JPS63502592A - 蛋白質の保存 - Google Patents
蛋白質の保存Info
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- JPS63502592A JPS63502592A JP50150987A JP50150987A JPS63502592A JP S63502592 A JPS63502592 A JP S63502592A JP 50150987 A JP50150987 A JP 50150987A JP 50150987 A JP50150987 A JP 50150987A JP S63502592 A JPS63502592 A JP S63502592A
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- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称
蛋白質の保存
技術分野
本発明は、ヘモグロビン、赤血球、リポソーム及び細胞のような材料の長期間保
存を可能にする乾燥貯蔵法に関する。
背景の技術
ヘム補欠分子族の鉄原子の2+から3+状態への酸化は、オキシ又はデオキシヘ
モグロビンを生物学的に機能しないメトヘモグロビンに転化する。この反応は低
酸素圧の状態で促進され、完全な赤血球の細胞において働く有能な還元系の存在
により生体内では最小となる。輸注のために赤血球を人間の献血者から得る場合
、その生体外貯蔵は一部酸化されたヘム(メトヘモグロビン)の加速的生成によ
って制限される。
乾燥状態での貯蔵は、加水分解をt11限し且つ化学的又は生物学的活性を破壊
しうる酸化的損傷のいくらかを防止する。しかしながら生物学的巨大分子を取扱
う場合、水の除去は2次、3次又は4次構造を不可逆的に変更し、結果として生
物学的効果を消失させることがある。
生体膜の脱水は普通構造的及び機能的完全性の決定的な損失を伴う[クロウ(C
roa+e)、クロウ及びシャクソン(J ackson)、1963]。生体
膜の再水利時−二、生体膜内の顆粒の再分散及び股間の融合に関して形態学的損
傷は明白である6更に特異的な酵素活性(例えばCu+の輸送)と関連する膜系
において、再水利は活性の完全な消失を誘導する。
Jl:Ara質を水性溶液中に分散させて調製される人工の膜系は、その基礎的
研究における有用性及びその潜在的な生物工学への適用性が故に多大な関心を集
めて軽た。燐脂質の分散液は自然にリポソームと呼ばれる閉じた構造体を形成す
る。リポソーム内のカプセル化された容量は、リポソームを生理学的「カプセル
」又は人工細胞としてlflせしめる。リポソーム内にカプセル化される溶質に
は人間のヘモグロビンがある。このように生成せしめられる「ヘモソーム(ha
ewoso+9es)Jは、赤血球代用品として非常に実用的な見こみがある[
ドジョルドジエピッチ(D jordjevich)及びミラー(Miller
)、1980;ディパー(G aber )ら、1983;ヘイワード(Hay
II+ard)ら、1985]、Lかし内包された溶質を含むリポソームを脱水
/再水利に供す場合、溶質は周囲の溶液に失われてしまう[マツデン(Madd
en)ら、1985]。
ヘモグロビンの(i4質リポソーム内へのカプセル化の影響は、ヘモグロビンの
再水和時の酸化を接触することであった。オキシヘモグロビンは再水和したヘモ
ソームから再生することができなかった。更に再水和した試料の可視吸収の多く
は消失して、本質的に無色の試料となる。これらの観察は、不飽和の燐脂質がヘ
モグロビンの酸化を促進し且つヘムを分子のグロビン部分から抽出しさりうると
いうことを発見したスゼベニ(S zeben i )らの記述するものと同様
である。
今回、蛋白質を炭水化物含有の水溶液から乾燥することにより、化学的及び物理
的劣化過程を回避できることが発見された。選択する炭水化物がそれ自体固体で
あるならば、密集した固体の蛋白質−炭水化物混合物が得られ、これは酵素活性
を減することなしに繰返し0℃まで冷却し且つ室温まで暖めることができる。更
にこの技術は水に依存する構造をもつ他の材料側光ぼりゴソーム及び更に完全な
#Il胞の貯蔵を容易にするために拡張しうる。
更に今回脱水/再水和後に分離した蛋白質、蛋白質系、生物学的及び人工の膜、
及び全細胞の生物学的活性を保持させるためにトレ/Sロース及び他の糖につい
て試験した。
それ数本発明は、水に依存する構造を有する材料をポリヒドロキシ化合物の水溶
液と接触させ、次いで水を材料から除去することを含んでなる該材料の保存法を
提供する。
ここに「水に依存する構造を有する材料」とは、水の存在下における疎水性及び
/又は親水性相互作用によって決定される2次、3次及び4次構造を有し且つそ
の構造が水の除去によって不可逆的に変えられ或し1は部分的又は完全に破壊さ
れる蛋白質、リポソーム及びm胞のような材料を包含するものとする。
[ポリヒドロキシ化合物]とは、分子当り2つ又はそれ以上のヒドロキシ基を有
し、それが水に依存する構造を有する材料に水素結合し或し1はさもなければそ
れを安定化することのできる物質のいずれかを包含する。
適当なポリヒドロキシ化合物は糖及び同様の又は関連するポリオール、得にトリ
オース、ペントース及びヘキソース、単、二及1オリゴ糖類及び関連するポリオ
ールを含む。好適なポリヒドロキシ化合物はグルコース、〃ラクトース及び非還
元糖特にトレ1zt3−スである。
発明の詳細な説明
本発明は1つの特別な具体例において、水に依存する構造を有する材料を、ポリ
ヒドロキシ化合物の水溶液と接触させ且つこれを材料内の1つ又はそれ以上のカ
プセル化空間に導入し、次いで水を該材料から除去することを含んでなる水性溶
液又は懸濁液を含有する1つ又はそれ以上の空間をカプセル化した該材料の保存
法を提供する。
本発明は他の観点において、水に依存する構造を有する材料及びポリヒドロキシ
化合物を含んでなる乾燥組成物を提供する。このポリヒドロキシ化合物は水に依
存する構造を有する材料と良く混ざって存在するであろうし、また材料が水性溶
液又は懸濁液の残部を含有する1つ又はそれ以上の空間をカプセル化している場
合、好ましくはポリヒドロキシ化合物もこれらの空間内に分散している。
本発明の保存法はヘモグロビンの貯蔵に特に適当であり、ヘム鉄の酸化を最小に
し且つ再水和時に気体輸送能力を保持させる。乾燥ヘモグロビンは精製したヘモ
グロビンの簡単な水溶液から、赤血球溶解物から、完全な赤血球から、或いは赤
血球代替品(ヘモソーム)から調製しうる。
いずれの理論によっても束mf:れたくはないけれど、本発明によって提供され
る安定化は[無水生物(anhydrobiosis)Jのある場合に観察され
るものと関連することが予想される。
多くの生物学的構造の有機体化は、絶対的に水の存在に依存する。疎水性構造例
えばすべての細胞及びそのオル〃ネラを限定する膜はその非極性部分からの水の
排除によって発生する。親水性構造例えば球状の蛋白質は溶液中において水と水
素結合することにより、また特別な誘電定数の媒体中において特別な双極子を維
持することにより安定化されてνする。
しかしながらいくつかの有機体は完全に近い脱水を生と抜く能力をもっており、
それらは脱水状態において年単位で測定されるIA人間存しうる。
この事実は1800年代の昔に認識されていた。乾燥状態の!?頚動物において
小さい砂中で生きる有機体は凍結以下十分な温度に且つ沸とう水はどの#Iさに
耐えうることが発見された[クロウ(Crove )及びクレツグ(CleFi
g)、1973及び1978]。これらの有機体における正常な代謝過程は、数
10年乾燥状態で貯蔵した後でさえその再水和の30分以内に回復する。
近年、[無水生物(anhydrobiosis)Jと呼ばれる乾燥を生き抜く
能力は、菌の胞子、枯菌カビのジクチオステリウム(D 1ctyostel
i+u++)のマクロシスト、パンのイースト、海老の包襄、線虫類及び植物の
種子を含む小さいが種々の群の有機体の性質であることが示されたEクロウ及び
クロウ、1984の総説を参照1゜
トレハロース、即ち自然界に広く分布するグルコースの非還元性三糖類は乾燥生
存しうる有機体のいくつかにおいて特に高濃度(乾燥重量の約20%程の多量)
で見出される。い(つかの有機体の脱水による生存は、脱水中のトレハロースの
合成[マシン(Fi4adir+)及びクロウ、1975]或いはその再水和に
続く分解[フレラグ、1964]と関係する。この分子は「水代替仮説」、即ち
簡単な炭水化物のヒドロキシル基が脱水中に失なわれる燐脂質の極性頭糸の水和
殻を代替しうるということを示唆する仮説に関連づけられた[クロウ及びフレラ
グ、1973]。
赤外分光法を用いる最近の実験[クロウ、クロウ及びチャプマン(Chapma
n )、19841はトレハロースが燐脂質2分子層の頭糸と水素結合しうろこ
とによって水に代替し、これによって水の不存在下に膜構造を安定化するという
証拠を示した。このモデルに対し、マツデン(Madden)ら(1985)は
支持を与えている。即ち彼らは脱水を炭水化物の存在下に行なう場合、単分子膜
リポソームの完全性が保持される(即ちリポソームの内部水性室からの溶質の炉
出かない)ということを示した。この保v1能力は試験した炭水化物のすべてに
あった。
糖及び同様の多価アルコールは、酵素活性を保持させる[プラトベリー(Bra
dbury)及びノヤフビ−(J aeoby)、1972]、不可逆的凝集を
禁止する[7リゴン(Frigon)及シリ−(Lee)、1972]、及び蛋
白質が熱的に変性する温度を上昇させる[ガールスマ、1968;ニューセア及
びセント・アンゲロ、1972まために溶液において使用されてきた。
蛋白質の分析、合成及び生物化学における広い用途のために、乾燥した蛋白質の
炭水化物中介の保護が多(の適用性を有するであろうと言える。多くの蛋白質の
貯蔵安定性は本発明の方法で高められる筈である。
本発明の特に新規な拡がりは脱水された細胞及びその代替物の安定化に関する。
自然に再び閉じる孔を生物的及び人工の膜に過渡的に作ることは可能である。し
かしながら、その存在する時間gi通過中これらの孔は炭水化物の、細胞質(細
胞)又はカプセル化された内容量(リポソーム)中への侵入を可能にする十分な
直径をもっている。斯くしてトレハロース(又は他の炭水化物)を人間の赤血球
の細胞質中−導入し、そしてその脱水状態における拡大された貯蔵を可能にする
ことができるはずである。
それ故に買置の危険性の高い患者に対して向原の赤血球を無限に貯蔵することか
で艶よう。同様にヘモソーム(hnea+osome)も製造でき、脱水後の状
態で貯′ia″Cきよう。乾燥ヘモンームの適用はその場での再水利後に簡単に
行なえるであろう。
今や本発明を、限定するものでない実施例により及び添付する図面を参照して例
示する。ここに第1図はヘモグロビン粉末の再水和時に生成するメトヘモグロビ
ンの百分率を示すヒストグラムである。糖は再水利後0.25モル濃度の濃度で
存在し、ヘモグロビンは0.01515モル濃あった。1)P4を含まないオキ
シヘモグロビン、2)Mを含まないデオキシヘモグロビン、及び3)〜11)3
)アラビノース、4)ftラクトース、5)7フース、6)グルコース、7)ア
ンノース、8)マルトース、9)ラクトース、10))レバロース及び11)ス
クロースを含むオキシヘモグロビン。
実施例1及び2
2つの別の蛋白質、ニワトリの卵白リゾチーム(実施例1)及び人間のヘモグロ
ビン(実施例2)の乾燥粉末を製造するために異なる糖を利用した。湿った及び
乾いたりゾチーム調製物の構造的安定性を熱量計で試験した。8!能的安定性を
ヘモグロビンによる気体輸送の分光学的評価によって証明した。
水又は緩58!に溶解した蛋白質に炭水化物を添加することによって炭水化物−
蛋白質の混合物を溶液で製造した。種々のトリオース、ペントース及びヘキソー
ス並びに単糖類及び三糖類を試験した。糖の濃度を1=1(重量:重りから最高
糖の0.25モル濃度まで変化させた。
3つの方法の1つによって水を除去した=a)溶液を気体窒素の一定流下に穏や
かに加熱する蒸発;b)試料を室温減圧下にさらず脱気、或いはC)溶液を最初
に液体窒素で凍結し、そして水を高真空下に昇華させる凍結乾燥、乾燥した試料
を真空下、五酸化燐上で長期間貯蔵した。
パーキン−エルマー社製の示差掃査型熱量計(DSC)DSC−2型を用いて熱
的評価を行なった。加熱速度は2.5℃/分であり、また記録計の全スケールは
0.25m−cal/秒の熱流の変化に相当した。得られた転移温度は最大熱流
の温度である。
第1表は水中及び糖グルコース、ガラクトース又はトレハロース中;二溶解した
りゾチームの変性温度と変性エンタルピー及びエントロピーの変化を含む。これ
らの糖のいずれかの存在は他の報告のvL察と一般的に一致して変性温度を上昇
させた[ガールスマ(Garlsma)、1968;ニューサー(Neucer
e)及びセント・アンプo(St、 ABelo)、1972]。
斯くして、溶液中において、糖は変性された状態に関して蛋白質の本来の構造を
安定化させる。この性質は試験した3つの糖の各によって示された。
墓り表
靴水虫及1水立糖蚕系沖におけるリゾチームの゛皿度上寒立玉乙乙乞(二及囚玉
4L已く二堰化
a 5 なし −72,8142410,5b 10 tt // 70.9
11B、2 337.7c 20 o 68.8 105.7 309.1d
10 グルコース 1:1 73.8 118.9 342.76 // )レ
バロース // 73.6 119,6 344,9f 〃 ガラクトース n
73.5 139.0 401.0、 // // 73,6 133,0
384.2b 5 // 73.9 136.3 392.7i 20 u 〃
75.3 101.0 289,6j 10 グルコース 5:1 83.2
88,8 249.8k 〃 トレハロース It 79.8 111.5 3
15,81 tt 77ラクトース # 81.5 90.4 254.9炭水
化物の存在又は不存在下に凍結乾燥したりゾチームに対する転移と関連した最高
熱流の温度及びエタルピー及びエントロピーの変化を第2表に概述する。純粋は
乾燥リゾチームの吸熱転移は、水中蛋白質の変性温度より約70℃以上の温度で
起こる。固体状態において、蛋白質のポリペプチド鎖は同一の温度での溶液中に
おけるようりも柔軟性が少ないであろう。
それ故に、乾燥蛋白質は水溶液中の蛋白質よりも高温度において蛋白質構造の折
り重ねの広がりに必要な柔軟性の程度に達するであろう。
鎧
糖の存在下において、転移温度は低下し、また転移に対するエンタルピー及びエ
ントロピー変化は溶液中の蛋白質に見られる値に等しいか或いはその値を凌駕す
る。即ち水和水が蛋白質の表面から除去されるにつれてそれは徐々に糖によって
置換され、糖の不存在下に起こらない蛋白質の立体配置の安定化をもたらすよう
である。
検討した3つの糖の各は溶解したリゾチームの熱量的挙動を乾燥した蛋白質に回
復させうるけれど、グルコース又は〃ラクトースを含む加熱した粉末は「褐色」
になることがn察された。この褐色化する反蛋白質に回復させうるけれど、グル
コース又は〃ラクトースを含む加熱した粉末は1゛褐色」にあることが観察され
た。この褐色化する反応はトレハロースの存在下には起こらなかった。従って無
水生物(antibioLic)有機体におけるトレハロースの発生への選択的
圧力は、その水に対して代替しうる能力よりも、褐色化反応を防止する非還元性
によるのかも知九ない、それにも拘らず、本発明では上述の糖のいずれがが乾燥
蛋白質−糖混合物の貯蔵に対して適当である。
これらの結果は、種々の炭水化物の存在又は不存在下における脱水/再水和の前
後の人間のヘモグロビンの機能的完全さを決定することによって助長することが
できた。オキシ、デオキシ及びメトヘモグロビンの相対的濃度はベネシュ(Be
neseh)ら、(1965)の記述する方法に従って溶液から得たスペクトル
により計算した。
WS1図において、脱水/再水和のサイクルに続く人間のヘモグロビンの溶液中
に生成するメトヘモグロビンの百分率が提示される。mを含まない乾燥したヘモ
グロビンを再水和した時、溶液はメトヘモグロビンに特徴的な褐色を呈した。生
成したメトヘモグロビンの百分率は貯賊期間と共に全ヘムの90%まで増大した
。同様のスペクトルは7エリシアン化カリウムの添加後のヘムの接触酸化によっ
ても生じさせることができた。
糖の不存在下における再水和ヘモグロビンの挙動と全く相反して、試験した炭水
化物の各はヘモグロビンを酸化による損傷から保護することができた。この保護
効果は3ケ月以上のJg1問乾燥状態で貯蔵した試料においてでさえ明白であっ
た。再水和された糖−ヘモグロビン混合物は酸素、窒素又は−酸化炭素への露呈
によって誘導されるスペクトルのシフトによって明白なように可逆的に気体交換
を行なうことができた。
リゾチーム又はヘモグロビンの乾燥粉末を月いて得られた本発明の結果は、炭水
化物が無水の蛋白質の安定性を高め且つ再水和後のajiJ理化学的及び生物学
的活性の保持を可能にするということを示す。
実施例3
蛋白質の乾燥状態での炭水化物による安定化を示す本発明の、赤血球代替物とし
てのヘモソームの本発明者による従来の研究[ヘイワード(Hay*ard)ら
、1985]と組合せは、人工赤血球を乾燥状態で安定化させる糖の能力の検討
をうながしたにの場合の炭水化物の保11fi!力は2面性である、即ちヘモグ
ロビンの酸化と変性の防止及び同時にヘモソームの内部水性室内におけるカプセ
ル化されたヘモグロビンの保持であるということを推定した。
今回炭水化物の(ヘモンーム内及び外部のバルク溶液内における)含有はヘムの
酸化を防止することを発見した。更に再水和された炭水化物/ヘモンームはヘモ
グロビン:燐脂質の割合において縮小することなくモレキュラーシープ中を通過
することができた。今日まで試験した炭水化物のすべてはこの能力において効果
的であった。反対に炭水化物を含まないヘモンームは不可逆的に凝集するように
なり、そして燐脂質は比較的浮き易いためにヘモグロビンから容易に分離した。
註尻文駁
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00143ANNEX To ’1rfE INTERNATIONAn、5E
ARCHREPORT 0NUS−A−1855591None
Claims (16)
- 1.水に依存する構造を有する材料をポリヒドロキシ化合物の水溶液と接触させ 、次いで水を材料から除去することを含んでなる該材料の保存方法。
- 2.材料が蛋白質、リボソーム又は細胞である請求の範囲第1項記載の方法。
- 3.材料が赤血球、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン或いはオキシヘ モグロビン又はデオキシヘモグロビンをカプセル化したリポソームである請求の 範囲第1項記載の方法。
- 4.材料が水性溶液又は懸濁液を含む1つ又はそれ以上の空間をカプセル化し、 また材料をポリヒドロキシ化合物の水溶液と接触させ且つこれを多くのカプセル 化される空間の1つの中に導入し次いで材料から水を除去することを含んでなる 請求の範囲第1項記載の方法。
- 5.ポリヒドロキシ化合物が糖又は関連ポリオールである請求の範囲第1項記載 の方法。
- 6.ポリヒドロキシ化合物がトリオース、ペントース、ヘキソース、単、二又は オリゴ糖類、及び関連ポリオールから選択される請求の範囲第51項記載の方法 。
- 7.ポリヒドロキシ化合物がグルコース、ガラクトース及び非還元糖から選択さ れる請求の範囲第6項記載の方法。
- 8.ポリヒドロキシ化合物がトレハロースである請求の範囲第7項記載の方法。
- 9.水に依存する構造をもつ材料及びポリヒドロキシ化合物を密に混じて含んで なる乾燥組成物。
- 10.材料が蛋白質、リポソーム又は細胞である請求の範囲第9項記載の組成物 。
- 11.材料が赤血球、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン或いはオキシ ヘモグロビン又はデオキシヘモグロビンをカプセル化したリポソームである請求 の範囲第9項の組成物。
- 12.材料が水性溶液又は懸濁液を含む1つ又はそれ以上の空間をカブセル化す る請求の範囲第9項の組成物。
- 13.ポリヒドロキシ化合物が糖又は関連ポリオールである請求の範囲第9項記 載の組成物。
- 14.ポリヒドロキシ化合物がトリオース、ペントース、ヘキソース、単、二又 はオリゴ糖類及び関連ポリオールから選択される請求の範囲第13項の組成物。
- 15.ポリヒドロキシ化合物がグルコース、ガラクトース及び非還元糖から選択 される請求の範囲第14項記載の組成物。
- 16.ポリヒドロキシ化合物がトレハロースである請求の範囲第15項記載の組 成物。
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