するための第２の手段。

該励起光パルスの少なくとも一部と該基準光パルスの少
なくとも一部とを該光検出のための第２の手段に導くた
めの手段、および該基準光パルスの少なくとも一部を前
記蛍光検出のための手段に導くための手段を備えている
。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記蛍光検出
のための手段と前記光検出のための第２の手段とからの
出力信号の大きさの所定の比を計算するための手段をさ
らに備えており、核化の各項は、前記励起光により励起
された前記染料の量を定量化する結果を与えるように選
択され、かつ測定器内で生ずるであろう他の変化には関
係なく励起された染料の所定の量に対して該結果が実質
的に一定であるように選択されている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記蛍光を検
出するための手段と出力信号の大きさの比を計算するた
めに蛍光を検出するための前記第２の手段とに接続され
た手段をさらに備えており。

前記比の各項が、少なくとも、前記励起光パルスを発生
させるための手段または前記基準光パルスを発生させる
ための手段のどちらかからの光パルス流中のパルスごと
の光パルス強度の差ならびに該蛍光を検出するための手
段と前記光パルスを検出するための第２の手段との時間
に対するおよび変動する温度によるスペクトル応答の差
に無関係となり、励起された染料の量を定量化するよう
に選択されている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記定量化の
ための手段が、光を検出するための第２の手段、前記励
起光の少なくとも一部を該光検出のための第２の手段に
導くための手段、前記励起光パルスと時間的に交互配置
されている基準光パルスを発生するための第２の手段、
該基準光パルス発生のための第２の手段により発生され
た該光の少なくとも一部を、前記蛍光検出のための手段
および該光検出のための第２の手段の各々に導くための
手段、および。

比 Ｃ Ｄ （ここで、Ａは、該励起光パルスによる前記染料の励起
に応答して放出される該染料からの蛍光の受取に応答す
る蛍光の受取に応答する該蛍光検出のための手段からの
出力信号の大きさであり、Ｂは、前記励起光パルスを発
生するための手段からの励起光パルスの受取に応答して
発生される光を検出するための該第２の手段からの出力
信号の大きさであり、Ｃは、該基準光パルスを発生する
ための第２の手段からの基準光パルスの受取に応答して
発生される光を検出するための該第２の手段からの出力
信号の大きさであり、そして、Ｄは。

該基準光パルスを発生するための第２の手段からの基準
光パルスの受取に応答して発生される蛍光を検出するた
めの該手段からの出力信号の大きさである）を計算する
ための手段を備えている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記Ａ、　Ｂ
、　Ｃ，およびＤが、光パルスを受け取っていない時に
は前記各々の検出手段の応答の大きさより小さくなるよ
うにされている。

本発明測定器のさらに他の実施態様では、前記案内のた
めの手段が光パイプである。

本発明の光学システムは、蛍光染料により標識付けされ
た分析または定量すべき物質を、該物質上に投影される
像の幾何学的配置を制限するためにマスクされた複数の
高い強度の光パルスによって励起するための光学装置、
該染料から放出された蛍光を検出するための、そして存
在する染料の量の変化以外のシステム中の変化の影響を
最小にするように放出される光の量を定量化するための
基準装置を備えた蛍光測定器のための光システムであっ
て、フローセルおよび光検出器を有しており、励起光の
ための該フローセル中の第１の光路。

該フローセル中の蛍光染料からの放出光のための該フロ
ーセルから該光検出器までの第２の光路。

および該第１の光路により該フローセルに投影された像
の幾何学的配列を制限するための該第１の光路内のマス
ク手段を備えている。

本発明光学システムの他の実施態様では、前記光検出器
に投影された該フローセルの像の幾何学的配列を制限す
るための前記第２の光路内の第２のマスク手段をさらに
備えている。

本発明光学システムのさらに他の実施態様では。

非コヒーレントな励起光パルスを供給するための前記第
１の光路に光学的に結合されたパルス化光源をさらに備
えている。

本発明光学システムのさらに他の実施態様では。

第２の光検出器、および各励起光パルスの一部を該第２
の光検出器に伝達するための第３の光路をさらに備えて
いる。

本発明光学システムのさらに他の実施態様では。

前記パルス化光源の像を前記第２の光検出器の面に投影
する前に該パルス化光源の像を空間的に聞分または統合
するための前記第３の光路内の手段をさらに備えている
。

本発明光学システムのさらに他の実施態様では。

前記光検出器に投影される前記フローセルの像の幾何学
的配列を制限するための前記第２の光路内の第２の手段
をさらに備えている。

本発明光学システムのさらに他の実施態様では。

前記第１の光路内に光学帯域通過フィルタをさらに備え
、該フィルタが、前記励起光パルスを示す波長帯域内の
波長を有する光を通過させ１前記蛍光染料からの放出光
の波長の帯域を含む所定の波長帯域内の波長を有する光
の通過を実質的に阻止する。

本発明光学システムのさらに他の実施態様では。

前記第２の光路内に光学帯域通過フィルタをさらに備え
、該フィルタが、前記放出された蛍光を示す波長帯域内
の波長を有する光を通過させ、前記パルス化光源からの
励起光の波長の帯域を含む所定、−の波長帯域内の波長
を有する光の通過を実質的に阻止する。

本基準システムは第１のパルス化励起光源と第２のパル
ス化基準光源と２個の検出器とを用いる。

典型的には、パルス化励起光源は、アークが電極間の空
間をランダムにさまよう高強度アーク燈である。励起光
パルスをフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）の
ような適当な蛍光体の標識をつけたサンプルを内包する
フローセル（ｆｌｏｗ　ｃｅｌｌ）まで導く光路がある
。励起光パルスは選択された特別な蛍光体の励起帯域に
光学スペクトルをもつ。各励起光パルス２に反応して、
蛍光体は励起する。つまり、一部の電子は入ってくる光
子からエネルギーを吸収し。

高エネルギー軌道状態に投げ出される。これらの励起電
子の多くは、光子を放出して低エネルギー軌道にまで衰
弱する。それらの光子は、サンプルから放出された蛍光
として見られる。第２の光路はこの蛍光を２個の光検出
器の１個目に導く。典型的には、この検出器は光を検出
し、蛍光強度を示す信号を出す増倍型光電管（以下９時
々ｒＰＭＴＪと表す）である。この信号の振幅は、サン
プル濃度を示すサンプル内の励起された蛍光体の量、す
なわち、変数Ａとして記憶される。

各励起光パルスの一部はまた光パイプによって第２の光
検出器にまで導かれる。第２の光検出器は信号を出力し
、その振幅は変数Ｂとして記憶される。この振幅信号Ｂ
は励起光パルスの強度を示す。第２の光源は典型的には
発光ダイオードだが。

励起光源と交互にパルス化され、基準光パルスを生成し
、基準光パルスは励起光パルスと時間的に交互配置され
る。これらの各基準光パルスの一部は第１及び第２の光
検出器に伝えられる。これら各基準光パルスに応答して
、第１及び第２の各光検出器は、各基準光パルスの強度
を示す信号を出力する。各基準パルスに反応した第１の
検出器の出力は変数りとして記憶され、各基準パルスに
反応した第２の検出器の出力は変数Ｃとして記憶される
。本システムは、光パルスがないときの各検出器の出力
の測定も行い第１の検出器の出力を変数２１として記憶
し、第２の検出器の出力を変数２２として記憶する。本
システムは次に（（Ａ−Ｚｌ）　／　（Ｂ−２２）　）
に（（Ｃ−２２）　／　（Ｄ−２１）〕を掛は合わせる
ことによりサンプルのＲＦＩを計算する。パルスごとの
強度や波長のシフトに関する２個の光源内の変動３また
は第１及び第２の検出器の応答の変化、またはシステム
の他の電子及び光学的構成要素における変動による信号
レベルのたいていの変化は、この比を用いることによっ
て除去される。

本発明の基準システムの利点は、先に議論した第２図の
パルス化光システムの全ての利点を含む。

主として、パルス化光システムの利点は高い黒体温度を
用いて非常に強度の高いパルスが生成される点である。

また、余分な熱を発生せず、ランプの寿命を短縮するこ
となく青色の範囲の励起帯域の波長をもつ励起エネルギ
ーが生成される。検出器を２個用いる主要な利点の中に
、２個の検出器の応答特性の変化や、どんな原因であれ
、パルスごとの励起光の強度の変化の影響が除去される
利点がある。これは、　ＲＦＩの計算に用いる特殊な比
のおかげである。以下の議論で明らかなごとく。

ＰＭＴ光検出器の感度のような応答特性のいかなる変異
も消去される。なぜならＲＦＩ比（ｆｒａｃｔｉｏｎ）
の分子及び分母のどちらにもＰＭＴの反応因子があるか
ら１ある。同じことがＰＩＮダイオード光検出器の感度
のような応答特性のいかなる変化についてもいえる。励
起光源から発生する光パルスのパルスごとのいかなる強
度の変化も消去される。なぜなら、　　ＲＦＩ比の分子
及び分母の両方に励起光パルスの強度に比例する項があ
るからである。ＬＥＤ基準光源から発生する光パルスの
強度のパルスごとの変化についても同じことがいえる。

本発明の光学システムは、システムの安定性及び信号対
雑音比を更に改善するために、基準システムの動作に改
良を加えた。励起光パルスを得るために、レーザーを使
うこともできるが、典型的には、パルス化された。広帯
域で、コヒーレントでない高強度アーク燈を用いる。こ
のような広域帯パルス化光源は連続光源より効率的であ
る。なぜなら、サンプルを加熱しすぎることなく、励起
帯域のより強烈な光を得ることができるからである。こ
のような加熱はシステムに望ましくない変化を生じさせ
る。励起帯域の光の強度がより強ければ、より多くの蛍
光分子が励起し、それによってサンプルから放出される
蛍光強度が増すために。

信号対雑音比が改善される。

システムの安定度をさらに改良するには、励起光源とサ
ンプルを包含するフローセルとの間の光路のマスク内に
注意深く大きさを決めた開口部を用いる。このマスクお
よび開口部を用いる理由は。

励起光の蛍光光学チャネルへの散乱を最小限にするため
にアーク像の幾何学的範囲を既知の領域に制限するため
である。アークフラッシュランプは２個の電極を用い、
その間にアークが形成される。

このアークは電極間を自由に動きまわるが、マスクと開
口部を用いることによってフローセル内の励起光入力窓
を通ってサンプルに投影されるアークの動きまわる像は
枠をはめられる。あるいは空間的に制限される。つまり
、散乱を最小限にするなどの方法で制御された。特定の
既知の領域に制限される。入力窓の境界外のフローセル
の構造物にはほとんどエネルギーが投射しないため、散
乱が最小限度になる。つまり、マスク開口部の像の光線
は入力窓以外のフローセルの領域にはあたらない。マス
ク開口部の像はフローセルのほぼ中心に投射、集中する
。このマスキングのため、フローセルの角から散乱する
励起光の量は減少する。

この散乱した励起光はサンプルから第１の検出器まで放
出光が進行する光路へ進行できる。励起光フィルタと放
出光フィルタの通過帯域には典型的には、わずかの重複
部分があるため、励起光の蛍光通路への散乱や連結を最
小限度にすると、システムの信号対雑音比は改善される
。このようなＩＪＩ起光路光路光放出光路の連結はクロ
ストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）と呼ばれている。ク
コストークは除去するのが非常に望ましい。なぜなら、
それはたやすく。

サンプルから放出された光を圧倒することができるから
である。この放出光は非常に弱い。なぜなら、サンプル
液内の標的の濃度は９本発明が最も有効である分析また
は定量においては小さいからである。

増倍型光電管の光電陰極は、入力光強度が一定であると
きにあらゆる一定の場所に落ちる光に対して生成される
信号出力の点で２表面の全領域に渡って均一ではない。

その結果、アーク像のような構成像（ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅｄ　ｉｍａｇｅ）が光電陰極の面を自由に動きまわれ
ば、出力信号の振幅は変化するようになる。本発明は、
アーク像を破壊するために空間積分または統合（ｓｐａ
ｔｔａｌ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を利用してそのよ
うな変化の可能性を除去している。

具体的には、励起光の光路では、アーク像はその幾何学
的領域を制限するため、マスクされている。

このマスクされた像はフローセルの入力窓に投影され、
そこで蛍光体分子が励起される。蛍光体分子は次に光子
をあらゆる方向にランダムに放出し。

それは統計的に球型を形成する。この放出された蛍光は
空間的に積分または統合され、フローセルの出力窓に一
様に輝く像としてＰＭＴに対して現われる。この均一な
像によって、光電陰極の感度の変化が出力信号の振幅に
影響を与えるのを避けることができる。さもなければ、
動きまわるアーク像が光電陰極に投影されれば、影響を
与えることであろう。

基準光パルスの光路においても、同じ目的で空間積分が
利用されている。この基準光路では、光パイプ内での多
くの内部反射が空間積分または統合をひきおこす。マス
キングは励起光路で利用されるのと同じ目的で基準光路
でも利用される。

励起光路および基準光路でのアーク像のマスキングおよ
び空間積分または統合によって１両通路とも真のつりあ
いまたは比例関係（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ　１ｔｙ
）を保っている。この結果、動きまわるアーク像やパル
ス振幅変動などから生じる不安定さや変動がなくなり、
補償され安定した信号となる。

本システムの動作にさらに改良を加えるなら。

フローセルの出力窓とＰＭＴ光電陰極との間の光路に注
意深く大きさを決めた開口部を設けたマスクを用いると
よい。このマスクと開口部はフローセルの出力窓の焦点
像の平面に位置する。開口部の大きさは、フローセルの
出力窓から放出された光がＰＭＴの光電陰極をわずかに
満たさないような大きさにされる。このわずかに満たし
ていない点が好ましいのは、−杯にしすぎると、光を失
い、信号対雑音比が下がることになるからである。しか
しながら、きっちり満たさないと、光電陰極の表面に小
さな場所ができ、サンプル濃度が高くなれば、望ましく
ない飽和状態となり得る。最適の開口部の大きさは、光
電陰極をできるだけ１００％の利用に近づけて満たす大
きさである。

フローセルの出力窓とＰＭＴ光電陰極との間のこのマス
ク利用のもう１つの利点は、　ＰＭＴに達する散乱励起
光の量を削減し得ることである。フローセルの壁または
角に不注意のために当たった励起光は、フローセルから
ＰＭＴへの光路に散乱する。

もし、二の散乱した励起光がＰＭＴによって検出されれ
ば、励起光の強度のため、誤差を生じ、　ＰＭＴを飽和
させることもあり得る。ＰＭＴの前のマスクは。

この散乱光がＰＭＴに届くのを防ぐ。

光学帯域通過フィルタは、励起光源とフローセルとの間
の光路で用いられる。このフィルタは励起光をフローセ
ルまで通過させるが、励起光波長の望ましい範囲より外
の波長をもつ光のフローセルへの通過は実質的に遮断す
る。別の光学帯域通過フィルタが、フローセルと増倍型
光電管との間の蛍光光路で用いられている。このフィル
タは。

染料分子から放出される波長の範囲の光を通し。

励起フィルタの通過帯域に属する波長を遮断する通過帯
域をもつように選ばれている。

基準ＬＥＤから放出される光パルスの波長変化はその温
度を安定させることによって最小化される。

１０００Ｈｚという特殊な周波数を用いることは決定的
ではないが、最小化はこの１０００！Ｉｚの周波数をも
つ電気的パルスの列でＬＥＤを常に１５区動することに
よりなされる。こうすれば、　ＬＥＤは動作温度まで上
昇し、　ＬＥＤは決して停止しないのでその温度は保持
される。ＬＥＤの温度が安定するならどんな駆動周波数
でも、十分である。

要約すると１本発明の主な利点は、上記の改良によって
、パルス化光源の変化や第１および第２の光検出器の変
化のためにおこる信号の変動を実質的に除くことができ
る点である。興味の対象である微量のタンパク質や分子
の正確な検出および定量が可能な非常に安定した基準シ
ステムが提供される。

（以下余白） （実施例） 第３図に本発明の基準システムおよび光学システムの主
要な要素を説明するための本発明の概略図が示される。

光学システムの構成の正確な詳細については、以下に光
学システムに関する別々の節で述べられる。

本発明の基準システムの議論を正しく組み立てるために
、基準システムの構造および動作の詳細を述べる前に、
蛍光測定器の一般的な動作についての簡単な議論を含め
る。光源２０は、フローセル２２内の流体中に混合され
たサンプル分子に標識づけするために用いられる特別な
蛍光体に励起光を与える。各蛍光体は、到来する光に対
し特定の励起波長帯域をもち、その光は蛍光体の蛍光を
励起させる。各蛍光体はまた。励起帯域内の到来する光
による励起に応答して放出される蛍光の放出波長帯域を
もつ。第４図は、一般的に用いられる蛍光体であるフル
オレセインの励起帯域および放出帯域を示す。この染料
は、そのピークが約４９０ｎｍである励起帯域２４をも
ち、またそのピークが５２０ｎｍである放出帯域２６を
もつ。励起帯域と放出帯域がいく分部分的に重なること
に注意されたい。

光源２０は、使用される特定の染料の励起帯域で十分強
烈な光を出力するならどんな光源でもかまわない。励起
帯域での光出力の強度が高ければ高いほど望ましい。な
ぜなら、より高強度の光により、適切な周波数の光子が
より多く放出されるからである。励起帯域の光子の数が
増大するほど。

標識上のより多くの染料分子が励起され、放出帯域の光
を放射する。これによって、定量化の努力の対象（励起
に応答して染料から放出された光）である信号が増え、
それによって信号対雑音比も大きくなり、検出システム
の感度が改善される。

光源２０は単色でコヒーレントな、励起帯域のどこか、
なるべくならピークまたはピーク付近の光を放出するレ
ーザーでもよい。好適な実施例において、光源２０は１
強度が大きく、広域帯で、高圧のキセノンランプであり
、従来のコンビ壬−夕で制御される駆動装置（図示しな
い）でパルス化される。光源２０のパルス化により持続
時間が１〜２ｍｓの非常に強度の高いパルスが出ノｊさ
れる。光源２０のパルスの変化率は好適な実施例におい
ては、　１０〜１０００Ｈｚの範囲である。この遅いパ
ルスの変化率と短いパルス幅によって光源２０は、余分
に熱を発生することなく、光の放出スペクトル内の余分
の赤外線成分もなく、非常に高い黒体温度に至るまで駆
動することができる。高い黒体温度は７それによって出
カスベクトルの青色光成分の強度が増すので、望ましい
。つまり、励起帯域のピーク付近の光放出が最大になる
。連続光源と比較すると。

パルス化光源の固有の効率により、熱の発生の削減が見
込まれ、また対流や放射によるサンプルの加熱も防がれ
る。サンプルの加熱は望ましくない。

なぜなら、サンプルから放出される蛍光の同じ標的の濃
度に対する強度は、標的の濃度が変化しないにもかかわ
らず、サンプル温度の上昇に対して変化する。ゆえに、
光源２０でサンプルを加熱すれば、システム内に望まし
からぬドリフトを生じ。

あるいは標的の見かけ上の濃度の変化を起こし。

誤りを生じる。

光源２０から放出された光は全角度に現れるため。

また、信号対雑音比を改良するために放出光の最大量を
捕らえ、それをフローセルに向けることが望ましいため
、コリメーティングレンズ２８を用い。

その開口数で放出光を捕らえ、それを円柱状に投影する
。

この円柱状の光は「完全遮断帯域通過フィルタ」という
フィルタ３０を通して投影される。このフィルタは、特
定の通過帯域の光をできるだけ多く通過させるが、この
通過帯域以外の全放射波長の通過を赤外線または紫外線
を含めて実質的に遮断するように構成されている。第４
図において、四角形３２は通過帯域を記号的に示してい
る。通過帯域の実際の端は垂直ではなく、実際はいく分
傾斜している。従来のフィルタ技術で作ることが可能な
通過帯域の端に対する最も急峻な傾斜による遮断が望ま
しい。なぜなら、励起スペクトルフィルタの通過帯域の
ピークは１通過帯域の端の傾斜が緩ければ、放出フィル
タスペクトルに近い方の傾斜端が放出フィルタスペクト
ルの最短波長、つまり点３４の波長よりも短い波長にお
いて、非常に低い伝送レベルに達するぐらい十分に励起
スペクトラムのピークからはなして移動されなければな
らないからである。このことは、散乱励起光が放出光と
して検出されるという形でのクロストークを避けるため
に必要である。フィルタ３０を完全に定義する仕様は以
下の通りである。フィルタの出力が半分になる点は、　
　４８８．３ｎｍ　（許容差は十〇ｎｍまたは−１，５
ｎｍ）と、　　４７Ｂ、３ｎｍ　（許容差は±２　ｎｍ
）である。フィルタ３０の４９６ｎｍでの透過率は最大
１０−６である。この使用に合致するフィルタならばど
のようなものでも１本発明を実行する目的に適している
。これらの仕様を備えたフィルタを公知の技術を用いて
製造できるフィルタ製造業者があるので。

その製造の詳細についてはここでは述べない。

フィルタ３０を通過後、励起光パルスはレンズ３６によ
って、マスク４０内の開口部３８に集束される。

この開口部の目的は、開口部３８の既知の境界線の外の
励起光の通過を遮断することである。その理由は、光学
システムの議論に関連して、以下でより深く議論される
。光源２０内のアーク４２の像は開口部３８の平面内に
ある。

次に、開口部３８から発散する光をレンズ４４が再び捕
らえ、フローセル２２に向かって伝送するため。

平行にする。平行にされた光線は光線の大部分を通すビ
ームスプリッタ４６を通過するが、このビームスプリッ
タは励起光の約９％を以下に述べる基準光路に方向転換
する。

レンズ４８は、開口部３８の像をフローセル内の透明な
入力窓を通してフローセル２２内に包含されているサン
プルに集束させる。フローセルの入力窓の反対側には鏡
２５があり、いかなる励起光や放出光もサンプルに反射
してもどす。サンプル分子は蛍光を発し、それによって
、全方向に光を放つ。

透明の出力窓は、蛍光放出光を光検出器５０の表面に導
くように設計された光路に、光子を逃がす。

光検出器５０の反対側にあるフローセルの表面の鏡２３
は光検出器５０から離れて進行する光子を出力窓に向け
て、それを通過するように反射する。

これらの放出された光子あるいは光線はフローセルの出
力窓を離れた後は様々な角度で発散する。

レンズ５２は放出された光子の一部を捕らえ、それを平
行光線にする。

もう一つの帯域通過フィルタ５４が、フローセル２２と
、光検出器５０との間におかれ１その通過帯域外のほと
んどの放射の伝送を遮断する。フィルタ５４の通過帯域
は第４図に四角形５６で示される。このフィルタの目的
は、励起された染料の放出スペクトル内の光を通すとと
もに、クロストークを除き、散乱した励起光を放出され
た蛍光と誤って検出しないようにするために、実質的に
他の全放射の伝送を遮断することである。通過帯域５６
の端は実際は垂直ではなく、フィルタ３０の場合と同じ
ように、わずかに傾斜している。理想的にはフィルタは
垂直なロールオフ（ｒｏｌｌｏｆｆ）をもっているであ
ろうが、現実にはロールオフは傾斜している。

フィルタは、できるだけ傾斜の急峻なロールオフをもち
、放出スペクトルのほぼ中心に通過帯域のピークを持つ
ように製造される。フィルタは１点５８の波長よりも短
い波長をもつ全ての光エネルギ−を実質的に遮断しなけ
ればならない。フィルタ５４の完全な仕様は、以下の通
りである。フィルタは出力が半分になる点が５１３ｎｍ
　（許容差は＋１，５または−Ｏｎｍ）と、５２３ｎｍ
（許容差は士−２ｎｍ）である「帯域通過フィルタのみ
」である。５０７．５ｎｍにおける透過率は、最大１０
−６である。フィルタ３０および５４はともに、従来の
フィルタ製造技術で作ることができる。

フィルタ５４を通過後、平行にされフィルタリングされ
た蛍光は集束レンズ（ｆｏｃｕｓｉｎｇ　１ｅｎｓ）５
６を通過する。励起パルス光がフローセル２２内のサン
プルに照射されると、光子が任意の方向に放出され、開
口部３８内の動きまわるアークの像はなくなる。つまり
、空間的に積分または統合されて輝く無定型の光の領域
になる。フローセルの壁から散乱し迷い出た励起光が光
検出器に到達するのを防ぐため、レンズ５６が用いられ
、フローセル２２の像をマスク６０の開口部５８に集束
する。この開口部５８は、フローセルの壁の像をマスク
し、フローセル内から放出された光線のみを通過させる
。

放出光の強度は次に光検出器５０で検出され、電気信号
に変換される。典型的には、光検出器５０は増倍型光電
管であるが、他の非常に感度の４１４１光検出器も用い
ることができる。

基準システム ビームスプリンタ４６は、励起光パルスのエネルギーの
小さな部分をレンズ６２に方向転換させる。

向きを変えられた光エネルギーの割合は決定的ではない
が、少なくとも容易に検出され信号に変換されるのに十
分なほど高率であるべきであり、また相当量の励起エネ
ルギーを、染料分子を励起させる仕事から奪ってしまう
ほど高率であってはならない。レンズ６２は、開口部３
８の像を光パイプロ４の入力端に集束させる。典型的に
は光パイプロ４は。

透明のプラスチック棒であり、被覆がある。被覆の屈折
率は、光線の内部反射が臨界角以下で被覆に当たるよう
に、中心部の屈折率とは十分な差をもたされている。レ
ンズ６２は光パイプロ４の開口部内にアーク像を集束で
きるように位１決めされ。

形成されるべきである。光パイプからいくらか光を失っ
ても、９％の方向転換した励起光エネルギーは基準シス
テムの動作の目的には十分すぎるので、致命的にはなら
ない。

光パイプロ４は、注入された光を内部反射によって出力
端まで誘導する。出力端で、誘導された光は多（の異な
る角度で現れる。光パイプロ４は、アークとマスク開口
部の像がそれを構成する光線の何千、何万という内部反
射によって破壊されるという点で、空間的に積分または
統合される。出力端から現れた光は、励起パルスととも
に点滅する。

輝く、均質の光の円板を示す。動きまわるアークの像は
完全に破壊される。

光パイプロ４の出力端から現れた光はレンズ６６で捕ら
えられ、第２の光検出器６８に投影される。この光検出
器６８は典型的にはＰＩＮダイオードであり。

ダイオードの伝達関数によって、到来する光パルスを、
到来するパルスの強さに関連づけられる振幅をもつ電気
パルスに変換する。

第２の光源７０は、典型的には緑色に発光するＬＥＤで
、コンピュータ制？１１のパルス駆動システム（図示し
ない）で駆動され、励起パルスと時間的に交互に配置さ
れる基準パルスを放出する。つまり各励起パルスの間で
ＬＥＤ７０は「ＯＮ」状態に駆動され。

基準光パルスを放出する。

各基準パルスはＬＥＤ自身のレンズで光検出器６８の方
向に向けられ、ビームスプリッタ７２を通る。

ビームスプリンタ７２によって、一部の基準パルス光の
エネルギーはまっすぐに通過し、各基準光パルスの一部
はふつうは鏡の壁の空洞（ｍｉｒｒｏｒｅｄ　ｗａｌｌ
ｃａｖｉｔｙ）　７６に向かって方向を変えられる。ビ
ームスプリンタ７２をまっすぐに通過するこれらの各基
準光パルスの部分は、光検出器６８にぶつかった基準光
パルスの一部の強さに関連する振幅をもつ電気パルスに
変換される。

ビームスプリッタ７２で鏡の壁の空洞７６と光検出器５
０に向かって分岐させられた各基準光パルスの一部はフ
ィルタ７４を通過する。フィルタ７４は、　ＬＥＤから
出た比較的強い緑色の光を、増倍型光電管５０を会包和
させないレベルにまで弱める。フィルり７４はまた。帯
域通過フィルタとしても作用し、　ＬＥＤから出た緑色
の光を通過させる一方、光線スプリンタ７２と増倍型光
電管５０との間の光学通路にたまたま入り込んだいかな
る散乱した青色の励起光も遮断する。図式で示している
だけではあるが、暗色の壁の形式をした光バブル（ｌｉ
ｇｈｔ　ｂａｆｆｌｅ）　７８があり、光パイプロ４の
端や、レンズ６６やＰｉＮダイオード６８から増倍型光
電管５０へ向かって、青色の励起光がほとんど散乱しな
いように配設されている。

フィルタ７４は高価なフィルタでなくてよい。なぜなら
ば、Ｎ単なフィルタを用いれば良いように。

緑色の基準光パルスと青色の励起パルスとの波長の差を
制御して十分に波長を離すことができるからである。

フィルタ７４を通過する基準光パルスは、みがかれたア
ルミニウム壁を持つ空洞７６の中へ導かれる。

ＬＥＤ７０の像を再び空間的に積分または統合し、それ
によって像を破壊するために、入ってくる光パルスは空
洞の壁の間で反射される。しかしながら。

ＬＥＤＯ像は安定しているため、この空間的積分または
統合は必要ではない。基準パルスは、増倍型光電管５０
の面に再び向けられるために、空洞７６内で反射され、
増倍型光電管では各基準パルスが。

基準光パルス強度に比例する振幅をもつ電気信号に変換
される。

第５図では、基準システムの一部である電気回路のブロ
ック図が示される。ＬＥＤ基準光源７０は。

Ｄ／Ａ変換器８２の出力と連結されているＬＥＤ駆動装
置８０によって駆動される。Ｄ／Ａ変換器８２はデータ
バス８４上のデータを線８６上のアナログ電圧に変換し
、それはＬＥＤ７０を流れる。比例した駆動電流に変換
される。データバス８４のデータやデータのタイミング
は制御論理８８で制御される。この制御論理は基準シス
テムの動作を制御するための様々なデータや制御信号を
生成するのに役立つ。この機能と、これらの制御信号や
データ信号のタイミングの関係については以下でより詳
細に述べる。データバス８４のデータと、データの出現
する時間を制御することによって、制御論理８８はＬＥ
Ｄ７０に様々な強度で基準光パルスを発生させることが
できる。基準光パルスの強度を変える能力が望ましい理
由は、システムの利得が調節できる点にある。

また、利得が低められたとき、基準光パルスの強度を同
様の因子で上げることができることが望ましい。

基準光パルス９０はＰＩＮダイオード光検出器６８と光
学的に連結される。このダイオードは、到来する光を線
９２上の電流に変換する。その電流は、基準光パルスの
強度に比例する。演算増幅器９４は電流電圧変換器とし
て連結され、電流信号を線９６上の電圧信号に変換する
。この信号は２個の演算増幅器９８および１００で処理
される。各増幅器はそれぞれ線１０２および線１０４上
の信号で制御される可変の利得をもつ。増幅器９８は、
線１０２が論理１をもつか論理Ｏをもつかどうかによっ
て１または５の因子で、線９６上の信号を増幅する。増
幅器１００は線１０２が論理１をもつか論理Ｏを持つか
どうかによって１または２０の因子で、増幅器９８の出
力の信号を増幅する。線１０２および線１０４の信号を
適切に制御することにより、１，５．２０または１００
の利得が選択できる。増幅器１００からの出力信号は、
線１０１を経て、ゲート付積分器１０６の入力と連結さ
れる。このゲート付積分器は、線１０１の信号を足し合
わせる。これは線１０８のＧＡＴＥ信号が立ち上がった
ときに始まる。ゲート付積分器は、　ＧＡＴＥ信号が立
ち上がっていないときの積分結果が保持される点でサン
プルアンドホールド回路（ｓａｍｐｌ、ｅａｎｄｈｏｌ
ｄ　ｃｉｒｃｕｉｔ）にいく公憤ている。ゲート付積分
器１０６が線１１０上のＲＥＳＥＴ信号を受けとるまで
結果は保持され、　ＲＢＳＥＴ信号を受けとったとき。

線１１２上の出力はゼロとなり１ゲ一ト付積分器は次の
パルスの積分を行うことができる。

ゲート付積分器の出力は、マルチプレクサ１１４のボー
トに連結される。このマルチプレクサの別のポートは、
増倍型光電管光検出器５０の信号を積分するための別の
ゲート付積分器１１８の出力線１１６と連結される。増
倍型光電管５０に照射する基準光パルス１２０は、電流
パルスに転換され、’ｆ＝９１２２上に出力される。こ
れらの電流パルスは演算増幅器１２４で電圧パルスに転
換され、ゲート付積分器１１８の人力に印加される。こ
のゲート付積分器は、線１１０に連結されたりセント入
力と、線１０８に連結されたゲート入力とを持ち、ゲー
ト付積分器１０６と同様に機能する。制御論理８８は、
　ＧＡＴＥおよびＲＥＳＥＴの信号で線１１０および線
１０８を制御する。その方法については、システムの意
図する目的を達成するためのシステムの動作が述べられ
るときに以下で述べる。

マルチプレクサ１１４は制御論理８８からの制御線１２
６上のＭＩＸ　Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ信号の状態によって、２
個の入力ボート１１２および１１６のうちの１つの信号
を選ぶ。選択された信号は出力線１２８に連結され。

出力線１２８はＡ／Ｄ変換器１３０の入力に連結してい
る。線１２８上のアナログ信号は、因子バス（ｆａｃｔ
ｏｒｂｕｓ）　１３２上の出力であるデジタル値に変換
され。

それは計算回路１３４に連結される。計算回路１３４は
必要な因子が因子バス１３２で受けとられたときに、必
要な因子全てをメモリに記憶した後、以下の説明のよう
に計算を行う。好適な実施例において、制御論理８８と
計算回路１３４は、適切にプログラムされたマイクロプ
ロセッサ（Ｚ８０）であり、そのアセンブリコードはこ
れとともに参考資料１として含まれる。しかしながら、
下記のような順序で上記のように信号を生成し、下記の
ように計算を行うアナログまたはデジタルの具体例であ
れば何でも９本発明の実行目的には十分である。全因子
を受けとり、貯えた後、計算回路は自動的に計算を行う
ことができるかあるいは線１３６上の信号を受けとって
計算を行うことができる。好適な実施例において線１３
６上の信号はまた。計算回路に。

測定を行ったときの利得を伝える。制御論理８８をＡ／
Ｄ変換器１３０と計算回路とに連結する他の制御信号の
意味と目的については、読み取りサイクルごとに行われ
る計算を実行させる制御信号のタイミングの議論と関連
して以下に説明される。

制御論理８８はまた。データバス８４によってデジタル
−アナログ変換器１３８と連結されている。データバス
８４上のデータは、制御論理をデジタル−アナログ変換
器１３８に連結するチップ選択綿１４０が有効であると
き、アナログ数に変換される。チップ選択線１４０はア
ドレスデコーダの出力になり得るし、また、　　Ｄ／Ａ
変換器１３８のアドレスデコーダとともに、アドレスバ
スの記号化でもありうる。

Ｄ／Ａ変換器１３８のアナログ出力はバッファ１４２で
緩衝され、増倍型光電管５０にバイアス電圧をかけるた
めに線１４６上に高電圧を出力する可変電圧高電圧型ｔ
１．１４４の制御入力に対してＣ０ＮＴＲ０Ｌ信号とし
て印加される。Ｄ／Ａ変換器１３８を選択してデータバ
ス８４のデータを変化させると、増倍型光電管への高電
圧が制御でき、システムの感度が制御される。

制御論理８８はアーク燈とも連結され、その閃光率を制
御する。線１４８のＴＲＩＧＧＥＲＡＲＣＬＩＧＩ（Ｔ
信号は、アーク燈２０にＩ・リガがかけられるとき、制
御論理８８によって立ち上げられる。この信号は、出力
が発光ダイオードを駆動するために連結されている駆動
増幅器１５０の人力と連結されている。ＴＲＩＧＧＥＲ
ＡＲＣＬＩＧ）ＩＴ信号が立ち上がっている間にＬＥＤ
　１５２から放出された光はＰｒＮダイオード１５４に
照射され、　ＰＩＮダイオードは光パルスを検出し、　
ＴＲＩＧＧＥＲ信号を、高電圧電源をトリガ入力に連結
する線１５６上に生成する。ＴＲＩＧＧＥＲ信号が発生
すると、高電圧電源１５８は高電圧を送り高電流パルス
がアーク燈２０を通り、アークを生成し、励起光パルス
１６０を生成する。励起光パルスは放出される蛍光の生
成を通じて、増倍型光電管５０に連結される。

第６図、第７図を参照すると、相対蛍光強度の計算を実
行するための制御信号のタイミングが理解される。第６
図は、単一の励起パルスと単一基準パルスを評価するた
めに、読み取りサイクルの間に計算回路１３４と制御論
理８８が実行するステップの流れ図である。第７図は第
６図の計算を実行するために１読み取りサイクルの間に
立ち一ヒげられる様々な制御信号間のタイミングの関係
を図示したタイミング図である。本システムは典型的に
は、励起パルスが生成される前のある時点で優先度の高
い割り込みが生成されるような１割り込みによって駆動
される。この割り込みは、第６図のステップを実行する
ルーチンヘベクタ方式により処理を移す。好適な実施例
において、各検出器からは、零または基準線信号が読み
取られる。つまり、各検出器から信号が読み取られ、励
起パルスまたは基準光パルスのどちらかのアドレスに信
号が記憶される。第６図のルーチンの人口点はゆえにス
テップ１６２であり、増倍型光電管５０から「ゼロ」光
または基準線出力を読み取る。

（以下余白） 第５図および第７図では、第６図のステップ１６２は５
時間線５の時刻ｔ１とｔ２との間に、線１１０上のＲＥ
ＳＥＴ制御信号を立ち上げることにより実行される。こ
の信号により、ゲート付積分器１０６および１０８の両
方がリセットされ、増倍型光電管５０とＰＩＮダイオー
ド６８から入ってくる信号を積分する準備が整う。時間
線３行目の時刻ｔ３では、　４８１０８上のＧＡＴＥ信
号が立ち上げられ、それによって両ゲート制御積分器が
同時に作動し１両者はそれぞれのチャンネルに連結され
た光検出器からの「ゼロ」光信号を積分し始める。ＧＡ
ＴＥ信号は１時刻ｔ４まで立ち上げられたままで、その
時刻に第７図の時間線６に示される線１３３上（７）　
５ＴＡＲＴ　Ｃ０ＮＶＥＲＳＩＯＮ信号が立ち上げられ
る。これによって、　Ａ／Ｄ変換器１３０はどんなアナ
ログ信号が線１２８にあろうとも、デジタル値への変換
を始める。線１２８上の信号は。

第７図の時間線４の、線１２６上（７）　ＭＩＸ　Ｃ０
ＮＴＲ０Ｌ信号の状態で制御される。時刻ｔ４ではＭＵ
Ｘ　Ｃ０ＮＴＲ０１，。

は低く、線１２８と接続するため線１１６上のサンプル
チャンネル信号を選択する。

時刻ｔ３とｔ４の間では時間線１と２における励起また
は基準光パルスは無（、そのため、　５ＴＡＲＴ　Ｃ０
Ｎ−ＶＥＲ５ＩＯＮ信号により時刻ｔ４に始まった変換
はサンプルチャンネルの「ゼロ」である光の値を計算す
る。サンプルチャンネルの零値の変換が終わると。

時刻ｔ、で第７図の時間線７に示される線１３１上のＣ
０ＮＶＥＲＳＩＯＮ　ＤＯＮＥ信号が立ち上げられる。

この信号は制御論理８８に、有効な因子データが因子バ
ス１３２上に存在することを知らせる。制３Ｂ　論理は
。

どの要素がバス１３２にあるかわかるようにプログラム
されており、この識別は、６個の因子または項のうちの
どれが現在バス１３２上で有効であるかを識別するため
に、３ビツトのＦＡＣＴＯＲ１０バス上のビットを設定
することにより計算回路１３４に送られる。ある実施例
においては、制御論理８８と計算回路１３４は単一のプ
ログラムされたマイクロプロセッサで因子バス１３２は
この単一回路に連結されている。そのような実施例にお
いては、どの因子がハス上にあるかの識別は既にマイク
ロプロセッサに知られているので、　ＦＡＣＴＯＲ１０
バス１３５は必要でない。ＦＡＣＴＯＲ１０バス上のビ
ットの設定は。

時間線８に図示されるように時刻ｔ、に始まる。しかし
、当業者には第７図の他の相対的なタイミング関係と同
様にこの相対的なタイミングも１回路の遅れを説明する
ためにわずかに調節しなければならないことが分るであ
ろう。第７図は本発明の概念のみを図示したのであって
１本発明を実行するための実際のシステムのタイミング
は第７図といく分ずれるかもしれない。

時刻ｔ６において、第７図の時間線９に示される線１３
７の信号５ＴＯＲＥ　ＦＡＣＴＯＲが立ち上げられる。

ＦＡＣＴＯＲＩＤバスのデータビットが有効であること
が知られるように２時刻ｔ６は時刻ｔ、の十分後に選ば
れている。この５ＴＯＲＥ　ＦＡＣＴＯＲパルスにより
。

計算回路１３４は、バス１３２上に記憶されているデー
タを読み取りＦＡＣＴＯＲ１０バス１３５で確認したア
ドレスにデータを記憶する。このようにして、第６図に
図示されるルーチンで実行される計算のための「サンプ
ル　ゼロ」の項が、計算されかつ記憶され、第６図にお
けるステップ１６２が完了する。

次に、基準システム光検出器であるＰＩＮダイオード６
８のためのゼロまたは基準′ｆｆＡ値を計算し記憶する
ため、ステップ１６４が実行される。ゼロ信号は既にゲ
ート付積分器１０６で積分されている。なぜなら、この
積分はＧＡＴＥ信号が立ち上げられた時刻ｔ３に始まっ
ているからである。ゲート付積分器１０６は、サンプル
　アンド　ホールド回路がサンプル信号が無効となった
後もサンプルした値を保持するのと同様に３時刻４から
櫃分値を保持する。

時刻ｔ７において、線１２６９時間線４のＭＬＩＸ　Ｃ
０ＮＴＲ０Ｌ信号が低レベルからの高レベルへ変化し、
ゆえにゲート付積分器１０６の出力が選択され線１２８
へ連結される。はぼ同時刻あるいはわずかに遅れて。

ｖＡ１３３上（７）ＳＴＡＲＴ　Ｃ０ＮＶＥＲ５ＩＯＮ
信号が再び立ち上げられ、変換プロセスが始まる。後に
、ある可変の時刻ｔ８ニおイ”ｉ’　Ａ／Ｄ変換器１３
０がＣ’０ＮＶＥＲＳＩＯＮ　ＤＯＮＥ信号を立ち上げ
、そのため、制御論理８８は、基準チャンネルのゼロま
たは基準線値がバス１３２上で現在有効なデータである
ことを示すため、　ＦＡＣＴＯＲＩＤハス１３５上のビ
ットを設定する。このバス１３５上のビットの設定は時
間ｔｓから始まる時間線８上に記号的に示されている。

時刻ｔ９でバス１３５上のビットが有効になったとき、
制′４１１論理８８は線１３７上の５ＴＯＲＥ　ＦＡＣ
ＴＯＲ信号を立ち上げ、それによって計算回路１３４は
、　Ａ／Ｄ変換器１３０からの出力バス１３２上のデー
タを読み取り、それをＦＡＣＴＯＲ１０ハス１３５上の
データで識別したアドレスに記憶する。

これで第６図のステップ１６４が完了した。

次に第６図のルーチンは、基準システムのＬＥＤ光源７
０を閃光させる。このためのステップは第６図に示され
ていないが、その詳細は当業者には明らかであろう。ま
たこの機能を行う正確なコートは１本文に添付の参考資
料ｌに含まれている。第６図のルーチンの次の２つのス
テップ１６６および１６８は第７図の時間線２上に示さ
れる基準光パルスに応答して生成された電気出力信号を
増倍型光電型５０およびＰＩＮダイオード光検出器６８
からそれぞれ読み取り記憶するためのものである。時間
線３上のＧＡＴＥパルスは８時刻ｔ、。とｔｌｌの間で
立ち上がっており、その時間は、基準光パルスの発生時
間と重なり合う点に注意されたい。制御論理８８と計算
回路の動作並びに基準光パルスに応答した各光検出器か
らの出力信号を読み取るための制御信号のタイミングは
、以前にゼロまたは基準線応答の読み取りについて述べ
たのと同様である。唯一の違いは、基準光パルスがゲー
ト期間中に生じることと１時間線８におけるＦＡＣＴＯ
ＲＩＤバスに設定されたアドレスはｒ　ＰＭＴの基準値
」とｒＰｉＮの基準値」のアドレスであることである。

第６図のルーチンの次の２段階のステップ１７０と１７
２は、この特定の読み取りサイクル中に発生した特定の
励起光パルスに応答して増倍型光電管およびＰＩＮダイ
オード光検出器から出た出力信号を読み取り、記憶する
ためのものである。この励起パルスは第７図の時間線１
上に示されている。

再び１時間ｖＡ３の時刻ｔ１２とｔ１３の間で、　ＧＡ
ＴＥ信号が立ち上げられる。この選択された時間は、励
起光パルスの発生時間を区切るためのものである。

制御論理と計算回路の動作及び、この励起パルスに対す
る応答を読み取り、記憶する制御回路の相対的なタイミ
ングは、　ＰＭＴとＰＩＮ光検出器に対するゼロ応答の
読み取りについて前記したものと同様である。ただし、
　ＦＡＣＴＯＲＩＤバス１３５上に書きだされるアドレ
スは適当に異なっている。

第６図の最終ステップ１７４と１７６は、ステップ１７
４で示す計算を行い、その結果を、「相対蛍光強度」と
して出力するためのものである。ステップ１７４で計算
される比は複雑な比であり、標的サンプル濃度の変化以
外のシステム内の他の変化と同様に検出器の基準線応答
の変化や、パルスごとの光強度の変化の影響が相殺され
、安定した標的濃度に対して「相対蛍光強度」が安定す
るように考えられている。比は互いに乗算される２つの
比から構成される。これら２つの比は記号で（Ａ／Ｂ）
Ｘ　（Ｃ／Ｄ）と表すことができる。Ａは、この読み取
りす・イクル中に生じた励起光パルスに応答してフロー
セルから放出された蛍光に対するＰＭＴの応答から光パ
ルスがないときのＰＭＴの応答を減じたものの振幅であ
る。Ｂは、この読み取りサイクル中に生じた励起パルス
に対するＰＩＮグイオ−ドの応答から光パルスがないと
きのＰＴＮダイオードの応答を減じたものの振幅である
。Ｃは、この読み取りサイクル中に生じたＬＥＤからの
基準光パルスに対するＰＩＮダイオードの応答から光パ
ルスがないときのＰＩＮダイオードの応答を滅じたもの
の振幅である。Ｄは、この読み取りサイクル中に生じた
ＬＥＤからの基準光パルスに対するＰＭＴの応答から光
パルスがないときのＰＭＴの応答を減じたものの振幅で
ある。

システムの動作においては１例えば１００回の励起パル
スおよび１００回の基準パルスのような多数のパルスか
ら平均相対蛍光強度を求める。こうすれば、測定の精度
が向上する。しかしながら、アーク燈２０の励起パルス
はパルスごとに強度が５％まで変動する。一定の標的濃
度について、放出される蛍光の強度は励起光の強度に比
例する。即ち。

これらの励起光の強度の変化が、相対蛍光強度の計算中
に相殺されないならば、実際の濃度が変化しないという
事実にもかかわらず、標的濃度に見掛け−Ｌの変化が生
じることになる。第６図のステップ１７４で計算される
比から考えると、励起パルスのパルスごとの強度が変化
するとＡ、Ｂ両項とも平等に増大することがわかる。各
パルスに対して、結果として残る相対蛍光強度は、従っ
て励起パルスの強度と無関係に同じままである。項Ａお
よびＢに対する励起パルスの強度のパルスごとの変化の
影響を相殺する必要性から１本発明の第２の光検出器の
必要性が生じた。しかしながら、第２の光検出器はＰＩ
Ｎダイオードである必要はない。

なぜなら、Ｂ項を与える機能を実行するならば。

いかなる光検出器でも充分であるからである。

一定の光強度に対応する。励起光パルスに対するＰＩＮ
ダイオードおよびＰＭＴ光検出器の応答において１時間
や温度によるドリフトがおこる。これらの変化は標的の
濃度に、実際は濃度は変化しないのに、見掛は上の変化
をおこす。これらの応答における変化は、各サイクル中
に各検出器から２回の読み取りを行い、各検出器からの
一方の読みが比の分子となり、もう一方の読みが分母と
なるような比を計算すれば相殺することができる。ゆえ
に、もし、一定のパルス強度に対して、どちらかの検出
器の反応がサイクルごとに変化すれば。

分子２分母ともに平等に減少または増大し、ゆえに変化
の影響は相殺される。つまり、励起光や基準光のパルス
における等しい光強度に対してサイクルごとにＰＭＴの
応答がドリフトをおこせば１項ＡおよびＤが平等に変化
し、変化の影響は相殺される。同様に、　ＰＩＮダイオ
ードの応答がサイクルごとに変化すれば１項ＣおよびＢ
が平等に影響をうけ、変化の相対蛍光強度に対する影響
は相殺される。各読み取りサイクルの間に各検出器から
光を２回読み取る必要性から、第２の光源の必要性が生
じた。

光学システム 第３図を再び参照すると本発明の光学システムの概略図
が示されている。この光学システムの機能は、アーク燈
２０とＬＥＤ７０から発生する異なる二組の光パルスを
、２つの異なる検出器まで、最小のクロストークと最大
の安定性で導くことである。

本光学システムは励起光のパルスを生成するアーク光源
２０を備えている。これらのパルスはコリメーティング
レンズ２８に導かれ２次に、先に仕様を記したフィルタ
ー３０を通過する。フィルター３０から現れた光パルス
は、集束レンズ３６を通過する。

集束レンズは、マスク４０の平面上の開口部３８に１動
きまわるアークの像を集束させる。開口部３８は。

フローセル２２の励起光の入力窓の大きさにほぼ等しい
。マスク４０内の開口部３８の目的は、動きまわるアー
クの像の幾何学的範囲をあらかじめ定めた領域に制限す
ることである。その理由は、放出される蛍光をＰＭ７５
０に向かって運ぶ光学チャンネルに入るフローセルの角
から散乱した散乱励起光の量を最小にするためである。

開口部の像がフローセルに集束したとき、励起光の入力
窓の範囲外のフローセルの端に光エネルギーが当たって
、　　ＰＭＴに向かって反射したり散乱したりしないよ
うに開口部３８のサイズを決めることにより散乱を最小
限にとどめている。

開口部の像は次に２　コリメーティングレンズ４４の開
口数に導かれ、そこで発散する光線が捕らえられ、平行
光線とされる。この光線は次にビームスプリッタ４６を
通って、集束レンズ４８に投影される。レンズ４８は開
口部３８の像を、フローセル２２の励起光の入力窓に集
束させる。

第８図はフローセルの平面図を示し、第９図はフローセ
ルの励起光の窓の正面図を示す。フローセルは３００か
ら３０３までの４つの透明の四角形の空洞３０４を定め
るよう配置された石英ガラスでできた窓から構成される
。空洞の中には、標識をつけた標的の液状懸濁液が入っ
ている。フローセルの角３０５から３０８までは不透明
な黒色石英で構成される。これらの角の部分は透明の石
英の窓と同じ厚さであり１それぞれの透明な石英窓のパ
ネルの不透明な延長部を形成するよう、角で透明な石英
窓につながれている。それによって５各窓の透明な部分
の境界が定められる。３０５および３０６の不透明な石
英の角の部分によって側面を守られる透明な石英窓のパ
ネル３００は励起光窓の透明な部分の境界を定める。こ
の励起光窓は第９図に示される。第９図は、第８図を線
９−９から見た図である。第９図は励起光窓を通って、
フローセルの空洞３０４の中へ入る開口部３８の像の望
ましい配置を示している。

像の側の焦点がフローセルの空洞３０４に入るように、
レンズ４８の配置を調整し、レンズ４８の形を選ぶこと
が望ましい。また２開口部３８の像全体をフローセルの
空洞３０４内に包含することができるように、レンズ４
８の物体の側の焦点に関してマスク４０の配置を調整し
、励起光の窓のサイズに関連して開口部３８の大きさに
選択することが望ましい。

開口部３８の像を形成する全ての光線は、不透明な角３
０５および３０６に触れることなく、励起窓３００を通
過しなければならない。もし、いくらかの光線が角に当
たると、空気と石英の屈折率が適合しないため、いくら
かの反射がおこる。このような反射は石英と空気との間
および石英とフローセル内の溶液との間の境界でおこり
得る。このような反射は望ましくない。なぜなら、励起
チャンネルから放出光チャンネルへの散乱光が増大する
という形での、システム内の雑音の原因となるからであ
る。フローセルの壁の屈折率を空気の屈折率にちょうど
適合させ、フローセル内の液体の屈折率をフローセルの
壁の屈折率に適合させることが望ましい。しかしながら
、これは実際の実施例においては、現在、可能ではない
。

塵埃粒子や溶液中の粒子から散乱される光および様々な
構造や、屈折率の異なる材質間の境界から反射する光が
存在する。この避けられない事実のために７フローセル
の石英の壁の内部に、内部反射によって捕らえられるの
にちょうど良い入射角を光源がもつことがある。つまり
、ある光線は石英とそれより小さい屈折率をもつ外部の
媒体との間の接触面で臨界角よりも大きい角度で交差す
る。そのような光線は第８図に示される光線３１６のよ
うに１石英の中に反射しもどされる。３０５から３０８
の不透明の隅の目的は、これらの捕らえられた光線の大
半が、それらの光線が雑音として検出されるであろう放
出光チャンネルに逃げるのを防ぐことである。

１パルスの間の典型的なアーク像の例を第９図に示す。

この特定のアークは開口部の境界の外で動きまわってい
たが、第３図のマスク４０の開口部３８の境界で端を切
りとられ、その結果アーク像の光はフローセルの３０５
および３０６の端の部分上には落ちないことに注意され
たい。励起光窓を通過するときにフローセル内に開口部
３８の像を形成する光線の境界は３０９〜３１２の破線
で図示されている。典型的には各励起光パルスのアーク
はまたアークの周囲を取り巻いて輝くガスの領域を生成
する。この輝くガスの領域の光もまたマスク４０内の開
口部３８に端を切りとられ、この輝く領域の像内の光は
、フローセルの励起光窓の不透明な角には落ちない。そ
こに落ちると、放出光の光学光チャンネルへ散乱されて
しまうであろう。

フローセルを通過した励起光は鏡２３でフローセルに反
射しもどされ、標的領域を通る２度目の通過でより多く
の染料分子を励起する。透明の石英の窓３０３の方向に
励起された蛍光分子から放出された放出光は鏡２５で反
射される。そして窓３０１の方向に放出された光子とと
もに放出光窓３０１を通って、外へでる。この放出光は
空洞３０４内の液体の中に星雲状の輝く領域を形成して
おり、空洞３０４に投影されたアーク像は、空洞３０４
内の放出光子の球形の放出によって破壊されるかあるい
は空間的に積分または統合される。

この放出された蛍光は、様々な角度で放出され。

中には発散するものもある。放出光は鏡でレンズ５２に
反射され、レンズ５２によって平行光線とされて帯域通
過フィルタ５４を通過する。このフィルタの特性は先に
定義された。このフィルタの目的は放出光の光学チャン
ネルへ進んできた散乱あるいは屈折励起光を通さないこ
とである。

フィルタ５４から現れる。フィルタを通過した光線は、
フローセルの放出光出力窓３０の像を第２のマスク６０
の開口部５８内の焦点へ運んでくる集束レンズ５６を通
過する。開口部５Ｂの大きさと、　ＰＭＴ内の陰極の表
面に対するその位置は、開口部５８の放出光出力窓の像
から発散した光線が、　ＰＭＴの陰極の表面の境界を越
えることなく、ＰＭＴの陰極の表面全体をおおうように
定められる。

本システムの第２の光源は緑色光を発する発光ダイオー
ド７０である。この発光ダイオードは自身のレンズをも
ち、指向性を有し位置的にも安定した光線を出す。その
光線はふつうビームスプリッタ７２を通り、　　ＰｒＮ
ダイオード光検出器６８に向けられる。Ｌ　Ｅ　Ｄ　７
０から放出された光の大部分は、ビームスプリフタを通
ってＰｒＮダイオードの表面上に落ち、そこで電気信号
に変換される。ビームスプリッタ７２により、　　ＬＥ
Ｄ７０より放出された各基準光パルスの一部は、フィル
タ７４を通るように向きを変えられる。フィルタ７４は
緑色の基準光パルスを通過させるが、いかなる青色の励
起光もＰＭＴへ向かって通過するのを遮断するように設
計されている。フィルタ７４から出現した基準光パルス
は１鏡の壁の空洞７６に入り、その壁の間でＬＥＤ７０
の像の内部反射がおこる。この内部反射によって、　　
ＬＥＤＯ像は空間的に積分または統合され、それによっ
てＬＥＤの像が破壊されるのだが、これは必要なことで
はない。なぜなら、　　ＬＥＤの像は安定しており。

空間的に積分または統合する必要があるほど動きまわら
ないからである。基準光パルスは次に空洞から現れ、　
ＰＭＴＯ光電陰極上に落ちる。

本基準システムの他の部分は光パイプロ４とそれに組み
合わされたレンズである。各励起光パルスの一部分を検
出のためにＰｒＮダイオード６８に導く必要があるため
、ビームスプリッタ４６が使われる。

ビームスプリフタにより各励起パルスの一部がレンズ６
２へその向きを変えられる。レンズ６２は開口部３８の
像を透明のプラスチック製の光パイプロ４の表面に集束
させる。光パイプは、光パイプ内に捕らえられた光を数
多くの内部反射を通じて、レンズ６６に導く。その過程
で、開口部３８の像が破壊される。そのため、レンズ６
Ｇに最も近い光パイプの端には、いかなる像も見えず、
その端は輝（円板のようにみえる。

励起パルス光は光パイプロ４から、多くの異なる角度で
現れる。この光は集束させられ、あるいは少なくともＰ
ｒＮダイオード６８に表面に集められなければならない
。これは、レンズ６６によって行われる。このレンズに
よってできるだけ多くの発生光が捕らえられる。この光
は次にＰｒＮダイオードの表面に集束される。この結果
光パイプから出現する光は実質的に全て、　　ＰｒＮダ
イオードの表面に投影される。

フローセル フローセルは、第８図および第９図に示すような長く幅
の狭い形状のものを選択すると、「エアペグ（ａｉｒ　
ｐｅｇ）　Ｊで洗浄しやすい。典型的なフローセルの配
置が第１０図に示されている。入力管３２０にはエアペ
グ３２６で分割されたサンプルアリコート（ａｌｉｑｕ
ｏｔ）　３２２と３２４が含まれる。これらのアリコー
トとエアペグは、エンドキャップ３２８を通って移動し
、１回につき１サンプルアリコーｉ・がフローセルの中
へ入る。つまり、１サンプルアリコートがフローセル内
に移され分析または定量され、その後、そのサンプルと
次のサンプルとの間のエアペグがフローセルを通って移
動させられる。

ニアペグの目的は、エアペグにつづくザンブルをフロー
セルに入れる前に、その１１のサンプルの残存物を掃除
し１壁を洗い流すことである。エンドキャップの目的は
、丸形の入力管３２０と正方形または長四角形の形のフ
ローセルの内部空洞３０４０間における液体の円滑かつ
力強い移動を助けることである。フローセルの反対側に
ある同様のエンドキャップ３３０は、四角形のフローセ
ルの空洞３０４から丸形の出力管３３２への移動を助け
る。

第１０図のフローセルは第８図および第９図の構造をし
ている。励起光パルスを受けとるための入力窓３００は
、第１０図の正面に示される。励起光エネルギーを内部
空洞３０４に反射しもどす鏡面２３は。

ｙ軸に沿って入力窓３００の反対側にある。出力窓３０
１は第１０図の右側面に示される。放出された蛍光をフ
ローセル内に反射しもどす鏡面２５はＸ軸に沿って窓３
０１の左側、または反対側にある。２つの窓はどの向き
にあってもよいが、放出された蛍光を導く光学チャンネ
ルへの励起光の散乱を最小限にするため、フローセルの
直交する面に２個の窓を設けることが望ましい。鏡面２
３および２５はフローセル壁の内面にあっても外面にあ
ってもよいが、外側の壁にある方が望ましい。

４、　欠　　の　　ｔ′　な量゛Ｈ 第１図は従来の基準システムの１例のブロック図、第２
図は従来の基準システムの改良例のブロック図、第３図
は本発明の蛍光測定器システムの１実施例のブロック図
、第４図は蛍光体の励起および放出帯域並びに、光学フ
ィルタの通過帯域をプロットした図、第５図は１例の基
準システムの電子部分のブロック図、第６図は相対蛍光
強度の計算過程の流れ図、第７図は第６図の過程を実行
するため基準システムの電子部分の制御に用いろ制御信
号のタイミング図、第８図は本発明の蛍光測定器の１実
施例で用いるフローセルの１例の平面図、第９図は本発
明の蛍光測定器の１実施例で用いられるフローセルの側
面図、第１０図は本発明の１実施例でエンドキャップと
ともに用いられるフローセル（ｆｌｏｗ　ｃｅｌｌ）の
斜視図である。

２０・・・第１の光源、２２・・・フローセル（ｆｌｏ
四ｃｅｌｌ）。

５０・・・第１の光検出器、６日・・・第２の光検出器
、７０・・・第２の光源、８８・・・制御論理、１３４
・・・計算回路。

ＦＩＧ、　９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、蛍光染料により標識付けされた分析または定量すべ
   き物質を、該物質上に投影される像の幾何学的配列を制
   限するためにマスクされた複数の高い強度の光パルスに
   よって励起するための光学装置、および、該染料から放
   出された蛍光を検出するための、そして存在する染料の
   量の変化以外のシステム中の変化の影響を最小にするよ
   うに放出される光の量を定量化するための基準装置を備
   えた蛍光測定器。 ２、前記光学装置が、蛍光染料の変動量を光のパルスに
   より励起するための手段を備えており、前記基準装置が
   、前記励起パルスに応じて該染料から放出される蛍光を
   検出するための手段、および、該染料から放出される蛍
   光の量を定量化して結果とするための、そして存在する
   該染料の量の変化以外のシステム中の全ての変化の影響
   を該結果から除去するための手段を備えている特許請求
   の範囲第１項に記載の蛍光測定器。 ３、前記励起のための手段が、前記染料の励起帯域中の
   エネルギーを有する前記光パルスを放出することのでき
   る高い強度のフラッシュランプを備えている特許請求の
   範囲第２項に記載の蛍光測定器。 ４、前記染料を、一方の寸法が他方よりも長い幾何学的
   配列の限られた空間内に収容するための手段をさらに備
   えている特許請求の範囲第３項に記載の蛍光測定器。 ５、前記収容するための手段が、前記励起光を受け入れ
   るための透明窓部と、前記染料から放出される蛍光を前
   記検出のための手段の方向に逃がすための透明窓部とを
   備えている特許請求の範囲第４項に記載の蛍光測定器。 ６、前記フラッシュランプがアークを備えており、前記
   染料上の該アークの像を空間的に積分または統合するた
   めの手段をさらに備えている特許請求の範囲第５項に記
   載の蛍光測定器。 ７、前記収容するための手段が、前記検出のための手段
   に向かう散乱励起光の伝達を邪魔するための手段をさら
   に備えている特許請求の範囲第６項に記載の蛍光測定器
   。 ８、前記定量化のための手段が、前記励起光パルスと時
   間的に交互配置された基準光パルスを発生するための第
   ２の手段、光を検出するための第２の手段、該励起光パ
   ルスの少なくとも一部と該基準光パルスの少なくとも一
   部とを該光検出のための第２の手段に導くための手段、
   および該基準光パルスの少なくとも一部を前記蛍光検出
   のための手段に導くための手段を備えている特許請求の
   範囲第７項に記載の蛍光測定器。 ９、前記蛍光検出のための手段と前記光検出のための第
   ２の手段とからの出力信号の大きさの所定の比を計算す
   るための手段をさらに備えており、該比の各項は、前記
   励起光により励起された前記染料の量を定量化する結果
   を与えるように選択され、かつ測定器内で生ずるであろ
   う他の変化には関係なく励起された染料の所定の量に対
   して該結果が実質的に一定であるように選択されている
   特許請求の範囲第８項に記載の蛍光測定器。 １０、前記蛍光を検出するための手段と出力信号の大き
   さの比を計算するために蛍光を検出するための前記第２
   の手段とに接続された手段をさらに備えており、前記比
   の各項が、少なくとも、前記励起光パルスを発生させる
   ための手段または前記基準光パルスを発生させるための
   手段のどちらかからの光パルス流中のパルスごとの光パ
   ルス強度の差ならびに該蛍光を検出するための手段と前
   記光パルスを検出するための第２の手段との時間に対す
   るおよび変動する温度によるスペクトル応答の差に無関
   係となり、励起された染料の量を定量化するように選択
   されている特許請求の範囲第８項に記載の蛍光測定器。 １１、前記定量化のための手段が、 光を検出するための第２の手段、 前記励起光の少なくとも一部を該光検出のための第２の
   手段に導くための手段、 前記励起光パルスと時間的に交互配置されている基準光
   パルスを発生するための第２の手段、 該基準光パルス発生のための第２の手段により発生され
   た該光の少なくとも一部を、前記蛍光検出のための手段
   および該光検出のための第２の手段の各々に導くための
   手段、および、 比　Ａ／Ｂ×Ｃ／Ｄ （ここで、Ａは、該励起光パルスによる前記染料の励起
   に応答して放出される該染料からの蛍光の受取に応答す
   る蛍光の受取に応答する該蛍光検出のための手段からの
   出力信号の大きさであり、 Ｂは、前記励起光パルスを発生するための手段からの励
   起光パルスの受取に応答して発生される光を検出するた
   めの該第２の手段からの出力信号の大きさであり、 Ｃは、該基準光パルスを発生するための第２の手段から
   の基準光パルスの受取に応答して発生される光を検出す
   るための該第２の手段からの出力信号の大きさであり、
   そして、 Ｄは、該基準光パルスを発生するための第２の手段から
   の基準光パルスの受取に応答して発生される蛍光を検出
   するための該手段からの出力信号の大きさである） を計算するための手段を備えている特許請求の範囲第２
   項に記載の蛍光測定器。 １２、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、光パルスを受け取
   っていない時には前記各々の検出手段の応答の大きさよ
   り小さくなるようにされている特許請求の範囲第１１項
   に記載の蛍光測定器。 １３、前記案内のための手段が光パイプである特許請求
   の範囲第１１項に記載の蛍光測定器。 １４、蛍光染料により標識付けされた分析または定量す
   べき物質を、該物質上に投影される像の幾何学的配置を
   制限するためにマスクされた複数の高い強度の光パルス
   によって励起するための光学装置、該染料から放出され
   た蛍光を検出するための、そして存在する染料の量の変
   化以外のシステム中の変化の影響を最小にするように放
   出される光の量を定量化するための基準装置を備えた蛍
   光測定器のための光システムであって、フローセルおよ
   び光検出器を有しており、 励起光のための該フローセル中の第１の光路、該フロー
   セル中の蛍光染料からの放出光のための該フローセルか
   ら該光検出器までの第２の光路、および 該第１の光路により該フローセルに投影された像の幾何
   学的配列を制限するための該第１の光路内のマスク手段 を備えた光学システム。 １５、前記光検出器に投影された該フローセルの像の幾
   何学的配列を制限するための前記第２の光路内の第２の
   マスク手段をさらに備えた特許請求の範囲第１４項に記
   載の光学システム。 １６、非コヒーレントな励起光パルスを供給するための
   前記第１の光路に光学的に結合されたパルス化光源をさ
   らに備えた特許請求の範囲第１４項に記載の光学システ
   ム。 １７、第２の光検出器、および各励起光パルスの一部を
   該第２の光検出器に伝達するための第３の光路をさらに
   備えた特許請求の範囲第１６項に記載の光学システム。 １８、前記パルス化光源の像を前記第２の光検出器の面
   に投影する前に該パルス化光源の像を空間的に積分また
   は統合するための前記第３の光路内の手段をさらに備え
   た特許請求の範囲第１７項に記載の光学システム。 １９、前記光検出器に投影される前記フローセルの像の
   幾何学的配列を制限するための前記第２の光路内の第２
   の手段をさらに備えた特許請求の範囲第１８項に記載の
   光学システム。 ２０、前記第１の光路内に光学帯域通過フィルタをさら
   に備え、該フィルタが、前記励起光パルスを示す波長帯
   域内の波長を有する光を通過させ、前記蛍光染料からの
   放出光の波長の帯域を含む所定の波長帯域内の波長を有
   する光の通過を実質的に阻止する特許請求の範囲第１４
   項に記載の光学システム。 ２１、前記第２の光路内に光学帯域通過フィルタをさら
   に備え、該フィルタが、前記放出された蛍光を示す波長
   帯域内の波長を有する光を通過させ、前記パルス化光源
   からの励起光の波長の帯域を含む所定の波長帯域内の波
   長を有する光の通過を実質的に阻止する特許請求の範囲
   第２０項に記載の光学システム。